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Resumen
La encapsulación es una técnica utilizada para contener sustancias de interés en otra, llamada
microcápsula. Su función es proteger al componente útil o liberarlo en forma controlada en un
medio y a una velocidad requerida. En este estudio se realizó la puesta a punto de la producción
de microcápsulas por el método de coacervación simple utilizando gelatina (1-5-10%p/v) como
matriz de pared y por acción del sulfato de sodio 20%p/v como agente inductor y glutaraldehído
(1-10mmol/g gelatina) como reticulante, en medios con distintos pH (3,5-5,6-9,5). A través de la
caracterización morfológica, el tamaño y la estabilidad en el tiempo de las microcápsulas
obtenidas y el rendimiento del proceso, se establecieron como mejores condiciones 1%p/v de
gelatina, pH 9,5 y 10 mmol glutaraldehído/g gelatina, obteniéndose microcápsulas de diámetro
medio de 2,28±0,18 micrones y rendimiento global del método de 44,1%.
1. Introducción
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Los principales objetivos de la encapsulación se orientan a proteger sustancias químicas o
microorganismos que presenten características de elevada volatilidad, oxidación, fotosensibilidad
o sensibilidad a la variación de pH del medio en que se encuentren, preservando de esa manera
sus propiedades biológicas, funcionales y fisicoquímicas (Levic et al., 2011).
Además de la protección que ofrecen las cápsulas, éstas también conforman sistemas de
liberación controlada del material de núcleo hacia el medio que las rodea, permitiendo una difusión
gradual a través de las paredes de las mismas (Solomon et al., 2012; Pothakamury y Barbosa-
Cánovas, 1995). La tecnología de microencapsulación y liberación controlada es utilizada, entre
otros propósitos, para suministrar diversos compuestos como fármacos, bacterias, enzimas,
pesticidas, fertilizantes, fragancias, aceites esenciales o sabores en las dosis que las aplicaciones
particulares requieran (Martins et al., 2014; Parra Huertas, 2010).
Actualmente se encuentra disponible una amplia gama de métodos para encapsular, los
cuales se pueden clasificar en físicos, físico-químicos y químicos. Dentro de los métodos físicos
se encuentran la extrusión, el recubrimiento por lecho fluidizado, la separación por suspensión
rotacional y el secado por atomización. En los procesos físico-químicos se hallan la coacervación
simple o compleja, la encapsulación por liposomas y la gelificación. Por último, en los métodos
químicos se destacan la inclusión molecular la polimerización y la co-cristalización (Guevara-
Bretón y Jiménez-Munguía, 2008; Sandoval et al., 2004).
Dentro de las metodologías fisicoquímicas, la coacervación, es una de las más antiguas y
más ampliamente utilizadas en la industria. El término coacervación se deriva de la raíz griega
“acervus” (agregación) y el prefijo “co” (junto) para describir la unión de partículas coloidales. Al
hablar de partículas coloidales se hace referencia a la separación de pequeñas gotas de líquido,
denominadas “coacervados” o fase rica en coloides, a partir de soluciones en donde al menos una
de ellas contiene un soluto coloidal o de naturaleza macromolecular.
Se puede emplear la coacervación en forma simple o compleja, de acuerdo al número de
solutos coloidales involucrados y a la actividad de los grupos ionizados de las macromoléculas
implicadas en el proceso de microencapsulación. La coacervación simple por su lado, involucra en
su sistema a un único soluto coloidal y se asocia a los grupos no ionizados en la macromolécula.
La formación de MC por este método, se puede resumir en cuatro pasos: primeramente, se realiza
la emulsificación del agente activo en una solución acuosa de la macromolécula elegida; la
segunda etapa corresponde a la separación de fases por reducción de solubilidad de la fase rica
en coloides. En la tercera etapa, se produce la encapsulación del agente activo por la deposición
de los coloides sobre él y por último, en la fase final, se agrega un compuesto reticulante que
otorga cierta rigidez a las MC al ser inductor de la creación de enlaces covalentes adicionales
entre él y el polímero (Madan, 2008).
Entre los materiales coloidales más empleados en la encapsulación por coacervación se
encuentran la gelatina, goma arábiga, goma xantana, quitosano, alginato, almidón, entre otras
(García Ceja y López Malo, 2012), pero la que más difusión y aplicación tiene es la gelatina (Maji
et al., 2007; Huang et al., 2007). Como agentes reticulantes se emplean regularmente
glutaraldehído (Ocak, 2012) y formaldehído (Solomon et al., 2012), entre otros. Respecto a la
amplia variedad de agentes inductores de la coacervación que pueden emplearse, englobando a
los electrolitos y solventes, (Okada et al., 1985b) realizaron un estudio exhaustivo del tema.
La coacervación simple ofrece ventajas significativas sobre la compleja con respecto a los
costos de operación y a la flexibilidad y simplicidad de los mismos. Para inducir la separación de
fases, la coacervación simple utiliza sales inorgánicas y solventes líquidos económicos y
asequibles, mientras que los procesos empleados en la coacervación compleja son más sensibles
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incluso ante un pequeño cambio de pH. Además, esta última, utiliza coloides relativamente caros
(Sutaphanit y Chitprasert, 2014).
Asimismo, la principal ventaja de la coacervación sobre otros métodos de encapsulación es
que presenta una eficiencia muy alta (hasta el 99%). Además, este método es simple, escalable,
de bajo costo, libre de disolventes tóxicos y reproducible. Por lo tanto, la coacervación puede
utilizarse para la fabricación de MC a escala industrial (Xiao et al., 2014). Las MC producidas por
coacervación son insolubles en agua y resistentes al calor, poseen excelentes características de
liberación controlada basadas en estrés mecánico, temperatura y liberación sostenida (Dong et al.,
2011).
El objetivo de este trabajo consiste en poner a punto la producción de MC mediante
coacervación simple, empleando gelatina libre de cualquier compuesto activo, sulfato de sodio
como agente inductor y glutaraldehído como agente reticulante. Para ello, se determinan las
mejores condiciones para las tres variables estudiadas (concentración de gelatina, pH del medio y
cantidad agregada de glutaraldehído por gramo de gelatina) y su efecto en la morfología,
estabilidad, tamaño y rendimiento de las MC obtenidas.
2. Materiales y Métodos
2.1 Materiales
Los reactivos utilizados fueron gelatina 225 Bloom, tipo B, grado alimenticio. Ácido acético
glacial p.a. Merck. Acetato de sodio anhidro p.a. Biopack. Sulfato de sodio anhidro p.a. Biopack.
Hidróxido de sodio en perlas p.a. Cicarelli. Ácido clorhídrico 36,5-38,0%, p.a. Cicarelli. Solución de
glutaraldehído 50% puro, Cicarelli. Alcohol etílico 96° comercial. Agua desionizada.
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Se llevó a cabo el ensayo de cenizas empleando el procedimiento detallado en la norma
técnica ecuatoriana NTE INEN 1954:2012. Para ello, se realizó por triplicado la determinación con
3 gramos de muestra usando un horno mufla (ORL-II, ORL, Argentina) a 550°C.
2.2.4 Determinación de pH
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glutaraldehído se agregó en concentraciones de 1 a 10 mmol/g de gelatina empleada. Se tomaron
muestras de las MC obtenidas para evaluar su estabilidad en agua en el tiempo y medir el tamaño
por microscopía óptica, siendo el resto lavadas 5 veces con agua destilada a temperatura
ambiente, al tiempo que fueron filtradas al vacío para eliminar residuos de sulfato de sodio y
glutaraldehído.
2.5 Rendimiento
W MCS
Rendimiento ( % )= x 100 (1)
WG
Donde, WMCS es el peso de las MC obtenidas luego de ser filtradas a vacío por filtro de microfibra
de vidrio de 1 micrón de diámetro de poro (Gamafil, Argentina), secadas en estufa de vacío (DZF-
6020, Arcano, Argentina) a 70°C y 30 mmHg de presión y enfriadas en desecador hasta peso
constante. WG es el peso de gelatina empleada en la solución inicial.
3. Resultados y Discusión
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Por otra parte, en la tabla II se presentan las mediciones de turbidez de la gelatina en
función del pH de soluciones buffer del par AcNa/AcH en el sistema agua/alcohol etílico. En
concordancia con lo obtenido por Hitchcock (1931) y Aewsiri et al., (2008), se observa una
máxima absorción de luz (Abs. 1,968±0,009) en el pH cercano al pI de la proteína estudiada.
Asimismo, al igual que Hafidz et al., (2011), se evidencia que, al incrementarse el pH, se
incrementa la turbidez debido a la formación de agregados proteínicos que presentan menores
interacciones acuosas. Se determinó que el pI de la gelatina usada como materia prima se
encuentra a un pH de 5,60±0,10, en correspondencia con el pI esperado para la gelatina de tipo B.
Tabla II. Punto isoeléctrico de la gelatina 1%p/v en función de la turbidez generada bajo la relación
volumétrica agua/alcohol etílico 1/3 a 40°C.
Relación molar AcNa/AcH pH teórico par AcNa/AcH* pH medido Abs. a 360 nm
16,67 5,98 5,82±0,16 1,917±0,014
8 5,66 5,60±0,10 1,968±0,009
4 5,36 5,28±0,08 1,953±0,002
2 5,06 4,98±0,08 1,936±0,004
1 4,76 4,67±0,09 1,827±0,003
0,5 4,46 4,38±0,08 1,821±0,008
0,25 4,16 4,11±0,05 1,052±0,008
0,13 3,86 3,91±0,05 0,334±0,008
0,06 3,56 3,46±0,10 0,021±0,001
* Calculado mediante la ecuación de Henderson-Hasselbach.
En general, los líquidos de mayor viscosidad presentan una mayor resistencia a la rotura y
deformación que los líquidos de baja viscosidad cuando se agitan. Por consiguiente, forman
gotitas de emulsión mayores y más estables comparadas con las de baja viscosidad. Es por ello
que, a medida que aumenta la viscosidad de la fase acuosa, la distribución se vuelve más amplia
y se desplaza a diámetros mayores. Al agregarse un reticulante como el glutaraldehído, se
observa una aglomeración total y casi instantánea del coacervado, incluso a 1 mmol/g gelatina.
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Resultados similares fueron obtenidos por Sutaphanit y Chitprasert (2014), en donde observaron
que al incrementarse la concentración de gelatina por encima de 16%p/v, se obtenía una solución
muy viscosa que desarrollaba clusters irregulares de MC.
Estos resultados permitieron establecer la concentración de gelatina al 1%p/v como la más
adecuada para el proceso ya que, en el intervalo de pH estudiado, se obtuvo mejor morfología de
MC.
Para reducir el número de variables de proceso y el número de pruebas a realizar, un
screening previo permitió establecer como valores constantes la proporción volumétrica
gelatina/agente inductor en 1/1, la temperatura de microencapsulación y gelificación en 40°C y
10°C respectivamente, las velocidades de agitación durante los procesos en 1500 y 2500 rpm, el
tiempo de hardening, fijación o deposición de la gelatina en 30 min y el tiempo de reticulación al
agregar el glutaraldehído, en 30 min. En todos los ensayos realizados a diferentes pH y usando
sulfato de sodio como agente inductor se obtuvieron MC en forma positiva, resultados que
concuerdan con los obtenidos por Okada et al., (1985b), los cuales confirmaron que la efectividad
del sulfato de sodio es independiente del pH.
Los resultados de la caracterización morfológica, estabilidad y tamaño contenidos en la
tabla IV y conseguidos de las microfotografías expuestas en la figura 1, permiten establecer que
bajo las tres condiciones de operación de pH, al aumentar la concentración de glutaraldehído
agregado, se observa una disminución en el tamaño de las MC obtenidas, tanto las que se
encuentran contenidas en los clusters o aglomeraciones (reducción aproximada de dos puntos,
cuarta columna desde la izquierda) como las que se encuentran dispersas en el medio (sin
cambios numéricos apreciables, quinta columna). Esto fue corroborado por Thakkar y Murthy
(2005) e Iwanaga et al., (2003), estableciendo que el control sobre la densidad de reticulación es
posible ya sea prolongando el período de reacción de reticulación o aumentando las
concentraciones de glutaraldehído.
Asimismo, a diferentes pH, se observa un cambio morfológico en los clusters pasando de
esféricos simples individuales para pH 3,5 (microfotografías A y B) a esféricos concatenados
definidos a pH 5,6 (microfotografías C y D) y a ovoides irregulares con múltiples brazos a pH 9,5
(microfotografías E y F).
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acarrea la aparición de MC en estado disperso en el medio, de tamaño mucho menor (del orden
de los 2 micrones) a las contenidas en los clusters. Como lo revelan los datos de la quinta
columna de la tabla IV, estos diámetros son prácticamente independientes del pH y de la
concentración de glutaraldehído agregado, no siendo así su naturaleza de agregación. Se observa
que a los pH de 3,5 y 5,6 la dispersión es menos acentuada lo que lleva a una agregación difusa y
extendida de estas pequeñas MC (microfotografías A*, B*, C* y D*). Por el contrario, a pH 9,5 y a
ambas concentraciones de glutaraldehído, se observa una dispersión estable de MC sin formación
de clusters (microfotografías E* y F*).
Figura 1. Microfotografías a 100X de las MC de gelatina 1%p/v a pH 3,5-5,6-9,5 y con 1-10 mmol
glutaraldehído/g gelatina. A) al finalizar el proceso. A*) a los 30 min de finalizado.
4. Conclusiones
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El método puesto a punto en este estudio se aplicará en la microencapsulación de aceite
esencial de pomelo para ser utilizado como aromatizante o conservante en la industria alimenticia.
Reconocimientos
Los autores desean agradecer la predisposición y el apoyo de la Mg. Ing. Liliana M. Cáceres y del
Centro QUIMOBI (UTN) – IMIT (CONICET) en el desarrollo del presente trabajo de investigación.
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