BACTERIAS DE

CRECIMIENTO DIFICIL
UNIDAD 1
• Las bacterias de crecimiento difícil o lento son
aquellas que necesitan mayor tiempo y
nutrientes especiales para su aislamiento.
• Entre los principales géneros tenemos a:
• Género Haemophilus
• Género Francisella
• Género Brucella
• Género Bordetella
• Género Pasteurella
• Género Kingella
GÉNERO HAEMOPHILUS
 CARACTERÍSTICAS GENERALES
• Este es un grupo de pequeñas
bacterias pleomórficas
gramnegativas que necesitan
medios enriquecidos, por lo
general que contengan sangre o
sus derivados, para su aislamiento.
– Haemophilus influenzae es un
patógeno importante para el ser
humano.
– H. ducrey, un patógeno de
transmisión sexual que causa el
chancroide.
 CARACTERÍSTICAS GENERALES
• Algunas especies de Haemophilus necesitan
factor X, que no es una sustancia única, sino
un grupo de compuestos tetrapirrólicos
termoestables provistos por varios pigmentos
que contienen hierro (por ej. Hemina,
hematina, protoporfirina IX)
 CARACTERÍSTICAS GENERALES
• La mayoría de las especies de Haemophilus
necesitan también factor V (NAD).
• Tanto el factor X como el V se hallan dentro de
los eritrocitos, incluidos los eritrocitos de
carnero.
• En consecuencia los hemófilos dependientes
del factor V no crecen en agar sangre de
carnero en el cual los eritrocitos están
intactos.
 CARACTERÍSTICAS GENERALES
• Cuando se prepara el agar
chocolate se produce la
liberación de los factores V y
X.
• Aún cuando la mayoría de las
especies de Haemophilus son
incapaces de crecer en agar
sangre de carnero, se pueden
observar colonias pequeñas
que crecen alrededor de
colonias de otros
microorganismos hemolíticos
en cultivos mixtos (por ejs.
Staphylococcus aureus).
 CARACTERÍSTICAS GENERALES
• La lisis de los eritrocitos libera factor X, mientras
que el factor V es sintetizado y provisto a los
hemófilos por los estafilococos propiamente
dichos.
• Aunque la mayoría de los laboratorios utilizan
agar chocolate para el cultivo de Haemophilus a
partir de muestras clínicas, estos también crecen
en agar con 5% de sangre de caballo o de conejo.
La hemólisis observada en estos medios es útil
para la identificación de especies.
 GÉNEROS Y ESPECIES
• Haemophilus influenzae
• Haemophilus influenzae biogrupo aegyptius
• Haemophilus ducrey
• Otras especies de haemophilus
– H. parainfluenzae
– H. parahaemolyticus
– H. aphrophilus
– H. haemolyticus
– H. segnis
– H. paraphrophilus
 EPIDEMIOLOGÍA
• Todas las especies de Haemophilus son
habitantes normales de las vías respiratorias
superiores de los seres humanos con la
excepción de H. ducrey que es un
microorganismo que solo se encuentra en
seres humanos pero no forma parte de la flora
normal de las personas y su presencia en
muestras clínicas indica infección.
 EPIDEMIOLOGÍA
• Las cepas de H. influenzae pertenecen a dos amplias
categorías: tipificables y no tipificables. Se tipifican
sobre la base de las características capsulares.
– Las cepas encapsuladas son 6: de tipo a,b,c,d,e y f.
• H. influenzae de tipo b es el agente causal más común
de las infecciones graves en los seres humanos.
• Las cepas no tipificables no producen cápsula y se las
encuentra con mayor frecuencia como habitantes
normales de las vías respiratorias superiores.
 HAEMOPHILUS INFLUENZAE
• H. influenzae es un bacilo gramnegativo
pleomórfico. Tiene una cápsula polisacárida,
para su crecimiento requiere los dos factores
que se hallan en la sangre X y V por lo que
debe cultivarse en agar chocolate.
 PATOLOGÍA
• El hábitat natural de H. influenzae, (orofaringe) de
las personas sanas, transmitiéndose por vía aérea
(gotitas de saliva) y ocasionalmente produce
enfermedad. Causa dos tipos de infección; la
invasiva o sistémica y las no invasivas. Estas
infecciones son más frecuentes en los niños entre
6 meses y 6 años.
• En las formas invasivas el microorganismo
atraviesa la mucosa faríngea llegando a la sangre,
produce bacteriemia y puede alcanzar las
meninges causando meningitis.
 PATOLOGÍA
• En niños y ancianos también puede producir
neumonía por vía aérea.
• Una forma muy grave de infección en los niños de
2 a 4 años de edad es la epiglotitis, que puede
causar la muerte por asfixia.
• Los otros serotipos de H. Influenzae diferentes
del b y no capsulados son menos virulentas.
• La cápsula y varias adhesinas son consideradas
factores de virulencia. La cápsula le permite
evadir la fagocitosis.
ENFERMEDAD ESPECIES MUESTRAS PARA MANIFESTACIONES
CULTIVO CLÍNICAS
Meningitis H. Influenzae tipo b LCR, sangre Cefalea, rigidez de
nuca
epiglotitis H. Influenzae tipo b Sangre, secreciones Disfagia,
laríngeas obstrucción vías
respiratorias altas,
epiglotis roja
Otitis media H. Influenzae Hisopado en Dolor y opresión en
(habitualmente secreción de los oídos
cepas no conducto auditivo
tipificables)
faringitis H. Influenzae tipo b Hisopado faríngeo, Mucosas inflamadas
secreciones con tumefacción y
laríngeas exudados amarillos

bronquitis H. Influenzae ( Esputo Tos persistente y no

habitualmente productiva,
cepas no sibilancias y disnea
tipificables)
ENFERMEDAD ESPECIES MUESTRAS PARA MANIFESTACIONES
CULTIVO CLÍNICAS

conjuntivitis H. Influenzae Hisopado Secreción

biogrupo aegyptius conjuntival conjuntival
mucopurulenta

Fiebre purpúrica H. Influenzae Sangre, hisopados Fiebre, dolor

brasilera biogrupo aegyptius conjuntivales, abdominal con
lesiones cutáneas, vómitos, petequias
orofaringe y lesiones cutáneas
hemorrágicas.

chancroide H. ducrey Hisopados Lesiones genitales

obtenidos de dolorosas y
úlceras genitales ulcerativas
 MUESTRAS
• Las muestras comprenden esputo y otros tipos
de material de vías respiratorias, pus, sangre y
LCR para frotis y cultivos según el origen de la
infección.
 DIAGNÓSTICO
• El diagnóstico de las infecciones por H.
influenzae se hace mediante examen
microscópico y cultivo de la muestra obtenida
del foco de infección (esputo, LCR , sangre)
 EXAMEN DIRECTO – TINCIÓN DE
GRAM
• Aparecen como pequeños
cocobacilos gramnegativos de
tinción pálida.
• Los microorganismos no pueden
ser identificados sólo a partir de
frotis teñidos por tinción de
Gram, incluso una tinción de
Gram negativa no descarta la
posibilidad de infección por
Haemophilus porque se pueden
presentar muy pocos
microorganismo en la muestra.
 CULTIVOS
• Como estos microorganismos tienen
requerimientos nutricionales especiales, las
muestras que los contienen no deben ser
expuestas a la desecación ni a temperaturas
extremas.
• Las muestras como LCR deben ser
transportadas hasta el laboratorio clínico lo
antes posible.
 CULTIVOS
• El agar sangre de carnero convencional no es
apropiado para el cultivo de Haemophilus que
requieren factor V para el crecimiento debido a
que la sangre ovina contienen naturalmente
enzimas que inactivan el factor V.
• La sangre de conejo o de caballo no contiene
estas enzimas y los medios de agar que contienen
algunos de estos productos hemáticos apoya el
crecimiento de la mayoría de las especies de
Haemophilus.
 CULTIVOS
• Cualquiera sea el medio utilizado el
aislamiento de Haemophilus requiere la
incubación a 35 a 37 oC en un medio
ambiente húmedo con CO2 (3 a 5%).
• El aislamiento primario se logra utilizando
agar chocolate, agar para aislamiento de
Haemophilus o la técnica de siembra en estría
para estafilococos.
 CULTIVOS
• La desventaja de utilizar ACH es que el medio
no permite la determinación de las
propiedades hemolíticas, lo que ayuda a
diferenciar H. haemolyticus y H,
parahaemolyticus de H. influenzae y H.
parainfluenzae
 TECNICA DE SIEMBRA EN ESTRIA
PARA ESTAFILOCOCOS
• Muchas bacterias y levaduras
sintetizan y secretan NAD
durante el crecimiento en
medios bacteriológicos.
• En cultivos mixtos, las especies
de Haemophilus que requieren
factor V pueden crecer como
colonias puntiformes alrededor
de las colonias de estos otros
microorganismos. Este
fenómeno se denomina
SATELITISMO
 TECNICA DE SIEMBRA EN ESTRIA
PARA ESTAFILOCOCOS
• Una colonia de una especie de Haemophilus
posible es subcultivada en una placa de agar
sangre de carnero y se siembra en estría como
un césped. Utilizando un alambre inoculador
se hace una única siembra en estría de un
microorganismo productor de NAD, como S.
aureus, atraves del inoculo del posible
Haemophilus
 TECNICA DE SIEMBRA EN ESTRIA
PARA ESTAFILOCOCOS
• Después del crecimiento durante
toda la noche en un
medioambiente enriquecido con
CO2 a 35 a 37 oC pueden
observarse colonias grises,
húmedas pequeñas de los
hemófilos dentro del área
hemolítica adyacente al
crecimiento de los estafilococos.
• Los hemofilos dependientes da el
factor X también crecen como
colonias satélites porque se
liberan hemina y hematina de los
eritrocitos lisados por la acción de
las hemolisinas estafilocócicas
 TECNICA DE SIEMBRA EN ESTRIA
PARA ESTAFILOCOCOS
• Este método se puede utilizar para la
identificación presuntiva de especies de
Haemophilus cuando no se requiere ni es
esencial la identificación de especies
 ENFOQUE PARA LA IDENTIFICACIÓN
DE ESPECIES
• Los criterios tradicionales de identificación son
hemólisis en agar sangre de caballo o conejo y el
requerimiento de los factores de crecimiento X ,
V o ambos.
• Para establecer los factores de crecimiento X y V
se colocan discos impregnados con cada factor
sobre un medio suplementado, por lo común
agar Mueller Hinton o agar tripticasa y soja que
fue inoculado con una suspensión liviana del
microorganismo.
 ENFOQUE PARA LA IDENTIFICACIÓN
DE ESPECIE
• Después de una noche
de incubación a 35 oC en
aerobiosis se examina la
placa para determinar el
crecimiento alrededor de
cada disco.
• Muchos
microorganismos que
requieren factor X
pueden traspasar
suficiente factor del
medio primario para dar
resultados falsos
negativos
 ENFOQUE PARA LA IDENTIFICACIÓN
DE ESPECIE
• Es decir que el crecimiento se produce a una
distancia determinada del disco X, que es un
indicio falso de que el microorganismo no
requiere el factor X.
• La prueba de porfirina es otro modo de
establecer los requerimientos de factor X por
un microorganismo y elimina el problema de
la transferencia a partir del medio primario.
ESPECIE REQUERI REQUERI CO2 HEMÓLISIS
MIENTO MIENTO
X V

H. Influenzae ₊ + ₊ -

H. Haemolyticus ₊ ₊ - ₊

H. Ducrey ₊ - - -

H. Parainfluenzae - ₊ V -

H. Parahemolyticus - ₊ - ₊

H. Segnis - ₊ - -

H. Paraphrophilus - ₊ - -

H. aphrophilus - - - -
DETECCIÓN DEL ANTÍGENO CAPSULAR
TIPO b
• Para el diagnostico rápido
de las infecciones por H.
influenzae tipo b, existen
técnicas inmunológicas
para la detección del
antígeno capsular tipo b
en LCR, suero y orina.
• H. influenzae encapsulado
puede ser tipificado por
aglutinación en laminillas,
coaglutinación con
estafilococos o
aglutinación de partículas
de látex recubiertas de Ac
con especificidad de tipo.
 TRATAMIENTO Y PROFILAXIS
• H. influenzae es naturalmente sensible a los
betalactámicos (ampicilina, cefotaxima y
ceftriazona), al cotrimoxasol y a las
fluoroquinolonas (ciprofloxacina y levofloxacina).
La resistencia adquirida a la ampicilina por
producción de betalactamasa es elevada.
• Existe una vacuna conjugada muy eficaz que ha
disminuido la incidencia de esta enfermedad en
los países en los que se administra.
 HAEMOPHILUS DUCREY
• H. ducrey requiere factor X para
crecer, por ello y por su semejanza
morfológica a los hemófilos se ha
clasificado en este género.
• Causa una enfermedad de
transmisión sexual, el chancroide o
chancro blando. Se caracteriza por
la aparición en los genitales o en la
región perianal de una pápula
eritematosa que se ulcera, es
dolorosa y da lugar a una
linfadenomegalia satélite. El
período de incubación es de 5 a 7
días y las lesiones se observan con
más frecuencia en los varones.
 DIAGNÓSTICO
• La tinción de gram y el cultivo son muy poco
sensibles.
• La muestra clínica es el exudado de la úlcera o de
un aspirado ganglionar. Proliferan mejor si se
usan raspaduras de la base de la úlcera.
• Debido a las complejas exigencias nutricionales
de esta bacteria, la muestra debe sembrarse en:
– agar chocolate con suero bovino fetal y vancomicina,
– incubado a 33 oC en atmósfera hipercápnica (5% de
CO2),
– durante 7 a 10 días.
 DIAGNÓSTICO
• H. ducrey requiere medios especiales para su
crecimiento. Dos de estos medios son agar
chocolate sobre una base de Mueller Hinton,
suplementado con IsoVitaleX al 1% y 3 ug/ml
de vancomicina.
• La vancomicina sirve para inhibir los
microorganismos Gram positivos que
colonizan de manera habitual el aparato
genital.
 ASPECTO DE LAS COLONIAS
• Las colonias de las cepas no capsuladas de H.
influenzae son pequeñas, lisas y traslúcidas a las
24 h.
• Las cepas capsuladas forman colonias más
grandes, más mucosas, con olor a madriguera de
ratón, no son hemolíticas en agar sangre de
conejo o caballo.
• Las colonias de H. haemolitycus, se asemejan a
las colonias de H. influenzae, excepto porque es
betahemolítico en agar sangre de conejo o
caballo.
 ASPECTO DE LAS COLONIAS
• Las colonias de H. ducrey son pequeña, plana,
lisa y traslúcida a opaca a las 48-72 h; las
colonias pueden extraerse completas de la
superficie del agar.
• Todas en agar chocolate excepto H. ducrey
que utiliza un medio selectivo.
 DIAGNÓSTICO
• Las técnicas de amplificación genética (PCR) se
están introduciendo para el diagnóstico de
esta infección por su mayor sensibilidad.
 TRATAMIENTO
• No se obtiene inmunidad permanente contra
la infección por chancroide.
• El tratamiento recomendado por el CDC, es 1g
de azitromicina por vía oral.
• Otros incluyen ceftriaxona intramuscular,
ciprofloxacina o eritromicina orales;
generalmente la persona cura en dos
semanas.
 PREVENCIÓN
• Para H. influenzae tipo b hay varias vacunas
que presentan conjugados de proteína-
polisacáridos de dosis múltiple.
• Estas vacunas redujeron de manera sustancial
la incidencia de infecciones graves causadas
por los microorganismos del tipo b y se
recomienda con firmeza la vacunación de los
niños a partir de los 2 meses de edad.
 PREVENCIÓN
• Se recomienda quimioprofilaxis con
rifampicina para todos los contactos del hogar
de casos índice de meningitis por H. influenzae
tipo b en los que hay por lo menos un
contacto menor de 4 años no vacunado.
GENERO FRANCISELLA
 CARACTERISTICAS GENERALES
• Los miembros del género Francisella son
cocobacilos intracelulares facultativos
gramnegativos y aerobios estrictos que se
tiñen débilmente y carecen de movilidad.
 ESPECIES
• En la actualidad, el género Francisella incluye
4 especies:
– F. tularensis,
– F. philomiragia,
– F. noatunensis y
– F. hispaniensis.
• F. tularensis se divide en cuatro subespecies:
– subespecie tularensis (tipo A),
– subespecie holarctica (tipo B),
– subespecie mediasiatica y
– subespecie novicida.
 ESPECIES
• Las 4 subespecies de F. tularensis pueden
causar tularemia, aunque difieren en su
virulencia para humanos y conejos.
• La subespecie tularensis tiene relación con
garrapatas y conejos y es virulenta en estos y
en los humanos. Este grupo biológico se
caracteriza fenotípicamente por la
producción de ácido a partir de glicerol y
porque posee citrulina ureidasa.
 ESPECIES
• F. tularensis subespecie holarctica, se
relaciona con la infección transmitida por el
agua; en vectores roedores, garrapatas y
mosquitos; y es de virulencia intermedia en
humanos y mínima en conejos.
• La subespecie holarctica es glicerol negativa y
no suele producir citrulina ureidasa.
 EPIDEMIOLOGIA Y PATOGENIA
• Francisella tularensis es el agente de la
tularemia de los seres humanos y los animales.
Esta bacteria es un bacilo corto, pleomórfico,
gramnegativo, de 0,2 a 0,7 µm x 0,2 µm y de
localización intracelular, fastidioso desde el
punto de vista de cultivo por crecer lentamente
en forma de colonias pequeñas y de requerir
medios de agar sangre con glucosa y cisteína.
• Con una distribución mundial, F. tularensis, es
transmitida al ser humano por:
– artrópodos y moscas que pican,
– por el contacto directo con el tejido de animal
infectado,
– la inhalación de aerosoles o
– la ingestión de alimentos o agua contaminados.
– Por mordedura de carnívoros que a su vez
comieron animales infectados.
 EPIDEMIOLOGIA Y PATOGENIA

• Este microorganismo es capaz de sobrevivir

fuera de un hospedador durante semanas, en
el agua más de tres meses a temperaturas de
13 - 15⁰C, y de persistir en cadáveres de
animales hasta 4 meses dependiendo de la
temperatura ambiental.
 PATOGENICIDAD
• F. tularensis, debe gran parte de su patogenicidad a su capacidad
para sobrevivir en el interior de macrófagos. Es probable que su
resistencia a la muerte intracelular se deba a su superóxido
dismutasa.
• Una vez que los macrófagos se activan, los microorganismos
mueren a causa del oxido nitroso intraleucocitario.
• Una respuesta neutrofílica local contrarresta la infección por este
microorganismo en su etapa inicial, pero no logra contener su
progreso.
 PATOGENICIDAD
• La respuesta neutrofílica forma una úlcera
cutánea localizada que después se transforma
en una lesión cicatrizal cuando los neutrófilos
son reemplazados por macrófagos.
• Posteriormente los microorganismos se
diseminan a distancia, donde forman
granulomas.
• Los microorganismos tienden acumularse en el
tejido linfoide y los pacientes muestran
esplenomegalia y bubones. La tularemia puede
confundirse con la peste cuando se observan
bubones.
 PATOGENICIDAD
• La capsula de F. tularensis es un componente
necesario para la expresión completa de la
virulencia que permite evitar la destrucción
inmediata por los neutrófilos
polimorfonucleares.
 CICLO BIOLÓGICO
• El ciclo biológico de este
microorganismo implica un
hospedador intermediario
que actúa como vector de
transmisión, generalmente
garrapatas y moscas
(tábanos), aunque se han
encontrado algunos casos
atribuidos a mosquitos, así
como un hospedador
definitivo donde se
multiplica.
 CICLO BIOLÓGICO
• Una vez en el hospedador definitivo,
Francisella tularensis infecta
principalmente a los macrófagos,
aunque tiene la capacidad de
infectar todos los tipos de células.
• Su entrada en el macrófago se
produce por fagocitosis y la bacteria
se encontraría en el interior de la
célula infectada en el fagosoma.
Posteriormente sale del fagosoma al
citoplasma, donde prolifera
rápidamente. Con el tiempo la célula
infectada sufre la apoptosis y las
bacterias son liberadas para iniciar la
infección de nuevas células.
 Espectro clínico de tularemia
• Las manifestaciones clínicas de la tularemia
dependen de:
– la vía de adquisición del microorganismo, La
transmisión de F. tularensis puede ocurrir por dos
vías: por la picadura de un artrópodo (tábanos o
garrapatas) o contacto directo con animales
infectados que provocan la forma ulceroglandular,
o por inhalación de polvo contaminado causante
de la forma respiratoria neumónica,
potencialmente fatal. Otras vías la orofaríngea,
conjuntival o cutánea.

– las subespecies bacterianas involucradas,

– la virulencia innata de la cepa infectante,
– la inmunocompetencia del hospedero y
– el grado de afección de órganos, aparatos y
sistemas.
 Espectro clínico de tularemia
• Después de la infección, hay un periodo de incubación
desde unas cuantas horas hasta 3 – 5 días, fiebre,
escalofríos , malestar general, cefalea, faringitis, a
veces diarrea, rigidez articular, dolor muscular, úlceras
en la piel, dificultad respiratoria, sudoración y pérdida
de peso. Algunas de las complicaciones incluyen
osteomielitis, pericarditis, meningitis y neumonía.
• Es probable que la fiebre aparezca y desaparezca, pero
por lo general se mantiene durante 4-5 semanas en
ausencia de tratamiento, durante este periodo se
observa disminución de peso, linfadenopatias y
enfermedad crónica.
• La inhalación de un
aerosol infeccioso
produce inflamación
peribronquial y
neumonitis
circunscrita (tularemia
neumónica).
• La tularemia
oculoganglionar
puede presentarse
cuando un dedo
infectado o una gotita
tocan la conjuntiva.
 PRUEBAS RECOMENDADAS PARA EL
DIAGNÓSTICO
• El diagnóstico de tularemia puede establecerse por: • Los cultivos tienden a evitarse por el riesgo de
• cultivo de la bacteria causal, infección en el laboratorio (se considera un
• por detección de anticuerpos (ELISA), o
patógeno de clase 3), además de por las
• por métodos de diagnóstico molecular (PCR).
dificultades de cultivo al ser una bacteria de
• El aislamiento en cultivo es dificultoso por crecer lentamente en forma de
crecimiento fastidioso y lento.
colonias pequeñas y requerir medios de agar sangre con glucosa, cisteína y
• La detección de anticuerpos suele ser el método
una fuente de hierro. También se ha podido cultivar en medios de agar
más utilizado por ser el más accesible a muchos
chocolate, medio de Thayer Martin, agar extracto levadura-cisteína, o en
medios líquidos de frascos de hemocultivos. F. tularensis puede detectarse laboratorios cuando se utilizan antígenos

en los sistemas de hemocultivo comerciales en el curso de 2 a 5 días. comercializados. Sin embargo tropieza con el

• Los medios se deben incubar en CO2 a una temperatura de 35 a 37 oC, inconveniente de que los anticuerpos no son

durante dos a cinco días. detectables antes de las 2 semanas o más de la

• No crece en agar Mac Conkey. infección.

• Es un patógeno intracelular facultativo.

 RECOLECCIÓN, TRANSPORTE Y
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA
• Se puede aislar F. tularensis de úlceras
primarias, aspirados y biopsias de ganglios
linfáticos, esputo, médula ósea y biopsias
tisulares (por ejs hígado, bazo).
• Las muestras deberán mantenerse a 4 – 8 oC
hasta su procesamiento.
• Se pueden colocar en un medio de transporte
Amies con carbón vegetal o en un medio de
Stuart a temp. Ambiente.
 CULTIVOS
• Estos microorganismos de crecimiento lento
requieren 2 a 4 días para la formación máxima
de la colonia y son catalasa positivos débil y
oxidasa negativos.
 CULTIVOS
• F. philomiragia difiere desde el punto de vista
bioquímico de F. tularensis; es oxidasa positiva
y la mayoría de las cepas produce sulfuro de
hidrógeno en el medio con agar con triple de
azúcar y hierro, hidroliza la gelatina y crece en
presencia de cloruro de sodio al 6% (ninguna
cepa de F. tularensis comparte estas
características)
 CULTIVOS
• Algunas cepas pueden requerir hasta 2
semanas para desarrollar colonias visibles.
• F. philomiragia tiene menos necesidades
especiales de cultivo que F. tularensis y
aunque no requiere cisteína ni cistina para su
aislamiento se asemeja a F. tularensis en que
es un bacilo cocobacilar pequeño que crece de
manera deficiente o no crece en agar de Mac
Conckey.
 CULTIVOS
• Las colonias son
transparentes, mucoides
y se emulsionan con
facilidad.
• Si bien fermentan los
hidratos de carbono, los
aislamientos deben
identificarse por
métodos serológicos
(aglutinación) o por una
tinción con anticuerpos
fluorescentes.
MÉTODOS DE DETECCIÓN DIRECTA
• La coloración de Gram en el
material clínico es de poca
utilidad. Dado que se tiñen mal
con la tinción de Gram, se puede
utilizar la tinción con naranja de
acridina para visualizar de un
frasco de hemocultivo positivo.

• En el comercio existen métodos de

tinción con anticuerpos
fluorescentes para la detección
directa del microorganismo en
extendidos de la lesión, pero la
recomendación es que estos
procedimientos se realicen en los
laboratorios de referencia.
MÉTODOS DE DETECCIÓN DIRECTA
• Se desarrollan pruebas
de reacción en cadena
de la polimerasa (PCR)
para detectar F.
tularensis en forma
directa en las muestras
clínicas.
• En un estudio reciente,
la PCR fue más sensible
que los cultivos para
determinar la presencia
de F. tularensis en
muestras de heridas.
MÉTODOS DE DETECCIÓN DIRECTA
• Es importante recordar que varios pacientes
con sospecha clínica de tularemia con
serología y cultivos negativos pudo detectarse
DNA por PCR.
 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS Y TRATAMIENTO
• No hay pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos estandarizadas para las
especies Francisella.
• El tratamiento con estreptomicina o
gentamicina por un periodo de 10 días casi
siempre produce mejoría rápida.
 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS
ANTIMICROBIANOS Y TRATAMIENTO
• La tetraciclina también es eficaz, pero son más
frecuentes las recaídas. Otros fármacos a los
que se puede recurrir son cloranfenicol y
ciprofloxacino. F. tularensis es resistente a
todos los antibióticos betalactámicos, como
consecuencia de la producción de
betalactamasa.
 RECOMENDACIONES
• La manipulación de todas las muestras clínicas, es
muy importante para prevenir la adquisición de F.
tularensis por aerosoles.
• Se recomiendan que las muestras se envíen a
laboratorios de referencia estatales o a otros
laboratorios que estén equipados para la
manipulación de Francisella.
• Las personas con exposición confirmada en el
laboratorio deben tratarse de manera
profiláctica.
GÉNERO BRUCELLA
 CARACTERÍSTICAS GENERALES
• Son:
• bacilos cortos o cocobacilos
gramnegativos que se colorean mal
con la coloración convencional de
Gram,
• inmóviles ,
• aerobios y
• no formadores de esporas.
• Muchos aislamientos requieren
el agregado de CO2 para su
desarrollo, en especial en el
aislamiento primario.
• Las brucelas son parásitos obligados de
animales y seres humanos y es característico
que se localicen en el interior de la célula.
 ESPECIES
• Se reconocen distintas especies, algunas de ellas
afectan a animales terrestres:
– B. abortus,
– B. melitensis,
– B. suis,
– B. ovis,
– B. canis,
– B. neotomae y
– B. microti
• Otras a mamíferos marinos
– B. ceti y
– B. pinnipedialis
 ESPECIES
– Brucella abortus, biovar 1-6 y 9;
– B. melitensis, biovar 1-3;
– B. suis, biovar 1,3-5 y
– B. canis
• Son patógenas en humanos.
 RESERVORIOS
• El reservorio lo constituyen especies domésticas de:
• ganado vacuno,
• porcino,
• caprino y
• ovino.
• También pueden afectar a camélidos americanos,
alces, algunas especies de ciervos y de animales
silvestres (liebre, zorro, comadreja etc.).
• B. canis constituye un problema ocasional en perros de
criadero y domiciliarios, mientras que en los perros
vagabundos la seroprevalencia puede llegar al 20%.
 VÍAS DE TRANSMISIÓN
– Por vía transplacentaria,
– por la ingestión de leche materna o
– por la exposición a sangre, orina o las heces de la
madre infectada durante el parto.
• Período de transmisibilidad Los animales
infectados pueden eliminar Brucella spp.
durante toda la vida y son el reservorio y la
principal fuente de contagio para el ser
humano.
 EPIDEMIOLOGÍA
• La brucelosis es una zoonosis, de
distribución mundial; su
presentación en humanos está
relacionada íntimamente con la
enfermedad en animales
domésticos.
• La enfermedad se asocia más
frecuentemente al sexo
masculino, entre los 30 y 40
años y en población rural, así
como en veterinarios,
laboratoristas, trabajadores de
frigoríficos y peones de campo.
 EPIDEMIOLOGÍA
• Presenta dos patrones epidemiológicos:
– patrón urbano-alimentario, por consumo de
leche y quesos no pasteurizados.
– patrón rural-laboral, por exposición profesional al
ganado infectado o sus productos, sea por
contacto o inhalación. En este caso tiene una
cierta tendencia estacional, generalmente ocurre
en primavera y verano, que es el período de
reproducción de los animales.
 EPIDEMIOLOGÍA
• Brucella spp tiene afinidad por los
tejidos de los órganos
reproductivos, en consecuencia
los mamíferos sexualmente
maduros o en estado de preñez
son más susceptibles a la
infección. Los animales infectados
eliminan las bacterias después de
un aborto o de un parto, así como
a través de la leche, secreciones
vaginales, semen, sangre, orina y
heces, contaminando pastos,
agua y el medio ambiente.
 EPIDEMIOLOGÍA
• De esta forma se completa el ciclo infeccioso,
asegurando la contaminación de otros animales y
la persistencia del germen en la naturaleza.
• En el ambiente, pueden sobrevivir y mantener la
capacidad infectante durante períodos variables
de acuerdo con las condiciones del medio en el
que sean eliminadas. Sobrevive muy bien a bajas
temperaturas y humedad, pero se inactiva a 60
⁰C.
 EPIDEMIOLOGÍA
• Las placentas y las membranas fetales de
ganado bovino, cerdos, ovejas y cabras
contienen eritritol, un factor de crecimiento
para las brucelas. La proliferación de
microorganismos en animales preñados
desencadena placentitis y aborto en estas
especies. En placentas humanas no hay
eritritol, por ello el aborto no es parte de la
infección por Brucella.
 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
• El cuadro clínico, la gravedad y la evolución de la infección
varían en función de la especie de Brucella infectante, de la
concentración del inóculo y del estado del paciente.

• El período de incubación en los humanos se estima que

podría ser de 1 a 3 semanas, pero puede llegar a varios
meses. Luego del periodo de incubación, la infección puede
evolucionar con diferentes formas clínicas:
• asintomática o subclínica,
• aguda con un comienzo brusco o insidioso,
• crónica.
La enfermedad puede durar días, meses o años si no se trata
adecuadamente
 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
• El inicio es gradual y se caracteriza por
malestar general, fiebre, debilidad,
mialgias generalizadas y sudoración. La
fiebre por lo general aumenta por la
tarde; su descenso durante la noche se
acompaña de sudoración abundante.
• Puede haber síntomas digestivos y
nerviosos.
• Los ganglios linfáticos aumentan de
tamaño y el bazo se vuelve palpable.
La hepatitis puede acompañarse de
ictericia.
 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
• El diagnóstico de brucelosis se puede realizar de
manera directa, aislando el microorganismo a
partir de cultivos de sangre, médula ósea u otros
tejidos o indirecta a través de métodos
serológicos que detectan anticuerpos. El tiempo
de incubación aproximado es de 15 días.
• La mayoría de los pacientes son diagnosticados a
través de métodos indirectos, ya que la
bacteriología no siempre es posible y cuando se
la realiza no siempre es positiva.
• Muestras:
– Se debe obtener sangre para
cultivo, material de biopsia
para cultivo (ganglios
linfáticos, hueso, etc. ) y
suero para pruebas
serológicas.
• Cultivo
– El agar Brucella fue
concebido de manera
específica para el cultivo de
bacterias del género Brucella.
(Este medio favorece el crecimiento de
microorganismos exigentes debido a su
contenido de peptonas, dextrosa,
extracto de levadura y sangre)
 CULTIVO
• Las bacterias del género Brucella
se multiplican en medios de uso
frecuente, como ser medios de
tripticasa y soya con o sin sangre
de carnero al 5%, medio de
infusión cerebro y corazón, y agar
chocolate. También se desarrollan
en medios de hemocultivos.
• Todos los cultivos se deben
incubar en CO2 al 8 a 10%, a una
temp. De 35 a 37 oC y se deben
observar durante 3 semanas
antes de descartarse como
negativos.
 CULTIVO
• Los medios de cultivo líquidos deben volver a
cultivarse aunque no se observe crecimiento
durante este periodo.
• Los cultivos negativos para Brucella no
excluyen la enfermedad porque las brucelas
pueden cultivarse en los pacientes sólo
durante la fase aguda de la enfermedad o
durante la recidiva de la misma.
 CULTIVO
• Después de unos días de incubación en agar,
las brucelas forman colonias en la estría
primaria, que tienen menos de 1 mm de
diámetro. No son hemolíticas.
• La observación de pequeñisimos cocobacilos
gramnegativos que son catalasa y oxidasa
positivos indican la presencia de bacterias del
género Brucella.
 CULTIVO
• Todo trabajo adicional en los cultivos debe
realizarse en una cabina con medidas de
bioseguridad.
• Se debe inocular un cultivo inclinado de urea de
Christensen y observarse con frecuencia. Una
prueba de ureasa positiva es característica de
bacterias del género Brucella.
• B. suis y algunas cepas de B. melitensis pueden
producir una prueba positiva menos de 5 min
después de inocular el cultivo inclinado; otras
cepas tardan de unas cuantas horas a 24 horas.
 CULTIVO
• Las bacterias que cumplen estos criterios
deben enviarse de inmediato a un laboratorio
de salud pública de referencia para la
identificación preliminar.
• Se han ideado métodos moleculares para
diferenciar con rapidez las diversas
biovariedades.
 MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN
• Las especies de
Brucella se diferencian
por:
– la rapidez con que
hidrolizan la urea,
– la capacidad relativa
para producir H2S,
– los requerimientos del
CO2 y
– la sensibilidad a los
colorantes de anilina,
tionina y fucsina
básica.
 MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN
• Otros cocobacilos gramnegativos no
fermentadores que pueden confundirse con
Brucella son Bordetella, Moraxella, Kingella y
especies de Acinetobacter.

• Sin embargo las especies de Brucella son

inmóviles, ureasa y nitrato-positivas y
aerobias estrictas.
 Diagnóstico serológico
• Diagnóstico serológico
• El diagnóstico de laboratorio de brucelosis se
establece la mayor parte de las veces con
pruebas de serología.
• Pruebas para detectar los Ac IgM e IgG
• Pruebas de Elisa
• Pruebas de Brucellacapt
 TRATAMIENTO
• Las brucelas pueden ser susceptibles a la
acción de tetraciclinas, rifampicina,
trimetoprim-sulfametoxasol, aminoglucósidos
y algunas quinolonas.
• Sin embargo por su ubicación intracelular, los
microorganismos no se erradican con facilidad
del hospedador totalmente. Para mejores
resultados se debe prolongar el tratamiento.
 PREVENCION
• Las brucelas son microorganismos patógenos en los
animales y son transmitidos al ser humano por el
contacto accidental con heces, orina, leche y tejidos de
animales infectados.
• La inmunización activa del ser humano contra la
infección por Brucella se encuentra en fase
experimental.
• El control consiste en limitar la diseminación y en la
posible erradicación de la infección de animales, la
pasteurización de la leche y los productos lácteos, así
como la reducción de los riesgos laborales cuando es
posible.
GÉNERO BORDETELLA
 GENERO BORDETELLA
• El género Bordetella contiene tres patógenos
para el ser humano:
• Bordetella bronchiseptica
• Bordetella pertussis
• Bordetella parapertussis
• B. pertussis, un microorganismo patógeno
muy contagioso e importante en el ser
humano, produce tos ferina.
• B. parapertussis puede producir una
enfermedad muy similar.
• B. bronchiseptica produce enfermedad en
animales como la tos de los perros y de los
conejos, y solo a veces produce
enfermedad respiratoria y bacteriemia en el
ser humano.
 CARACTERISTICAS GENERALES
• El género Bordetella:
– Es un cocobacilo gramnegativo de tamaño
pequeño,
– Aerobio estricto
– Contienen una cápsula
– Crece lentamente en medios preferente
enriquecidos, pero que contengan almidón o
carbón para eliminar las sustancias tóxicas del
propio medio de cultivo que inhiben su
crecimiento
 EPIDEMIOLOGÍA
• Antes de la introducción de vacunas y en las
poblaciones en las que no se realizó
inmunización, pertussis (tos convulsa) era una
enfermedad epidémica con ciclos cada 2 a 5
años.
 EPIDEMIOLOGÍA
• ¿Cómo se transmite la infección?
• Se transmite de persona a persona, tal vez por
vía aérea a partir de la tos de una persona
infectada; los seres humanos son los únicos
reservorios.
 PATOGENIA
• El mecanismo por el que B. pertusssis, el patógeno
principal de las tos convulsa, vence las defensas
inmunes de los individuos sanos es complejo, e
incluye la participación de diversos factores de
virulencia interrelacionados

• Por ejemplo, una vez que alcanza las vías

respiratorias del huésped B. pertussis se adhiere a
las células epiteliales ciliadas respiratorias por
medio de las adhesinas y paraliza los cilios de la
tráquea por medio de una citotoxina.
 PATOGENIA
• Entonces un factor de virulencia importante
es, la toxina pertussis (TP) producida por el
microorganismo adherido.
• La TP entra en el torrente sanguíneo y luego
se une a receptores específicos en las células
del huésped.
 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
• La tos ferina es una
enfermedad local del árbol
respiratorio acompañada de
síntomas generales graves.
No se produce bacteriemia.
Los primeros síntomas que
aparecen tras una a dos
semanas de incubación son
semejantes a un resfriado con
tos, rinorrea, mal estado
general y fiebre. Constituyen
el PERÍODO CATARRAL que
dura de una a dos semanas.
• Durante esta etapa, un gran número de microorganismos son
pulverizados en las gotitas, y el paciente es muy contagioso,
pero no esta muy enfermo.
 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
• Sigue el PERÍODO PAROXÍSTICO
que dura una o dos semanas y
se caracteriza por una tos de
carácter explosivo y el
característico «coqueluche» con
la inhalación. Esto lleva al
agotamiento rápido y puede
acompañarse de vómito,
cianosis y convulsiones. El
«coqueluche o silvido» y las
complicaciones principales se
presentan sobre todo en los
lactantes.
 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
• La tos paroxística predomina en los niños
mayores y en los adultos. La leucocitosis es
alta (16000 a 30000) con una linfocitosis
absoluta. La convalecencia es lenta B.pertussis
es una causa frecuente de tos prolongada (4 a
6 semanas) en los adultos. En ocasiones
excepcionales, la tos ferina se acompaña de
complicaciones neurológicas graves que
pueden ser letales (convulsiones y encefalitis)
 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
• Finalmente se alcanza el período de
convalecencia en el que van mejorando los
síntomas hasta desaparecer; este estadio es
generalmente prolongado ya que la tos puede
persistir hasta un mes.
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
 MUESTRAS
• Los hisopos nasofaríngeos (NP) o aspirados de
NP que utilizan solución salina son las
muestras preferidas. Los hisopos deben tener
punta de dacrón o rayón, no de alginato
cálcico porque inhibe la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), ni algodón, porque este
lisa los microorganismos.
 CULTIVO
• El aislamiento primario de B. pertussis exige
medios enriquecidos. Se puede usar el medio
de Bordet-Gengou (agar papa-sangre-glicerol)
que contiene 0,5 ug de penicilina G; sin
embargo, es preferible el medio con carbón
vegetal complementado con sangre equina,
cefalexina y anfotericina B (de Regan Lowe)
por el mayor tiempo de validez del producto.
 CULTIVO
• Los antibióticos en los medios de cultivo tienden
a inhibir otra microbiota respiratoria, pero
permiten la proliferación de B. pertussis.
• Las placas son incubadas de 35 a 37oC durante 3
a 7 días en un medio aerobio dentro de un
entorno húmedo (una bolsa sellada de plástico).
• Los pequeños bacilos gramnegativos que apenas
captan el colorante se identifican por medio de
tinción de inmunofluorescencia. B. pertussis no
es móvil.
 PRUEBAS DE IDENTIFICACION
• El microorganismo es un aerobio estricto y
muestra positividad a la oxidasa y la catalasa,
pero negatividad a nitrato, citrato y urea; los
resultados de tales estudios ayudan a
distinguir entre las demás especies de
Bordetella. No necesita de factores X ni V para
subcultivo.
 PRUEBA DE ANTICUERPO
FLUORESCENTE DIRECTO
• El reactivo de Ac fluorescente se puede utilizar
para examinar las muestras de frotis
nasofaríngeas. Sin embargo, puede haber
resultados positivos falsos y negativos falsos.
La sensibilidad es de casi 50%. La prueba de
Ac fluorescente es muy útil para identificar B.
pertussis después del cultivo en medios
sólidos.
 REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA
• La PCR es el método más sensible para
diagnosticar tos ferina. Deben incluirse
sensibilizadores tanto para B. pertussis como
para B. parapertussis. Cuando se dispone de
esta prueba debe reemplazar a las pruebas de
Ac fluorescentes directos.
• Los puntos efectores existentes pueden
mostrar reacción cruzada con otras especies
de Bordetella.
 DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
• La producción de Ac de IgA, IgG e IgM tiene
lugar después de exposición a B. pertussis y
tales Ac pueden detectarse con
inmunoanálisis enzimático. Las pruebas
serológicas en pacientes son de poca ayuda
diagnóstica, fundamentalmente debido a que
no hay un aumento de Ac de aglutinación o
precipitación, sino hasta la 3era semana de la
enfermedad.
 TRATAMIENTO
• B. pertussis es susceptible a varios fármacos
antimicrobianos in vitro. La administración de
eritromicina durante la etapa catarral de la
enfermedad favorece la eliminación de los
microorganismos y puede tener utilidad en la
profilaxis. El tratamiento tras el inicio de la
fase paroxística pocas veces modifica la
evolución clínica. La inhalación de oxígeno y la
sedación evitan la lesión anóxica del cerebro.
 PREVENCIÓN
• Todo lactante debe recibir tres inmunizaciones
contra la tos ferina durante el primer año de
vida. Se dispone de múltiples vacunas
acelulares contra la tos ferina autorizadas en
EEUU y en otros países. Las vacunas acelulares
tienen por lo menos dos de los siguientes
antígenos: toxina de la tos ferina inactivada,
hemaglutinina filamentosa, proteínas
fimbriales y pertactina.
 PREVENCIÓN
• La vacuna contra la tos ferina se administra,
por lo común, en combinación con los
toxoides de difteria y tétanos.
• La administración profiláctica de eritromicina
durante cinco días también beneficia a los
lactantes no inmunizados o a los adultos con
exposición intensa.
 CARACTERÍSTICAS GENERALES
• Bacilos pequeños, gramnegativos, inmóviles.
• oxidasa y catalasa positivos
• fermentan la glucosa.
• aerobias o anaerobias facultativas
• temp de 37 oC
• La mayoría no se desarrolla en agar Mac
Conkey
 EPIDEMIOLOGÍA

• La mayoría de estos microorganismos forman

parte de la flora animal y se transmiten a los
seres humanos por contacto estrecho con
animales, incluso por mordeduras.
• En la mayoría de los casos no se conocen factores
de virulencia y los microorganismos pueden
considerarse patógenos oportunistas que
requieren la ruptura mecánica de las barreras
anatómicas del huésped, como son las heridas
producidas por mordeduras para ingresar al
organismo.
 EPIDEMIOLOGÍA

• Pasteurella multocida, otras especies de

Pasteurella, generalmente su hábitat y
reservorio es en la Nasofaringe y tracto
gastrointestinal de animales salvajes y
domésticos.
• Pueden encontrarse como parte de la flora de
la vía respiratoria superior de seres humanos
que tienen exposición intensa a los animales
(por ej. cuidadores de animales)
 ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR
PASTEURELLA
• De las especies de este género
Pasteurella multocida es la
especie encontrada con mayor
frecuencia en las muestras
clínicas.
• Como el modo de transmisión
a menudo involucra la
inoculación traumática del
microorganismo a través de la
piel humana, es de esperar
que la mayoría de las
infecciones causadas por estas
bacterias involucre heridas y
los tejidos blandos.
 ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR
PASTEURELLA
• Sin embargo, en algunos pacientes
comprometidos puede haber infecciones de las
vías respiratorias y otros sitios del cuerpo.
• Infección respiratoria crónica, por lo general en
pacientes con enfermedad pulmonar crónica
preexistente y exposición intensa a animales.
• También puede haber bacteriemia con formación
de abscesos metastásicos, a veces en pacientes
sin antecedentes de exposición a animales.
 FACTOR DE VIRULENCIA

• El factor de virulencia de Pasteurella

multocida, y otras especies de Pasteurella se
debe a una endotoxina y cápsula
antifagocitaria asociadas con P. multocida.
• Pueden causar infecciones localizadas de los
tejidos blandos después de una mordedura o
arañazo.
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

• No se requieren
consideraciones especiales
para la obtención y el
transporte de las muestras.
MÉTODOS DE DETECCIÓN DIRECTA
• Además de la tinción de Gram de muestras de
pacientes, no hay procedimiento específico
alguno para la detección directa de estos
microorganismos en materiales clínicos.
• Las especies de Pasteurella típicas son bacilos
cortos, rectos, aunque P. aerogenes también
puede aparecer como cocobacilos.
• Las células de P. bettyae son bacilos por lo
general más delgados que los de otras especies
MEDIOS DE CULTIVO DE ELECCIÓN
• Estas bacterias se desarrollan bien en los medios
de cultivo comunes, como agar sangre de oveja al
5% y agar chocolate, la mayoría de las cepas no
se desarrolla en agar Mac Conkey.
• Se desarrollan bien en el caldo de los sistemas de
hemocultivos y los caldos nutritivos comunes,
como tioglicolato e infusión cerebro-corazón.
• El agar sangre de oveja al 5% y el agar chocolate
deben incubarse a 35 oC en CO2 o aire
atmosférico durante 24 h como mínimo.
 ASPECTO DE LAS COLONIAS
• P. multocida se
observan colonias
convexas, lisas,
grises, no
hemolíticas; pueden
ser rugosas y
mucoides; pueden
tener un olor a moho
o hongo.
• Por lo general no se usan las técnicas
serológicas para el diagnóstico de laboratorio
de las infecciones por estos microorganismos.
• Producen Indol
• Negativas a la prueba de la Urea
 TRATAMIENTO
• P. multocida es sensible a casi todos los antibióticos.
• La penicilina G se considera el fármaco de elección
para las infecciones por P. multocida como resultado de
mordeduras de animales.
• Una característica rara de estos microorganismos es
que la mayoría es sensible a la penicilina. Aunque la
mayoría de los demás bacilos gramnegativos
importantes para la clínica son intrínsecamente
resistentes a la penicilina.
• Las tetraciclinas y las fluorquinolonas son fármacos
alternativos.
 PREVENCIÓN
• Como estos microorganismos rara vez están
implicados en infecciones en el ser humano,
las vacunas o las medidas profilácticas no son
necesarias.