BACTERIAS GRAM NEGATIVAS FASTIDIOSAS

1. Generalidades del género Haemophilus

El género Haemophilus se compone de cocobacilos Gram negativos anaerobios facultativos, no

móviles. Estas bacterias son catalasa y oxidasa positivas y reducen nitratos a nitritos. Son parásitos
obligados de las membranas mucosas de animales y seres humanos. Hay alrededor de 13 especies
dentro de las cuales 8 están asociadas a infecciones en humanos: H. influenzae, H. ducreyi, H.
parainfluenzae, H. parahaemolyticus, H. paraphrohaemolyticus, H. parahaemolyticus, H. pittmaniae
y H. aegyptius. H. influenzae puede formar parte del tracto respiratorio superior hasta en un 50%
de la población normal. H. influenzae de tipo b es responsable de cuadros de meningitis con
precedente de infecciones respiratorias y otitis, epiglotitis, celulitis periorbitaria, artritis séptica,
neumonía y conjuntivitis. Las cepas de H. influenzae de los otros serotipos, así como las cepas no
tipificables, pueden causar infecciones como neumonías y bronquitis en adolescentes y adultos, en
su mayoría con algún tipo de compromiso inmunológico, o infecciones no invasivas en niños. Por
otro lado, H. ducreyi produce el chancro blando, una infección de transmisión sexual, la cual se
manifiesta como una úlcera dolorosa en los genitales con linfadenopatías inguinales. Las especies
restantes, incluyendo H. parainfluenzae, H. aphrophilus y H. haemolyticus se pueden encontrar
raramente produciendo infecciones en pacientes inmunocomprometidos.

La mayoría de las especies de este género se consideran nutricionalmente fastidiosas porque

requieren para su crecimiento medios enriquecidos con NAD (factorV) y/o hemina (factor X). El agar
sangre no soporta su crecimiento ya que el factor V no está biodisponible por estar dentro de los
eritrocitos. A nivel clínico se utiliza Agar Chocolate para aislar a estas bacterias ya que provee
adecuadamente, el factor X y V que se liberal lisar los eritrocitos por calor... Es común suplementar
el Agar Chocolate con bacitracina, con el fin de inhibir el crecimiento de bacterias de la flora normal
del tracto respiratorio. Las condiciones óptimas de crecimiento para el género Haemophylus son
incubar a 33-37°C en una atmósfera con 5-10% de CO2 de 18 a 24 horas.

Haemophilus puede crecer en agar sangre alrededor de otras bacterias, como Staphylococcus
aureus, que proporcionan el factor V. A este fenómeno se le conoce como satelitismo (Fig.1). Las
especies de Haemophilus pueden presentar además pleomorfismo celular, dependiendo de la edad
del cultivo y el medio que se utiliza. En los cultivos más viejos se observan células bacterianas con
formas bacilares, mientras que en los cultivos más jóvenes se encuentran formas cocoides o
cocobacilares.
H. influenzae

S. aureus

Figura 1. Fenómeno de satelitismo de H. influenzae en Agar Sangre alrededor de colonias de S.

aureus.

Además de su morfología colonial y microscópica pequeña y grisácea, se pueden efectuar una serie
de pruebas bioquímicas para su identificación, (Cuadro 1).
Cuadro 1. Características diferenciales de especies de Haemophilus.

Requerimiento de Catalasa
Especie Hemólisis¹
X V CO2
H. influenzae + + + – +
H. haemolyticus + + – + +
H. ducreyi + – – – –
H. parainfluenzae – + V³ – V
H. parahaemolyticus – + – + +
¹ Hemólisis en Agar sangre de caballo.
³ V, variab!e

2. Generalidades del Género Neisseria

El género Neisseria se caracteriza por ser diplococcos Gram-negativos que se asemejan a granos de
café, no móviles, con una reacción positiva a las pruebas de oxidasa, catalasa. Las especies de
Neisseria se caracterizan por ser de metabolismo aerobio y el crecimiento de las especies patógenas
se ve favorecido mediante incubación en una atmósfera altamente húmeda y enriquecida a 5-8%
de CO2. Su temperatura de crecimiento es óptima entre los 35-37oC y tienen requerimientos
nutricionales complejos.

N. gonorrhoeae y N. meningitidis son los principales patógenos de humanos. Estas dos especies son
patógenos obligatorios del ser humano no se conocen reservorios animales. N. gonorrhoeae es el
agente etiológico de la gonorrea, infección de transmisión sexual, asociada con uretritis aguda,
epididimitis, prostatitis, disuria, secreción cervical y dolor abdominal bajo. N. gonorrhoeae es una
bacteria altamente sensible a la desecación y cambios de temperatura. La infección se presenta al
haber contacto íntimo y prolongado de mucosas y secreciones. Por otro lado, N. meningitidis se
asocia con infecciones como meningitis, septicemia, neumonía o artritis supurativa. N. gonorrhoeae
no se considera flora normal mientras que N. meningitidis puede encontrarse como un habitante
de la flora normal del tracto respiratorio superior de personas portadores pero también puede
actuar como un patógeno invasivo en este mismo sitio.
En el caso de N. gonorrhoeae se recomienda realizar Gram a partir de muestras urogenitales. La
presencia de diplococos Gram Negativos intracelulares a partir de una secreción uretral de un
hombre sintomático correlaciona con un 89% de cultivos positivos y es una gran evidencia de
infección gonocócica. Debido a que las mujeres presentan flora normal con morfología similar a
Neisseria, solo un 50% de los casos correlaciona con el cultivo positivo del mismo. N. gonorrhoeae
es nutricionalmente mucho más exigente que N. meningitidis, de manera tal que puede crecer
únicamente en medios enriquecidos como Agar Chocolate, pero no puede crecer en Agar Sangre,
mientras que N. meningitidis puede crecer tanto en Agar Sangre como en Agar Chocolate.
Debido a la flora normal asociada al tracto urogenital, se recomienda utilizar medios selectivos tales
como Thayer Martin para aislar N. gonorrhoeae. A diferencia de N. meningitidis, quien podría
aislarse de muestras de tracto genital también, N. gonorrhoeae no produce ácido a partir de
maltosa. Por otro lado, N. meningitidis en muestras de líquido cefalorraquídeo, se observan tanto
extra como intracelularmente. Si la muestra proviene de LCR puede cultivarse en Agar Chocolate
mientras que si proviene de mucosas asociadas a flora normal, se recomienda aislar a la bacteria en
medio Thayer Martin u otro medio selectivo.
3. Generalidades del Género Campylobacter

En la familia Campylobacteriaceae se incluyen los géneros Campylobacter y Arcobacter. Las especies

de Campylobacter se caracterizan por ser bacilos Gram-negativos curvos, en forma de S o de espiral,
con un tamaño de 0.2-0.9 µm x 0.5-5.0 µm, son no esporulados, móviles por un flagelo en uno o
ambos polos de la célula, oxidasa positivos, y microaerofílicos (5% 02 - 10% CO2 - 85% N2).

Los tres agentes más frecuentemente asociados a infecciones en el ser humano del género
Campylobacter incluyen: C. jejuni subsp. jejuni, C. coli, y C. fetus subsp. fetus. De las especies
mencionadas, la presentación clínica de la infección va desde un cuadro asintomático hasta una
infección seria. Los síntomas y signos incluyen fiebre, dolor abdominal y diarrea, con o sin sangre y
leucocitos fecales, y duran desde varios días hasta más de una semana. C. jejuni subsp. jejuni y C.
coli también son responsables de infecciones extraintestinales, incluyendo bacteremias, infecciones
del tracto urinario, meningitis, endocarditis, entre otras. C. fetus subsp. fetus se asocia
principalmente a bacteremia y a infecciones extraintestinales, aunque también puede ser causa de
gastroenteritis.

Se puede efectuar un diagnóstico presuntivo de la infección por Campylobacter directamente en un

frotis de heces cuando se tiñe por Gram, substituyendo la safranina por fucsina o carbolfucsina,
gracias a la morfología celular característica (en forma de “aves de gaviota”) y a la presencia de
leucocitos fecales, los cuales se observan entre 25-80% de los casos confirmados por cultivo.

Las muestras de heces, o bien, los hisopados rectales, se utilizan para el aislamiento de la bacteria.
Estas muestras deben ser inoculadas en medios selectivos, los cuales son medios enriquecidos,
como agar sangre, a los cuales se les añade antibióticos como agentes inhibitorios, por ejemplo,
suplemento Skirrow o suplemento Bützler. Posteriormente los medios deben ser incubados hasta
por 48 horas en condiciones microaerofílicas. Dado que C. jejuni subsp. jejuni y C. coli crecen bien a
42oC, se recomienda la incubación a esta temperatura para inhibir algunas otras bacterias
contaminantes que crecen a 35-37oC pero no a 42oC. Sin embargo, algunas otras especies de
Campylobacter, como C. fetus subsp. fetus, crecen adecuadamente a 35-37°C pero no a 42oC.
Además, estas tres especies son catalasa positiva, reducen nitratos, crecen en Agar Mc Conckey, son
sensibles al ácido nalidíxico y resistentes a la cefalotina. La morfología colonial varía según los
medios de cultivos utilizados en el aislamiento. En medios recién preparados, Campylobacter
produce colonias irregulares, planas, con un color grisáceo. En medios relativamente más viejos y
más deshidratados, las colonias de Campylobacter son redondas, convexas y brillantes. Usualmente
no se observa hemólisis en placas de agar sangre.
Figura 1. Morfología en “forma de gaviota” de Campylobacter.

OBJETIVO

Describir las principales características fenotípicas y bioquímicas de las bacterias del género
Campylobacter, Neisseria y Haemophilus spp. asociados a infecciones para que el estudiante sea
capaz de reconocerlos en el contexto de un laboratorio bacteriológico de diagnóstico.

METODOLOGÍA

Haemophilus
DÍA 1

1. Entrega de cultivos
2. Realizar frotis y tinción de Gram.
3. Realizar la prueba de oxidasa a partir del agar sangre
4. Sembrar la bacteria en 1 placa de agar Chocolate.
5. Sembrar un inóculo denso en todas direcciones en placa de Agar Sangre.
Posteriormente se realiza un inóculo transversal (en estría) con un cultivo
de S. aureus.
6. Sembrar un inóculo denso en todas direcciones en 1 placa de Agar
Tripticasa Soya (ATS). Agregue 1 disco de factor V y otro de factor X en la
misma.
7. Sembrar un inóculo denso de la bacteria, en todas direcciones en una placa
de Agar Chocolate y agregar un disco de bacitracina.
8. Incubar un juego de placas a 37°C por 18-24 con 5-8% CO2.

Rayar en toda la placa Haemophilus

Estría de S. aureus

Figura 2. Esquema de cómo sembrar placa para observar fenómeno de satelitismo.

Neisseria

1. Entrega de cultivos
2. Realizar frotis y tinción de Gram.
3. Realizar la prueba de oxidasa a partir del Agar Sangre
4. Sembrar la bacteria en 1 placa de agar Chocolate, 1 placa de Agar Sangre, 1
placa de ATS y 1 placa de AgarThayer Martin.
5. Incubar un juego de placas a 37°C por 18-24 con 5-8% CO2.

Campylobacter

1. Entrega de cultivos.
2. Realizar frotis y tinción de Gram modificado utilizando fucsina fenicada en
lugar de safranina.
3. Realizar la prueba de oxidasa a partir del agar sangre
4. Sembrar la bacteria en dos placas de agar sangre.
5. Incubar a 35-370C y a 420C en condiciones microaerofílicas por 48 horas.

DÍA 2

Haemophilus

1. Describir la morfología colonial de cada bacteria en los medios sembrados

considerando tamaño, forma, elevación, margen, tipo de superficie,
características ópticas y producción de hemólisis.
2. Realizar la prueba de catalasa a partir de la placa de Agar Tripticasa Soya.
3. Realizar la lectura del fenómeno de satelitismo.
4. Realizar la lectura de la utilización de factor X y V y resistencia a bacitracina.

Neisseria

1. Describir la morfología colonial de cada bacteria en los medios sembrados

considerando tamaño, forma, elevación, margen, tipo de superficie,
características ópticas y producción de hemólisis.
2. Realizar la prueba de catalasa a partir de la placa de ATS.

Campylobacter

1. Describir la morfología colonial de cada bacteria en los medios sembrados

considerando tamaño, forma, elevación, margen, tipo de superficie,
características ópticas y producción de hemólisis.
2. Realizar la prueba de catalasa a partir de la placa de Agar Tripticasa Soya.
RESULTADOS

Emita un reporte de laboratorio (Hoja de Reporte) que demuestre la identificación del agente
bacteriano a partir de las pruebas de laboratorio realizadas. Haga una breve descripción de un
caso clínico asociado a este patógeno y un esquema de tratamiento antibacteriano.

DISCUSIÓN

1. Enumere en qué muestras clínicas espera encontrar H. influenzae. ¿ Cómo procesaría

dichas muestras?
2. ¿Cuáles pruebas le permiten diferenciar entre N. meningitidis y N. gonhorroeae?
3. Investigue en los laboratorios clínicos de Costa Rica cómo se procesan las muestras de
heces sospechosas por Campylobacter. ¿Cuáles pruebas se realizan?

REFERENCIAS

Textbook of Diagnostic Microbiology. 5th edition. Edited by Mahon C, Lehman D, Manuselis

G.2014. W.B. Saunders Company. Philadelphia, Pennsylvania, USA.