Tema III

Ensayos in vitro (citotoxicidad)

 Objetivos
➢ Definirel concepto de citotoxcidad
➢ Conocer y diferenciar los ensayos usados
para evaluar la citotoxicidad de un
biomaterial
 Repaso

➢ ¿Qué necesita saber un Ingeniero de (Bio)Materiales de

Biología?
⚫ ¿Qué es determinante para que “mi” biomaterial pueda
desarrollarse y venderse? (comercializable)
⚫ ¿Qué hace que un biomaterial sea mejor que otro?
(comercialmente competitivo)
 Citotoxicidad
➢ Cualidad de ser tóxico o nocivo para las
células.
⚫ 1.- En si misma
⚫ 2.- Genera otras sustancias tóxicas por deterioro (ej. radicales
libres, metales pesados).
⚫ 3.- Genera otras sustancias tóxicas biológicas (ej. Anticuerpos)
⚫ 4.- Activas reacciones de inflamación o inmunológicas.

➢ Evaluacion previa del comportamiento de

los biomateriales. Como va a responder
mi material.
⚫ Respuesta a fluidos biológicos
⚫ Respuesta de células vivas
 Respuesta a fluidos biológicos
➢ Someter el biomaterial a condiciones biológicas
realistas:
⚫ Temperatura: 37ºC
⚫ pH 7,4
⚫ Enzimas y sustancias muy activas
➢ Evaluación de la respuesta del material
⚫ Alteración de las cualidades del biomaterial
⚫ Liberación de compuestos tóxicos (metales pesados,
ácidos/bases, residuos de disolventes, etc)
⚫ Precipitación de sales insolubles
⚫ Liberación de compuestos bioactivos (p.ej. Ca2+)
 Respuesta de células vivas
➢ Suspensiones y cultivos
celulares
➢ Modos de evaluación
⚫ Exposición del cultivo a
suspensiones del
biomaterial
⚫ Cultivo de células sobre el
biomaterial
➢ Muerte de las células
⚫ Necrosis -> muerte por
agresión externa
⚫ Apoptosis-> “suicidio”
celular
Modelos in vitro
➢ Incubación con células
sanguíneas o epiteliales
⚫ Primeras en interaccionar
con el biomaterial
⚫ Linfocitos: reacción inmune
➢ Cultivos con células del
tejido conjuntivo
⚫ Siguientes en
interaccionar: cicatrización
⚫ Fibroblastos: fabricación
del estroma del órgano
(aislamiento)
 Evaluación de la Viabilidad
celular
➢ Concepto de viabilidad celular
⚫ Células vivas y
⚫ Funcionales (≈sanas)
➢ Tormenta de ideas:
⚫ ¿Cómo evaluarías si las células están vivas,
muertas o dañadas?
⚫ Pista: ¿cómo evaluarías si una persona está
viva, muerta o herida?
EVALUACION MORFOLÓGICA
poly(ethylenimine) (PEI)
Fisher et al 2003
 Ensayos
enzimáticos

Ejemplo:
the release of the cytosolic enzyme
lactate dehydrogenase (LDH) show
damage in plasme membrane.

Fisher et al 2003
Ensayos de captación de rojo
neutro *(neutral red)
- El rojo neutron es captado por las células
(especialmente los lisosomas y endosomas) y en la
medida en que la célula pierde viabilidad por la acción
del compuesto evaluado se libera al medio el colorante
pues solo las celulas viables son capaces de retener el
colorante. Se determina la cantidad de colorante que
permanence en el interior de las células y se
estima la concentración del compuesto que produce la
inhibicion del 50% celular (CL50). El rojo neutron se
lee a 540 nm. Cuanto mayor es el C50 menos tóxico es
el material.

- % supervivencia = células que sobreviven/total x 100

Leon et al., 2006
Taxol, es un compuesto utilizado en quimioterapia.
Cuanto mayor es el C50 menos toxico es un material
 Ensayo de
densidad óptica
Ensayo de enlazamiento al azul
de kenacid
➢ Se evalua el cambio de proteínas totales.
➢ Protocolo. Se cultivan las células con el
supuesto biomaterial. Se retira y se añade
azul de kenacid. Posteriormente se estima
la cantidad de proteínas totales por cultivo
por DO a 570-600 y se estima la viabilidad
celular.
Ensayo de reducción del MTT
El MTT de color amarillo y soluble es reducido en
presenciade mitochondrial activas a formazan rojo e
insoluble. Valoracion de formazan por DO.
 Bibliografia recomendada
➢ Arencibia et al., 2003
➢ Castro de Pardo et al., 2006
➢ Leon et al., 2006
➢ Rodeiro et al 2004
➢ Fischer et al., 2003