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Absorción de hierro mejorada del pan fermentado con ácido láctico (un in vivo / ex

estudio en vivo)

La modificación de la dieta para aumentar la biodisponibilidad de hierro es una estrategia


efectiva para compensar la deficiencia nutricional de hierro.

En este estudio, investigamos el efecto de la fermentación de ácido láctico de la masa de pan


sobre la absorción de hierro en

Células Caco-2 y ferritina sérica en ratas. Se prepararon cuatro tipos de pan: pan ordinario; pan
+ hierro; pan +

hierro + Lactobacillus acidophilus (L. acidophilus) y finalmente, pan + L. acidophilus. Para


estudio in vivo, 24 ratas

fueron divididos en cuatro grupos y alimentados con cada tipo de pan. El nivel de ferritina en
suero se midió después de 30 días.

Para el estudio ex vivo, cada tipo de pan fue digerido y agregado a las células Caco2 y a la
formación de ferritina en las células.

se evaluó. Los resultados mostraron que al agregar L. acidophilus a la masa, la formación de


ferritina aumentó

significativamente en comparación con los controles en las células intestinales (in vitro) y
suero animal (in vivo). De acuerdo con la

resultados, la absorción de hierro del pan fermentado con ácido láctico fortificado con hierro
podría incrementarse y debido a ese hierro

pan fermentado con ácido láctico fortificado, posiblemente un suplemento simple y de bajo
costo para la deficiencia de hierro

pacientes anémicos

INTRIDUCCION

La deficiencia nutricional más común en humanos es la deficiencia de hierro,

con casi 1,62 billones de personas que sufren de anemia alrededor

El mundo (Diego Quintaes et al., 2017). Los humanos necesitan comida para revivir

hambre y evitar el riesgo de enfermedades relacionadas con la nutrición, también para


mejorar

El bienestar físico y mental de los consumidores (Siro et al., 2008).

Hay una serie de compuestos adicionales que se agregarán a los alimentos,

que se llaman enriquecimiento o fortificación. Los nutrientes esenciales son

a veces incluido en los alimentos para prevenir o corregir lo demostrado

deficiencia de uno o más elementos en toda la población o unos pocos

grupos específicos (Diego Quintaes et al., 2017). Uno de los ejemplos de


La fortificación de alimentos es una serie de productos, que se fabrican a partir de

harinas de cereales (por ejemplo, pan, refrigerios de cereales y cereales para el desayuno). Tal

los cereales se usan como un método saludable para reemplazar el hierro para las necesidades
diarias

o para la deficiencia de hierro (Allen et al., 2006; Lopez et al., 2016).

El hierro suplementario en la fracción rica en fitato y fibra

la solubilidad del salvado de trigo se ve afectada por las condiciones del pH gastrointestinal y

la presencia de varios minerales como Ca, Zn y Cu (Platt y

Clydesdale, 1987; Diego Quintaes et al., 2017).

La reducción de

elementos inhibidores de fitato y la mejora de la solubilidad del hierro,

junto con un volumen elevado de ácido láctico en los productos fermentados, tienen

sido justificado El efecto del mecanismo de fermentación láctica en

se desconoce el hierro Hubo un aumento en las especies de Fe hidratado (3+) después de

La fermentación láctica sin cambios significativos en el Fe hidratado.

(2+) (Scheers et al., 2016). Sin embargo, eliminar fitatos puede ser un

método eficaz para aumentar la biodisponibilidad de hierro. Esto depende

en los contenidos de la dieta, la solubilidad de los alimentos ingeridos en presencia

de inhibidores como fitatos y polifenoles (Hallberg y Hulthén,

2000). Estudios recientes han demostrado que las fuentes microbianas son más

suministro prometedor para la producción de fitasas y como consecuencia

Reducir el nivel de fitatos. Lopez y col. sugirió que la fitasa puede ser

sintetizado por organismos que se utilizan como iniciadores microbianos para alimentos

tratamiento. Para mostrar esto, después del aislamiento de bacterias de ácido láctico de

masa madre, demostraron que estas bacterias podían secretar fitasas

enzimas, que pueden destruir el ácido fítico (alrededor del 30%) sin

Cualquier influencia sobre las bacterias. El ácido fítico es un ejemplo de "antinutrientes"

ya que une minerales en el tracto digestivo, haciéndolos menos disponibles para

absorción (Lopez et al., 2000; Idris et al., 2019). Durante el preparación de panes de masa
fermentada, la fermentación de ácido láctico puede degradar

los fitatos y, por lo tanto, aumentan la biodisponibilidad del hierro. Por lo tanto, láctico

La fermentación ácida es un método simple y natural de preparación de alimentos.


(Hallberg y Hulthén, 2002; Pleissner et al., 2017). Bacterias de ácido láctico

representa una mayor parte de los microorganismos presentes en la masa madre

y productos lácteos fermentados (Umeki et al., 2004; Angmo et al., 2016).

El pan es la parte principal de la comida diaria de un humano y el preparado

la masa se mantiene como masa fermentada cruda para el uso al día siguiente. Esta manera de

la preparación del pan se conoce como pan de masa madre y está bien documentada

en California, donde el principal lactobacillus (L.) es L.

San Francisco. Las propiedades microbianas de esta fermentación no son

definido pero si se introdujeran bacterias probióticas, podría proporcionar a largo plazo

beneficios para la salud a través del aumento de la biodisponibilidad de hierro

(Tieking et al., 2003). Los probióticos son suplementos dietéticos que son

beneficioso para el huésped y mejora el equilibrio de la microflora intestinal.

Los productos probióticos contienen bacterias que tienen efectos beneficiosos sobre

salud del consumidor. La historia del uso de microorganismos vivos en los alimentos.

especialmente las bacterias productoras de ácido láctico, para mantener y

mejorar la salud humana, se remonta a hace 100 años (Bottazzi, 1983;

Kopp-Hoolihan, 2001).

El objetivo de este estudio fue investigar la influencia del contenido del pan.

probióticos en la absorción de hierro del pan. El pan fue horneado con

lactobacilos para estandarizar la masa de levadura, con y sin

fortificación de hierro El pan digerido in vitro se añadió a una célula Caco-2.

monocapa para evaluar la formación de ferritina.

MATERIALES Y METODOS

2.1. Procedimientos para hacer pan

La masa se preparó mezclando una bolsita de levadura (Harvest Gold,

levadura seca de acción rápida para pan casero, bolsita de 6 g, Reino Unido) y un

tableta de sulfato ferroso triturada a 100 g de harina integral

(McDougall, Reino Unido) y 100 ml de agua destilada. Durante la noche culturas de

Lactobacillus acidophilus (L. a) se lavaron y se volvieron a suspender en PBS

para producir aproximadamente 107 ufc / ml. Dos ml de cada suspensión bacteriana fueron

combinado con la masa. La muestra de masa sin bacterias y


la masa sin hierro y bacterias se usaron como controles. Cuatro diferentes

se prepararon tipos de masa: grupo 1, pan ordinario; Grupo 2,

pan + hierro; grupo 3, pan + hierro (Fe) L. acidophilus probiótico

bacterias y finalmente; grupo 4 pan + L. acidophilus Cada tipo de pan

estaba seco y en polvo. Para el estudio in vivo, 24 ratas Sprague-Dawley

fueron divididos en cuatro grupos y alimentados con cada tipo de pan. los

el nivel de ferritina en suero se midió después de 30 días. Simular in vivo.

proceso de digestión del pan mientras pasa por el estómago y el duodeno,

se realizó la primera digestión péptica e intestinal y el dializado

se recogió y luego se cultivaron células Caco-2 bajo hierro libre y

Medios de contenido de hierro. Finalmente, el dializado recogido se insertó en el

Se midió el medio de cultivo y el valor de ferritina formado por las células.

La masa sin hierro y la masa fortificada con hierro sin bacterias fueron

utilizado como las variables de control. Se incubaron diferentes tipos de masa

durante 18 ha 37 ° C. El pan se horneó en la plancha y se secó hasta

masa constante a 50 ° C y triturada con una licuadora (Atomix).

2.2. Procedimientos in vitro

2.2.1. Cultivo de células

Las células Caco-2 se compraron de ECACC (CB No: 02D052, Reino Unido) en

paso siete y cultivado a 37 ° C y 5% de CO2 en mínimo esencial

Medio (Sigma M 2279) con solución de aminoácidos no esenciales al 1%

más 1% de L-glutamina. El medio se preparó agregando 10% de feto

suero de ternera (Lablech 4-101-500) y 1% de penicilina y estreptomicina

(10,000 U ml-1 y 10,000 mg ml-1) (GIBCO 15140-122).

En este ensayo, se utilizó Iron Free Media (IFM). Esto contenía

Medio esencial mínimo (GIBCO 41500–018) con TUBOS (Sigma

P1851), penicilina 10,000 U ml-1 y estreptomicina 10,000 μg / ml (GIBCO

15140–122) Hidrocortisona (Sigma H0888-1G), Insulina (Sigma I1882),

Selenito de sodio (Sigma S5261-10G), Triiodo-L-tirronina, sal de sodio

(SigmaT6397-100G) y factor de crecimiento epidérmico (Sigma E4127)


(Glahn et al., 1998).

2.2.2 Cepa probiótica y condiciones de cultivo

L. acidophilus NCIMB 701748 se obtuvo de DSM (17938) Cultivado en caldo De man, Rogosa &
Sharp (MRS) o en agar MRS placas a 37 ° C en condiciones anaeróbicas (en frasco anaeróbico,
Oxoid Ltd., Reino Unido) durante 18-20 h.

2.2.3. Digestión in vitro

Se agregaron dos gramos de cada muestra de pan a 10 ml agrupados frescos

saliva humana Para imitar el paso del pan a través del

estómago y duodeno, se realizó digestión péptica e intestinal.

Para la digestión péptica, 0,5 ml de solución de pepsina (Sigma P-7000,

500 unidades / mg de proteína) se añadieron a 10 ml de cada muestra de pan en un

tubo de cultivo con tapón de rosca. El tubo fue tapado, colocado horizontalmente y

incubado a 37 ° C en un agitador oscilante, a 55 oscilaciones por minuto durante

duración de 60 min. Una bolsa de diálisis de 1.3 cm (peso molecular cortado

12,000-14,000, Sigma D9652) que contiene 10 ml de tampón PIPES 150mM

(Sigma P 1851) (pH 6,7) se colocó en el sistema digestivo y se incubó

a 37 ° C, luego continuó durante 30 min.

Para la etapa de digestión intestinal, 2.5 ml de extracto de pancreatina-bilis

mezcla (0.4 mg / ml de pancreatina porcina, 4 × especificaciones USP, y

Se añadieron 2,4 mg / ml − 1 de extracto de bilis porcina en 120 mmolL − 1 NaCl) a

el tubo y se incubó a 37 ° C durante 2 h. En la etapa final de la digestión.

procedimiento, se usaron 1 ml de dializado y 1 ml de IFM fresco

para el ensayo de cultivo de tejidos para aumentar la absorción de hierro (Gangloff et al.,

1996). El procedimiento de inmunoensayo enzimático se completó a través de

el uso del kit Spectro ferritin (Ramco laboratories, Inc. USA, S 22).

2.3. Sección in vivo

2.3.1. Animales

Veinticuatro ratas macho Sprague-Dawley (peso 125-150 g) fueron

obtenido del "Instituto Pasteur de Irán" y alojado individualmente

en jaulas de acero inoxidable y plástico a 25 ± 1 ° C, 55 ± 5%

humedad en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h. Tenían libre acceso al agua y


Chow con 50 mg kg-1 (50 ppm) de contenido de hierro (Roussel et al., 2006).

2.3.2. Dietas animales

Se prepararon cuatro tipos de pan como se describió anteriormente (Sección

2.1) y cada variedad se secó y se pulverizó, luego 87.5 g en polvo

pan se suplementó con 5 g de caseína, 5 g de aceite de maní, 0,75

NaCl y 0,7 g de Caco3. La harina de trigo es rica en vitaminas y esencial.

nutrientes, por lo tanto no había necesidad de agregar vitaminas y minerales.

Después de 7 días de adaptación, los animales se dividieron en cuatro grupos,

cada grupo contiene seis ratas con pesos similares. Las ratas fueron alimentadas

durante 30 días: el grupo I recibió pan; grupo II: pan + Fe; grupo III,

pan + Fe + L. acidophilus, y finalmente; grupo IV, pan + L. acidophilus.

La dosis de suplemento de hierro fue de 0.25 mg por kg de cuerpo.

peso y 108 ufc ml-1 probiótico. Todos los animales recibieron cuidado humano en

cumplimiento de la Guía para el cuidado y uso del laboratorio animal

preparado por el Instituto de Recursos Animales de Laboratorio y publicado

por los Institutos Nacionales de Salud (publicación NIH no. 85–23).

Comité Institucional de Ética Animal de la Universidad de Medicina de Alborz

Ciencias fue aprobado este proceso de estudio (número de referencia REC:

Abzums. Rec. 1394,30).

2.3.3. Diseño del estudio

Los animales fueron alimentados con alimentos definidos en los diferentes grupos para

30 días y luego la extracción de sangre se realizó mediante punción cardíaca

mientras que los animales anestesiados generalmente usan éter. Los animales fueron

asesinado al final del estudio. La ferritina sérica se midió usando el

Kit ELISA de rata Ferritin (FTL) de Abcam según el protocolo del fabricante.
Fig. 1. Fotografías de la célula Caco-2 durante el período

de estudio con dos aumentos ✕ 400 (A), ✕ 1000

(B) con microscopio de luz invertido; Microvellosidades

Formateado por Caco-2 Cells representado por Electron

Microscopio con 30,000 aumentos (C) y

Tinción periódica de ácido de Schiff (PAS) de The Caco-2

Células para el ensayo de formación de mucina (D).

2.4. análisis estadístico

Todos los datos se presentan como media ± SEM. El estadístico significativo

Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante la prueba t y ANOVA unidireccional

utilizando el paquete de software SPSS (Versión 16.0: Chicago, IL). Un valor de

P <0,05 se consideró significativo. Todos los experimentos fueron repetidos

al menos tres veces

3. Resultados

3.1. Pan horneado y digestión in vitro

El probiótico aislado se añadió a hierro fortificado y no fortificado.

harina, luego se preparó la masa. Los panes fueron horneados, digeridos

y se añadieron 300 μL de fluido ingerido de 10 ml al Caco-

2 pozos celulares. Como se muestra en la Fig. 1A-B, las células Caco-2 se alcanzaron

confluencia, y luego se detectaron microvellosidades diferenciadas y

microscopía electrónica (Fig. 1C) 14 días después del cultivo. Ácido periódico

Schiff (PAS) también mostró formación de mucinas en las células Caco-2

(Fig. 1D). Después de 22 h, las células se lisaron y se analizaron para determinar la formación
de ferritina.

Masa sin hierro y masa fortificada con hierro sin bacterias

fueron utilizados como controles.

Como se muestra en la Tabla 1, relación de formación de ferritina en hierro / sin bacterias

grupo en comparación con el no hierro / sin bacterias (como control) estaba alrededor de

1.27, que esta diferencia no fue significativa. Pero la formación de ferritina

La proporción en el grupo sin hierro / bacteria en comparación con el grupo control se


incrementó significativamente a 1.53. Sin embargo, la mayor formación de ferritina
se detectó en el grupo de hierro / bacteria que era 110 ± 15 ng / ml y su

la ración fue de alrededor de 1.833 en comparación con el grupo control.

3.2. Resultados in vivo

La base de la ferritina sérica fue 644.7 ± 130.5 μg / dl, que fue

obtenido del grupo de control (Pan (sin hierro / sin bacterias)) (Tabla.

2) El aumento de ferritina sérica en el grupo de Pan + Fe (Hierro / sin bacterias) fue

no significativo en comparación con el control, pero este nivel se incrementó

significativamente en el grupo Pan + lactobacillus (sin hierro / bacteria). A pesar de que,

se detectó un nivel de ferritina significativamente más alto en suero animal

en Pan + Fe + lactobacillus (Hierro / bacteria) que ambos factores fueron

presencia en este grupo. La medida de ferritina fue alrededor de 1.82 veces más

que su grupo de control de medida.

4. Discusión

La fermentación es uno de los métodos más antiguos de preparación y

mantenimiento de alimentos y bebidas. Porque es una forma natural, también

Aumenta el valor nutricional de los alimentos. Los consumidores consideran esto

método como ejemplo de ningún aditivo alimentario (Scheers et al., 2016). los

composición bacteriana de tales alimentos fermentados con ácido láctico normalmente

constituye diferentes cepas de lactobacillus, especialmente aquellas que son más resistente al
ácido que otros y puede crecer bien a valores de pH alrededor
4–5 (Molin, 2001). Para obtener resultados confiables que describan la disponibilidad

de hierro en alimentos en presencia de bacterias probióticas por técnicas in vitro,

combinamos la digestión in vitro con técnicas de diálisis y

Sistemas celulares Caco-2. Nuestro estudio reveló que la fermentación de ácido láctico de

el pan, fortificado o no fortificado con hierro, aumenta la formación de ferritina

en las células intestinales, lo que puede deberse a la producción de

ácido por LAB, así como la actividad fitasa de L. acidophilus. En nuestro anterior

trabajo, investigamos la actividad fitasa de un grupo de probióticos

bacterias y entre ellas, L. acidophilus T, mostraron la fitasa más alta

actividad (Khodaii et al., 2013). Los nombres químicos del ácido fítico son inositol

hexakisfosfato (IP6), polifosfato de inositol o fitato cuando está en

forma de sal (Grusak, 2009). Debido a su estructura única, es altamente

unidos con cationes como calcio, magnesio, zinc, cobre, hierro

y potasio y forma sales insolubles. Por lo tanto, esta combinación

tiene un efecto negativo en la absorción y digestibilidad de estas sales por

animales (White y Broadley, 2009).

La enzima que degrada el fitato llamada fitasa que se considera como

nueva solución para la digestión de fitato durante el procesamiento de alimentos y en

El tracto gastrointestinal. Solo se forma inositol hexa- y pentafosfato

tener un efecto negativo en la absorción de las sales en el aparato digestivo

sistema y otros acidificantes hidrolizados tienen poca capacidad para unirse

solutos o sus complejos que son solubles (Kumar et al., 2010;

Kumar y Sinha, 2018).

Según los resultados adquiridos por López et al., Fermentación completa

de harina de trigo usando una masa madre que contiene Lactobacillus mezclado

plantarum S18, Leuconostoc mesenteroides S50 y levadura de panadería después

90 min y después de 5 h de fermentación redujeron 30% y 60% de ácido fítico,

respectivamente (López et al., 2001). Najafi y col. reducido la acidez de

pan en un 70–80% usando una masa madre del 30% que contenga cualquiera de las bacterias

Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides y lactobacillus


acidophilus en combinación con levadura de panadería, durante la fermentación de 90
minutos

(Najafi et al., 2012).

Masa madre a través de la producción de ácido, proporcionando el pH óptimo para

actividad de las fitasas de harina y producción de la enzima fitasa por su

Bacterias y levaduras de ácido láctico, hidroliza el ácido fítico. Ácidos orgánicos

También aumenta la descomposición del ácido fítico por la fitasa a través del aumento

solubilidad del complejo de ácido fítico.

Brune y col. demostró que la fermentación de masa madre aumenta el hierro

absorción (Brune et al., 1992). Las bacterias del ácido láctico están desactivadas.

durante la cocción del pan y no puede tener un efecto directo sobre la absorción de hierro.

Aumento de la ingesta de hierro debido a los resultados del consumo de alimentos


fermentados

por la presencia de pequeños ácidos orgánicos producidos durante la fermentación

proceso de ácido láctico. Uno de los más importantes de estos pequeños

Los ácidos orgánicos son lactato. Los ácidos orgánicos contribuyen a varias características.

de los alimentos fermentados que son efectivos en la absorción de hierro:

a) reducción del pH, que activa las fitasas endógenas, lo que conduce

a una descomposición del fitato y libera el hierro del ironphytate insoluble

complejos (Sandberg y Andersson, 1988). Este es quizás el

parte más importante en todo el mecanismo de acción de alimentos fermentados. si)

La capacidad de amortiguación del ácido láctico en el rango de pH de 3-5, que puede

inducir un retraso en la formación de compuestos de hierro menos solubles como

hidróxido férrico con biodisponibilidad reducida (Hallberg y Rossander,

mil novecientos ochenta y dos). c) La facilitación de la formación de complejos solubles de


ácido orgánico de hierro.

al pH intestinal (Hallberg y Rossander, 1982). d) Causando un

retraso en la tasa de vaciado gástrico (Liljeberg y Björck, 1998), este retraso

conduce a un aumento en el tiempo de contacto del hierro con un nivel duodenal

(Salovaara et al., 2003). En el presente trabajo, realizamos un estudio in vivo.

comparar los resultados obtenidos de los estudios in vitro de células Caco-2 con el

estudio animal Nuestros resultados confirmaron que existe una fuerte correlación
entre la absorción de hierro in vitro (en células Caco-2) e in vivo (en animales

estudios).

Los resultados obtenidos en este estudio mostraron que la adición de L.

acidophilus a la masa aumentó la formación de ferritina en el

niveles in vitro e in vivo significativamente más que el grupo control. En conclusión,

el pan fermentado con ácido láctico fortificado con hierro posiblemente sea un

suplemento factible para pacientes anémicos con deficiencia de hierro. Un aumento en

absorción de hierro del pan fermentado con ácido láctico fortificado con hierro, con

pan fermentado con ácido láctico fortificado con hierro, posiblemente sea un simple y

suplemento de bajo costo para pacientes anémicos con deficiencia de hierro.

Reconocimiento

El presente estudio es financiado por la Universidad Alborz de

Ciencias Médicas. Los autores agradecen a los técnicos de laboratorio de Zistyar Sina por

proporcionando el equipo y su asistencia técnica.

Declaración de interés

Los autores no tienen conflicto de intereses.