LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGA DE LOS ALIMENTOS

Mtodos de anlisis del contenido protenas en alimentos

La determinacin de la CANTIDAD DE PROTENA
de un alimento no es sencilla y el valor obtenido en cada caso depende del MTODO utilizado.

Muchos

NALISIS DEL CONTENIDO DE PROTENAS O S EN LOS ALIMENTOS

2013
Dra. Roxana Verdini

ensayos dependen de la presencia de una determinada cadena lateral aminoacdica (Lowry, Biuret).

los

resultados analticos se vern condicionados por la proporcin del aminocido en cuestin en las protenas sometidas al ensayo y necesitarn ser referidos a alguna protena estndar.

Otros

mtodos se basan en la determinacin del contenido de nitrgeno total (Kjeldahl).

Mtodos de anlisis del contenido protenas en alimentos

Existen numerosas fuentes de NITRGENO NO PROTEICO que pueden interferir en algunos mtodos de anlisis: aminocidos
libres, pptidos pequeos, libres pequeos cidos nucleicos, fosfolpidos, aminoazcares, porfirina, algunas vitaminas, alcaloides, cido rico, urea, iones amonio, etc.

Mtodos de anlisis del contenido protenas en alimentos

Los mtodos mas comnmente empleados son: Kjeldahl, Kjeldahl/Bethelot, Kjeldahl/Bethelot Biuret, Lowry, absorbancia a 280 nm, fijacin de colorantes, turbidimtrico. turbidimtrico

Otras

fuentes de interferencia pueden ser los otros macronutrientes presentes en los alimentos como hidratos de carbono y lpidos.

Mtodos de anlisis del contenido protenas en alimentos

Estos mtodos se fundamentan en: determinaciones de nitrgeno, enlaces peptdicos, peptdicos aminocidos aromticos, absortividad UV de las protenas, grupos amino libres, propiedades de dispersin de la luz, capacidad de adhesin de colorantes. colorantes

Mtodo de Kjeldahl j
Es
un mtodo oficial descrito en mltiples normativas: AOAC, ISO, Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias.

El mtodo de Kjeldahl se basa en los siguientes supuestos: la

proporcin de nitrgeno no protenico en un producto alimenticio es demasiado pequea para ser significativa, i ifi ti

una

determinacin del contenido de nitrgeno it t t l (refleja total ( fl j con suficiente fi i t precisin i i el contenido de protena del alimento,

la l proporcin i que representa t el l nitrgeno it en la mayor parte de las protenas alimenticias es de 16%. 6%

Mtodo de Kjeldahl j
FUNDAMENTO

Mtodo de Kjeldahl j
UN POCO DE HISTORIA

Involucra la conversin del nitrgeno presente a

sulfato de amonio por OXIDACIN HMEDA con cido sulfrico.

En

Posteriormente

el sulfato de amonio se descompone por ALCALINIZACIN con hidrxido de sodio y DESTILACIN del amonaco liberado captndolo en una solucin cida.

1883 el investigador dans Johann Kjeldahl desarroll el proceso bsico del conocido mtodo actual de anlisis de protenas por el mtodo Kjeldahl, ms propiamente, para analizar nitrgeno orgnico.

El

mtodo original fue sufriendo luego algunas modificaciones.

Finalmente
amonaco.

se realiza una VALORACIN del

Esta

determinacin incluye todo el nitrgeno reducido presente (-NH2 y =NH), de modo que los compuestos amoniacales, urea y aminocidos libres son tambin valorados.

Wilforth Gunning Arnold Winkler

(1885) (1889)

Mtodo de Kjeldahl j
UN POCO DE HISTORIA

Mtodo de Kjeldahl j
UN POCO DE HISTORIA

En

el mtodo original la digestin se efectuaba con una mezcla de cido sulfrico y anhdrido fosfrico y la oxidacin se completaba mediante la adicin de permanganato de potasio.

Los

catalizadores permiten acortar el tiempo de digestin y actan como transportadores de O2.

Otra

Las

modificaciones del mtodo resultado ms tiles emplean:

que

han

modificacin ampliamente aceptada es la introducida en la etapa de destilacin propuesta por Winkler:

xido

de mercurio como catalizador de oxidacin (Wilfoth). K2SO4 para aumentar el punto de ebullicin del cido sulfrico (Gunning). (Gunning) CuSO4 tambin como catalizador de oxidacin (Arnold).

originalmente se utilizaba cido sulfrico valorado para captar el amonaco, titulando

posteriormente su exceso con NaOH valorado. valorado

Mtodo de Kjeldahl j
UN POCO DE HISTORIA

Mtodo de Kjeldahl j
ESQUEMTICAMENTE

La modificacin consiste en:

recibir el NH3 sobre una solucin de cido brico, valorarlo directamente con solucin valorada de H2SO4 (Winkler) o HCl.

Ventajas: la solucin de cido brico no necesita

ser exactamente medida, medida eliminando los errores en la medicin del cido valorado en el colector y por otra parte slo se requiere una solucin valorada H2SO4 (Winkler) o HCl.

El uso de perlas de vidrio sirve de ncleo para la

formacin de burbujas.

Mtodo de Kjeldahl j
ALGUNOS EQUIPOS

Mtodo de Kjeldahl j
ALGUNOS EQUIPOS

Los os equ equipos pos mas as modernos ode os viene e e co con u un s sistema ste a
de extraccin y neutralizacin de gases:

u una au unidad dad Scrubber Sc ubbe que b bloquea oquea e el paso y

neutraliza las condensaciones cidas,

una

bomba de recirculacin de agua que proporciona un gran caudal de vaco para la aspiracin de los gases.

Mtodo de Kjeldahl j
VENTAJAS DEL MTODO

Mtodo de Kjeldahl j
FACTOR DE CONVERSIN

Apropiado para varios tipos de productos. Alta fiabilidad. Usado como mtodo de referencia. referencia
DESVENTAJAS DEL MTODO

El El

contenido porcentual promedio de N en las protenas de diversos alimentos es de 16%. 16% factor para convertir N en protenas sera entonces 100/16 = 6,25.

Este
nitrogenados no

Interfieren
proteicos.

compuestos

factor general de conversin no es sin embargo exacto, ya que las protenas de origen animal contienen generalmente menos nitrgeno y las de origen vegetal ms.

Uso de catalizadores txicos o caros. caros Eleccin del factor de conversin.

As, As

el factor de conversin para la protena del trigo es 5,7 y para la de productos lcteos es 6,38.

Mtodo de Kjeldahl j
FACTOR DE CONVERSIN

Mtodo de Kjeldahl j
FACTOR DE CONVERSIN

Actualmente

se conoce el contenido de N, y por lo tanto el factor apropiado, apropiado de una gran cantidad de productos agrcolas.

Debido

a la confusin que podra derivarse del hecho de utilizar el factor general de conversin 6 25 o el especfico para la protena en estudio 6,25

Es necesario aclarar siempre en los informes

el factor de conversin utilizado para el clculo de protenas.

Mtodo de Kjeldahl j
ECUACIONES
Digestin g : n-C-NH2 + mH2SO4 + catalizadores CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

Mtodo de Kjeldahl j
CLCULOS
%N = V x N x 14 x 100 1000 p %N = V x N x 0,014 x 100 p V: mL de cido N: normalidad del cido P: gramos de muestra , equivalente q volumtrico del N 0,014:

Neutralizacin y destilacin (NH4)2SO4 + 2 NaOH ( NH3 + H3BO3 Titulacin H2BO3- + H+ H3BO3

+

2 NH3 + Na2SO4 + 2 H2O NH4 + H2 BO3-

Mtodo de Kjeldahl j
Mtodo de Kjeldahl /Berthelot

Mtodo de Kjeldahl j
Mtodo de Kjeldahl /Berthelot

Este

mtodo combina la digestin hmeda del mtodo de Kjeldahl con la reaccin colorimtrica de Bethelot.

La absorbancia del complejo de se lee a 540 nm. Se calibra con solucin de sulfato de amonio. Por lo tanto lo que se determina por este mtodo
es nitrgeno total.

El producto de la digestin se neutraliza, neutraliza se lleva

a volumen final y luego una alcuota se somete a la reaccin colorimtrica.

El

NH4+ presente en la digestin sulfrica reacciona con el fenol e hipoclorito de sodio en medio alcalino, formndose un complejo de color azul.

La

intensidad del color producido es directamente proporcional a la cantidad de N amoniacal presente en la muestra. muestra

Otros mtodos
Mtodos qumicos

Otros mtodos
Mtodo de absorbancia a 280 nm

Los alimentos son una matriz compleja por lo que se sugiere que estos mtodos empricos e indirectos sean calibrados con el mtodo de Kjeldahl.

El

mtodo se basa absorbancia a 280 nm.

en

la

medicin

de

Las protenas poseen una banda de absorcin en

el UV entre190 y 290 nm debida fundamentalmente a la presencia de aminocidos aromtcos (tirosina, triptofano y fenilalanina). fenilalanina)

Se espera una buena correlacin entre estos dos

tipos de determinaciones de protena cuando la relacin N no proteico/N proteico es baja y constante

Son

Es un mtodo simple, rpido y no destructivo. Es un mtodo directo para la determinacin Es

satisfactorios para leche y cereales e insatisfactorios para la mayora de los vegetales y mezclas de alimentos.

de protenas que puede aplicarse en algunos sistemas alimenticios. alimenticios necesaria la calibracin con una protena estndar. estndar

Otros mtodos
Mtodo de absorbancia a 280 nm

Otros mtodos
Mtodo de Biuret

La solucin debe ser clara e incolora, la turbidez

puede afectar los resultados.

Las protenas y pptidos reaccionan con iones de

cobre en solucin alcalina, formando un quelato color violeta de configuracin desconocida.

El

contenido de aminocidos aromticos difiere considerablemente entre las distintas protenas.

La intensidad de color del complejo a 550 nm es

directamente proporcional a la concentracin de protenas presente en la muestra. muestra

Los

cidos nucleicos interfieren, no as el amonio.

Es Es

rpido, simple y no detecta nitrgeno de fuentes no proteicas o no peptdicas. peptdicas necesaria la calibracin con una protena estndar estndar.

Otros mtodos
Mtodo de Biuret

Otros mtodos
Mtodo de Lowry

Altas Las Se

concentraciones de carbohidratos, lpidos pueden causar opalescencia en la solucin final. sales de amonio tambin interfieren en la reaccin. ha encontrado poca aplicacin en anlisis de alimentos debido a la presencia de interferentes como azcares reductores que reducen el ion cprico en medio alcalino produciendo resultados insatisfactorios. Ejemplo: leche.

Cuando

se agrega reactivo de Folin a una protena, sta se reduce a un complejo azul de molibdeno por la oxidacin de los aminocidos tirosina triptfano, tirosina, triptfano cistina, cistina cistena e histidina. histidina

La

absorbancia del complejo se lee a 750 nm (mayor sensibilidad) o a 500 nm. nm

Tiene
Biuret. Biuret protena. protena

mayor sensibilidad que el mtodo del

La respuesta del color vara de acuerdo al tipo de La

intensidad del color no es estrictamente proporcional a la concentracin de protena. protena

Otros mtodos
Mtodo de Lowry

Otros mtodos
Mtodos de adhesin de colorante

Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de

carbono interfieren en la reaccin.

Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de

carbono interfieren en la reaccin.

Es menos afectado por la turbidez de la muestra. Es afectado por la presencia de azcares

reductores al igual que el mtodo de Biuret.

Es menos afectado por la turbidez de la muestra. Es afectado por la presencia de azcares

reductores al igual que el mtodo de Biuret.

Pueden adherirse colorantes CATINICOS (BRADFORD). Sus fundamentos son diferentes.

ANINICOS

Otros mtodos
Mtodos de adhesin de colorante aninico

Otros mtodos
Mtodos de Bradford

El

COLORANTE ANINICO se une a los grupos catinicos de los residuos bsicos de las protenas (histidina, arginina, lisina) y forman un complejo insoluble. insoluble

El

Se basa en la unin del colorante Coomassie Blue G-250 a las protenas.

Las

El

colorante en exceso permanece soluble y se relaciona inversamente con la concentracin de protenas.

protenas (aminocidos bsicos y aromticos) se unen a la forma azul para formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. libre

El

Este mtodo es sensible, simple, rpido, barato y

pocas sustancias interfieren en su determinacin. determinacin

mtodo con el colorante NARANJA 12 est descripto en la AOAC para leche fluida, helados, leche en polvo descremada (=480 nm).

Entre

Algunos compuestos no proteicos como almidn

o metales pueden unirse al colorante.

las sustancias que interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas. bsicas

No interfieren los carbohidratos.