Estudio de La Estructura y Propiedades de Las Proteínas Integrales de La Membrana

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Biología celular y molecular. Conceptos y experimentos, 8e
CAPÍTULO 4: La estructura y función de la membrana plasmática
4.5 ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS INTEGRALES DE LA
MEMBRANA
Por sus dominios hidrófobos transmembrana, las proteínas integrales de la membrana son difíciles de aislar en una forma soluble. La extracción de
estas proteínas de la membrana requiere el uso de un detergente, como el detergente iónico (cargado) SDS (dodecilsulfato de sodio) que
desnaturaliza las proteínas o el detergente no iónico (sin carga) Tritón X100, que casi nunca altera la estructura terciaria de las proteínas)
Como los lípidos de la membrana, los detergentes son anfipáticos, se componen de un extremo polar y una cadena de hidrocarburo no polar (fig. 2–
20). Como consecuencia de su estructura, los detergentes pueden sustituir a los fosfolípidos para estabilizar las proteínas integrales mientras las
hacen solubles en una solución acuosa (fig. 4–16). Una vez que las proteínas se solubilizaron con el detergente, pueden realizarse varios análisis para
conocer los aminoácidos que componen la proteína, su masa molecular, secuencia de aminoácidos, etcétera.
FIGURA 4–16
Solubilización de proteínas de membrana con detergentes. Los extremos no polares de las moléculas de detergente se asocian con los
residuos no polares de la proteína, que previamente habían estado en contacto con las cadenas de ácido graso de la bicapa lipídica. Por el contrario,
los extremos polares de las moléculas de detergente interactúan con las moléculas de agua circundantes, lo que mantiene la proteína en solución.
Como se muestra aquí, los detergentes no iónicos solubilizan las proteínas de membrana sin alterar su estructura.
Los investigadores han tenido muchas dificultades para obtener cristales de la mayor parte de las proteínas integrales de la membrana para su uso en
la cristalografía por rayos X. En realidad, menos del 1% de las estructuras proteínicas de alta resolución conocidas representan proteínas integrales de
la membrana.2 Además, la mayor parte de estas estructuras representa versiones procariotas de una proteína particular, a menudo más pequeñas que
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sus homólogos eucariotas y más fáciles de obtener en grandes cantidades. Una vez que se determina la estructura de un miembro de una familia de
4.5 ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS INTEGRALES DE LA MEMBRANA, Page 1 / 8
proteínas de membrana, los investigadores casi siempre pueden aplicar una estrategia llamada modelado de homología para conocer la estructura y
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actividad de otros miembros de la familia. Por ejemplo, la solución de la estructura del conducto bacteriano KcsA para potasio (fig. 4–39) aportó
muchos datos que pudieron aplicarse a la estructura y mecanismo de acción de conductos de K+ mucho más complejos en células eucariotas (fig. 4–
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Los investigadores han tenido muchas dificultades para obtener cristales de la mayor parte de las proteínas integrales de la membrana para su uso en
la cristalografía por rayos X. En realidad, menos del 1% de las estructuras proteínicas de alta resolución conocidas representan proteínas integrales de
la membrana.2 Además, la mayor parte de estas estructuras representa versiones procariotas de una proteína particular, a menudo más pequeñas que
sus homólogos eucariotas y más fáciles de obtener en grandes cantidades. Una vez que se determina la estructura de un miembro de una familia de
proteínas de membrana, los investigadores casi siempre pueden aplicar una estrategia llamada modelado de homología para conocer la estructura y
actividad de otros miembros de la familia. Por ejemplo, la solución de la estructura del conducto bacteriano KcsA para potasio (fig. 4–39) aportó
muchos datos que pudieron aplicarse a la estructura y mecanismo de acción de conductos de K+ mucho más complejos en células eucariotas (fig. 4–
42).
Una de las primeras proteínas de membrana cuya estructura tridimensional completa se determinó mediante cristalografía por rayos X se muestra en
la figura 4–17a. Esta proteína, el centro de reacción fotosintética bacteriana, consiste en tres subunidades que contienen 11 hélices α que abarcan la
membrana. La mayor parte de las proteínas de membrana no han sido tan fáciles de cristalizar, como lo fue el centro de reacción fotosintética. Entre
los obstáculos hallados, están que muchas proteínas de membrana: 1) aparecen en escaso número en cada célula; 2) son inestables en las soluciones
con detergentes necesarias para su extracción; 3) fácilmente muestran agregación y 4) son modificadas de manera profunda por la glucosilación y no
pueden ser expresadas en la forma de proteínas “recombinantes” en otros tipos de células. Algunas de las dificultades técnicas para preparar los
cristales de proteínas de membrana se resolvieron con metodologías nuevas y los esfuerzos de laboratorio. Por ejemplo, en un estudio, los
investigadores pudieron obtener cristales de alta calidad de un transportador bacteriano luego de probar y refinar más de 95 000 condiciones
diferentes para la cristalización. En algunos casos se identifican versiones mutantes de una proteína de membrana más idóneas, para formar las
disposiciones ordenadas de moléculas que integran la estructura cristalina “en enrejado”. En otros casos más se logra la cristalización por la unión
covalente de la proteína de membrana con otras moléculas, a menudo proteínas solubles pequeñas. Desarrollos recientes en la tecnología de
microscopia electrónica han permitido que se determine la estructura de las proteínas de membrana con alta resolución al obtener imágenes de un
gran número de proteínas idénticas a temperaturas muy bajas para reducir el ruido en la imagen y después creando imágenes conjuntas promedio
(fig. 4–17b). Como la microscopia se realiza a temperaturas muy bajas se conoce como microscopia crioelectrónica. Utilizando este método, es posible
observar cadenas laterales de aminoácidos individuales y reconstruir la estructura molecular por completo a partir de la información de microscopia
electrónica (fig. 4–17c).
FIGURA 4–17
Estructura de proteínas incrustadas. a) Estructura terciaria del centro de reacción de fotosíntesis de una bacteria, determinada por cristalografía
de rayos X. La proteína contiene tres polipéptidos diferentes que se extienden por la membrana, mostrados en amarillo, azul claro y azul oscuro. La
naturaleza helicoidal de cada uno de los segmentos transmembrana es evidente. b) Imágenes de microscopia electrónica de alta resolución del canal
de iones TRPV, reconstruidas promediando muchas micrografías electrónicas individuales de proteínas congeladas en hielo a bajas temperaturas
(microscopia crioelectrónica). c) Estructura del canal TRPV determinado por microscopia electrónica.
de rayos X. La proteína contiene tres polipéptidos diferentes que se extienden por la membrana, mostrados en amarillo, azul claro y azul oscuro. La
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naturaleza helicoidal de cada uno de los segmentos transmembrana es evidente. b) Imágenes de microscopia electrónica de alta resolución del canal
de iones TRPV, reconstruidas promediando muchas micrografías electrónicas individuales de proteínas congeladas en hielo a bajas temperaturas
(microscopia crioelectrónica). c) Estructura del canal TRPV determinado por microscopia electrónica.
FUENTE: a) De G Feher, JP Allen, MY Okamura, DC Rees. Ature 339:113, © 1989; reimpreso con permiso de Macmillan Publishers Ltd; b, c) De
Maofu Liao et al. Nature 2013;504:107.
Pese al incremento en el éxito de la cristalización de proteínas y de los avances rápidos en microscopía crioelectrónica, los investigadores aún
dependen en gran medida de métodos indirectos para determinar la organización tridimensional de la mayor parte de las proteínas de membrana. En
los párrafos siguientes se examinan algunas de estas estrategias.
Identificación de dominios transmembrana
Puede aprenderse mucho sobre la estructura de una proteína de membrana y su orientación en la bicapa lipídica con un análisis computacional de su
secuencia de aminoácidos, que es fácil de deducir a partir de la secuencia de nucleótidos de un gen aislado. La primera pregunta que se formularía es:
¿qué segmentos de la cadena polipeptídica en realidad están sepultados en la bicapa lipídica? Los segmentos de la proteína incluidos dentro de la
membrana, que se describen como dominios transmembrana, tienen una estructura sencilla, consisten en una cadena con cerca de 20
aminoácidos de predominio no polar que cruzan el centro de la bicapa lipídica en forma de una hélice α.3 La figura 4–18 presenta la estructura
química de una sola hélice transmembrana, que muestra la estructura bidimensional de la glucoforina A, la principal proteína integral de la membrana
plasmática del eritrocito. De los 20 aminoácidos que conforman la hélice α de un monómero de glucoforina (aminoácidos 73 a 92 de la fig. 4–18),
todos, excepto tres, tienen cadenas laterales hidrófobas (o un átomo H en el caso de los residuos de glicina). Las excepciones son la serina y treonina,
que son residuos polares sin carga (fig. 2–26). La figura 4–19a muestra una parte de la hélice transmembrana con un residuo de treonina, similar a
los de la glucoforina A. El grupo hidroxilo de la cadena lateral del residuo puede formar un enlace de hidrógeno con uno de los átomos de oxígeno de
la columna peptídica. También puede haber residuos con carga completa en las hélices transmembrana, pero tienden a estar hacia uno de los
extremos de la hélice y acomodados de manera que les permita adaptarse en su ambiente hidrófobo. Esto se ilustra en las hélices transmembrana
modelo mostradas en las figuras 4–19b y c. Cada una de las hélices de estas figuras contiene un par de residuos cargados cuyas cadenas laterales son
capaces de interactuar con las regiones polares más internas de la membrana, aun cuando sea necesario distorsionar la hélice para hacerlo. La figura
4–19d presenta dos residuos de tirosina con sus cadenas laterales hidrófobas; cada anillo aromático está orientado paralelo a las cadenas de
hidrocarburo de la bicapa con la que se integró.
FIGURA 4–18
La glicoforina A, una proteína integral con un único dominio transmembrana. La única hélice α que pasa a través de la membrana consiste
de manera predominante en residuos hidrofóbicos. Los cuatro residuos de aminoácidos cargados positivamente del dominio citoplasmático de la
extremos de la hélice y acomodados de manera que les permita adaptarse en su ambiente hidrófobo. Esto se ilustra en las hélices transmembrana
modelo mostradas en las figuras 4–19b y c. Cada una de las hélices de estas figuras contiene un par de residuos cargados cuyas cadenas laterales son
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capaces de interactuar con las regiones polares más internas de la membrana, aun cuando sea necesario distorsionar la hélice para hacerlo. La figura
4–19d presenta dos residuos de tirosina con sus cadenas laterales hidrófobas; cada anillo aromático está orientado paralelo a las cadenas de
hidrocarburo de la bicapa con la que se integró.
FIGURA 4–18
La glicoforina A, una proteína integral con un único dominio transmembrana. La única hélice α que pasa a través de la membrana consiste
de manera predominante en residuos hidrofóbicos. Los cuatro residuos de aminoácidos cargados positivamente del dominio citoplasmático de la
proteína de membrana forman enlaces iónicos con grupos cabeza de lípidos cargados negativamente. Los carbohidratos están unidos a varios
residuos de aminoácidos en la superficie externa de la proteína (mostrado en el recuadro). Todos menos uno de los 16 oligosacáridos son pequeñas
cadenas con enlaces O (la excepción es un oligosacárido mayor unido al residuo de asparagina en la posición 26). Las moléculas de glicoforina están
presentes como homodímeros dentro de la membrana de eritrocitos (véase figura 4–32d). Las dos hélices del dímero se cruzan una sobre otra en la
región entre los residuos 79 y 83. Esta secuencia GlyXXXGly se encuentra por lo común donde las hélices transmembrana se acercan mucho.
FIGURA 4–19
La organización de varios residuos de aminoácidos dentro de las hélices transmembrana. a) En esta imagen de una pequeña porción de
una hélice transmembrana, el grupo hidroxilo de la cadena lateral de treonina (flecha) es capaz de formar un enlace de hidrógeno (compartido) con
un oxígeno de cadena principal dentro de la bicapa lipídica. Los enlaces de hidrógeno están indicados por las líneas punteadas y sus distancias se
muestran en angstroms. b) Las cadenas laterales de los dos residuos de lisina de esta hélice transmembrana son largas y flexibles, lo suficiente como
para formar enlaces con los grupos cabeza y las moléculas de agua de la cara polar de la bicapa lipídica. c) Las cadenas laterales de los dos residuos de
ácido aspártico de esta hélice transmembrana también pueden alcanzar la cara polar de la bicapa, pero introducen distorsión en la hélice al hacerlo.
d) Las cadenas laterales aromáticas de los dos residuos de tirosina de esta hélice transmembrana están orientadas perpendicularmente al eje de la
membrana, y paralelas a las cadenas de ácido graso con las que interactúan.
FUENTE: ad) de Anna CV Johansson y Erik Lindahl. Biophys J 2006;91:4459–4453, © 2006, reproducida con autorización de Elsevier.
Al conocer la secuencia de aminoácidos de una proteína integral de la membrana, casi siempre es posible identificar los segmentos transmembrana
mediante una gráfica de hidropatía, en la que se asigna un valor a cada sitio de un polipéptido que representa una medición del grado en que un
aminoácido es hidrófobo en ese sitio, así como la de sus vecinos. Esta estrategia proporciona un “promedio de dirección” de la hidrofobia de
secciones cortas del polipéptido y garantiza que uno o unos cuantos aminoácidos polares de la secuencia no alteren el perfil de todo el segmento. La
intensidad con que un aminoácido es hidrófobo puede determinarse con varios criterios, como su liposolubilidad o la energía que se necesitaría para
transferirlos de un medio lipídico a uno acuoso. La figura 4–20 muestra una gráfica de hidropatía para la glucoforina A. Los segmentos
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FUENTE: ad) de Anna CV Johansson y Erik Lindahl. Biophys J 2006;91:4459–4453, © 2006, reproducida con autorización de Elsevier.
Al conocer la secuencia de aminoácidos de una proteína integral de la membrana, casi siempre es posible identificar los segmentos transmembrana
mediante una gráfica de hidropatía, en la que se asigna un valor a cada sitio de un polipéptido que representa una medición del grado en que un
aminoácido es hidrófobo en ese sitio, así como la de sus vecinos. Esta estrategia proporciona un “promedio de dirección” de la hidrofobia de
secciones cortas del polipéptido y garantiza que uno o unos cuantos aminoácidos polares de la secuencia no alteren el perfil de todo el segmento. La
intensidad con que un aminoácido es hidrófobo puede determinarse con varios criterios, como su liposolubilidad o la energía que se necesitaría para
transferirlos de un medio lipídico a uno acuoso. La figura 4–20 muestra una gráfica de hidropatía para la glucoforina A. Los segmentos
transmembrana casi siempre se identifican como un pico separado que se extiende hasta el lado hidrófobo del espectro. Casi siempre puede hacerse
una predicción confiable sobre la orientación del segmento transmembrana dentro de la bicapa si se examinan los residuos de aminoácidos de los
flancos. En la mayor parte de los casos, como se ilustra con la glucoforina en la figura 4–18, las partes del polipéptido en el flanco citoplásmico de un
segmento transmembrana tienden a tener una carga positiva mayor que los del flanco extracelular.
FIGURA 4–20
Gráfico de hidropatía para la glicoforina A, una proteína simple que se extiende a lo largo de la membrana. La hidrofobicidad se mide
por la energía libre requerida para transferir cada segmento del polipéptido desde un disolvente no polar a un medio acuoso. Los valores por encima
de la línea 0 requieren energía (+ΔG), lo que indica cadenas laterales de predominio no polar. Los picos que se proyectan por encima de la línea roja
indican tramos continuos de aminoácidos en su mayoría no polares, y se interpretan como dominios transmembrana.
No todas las proteínas integrales de la membrana contienen hélices α transmembrana. Algunas contienen un conducto relativamente grande situado
dentro de un círculo de cadenas β que cruzan la membrana organizadas en un barril, como se ilustra en la figura 5–4. Hasta ahora, los conductos
acuosos construidos con barriles β sólo se han encontrado en las membranas externas de bacterias, mitocondrias y cloroplastos.
2Muchas proteínas integrales de membrana tienen una porción sustancial presente en el citoplasma o espacio extracelular. En muchos casos, esta
porción soluble se dividió de su dominio transmembrana, se cristalizó y se determinó su estructura terciaria. Aunque esta estrategia aporta datos
valiosos sobre la proteína, no brinda información sobre la orientación de la proteína dentro de la membrana.
3Ya se ha mencionado que la hélice α es una conformación favorecida porque permite la formación de un número máximo de enlaces hidrógeno entre
los residuos de aminoácidos vecinos, lo que crea una configuración muy estable (de baja energía). Esto es muy importante para el polipéptido que
atraviesa la membrana y está rodeado por cadenas grasas acilo, por lo que no puede formar enlaces de hidrógeno con un solvente acuoso. Las hélices
transmembrana tienen al menos 20 aminoácidos de largo porque ésta es la longitud mínima de un polipéptido capaz de atravesar el centro de
hidrocarburo de una bicapa lipídica de 30 Å de espesor. Se han encontrado unas cuantas proteínas de membrana que tienen asas o hélices que
penetran, pero no abarcan toda la bicapa. Un ejemplo es la hélice P de la figura 4–39.
Técnicas experimentales para identificar los cambios de conformación dentro de una proteína integral de
membrana
Supóngase que se aisló un gen para una proteína integral de la membrana y con base en su secuencia de nucleótidos, se determina que contiene 12
los residuos de aminoácidos vecinos, lo que crea una configuración muy estable (de baja energía). Esto es muy importante para el polipéptido que
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atraviesa la membrana y está rodeado por cadenas grasas acilo, por lo que no puede formar enlaces de hidrógeno con un solvente acuoso. Las hélices
transmembrana tienen al menos 20 aminoácidos de largo porque ésta es la longitud mínima de un polipéptido capaz de atravesar el centro de
hidrocarburo de una bicapa lipídica de 30 Å de espesor. Se han encontrado unas cuantas proteínas de membrana que tienen asas o hélices que
penetran, pero no abarcan toda la bicapa. Un ejemplo es la hélice P de la figura 4–39.
Técnicas experimentales para identificar los cambios de conformación dentro de una proteína integral de
membrana
Supóngase que se aisló un gen para una proteína integral de la membrana y con base en su secuencia de nucleótidos, se determina que contiene 12
aparentes hélices α que cruzan la membrana. Es posible que el lector se interese por conocer los sitios dentro de los dominios transmembrana que
son accesibles al entorno acuoso y cómo estos sitios cambian cuando la proteína desempeña su función. La información de ese tipo es
particularmente importante cuando se trabaja con un conducto o transportador de membrana que actúa en el desplazamiento de sustancias
hidrófobas a uno y otro lado de la membrana. Aunque estas determinaciones son difíciles de hacer sin modelos estructurales detallados, puede
obtenerse información considerable mediante la mutagénesis dirigida a un sitio, o sea, con la introducción de cambios específicos en el gen que
codifica la proteína (sección 18.25). En la figura 4–21 se muestra un experimento de este tipo realizado con la permeasa de lactosa, proteína
transportadora de azúcar en membranas de bacterias. En dicho experimento, los investigadores prepararon versiones diferentes de la permeasa, en
que fueron sustituidos todos los aminoácidos individuales de la proteína, uno cada vez y en su lugar se incluyó un residuo de cisteína. Más tarde, cada
proteína mutada de la membrana se incubó en un reactivo hidrosoluble (NEM) con una solución capaz de agregar un grupo alquilo a la cadena lateral
de cisteína, en la medida que tuviera acceso a dicha cadena lateral. Las incubaciones con NEM se realizaron en dos situaciones diferentes: en
presencia del azúcar por ser transportado o sin su presencia. La imagen de la figura 4–21a indica los residuos (señalados en la forma de esfera roja) de
la proteína que resultaron alquilados por NEM en ausencia del azúcar. Se piensa que muchos de tales residuos accesibles revisten una cavidad
hidrófila “interógrada”, es decir, que mira hacia dentro en la permeasa y que está abierta al citoplasma. Los residuos de cisteína que no estaban
marcados, en particular en las hélices VI y XII, posiblemente “quedan frente” a las cadenas grasas acilo de los fosfolípidos o están situadas en las
regiones muy apiñadas de la molécula de modo que se tornan inaccesibles a NEM.
La imagen en la figura 4–21b indica dichos residuos (señalados en la forma de esferas doradas) que presentan un incremento notable de reactividad a
NEM cuando se incuba la permeasa con el azúcar por transportar. La diferencia de reactividad de NEM de los residuos entre la proteína, en ausencia
del azúcar (a) y en presencia del mismo (b), denota que dos partes diferentes de la proteína se tornan accesibles al medio acuoso en las dos
situaciones comentadas. En otras palabras, los resultados sugieren que la adición del azúcar induce un cambio de conformación en la permeasa. El
análisis cuidadoso de las posiciones de los residuos que quedan “marcados” en estas dos configuraciones refuerza la posibilidad del modelo que se
presenta en la figura 4–21c. Según este modelo de “acceso alternante”, los sitios de unión con el azúcar quedan abiertos hacia el citoplasma de la
bacteria en una conformación y abiertos hacia el espacio extracelular en la otra. La alternancia de las dos conformaciones es la que induce el
transporte del azúcar a través de la membrana; este tipo de sistema de transporte impulsado por iones se detalla más adelante.
FIGURA 4–21
Un experimento que emplea mutagénesis dirigida al sitio para aprender sobre los cambios dinámicos en la conformación de una
proteína de membrana a medida que lleva a cabo su actividad. La estrategia práctica del experimento y sus resultados se discuten en el texto.
La superficie citoplásmica de la proteína (lactosa permeasa) está en la parte superior. a) Las esferas rojas indican los residuos de la proteína de
membrana que reaccionó con el agente alquilante NEM en ausencia de un azúcar para ser transportado. b) Las esferas doradas denotan los residuos
que son mucho más accesibles para el agente alquilante cuando la proteína se incuba con el azúcar. Las esferas doradas en b) se agrupan en una
porción de la proteína cerca del medio externo (el periplasma en las bacterias). Los autores concluyeron que las esferas doradas corresponden a
residuos que recubren una cavidad orientada hacia afuera, es decir, una que está abierta al medio externo. Los resultados apoyan un modelo de
acceso alterno al medio como se muestra en la parte c). (Nótese que la estructura que se representa en las partes ab) es de la conformación dirigida
hacia adentro, según lo determinado por la cristalografía de rayos X).
FUENTE: a, b) de H. Ronald Kaback, et al. PNAS 2007;104:492, © 2007 National Academy of Sciences, Estados Unidos; c) Reimpreso de Current
4.5 ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE LAS PROTEÍNAS INTEGRALES DE LA MEMBRANA,
Opinion in Structural Biology 2004;14:414, fig. 1 por HR Kaback, con permiso de Elsevier. Page 6 / 8
La determinación de las relaciones espaciales entre los aminoácidos de una proteína de membrana es otro método para conocer algunos de los
fenómenos dinámicos que ocurren cuando la proteína lleva a cabo su función. Una forma de aprender sobre la distancia entre residuos seleccionados
porción de la proteína cerca del medio externo (el periplasma en las bacterias). Los autores concluyeron que las esferas doradas corresponden a
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residuos que recubren una cavidad orientada hacia afuera, es decir, una que está abierta al medio externo. Los resultados apoyan un modelo de
acceso alterno al medio como se muestra en la parte c). (Nótese que la estructura que se representa en las partes ab) es de la conformación dirigida
hacia adentro, según lo determinado por la cristalografía de rayos X).
FUENTE: a, b) de H. Ronald Kaback, et al. PNAS 2007;104:492, © 2007 National Academy of Sciences, Estados Unidos; c) Reimpreso de Current
Opinion in Structural Biology 2004;14:414, fig. 1 por HR Kaback, con permiso de Elsevier.
La determinación de las relaciones espaciales entre los aminoácidos de una proteína de membrana es otro método para conocer algunos de los
fenómenos dinámicos que ocurren cuando la proteína lleva a cabo su función. Una forma de aprender sobre la distancia entre residuos seleccionados
de una proteína es introducir grupos químicos cuyas propiedades sean sensibles a la distancia que los separa. Los nitróxidos son grupos químicos
que contienen un electrón non, el cual produce un espectro característico cuando se vigila con una técnica llamada espectroscopia por resonancia
paramagnética electrónica (EPR; electron paramagnetic resonance spectroscopy). Es posible introducir un grupo nitróxido en cualquier sitio de una
proteína mediante mutación de ese sitio a una cisteína para luego unir el nitróxido al grupo —SH del residuo de cisteína. La figura 4–22 muestra
cómo se usó esta técnica para descubrir los cambios en la conformación de una proteína de membrana cuando su canal se abre como respuesta a los
cambios en el pH del medio. La proteína en cuestión, un canal bacteriano para K+, es un tetrámero compuesto por cuatro subunidades idénticas. La
abertura citoplásmica al canal está delimitada por cuatro hélices transmembrana, una de cada subunidad de la proteína. La figura 4–22a muestra los
espectros EPR que se obtuvieron cuando se introdujo un nitróxido cerca del extremo citoplásmico de cada hélice transmembrana. La línea roja indica
el espectro obtenido en un pH de 6.5, cuando el canal está cerrado y la línea azul muestra el espectro con el pH de 3.5, cuando el conducto está abierto.
La forma de cada línea depende de la proximidad de los nitróxidos entre sí. El espectro es más ancho en el pH 6.5 porque los grupos nitróxido de las
cuatro subunidades están más próximos en este pH, lo cual disminuye la intensidad de sus señales EPR. Estos resultados indican que la activación del
canal se acompaña de un aumento en la separación de los residuos marcados de las cuatro subunidades (fig. 4–22b). El aumento en el diámetro de la
abertura del conducto permite que los iones del citoplasma lleguen a la vía permeable real (mostrada en rojo) dentro del canal, el cual sólo admite el
paso de iones K+ (explicado antes). La figura 18–8 muestra una técnica alternativa llamada FRET que también puede usarse para medir cambios en la
distancia entre grupos marcados de una proteína. Como se mencionó en el capítulo 2, la espectroscopia por NMR es otra técnica que proporciona
información sobre las distancias entre átomos en una estructura proteínica; en fecha reciente la NMR se ha vuelto el método preferido para estudiar la
dinámica de las proteínas de membrana.
FIGURA 4–22
Uso de la espectroscopia EPR para registrar los cambios en la conformación de un canal de iones K+ bacteriano a medida que se
abre y se cierra. a) Espectros EPR de nitróxidos que se han unido a residuos de cisteína cerca del extremo citoplásmico de las cuatro hélices
transmembrana que recubren el canal. El residuo de cisteína en cada hélice reemplaza un residuo de glicina que normalmente está en esa posición.
Las formas de los espectros dependen de las distancias entre electrones no pareados en los nitróxidos en las diferentes subunidades. (Los nitróxidos
se describen como “etiquetas de espín”, y esta técnica se conoce como etiquetado de espín dirigido al sitio). b) Un modelo altamente esquemático del
canal de iones en los estados abierto y cerrado con base en los datos de la parte a). La apertura del canal va acompañada del movimiento de los cuatro
grupos de nitróxido separados uno del otro.
FUENTE: a) Reimpreso con permiso de Macmillan Publishers Ltd: de E Perozo, et al. Nature Struct Biol 1998;5:468.
Las formas de los espectros dependen de las distancias entre electrones no pareados en los nitróxidos en las diferentes subunidades. (Los nitróxidos
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se describen como “etiquetas de espín”, y esta técnica se conoce como etiquetado de espín dirigido al sitio). b) Un modelo altamente esquemático del
canal de iones en los estados abierto y cerrado con base en los datos de la parte a). La apertura del canal va acompañada del movimiento de los cuatro
grupos de nitróxido separados uno del otro.
FUENTE: a) Reimpreso con permiso de Macmillan Publishers Ltd: de E Perozo, et al. Nature Struct Biol 1998;5:468.
REVISIÓN
1. ¿Por qué son necesarios los detergentes para solubilizar las proteínas de la membrana? ¿Cómo podría determinarse la diversidad de las
proteínas integrales en una fracción purificada de membrana?
2. ¿Cómo pueden determinarse: 1) la localización de segmentos transmembrana en la secuencia de aminoácidos o 2) la localización relativa de las
hélices transmembrana con acceso al medio externo?

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