Manual de Prácticas de Bioquímica

PRACTICA N° 7

TRANSPORTE ELECTRONICO: ESTUDIO DE LA ACCION ENZIMATICA DE

LA SUCCINATO DESHIDROGENASA Y DE LACTATO DESHIDROGENASA

OBJETIVO

1. Poner de manifiesto experimentalmente una de las etapas del metabolismo intermediario y

la acción de las enzimas de oxido-reducción, haciendo uso de un aceptor de electrones
como el azul de metileno.

2. Verificar la acción inhibitoria del malonato sobre la succinato deshidrogenasa y del cianuro a
nivel de la cadena respiratoria mitocondrial.

ESTUDIO DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA

INTRODUCCIÓN

Las transformaciones biológicas de sustratos comprenden procesos de oxido-reducción

y transferencia de electrones a través de una serie de sistemas enzimáticos.

En las oxido-reducciones se produce transferencia de electrones a partir de un dador

hasta un aceptor. Algunas veces el transporte de electrones es realizado mediante la
transferencia de átomos de hidrógeno o bien átomos de hidrógeno y un electrón. Las enzimas
que realizan este tipo de reaccione son las deshidrogenasas pudiendo ser piridin (NAD,
NADH) o flavina (FAD) dependientes; además existen los citocromos que son de naturaleza
ferroporfirínica y se encuentran ordenados de acuerdo a su potencial de oxido reducción
constituyendo la llamada "Cadena de Transporte Mitocondrial".

Algunos compuestos orgánicos coloreados, al aceptar hidrógenos se convierten en

leucoderivados. Tal es el caso del azul de metileno cuyo potencial de oxido-reducción es +0.01
y el 2,6-diclorofenolindofenol cuyo potencial de oxido-reducción es +0.22.

La succinato deshidrogenasa (SHD) es una flavoproteína unida a hierro no hémico. El

metal tiene como finalidad actuar como enlace para conservación de energía y desacoplar los
dos equivalentes reductores del ion hidrogeno aceptado por la flavina y, finalmente estabilizar
la forma semiquinoide de la flavina.

Diversas sustancias pueden actuar inhibiendo los sistemas biológicos de oxido-

reducción. Por ejemplo, el malonato actúa específicamente inhibiendo a la succinato
deshidrogenasa por un mecanismo competitivo; por lo tanto la prueba experimental con azul
de metileno será negativa, es decir no se decolora por no haber movilización de electrones. El
cianuro, actúa impidiendo la reoxidación de los citocromos, pues se combina específicamente
con el Fe++ de la citocromo oxidasa; por ello los citocromos permanecen reducidos e
incapaces de seguir actuando y se bloquea la respiración.

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAL
Sucrosa 0.25 M

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Succinato de sodio 0.1 M

Malonato de sodio 0.5 M
Buffer fosfato pH 7.4 0.1 M
Azul de metileno 0.05%
Aceite mineral
Tubos de ensayo
Pipetas
Morteros
Centrífuga

METODO DE TRABAJO
A) Preparación del homogenizado. Colocar un mortero sobre hielo picado, luego pesar 10.0
g. de hígado, corazón o músculo de rata o de conejo; picarlo y colocarlo sobre el mortero.
Añadir 90.0 ml de sucrosa 0.25 M la cual debe estar fría, homogenizar y luego centrifugar a
8000 rpm durante 10 min. Decantar el sobrenadante en un beaker y guardarlo e frío hasta su
uso.

Prepare el siguiente sistema de tubos:

Tubo N° 1 2 3 4
Succinato de sodio 0.1 - 0.5 0.5 0.5
Buffer fosfato pH 7.4 2.0 2.0 2.0 2.0
Malonato de sodio - - 0.5 -
Cianuro de potasio 0.1 M - - - 0.5
Agua destilada 1.5 1.0 0.5 0.5
Azul de metileno 0.05% 0.5 0.5 0.5 0.5
Extracto enzimático 0.5 0.5 0.5 0.5
Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0

El contenido de cada uno de los tubos se mezcla rápidamente antes de agregar el

aceite mineral, el cual tiene la función de crear un medio libre de oxígeno. Llevar a baño maría
a 37°C observar el decoloramiento de cada tubo cada 5 min. Discuta los resultados.

CUESTIONARIO
1. Haga un esquema de la oxidación del succinato por acción de la succinato
deshidrogenasa, además acople la cadena respiratoria para indicar el destino final del
hidrógeno y de los electrones del succinato.

2. Cuál es el efecto de cada uno de los siguientes inhibidores sobre el transporte electrónico
y la formación de ATP en la cadena respiratoria.
a) Azida
b) Atractilósido
c) Rotenona
d) Monóxido de carbono
f) Antimicina A

3. Que son los desacopladores de la fosforilación oxidativa. Ponga por lo menos dos
ejemplos.

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