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Society
ISSN: 2072-9294
infoselvandina@gmail.com
Selva Andina Research Society
Bolivia
Key words:
In vitro culture,
propagation,
establishment,
contamination,
disinfection.
© 2016. Journal of the Selva Andina Research Society. Bolivia. All rights reserved.
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Ancasi-Espejo et al. J. Selva Andina Res. Soc.
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Introducción
El plátano (Musa spp.) es una planta frutal de gran vitro, en algunos plátanos, es frecuente la presencia
importancia alimenticia, económica y sociocultural, de microorganismos, oxidación fenólica de los teji-
del género Musa perteneciente a la familia de las dos, baja viabilidad y baja brotación, por lo que se
musáceas, ampliamente cultivada en las regiones hace necesario la realización de pretratamientos a
tropicales del mundo. El plátano ocupa el cuarto las plantas madres para mejorar el establecimiento
lugar en los alimentos después del arroz, el trigo y de los explantes (Ramirez et al. 2008).
maíz (Lassoudiere 2007). El objetivo de la investigación fue determinar un
El cultivo del plátano a escala mundial en cuanto a mejor medio de cultivo en la fase de establecimiento
área cultivada se estimaba en 5,029997 ha y 30,471 para propagación in vitro de plátano (Musa paradisia-
870 t/anuales, de las cuales el 73% estan concentra- ca), para lograr la sobrevivencia de los explantes.
das en países del África, un 3% en el Asia y el 25%
en América Latina y Caribe (7,008530 t), en donde Materiales y métodos
Colombia, Costa Rica, Ecuador, Panamá, Perú y
Venezuela eran los principales productores (FAO Ubicación. El presente trabajo de investigación se
2002). realizó en el año 2014 en el Laboratorio de Biotec-
En Bolivia, el área cultivada se estimaba en 63895 nología Vegetal del Área de Ciencias Biológicas y
hectáreas de banano y plátano (CANEB 2008), que Naturales (A.C.B.N) de la Universidad Amazónica
se cultivan en la zona oriental, en Chapare de Co- de Pando. se encuentra Geográficamente se ubicada
chabamba, en Alto Beni, en los Yungas y Caranavi a 11° 01´ 59.20´´ latitud sur y 62° 45´ 31.13´´ de
de La Paz (Soto-Azurduy 2010). longitud oeste, con una temperatura promedio de 25
Los cultivares de plátano son susceptibles a enfer- ºC y una humedad relativa de 54%.
medades como la Sigatoka negra (Mycospharella Material biológico. El material vegetal usado para
fijiensis), Hereque (Ralstonia solanacearum), y el esta investigación fue recolectado en el Centro de
Mal de Panamá (Fusarium oxysporum f. sp cubense) Investigación de Nuevas Tecnologías de la Amazo-
que ocasiona pérdidas en la producción de frutas y nia (CINTA) de la Universidad Amazónica de Pan-
afecta la disponibilidad de material vegetal de pro- do (UAP).
pagación sano en campo (Aular & Casares 2011). Recolección del material vegetal de campo. Para la
La micropropagación in vitro es una técnica que descripción morfológica del plátano, se utilizó la
permite la reproducción masiva de plantas libres de lista de descriptores para Musa spp., publicados, por
organismo fitopatógenos y se constituye en una he el Instituto Internacional de Recursos Filogenéticos
rramienta para el mejoramiento genético (Roux et (IPGRI) (Franco & Hidalgo 2003). El banano (Mu-
al. 2002). Por fortuna, el género Musa puede multi- sa spp.), se caracterizó morfológicamente de acuer-
plicarse rápidamente mediante las técnicas de mi- do a los descriptores del IPGRI-INIBAP/ CIRAD
cropropagación (Angarita & Perea 1984). Sin em- (1996), y considerando a los mejores cultivares de
bargo, en la etapa de establecimiento de cultivo in la zona, en referencia a la calidad del fruto, tamaño
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uniforme del fruto, uniformidad de color, sabor y medios de cultivo en la fase de establecimiento para
aceptabilidad en el mercado. la propagación in vitro del plátano se siguieron los
La planta seleccionada tuvo un tamaño mediano, siguientes pasos: i) preparación de los medios de
con buena calidad de racimo y aparentemente sanas cultivo (Tabla1), ii) desinfección del material vege-
(libres de enfermedades), una vez seleccionada mor- tal y iii) establecimiento del cultivo de plátano.
fológicamente se marcó con una cinta plástica y se Medios de cultivo. La compasión de los medios de
identificó con un número. La muestra seleccionada cultivo solidos utilizados se describen en la Tabla 1.
tenia las condición fitosanitaria (planta sana), se Estos se distribuyeron a 15 mL en cada tubo de
escogió a los hijos espada de 20-30 cm con un pe- ensayos (250 mm de largo x 15 mm de diámetro).
dúnculo (o pedículo) de 5 a 10 cm de diámetro. Posteriormente, los tubos se esterilizaron en auto-
La muestra tuvo un meristemo viable. Todos los hi clave durante 20 min a 15 PSI de presión y 121 °C.
juelos (cormos) seleccionados fueron extraídos e Desinfección del material vegetal. Se usaron cor-
identificados con el mismo número de la planta ma mos de tamaño de 10 cm de forma cuadrada se
dre. Paralelamente, una vez recolectadas las mues- desinfestaron con hipoclorito de sodio (NaClO) al
tras de cada planta, se tomó también porciones de 30% (v/v) durante 12 h, alcohol al 70% por 30 s,
hojas (10 x 10 cm) de la misma planta para el análi- hipoclorito de sodio (NaClO) al 5% con dos gotas
sis fitopatológico. de tawi 20 por 15 min, agrobac 3 g /L durante 5 min
Protocolo para cultivo in vitro de plátano (Musa pa- (Ortega et al. 2011).
radisiaca) en la fase establecimiento. Para evaluar los
Tabla 1 Medios de cultico para la inducción de brotes cormos de plátano (Musa paradisiaca)
para la micropagacion in vitro
Establecimiento. Dentro de una cámara de flujo La extracción se realizó bajo condiciones asépticas
laminar, los cormos fueron reducidos a un tamaño en la cámara de flujo laminar y con la ayuda de
de 3 cm y se dejó en hipoclorito de sodio (NaClO) pinzas y bisturí estériles. Se colocó los explantes en
al 3.6% durante 5 min, luego en una solución 30 tubos de ensayos con medio de cultivo previamente
mg/L de cisteína, posteriormente se redujeron a 1 esterilizado.
cm y fueron depositados en solución de ácido as- Pará el establecimiento, se dejó en cuarenta (48 h),
córbico 10 mg/10 mL por 10 s (Ortega et al. 2011). con ausencia de luz total para reducir el proceso de
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oxidación. Una vez cicatrizadas las heridas se eva- otra parte, el C.V. fue inferior al 35%; lo cual, signi-
luaron el grado de Oxidación con una escala de 1 = fica que las transformaciones realizadas homoge-
5-15% a 5 = 100%, según la escala de Novak et al. neizaron adecuadamente los datos.
(1989), El porcentaje de contaminación de hongos y
bacteria, se evaluó mediante la observación de mi- Tabla 2 Análisis de varianza para el grado de oxida-
ción de los ex plantes in vitro de plátano
croscópica, cada cinco días durante 30 días, se de-
(Musa paradisiaca)
terminó la presencia de contaminantes fungosos que
se basó en la identificación visual del micelio gene- Oxidación
Resultados
Tabla 3 Explantes contaminados por efecto de bacterias y hongos de plátano (Musa paradisiaca)
De los 36 explantes iniciales de plátano, 10 explan- cimiento in vitro en algunas especies es necesario
tes (28%) fueron contaminados por de hongos y agregar al medio de cultivos antioxidantes para
bacterias y 26 explantes (72%) no fueron contami- evitar la oxidación del explante o medio de cultivo.
nados (Figura 2). Los antioxidantes más usados en el plátano son el
ácido ascórbico, ácido cítrico y L-cisteína, estos
Figura 2 Porcentaje de contaminación de los compuestos se utilizan antes del establecimiento del
explantes de plátano
material o adicional al medio de cultivo (George
1996, Jiménez 1998). Aliyu (2005), menciona que
mediante la adición de carbón activo (CA) se evita
la oxidación del explante. Sin embargo, en el pre-
sente estudio se observó que el medio tres Murashi-
ge y Skoog (MS) suplementado con ácido ascórbico
y ácido cítrico obtuvo menor grado de oxidación
(0.26) que con el tratamiento dos Murashige y
Skoog (MS), suplementado con carbón activo obtu-
Discusión vo mayor grado de oxidación (0.60). El ácido cítri-
co y ascórbico son los antioxidantes más utilizados
La oxidación de compuestos fenólico en cultivo in en cultivo in vitro para evitar la oxidación en los
vitro son catalizados por la enzima polifenol oxida- tejidos (Aguirre 2010). Los productos químicos
sas (PPO) que producen quinonas, que son com- antioxidantes como el ácido cítrico y ácido ascórbi-
puestos químicos reactivos y propensos a reaccio- co, presenta una mayor efectividad cuando se los
nar, causando daño e incluso la muerte celular. Al utiliza de manera conjunta (Pérez et al. 2014).
respecto Monzón-Ostorga (2005) indica que los En nuestro estudio se observó que la combinación
compuestos fenólicos son exudados por la herida de ácido ascórbico y cítrico logra controlar la oxida-
del tejido hacia el medio, a la vez son atrapados por ción permitiendo la sobrevivencia de los explantes
el gelificante y acumulados, formando un área negra del plátano en condicione in vitro. El ácido ascórbi-
alrededor del explante, causando la inhibición del co inhibe la oxidación, reduciendo el complejo fe-
crecimiento (Amiot et al. 1996, Bray et al. 2000). nólico. Este compuesto en la micro propagación
Murashige (1974) señala que en la etapa de estable- puede actuar en dos formas: como reductor o como
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vitamina, Por otro lado el ácido cítrico es un ácido establecimiento en cultivo in vitro, entre ellos el
tricarboxilo muy común en las plantas, que es utili- hipoclorito de sodio (NaClO), con menor frecuencia
zado en la preparación de explantes y medios, sien- el cloruro de calcio (Aguirre et al. 2010). En la pre-
do uno de los compuestos claves del ciclo de Krebs sente investigación se utilizó el NaClO en concen-
y es un antioxidante por que ejerce un efecto inhibi- traciones de 5% y 3.6% respectivamente en diferen-
torio sobre la PPo (polifenol oxidasa) (Monzón- tes tiempos (menores a 15 min), donde se obtuvo el
Ostorga 2005). Asimismo, Canchignia.et al. (2004), 70% de explantes sin contaminación.
mencionan que el ácido cítrico se ha usado, para La concentración y el tiempo de exposición al de-
superar problemas específicos de oxidación los cua- sinfectante están relacionados tanto a la especie
les se asocian con cultivo de tejidos en musáceas. como al tipo de explante, siendo el hipoclorito de
La combinación de ambos antioxidante se manifestó sodio uno de los más utilizados, ya que se considera
en una reducción de la oxidación para la propaga- gentil con el tejido vegetal y no con los microorga-
ción in vitro de plátano. Resultados similares se nismos contaminantes, además, es de fácil adquisi-
observaron en teca, donde el ácido ascórbico y el ción y bajo costo en el mercado. Araya (2000),
ácido cítrico usados conjuntamente durante 24 ho- menciona que a mayor concentración y tiempo de
ras, disminuyeron los compuestos fenólicos (Akram exposición al NaOCl, menor porcentaje de contami-
& Aftab 2009). De igual manera D´Silva & nación. Asimismo (Ramirez-Villalobos et al. 2004),
D´Souza (1993), utilizaron el ácido cítrico y el áci- menciona que a altas concentraciones de NaClO y/o
do ascórbico, para combatir la oxidación de los tiempos muy prolongados (mayores a 20 min) inhi-
explantes en condiciones in vitro. ben el crecimiento del explante, dependiendo el tipo
La presencia de agentes contaminantes ya sean bac- de especies.
terias u hongos en los cultivos in vitro se debe a
varios factores, entre los que sobresalen la asocia- Conflictos de intereses
ción del explante a su medio, así como por las con-
diciones de la introducción y la fuente origen del Los autores declaran que no tienen conflictos de
material vegetal; de ahí la importancia de obtener un interés con la presente investigación.
material vegetal adecuado para usarlo como explan-
te (Mroginski & Roca 1991). Esto fue evidente en Agradecimientos
nuestra investigación, ya que cuando se introdujo
material proveniente de campo, hubo altos porcenta- Se agradece el financiamiento de esta investigación
jes de contaminación que no permitieron el estable- a la Dirección de Investigación de Ciencias y Tec-
cimiento in vitro. nología de la Universidad Amazónica de Pan-
Alonso-Gómez (2002), Recalde-Bastidas (2007), do. Asimismo, nuestros agradecimientos al Dr. Julio
menciona que la contaminación, más que matar a Gabriel por la revisión y contribución para la mejora
los explantes directamente, invade el cultivo ha- de la presente publicación.
ciendo que el explante no sea apto para su micro
propagación. Existen varios compuestos químicos
que se utilizan para la desinfección en la fase de
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