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DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CURSOS

DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA SALUD

CARRERA
Medicina Veterinaria y Zootecnia

PRODUCTO FINAL
Diseño de primers para el exón 10 del gen PKD en gatos

CURSO
Biología Molecular y Genética

PROFESOR
Blgo. Mg. Rensson Homero Céliz Ygnacio

SECCIÓN 3A TEO

AUTORES
Tineo Pacheco, Liz Lucero
Salazar Bazalar, Andrea Thais
Torres Pumajulca, Miguel
Rivera Chavez, Moroni Jarid

LIMA – PERÚ
2023-1
DEDICATORIA

Dedicado a nuestros padres que gracias a su esfuerzo


hoy podemos estar en camino a desarrollarnos
como parte de la siguiente generación de médicos
en medicina humana y médicos veterinarios.

DISEÑO DE PRIMERS PARA EL EXÓN 10 DEL GEN PKD EN GATOS 2


ÍNDICE

I. INTRODUCCIÓN 4

1.1. Definición de la enfermedad 5


1.2. Tipo de herencia 5
1.3. Nombre y localización cromosómica del gen involucrado 6
1.4. Nombre y función de la proteína codificada 6
1.5. Mutación que ocasiona la enfermedad 6
1.6. Consecuencia de la mutación 7
1.7. Sintomatología de la enfermedad 7
1.8. Importancia veterinaria 7
1.9. ¿Qué son los primers? 8
1.10. Importancia del diseño de primers para el diagnóstico molecular 9

II. METODOLOGÍA Y RESULTADOS 10

2.1. Pasos realizados 10


2.1. Gráfica de primers 15
2.3. Tabla representativa 17

III. CONCLUSIONES 18

IV. REFERENCIAS 19

V. ANEXOS 20

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I. INTRODUCCIÓN

Se puede decir que la conciencia sobre la enfermedad PKD en gatos puede variar
según la región y la comunidad de estudio, sin embargo, a nivel Perú podemos decir
que muchos propietarios de gatos pueden no estar familiarizados con la enfermedad
o no tener conocimiento de la importancia de las pruebas de detección, ya que no
existe una difusión de información precisa sobre la enfermedad PKD en gatos.

Dentro de este trabajo de investigación, buscamos recopilar información para


entender desde un punto biológico más sobre este tema, aplicando el conocimiento
adquirido sobre el diseño de primers.

Como futuros médicos veterinarios, creemos que estos aspectos son fundamentales
para aumentar el interés, la conciencia y a largo plazo fomentan prácticas de cría
responsables de esta enfermedad, ya que la técnica de diseño de primers ya ha
sido el camino para el estudio de mutaciones, así como posibilidades para mejorar
tratamientos e incluso desarrollar alternativas de cura.

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1.
1.1. Definición de la enfermedad

Se conoce que la enfermedad renal poliquística, conocida en inglés


como PKD es una afección congénita en la que se forman quistes en
los riñones, lo que eventualmente conduce a la insuficiencia renal
crónica. Esta enfermedad afecta a diferentes razas de gatos, pero se
ha observado una predisposición racial en los gatos de raza Persa
(Avgeris y Daniel, 1990; DiBartola, 2000). Se ha determinado que la
enfermedad tiene una herencia autosómica dominante (Eaton et al.,
1997). La importancia creciente de esta enfermedad se debe, en gran
medida, al mayor uso de la ecografía en los últimos diez años en la
práctica clínica de animales pequeños, lo que ha permitido detectar
más casos de manera no invasiva y sensible antes de que aparezcan
los signos de insuficiencia renal (Ferreira et al., 2013).

1.2. Tipo de herencia

El PKD es el resultado de una anomalía de un solo gen autosómico


dominante, ya que se encuentra en un cromosoma no sexual y cuya
versión dominante del gen determinará el fenotipo o rasgo observable
en un individuo, incluso si sólo está presente una copia del gen.

Es decir, si una especie hereda el alelo dominante de este gen de uno


de sus progenitores, este expresará el PKD, independientemente del
alelo que haya heredado del otro progenitor.

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1.3. Nombre y localización cromosómica
Este gen se localiza en el cromosoma E3 en la especie felina. El
cromosoma E3, coin un total de 46 exones, según NCBI (ver Anexo1).
Con un tipo de variante nonsense y presentando una mutación en
c.9882C>A (ver Anexo 2).

1.4. Nombre y función de la proteína codificada


La proteína codificada en esta mutación es específicamente la
policistina-1 (ver Anexo3). Esta proteína desempeña un papel
importante en la función de los riñones y otros órganos. La proteína
policistina es un canal iónico y está involucrada en la regulación del
flujo de iones y moléculas en las células.

En el contexto de la enfermedad renal poliquística (ERP), la proteína


policistina-1 se encuentra mutada o presenta anomalías en su
estructura (ver Anexo4), lo que afecta su función normal. Esto
conduce a una alteración en el desarrollo y la función de los túbulos
renales, lo que resulta en la formación de quistes renales y la
progresión de la enfermedad.

La proteína policistina-1 también se ha implicado en diversas


funciones celulares, incluyendo la señalización celular, la interacción
con otras proteínas y la regulación del crecimiento y la diferenciación
celular.

1.5. Mutación que ocasiona la enfermedad


Descripción detallada de la mutación que ocasiona la enfermedad según el OMIA, o
del gen que se elegirá para el agente bacteriano.

[Descripción detallada]
- Nomenclatura:
- Tipo de mutación según sustitución y según impacto en la
secuencia de la proteína:

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- El exón 14 del gen PKD se encuentra…
donde está ubicada la mutación (ejemplo: exón 14 del gen PKD). Encontrar
el exón en cuestión es fundamental pues es a este exón a quien se le va a
diseñar los 10 pares de primers. Si no se encuentra el exón no se podrá
diseñar los primers.

1.6. Consecuencia de la mutación


Los gatos afectados nacen ya con este trastorno hereditario, en la
mayoría de veces sin pruebas como el test genético no se sabe si el
animal se ve afectado sin embargo cuando el animal se desarrolla las
bolsas quísticas que están ubicadas en el riñón de modo que mientras
van creciendo los quistes llegan a dañar el órgano incluso dejarlo sin
función alguna y concluyendo con un fallo renal grave.

1.7. Sintomatología de la enfermedad


Los signos clínicos que se pueden observar serán a partir de los 3 a
10 años de edad y estos serían, Letargia, Hematuria,
Vómitos,polidipsia y fiebre no obstante estos síntomas dependen de la
gravedad en la insuficiencia renal poliquística.

1.8. Importancia veterinaria de la PKD en gatos


La enfermedad renal poliquística o PKD (Polycystic kidney disease), es
una enfermedad hereditaria de tipo autosómica dominante que ha sido
descrita tanto en perros como en gatos, siendo en ésta última especie
más común, las razas Persa, Himalaya y exóticos son las más
afectadas por ésta enfermedad, su prevalencia varía en los diferentes
países pero se calcula que afecta al 38% de la población mundial de
gatos de estas razas, también ha sido reportada en el 16% de otras
razas en las que se ha practicado “outcrossing”, tales como American
Shorthairs, Siamés, American curls, Scottish folds, Birmano, Ragdoll,
American rex devon y Maine coon. (Cortés, 2016)
La prevalencia de esta enfermedad ha sido estimada en Estados
Unidos de América, Australia, Reino Unido, Alemania, Francia,
Finlandia, Italia y otros países, con valores que varían desde un 8% a
64%, con un promedio aproximado a nivel mundial de un 38%, pero

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los datos no están disponibles en Chile (...). Los datos de enfermedad
renal poliquística obtenidos en este estudio fueron comparados con las
prevalencias descritas en otros países y se comprobó que la forma de
presentación de la enfermedad según la edad y el sexo de los
individuos, con lo descrito en la literatura mediante la prueba de
ChiCuadrado (χ²). Se examinaron un total de 53 gatos. Se encontró la
presencia de enfermedad renal poliquística en 25 (47,2%) de los gatos
examinados. No hubo diferencia significativa entre los grupos de edad,
ni entre machos y hembras, pero sí se encontró diferencia en la
procedencia de los animales (criaderos comerciales o crianzas
caseras). (Galleguillos, 2007, p. 4)

1.9. ¿Qué son los primers?


Se denomina primers a las pequeñas secuencias de ADN o ARN que
se utilizan como cebadores o iniciadores en técnicas de amplificación
de ácidos nucleicos, como la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR, por sus siglas en inglés). Los primers son esenciales para la
amplificación selectiva de un fragmento específico de ADN o ARN.
Consisten en secuencias cortas de nucleótidos complementarios a
regiones específicas del ADN o ARN objetivo. Estas secuencias de
nucleótidos se diseñan de manera que se unen a las regiones de inicio
y finalización del fragmento deseado durante el proceso de
amplificación. En la PCR, se agregan dos primers, uno para cada
cadena del ADN objetivo, y actúan como cebadores para la síntesis de
nuevas cadenas de ADN. Estos primers se unen de manera
complementaria a las secuencias de ADN objetivo y proporcionan el
punto de partida para la replicación del fragmento de interés. Los
primers suelen tener una longitud de aproximadamente 15-30 pares de
bases y se diseñan de manera específica para cada aplicación,
considerando factores como la secuencia objetivo, la temperatura de
fusión y la especificidad. En resumen, los primers son secuencias de
ADN o ARN que se utilizan como iniciadores en técnicas de

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amplificación de ácidos nucleicos para dirigir la amplificación selectiva
de fragmentos específicos de ADN o ARN.

1.10. Importancia del diseño de primers para el diagnóstico molecular

El diseño de primers desempeña un papel crucial en el diagnóstico


molecular debido a su importancia en varios aspectos.

En primer lugar, los primers deben ser específicos, es decir, diseñados


para reconocer y unirse únicamente a la secuencia de interés. Esto
garantiza la amplificación precisa y evita la detección de secuencias no
deseadas, lo que es esencial para obtener resultados confiables.
Además, los primers deben ser sensibles, permitiendo la detección de
cantidades mínimas de material genético para diagnosticar
enfermedades o infecciones en sus etapas tempranas.

El diseño de primers también debe considerar aspectos técnicos,


como la longitud óptima, la temperatura de fusión y la estabilidad de
los primers. Estos parámetros técnicos influyen en la eficiencia de la
amplificación y en la calidad de los resultados obtenidos. Asimismo, la
variabilidad genética debe ser tomada en cuenta al diseñar primers
para detectar variantes genéticas específicas.

Es importante asegurarse de que los primers sean compatibles con las


variantes más comunes en la población objetivo, permitiendo una
detección eficiente. En resumen, el diseño adecuado de primers es
esencial para el éxito de los análisis moleculares y el diagnóstico de
enfermedades. Un diseño preciso, sensible y específico de los primers
permite obtener resultados confiables y precisos, lo que facilita la
identificación temprana de enfermedades, la selección de tratamientos
adecuados y el monitoreo de la respuesta terapéutica.

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II. METODOLOGÍA Y RESULTADOS
2.
2.1. Pasos realizados

Para la identificación del gen PKD se accedió a la base de datos


OMIA, NCBI, Ensembl y Uniprot, con estas herramientas pudimos
obtener la secuencia, función y dónde se origina la mutación del gen.

Entonces:
- Ingresamos a la página de OMIA.
- Buscamos a la especie doméstica “felis catus” y el gen PKD. Al
ver la lista de opciones disponibles decidimos seleccionar la
información correspondiente al gen PKD1 ingresada en 2004.
Esta elección se basó en nuestra necesidad de obtener detalles
más amplios y un estudio con un período de tiempo más
extenso, lo cual nos proporcionaría un mayor nivel de
información.

https://www.omia.org/OMIA000807/9685/

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- Ingresamos a la base de datos NCBI. Aquí encontramos: la
ubicación del cromosoma, número de exones y posición de la
cadena. Mencionar que en este resultado no fue necesario
invertir la dirección ya que se mostraba en Forward, que
coincidía con su dirección original.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100144606,%20a

- Luego, ingresamos a Ensembl. Para ello debemos darle clic a


Secuencias de Referencia NCBI, identificamos al ARNm
como: policistina-1 isoforma X2, y ahí se presentó el exón se
encuentra la mutación, el gráfico de resumen nos permitirá
conocer a los UTR, intrones y exones, luego le damos clic en
exones y configuramos en DNAc para ver la secuencia de
bases nitrogenadas, retornamos a la página de OMIA para
verificar la posición de la mutación, el cual se comprueba en
Ensembl, delimitamos a los exones desde los extremos
izquierdo y derecho con un rango de 200 a 300 nucleótidos,
este debe fijado con la tecla CONTROL y seleccionar con el
mouse. Una vez identificados los intervalos le damos clic en
Primer - BLAST.

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- En Primer - BLAST:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGA
NISM=Felis%20catus&INPUT_SEQUENCE=NC_058383.1&PRI
MER5_END=39428882&PRIMER3_START=39429154&PRIME
R5_START=39428669&PRIMER3_END=39429430&PRIMER_
PRODUCT_MAX=761&SHOW_SVIEWER=true, ingresamos a
la sección: EXON/ INTRON SELECTION, el código del gen por
intervalos de bases nitrogenadas, el cual estará de manera
automática, respecto a los parámetros se debe especificar el
tamaño hasta 1000 pares de bases, la temperatura de Melting
debe estar entre 57 y 63, valor óptimo de 60 y una diferencia de
3. En la siguiente sección: PRIMER PAIR SPECIFICITY
CHECKING PARAMETERS, ingresamos a la data de base y le
daremos clic en Refseq representative genomes y en
organismo, la especie trabajada “felis catus”. En la sección de
PRIMER PARAMETERS, especificamos los valores mínimo 15
y máximo 25 respecto al primer size para obtener un mínimo de
10 opciones de primers, el primer GC content (%) debe estar
entre 40 y 60, en Max poly-x debe haber máximo 3 bases
nitrogenadas que deberán repetirse, en Max complementarity
debe haber un nivel de espontaneidad de 5 para evitar ser
rigurosos en el criterio. Finalmente, click en GET PRIMERS.
- Una vez encontrados los 10 primers con el programa
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ct
g_time=1688523851&job_key=m5FEAFgbVbNyjU-IQuhrujjzeog
V4GGVFA) estos deberán ser exportados a un cuadro de excel
donde deberemos analizar cada primers y finalmente comparar.
- En el cuadro de excel se deberá copiar en orden los 10 Primers
encontrados, identificar la dirección Forward y Reverse con su
respectivo número de secuencia, tamaño de amplicón (pb), el
largo, GC porcentual y temperatura.
- Nos registramos en el programa IDT
(https://www.idtdna.com/calc/analyzer) para obtener los

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valores del HAIRPIN, SELF-DIMER Y HETERODIMER de cada
primers encontrado a través del cálculo del OligoAnalyzer,
donde deberemos considerar con énfasis el máximo valor
encontrado de energía (el primero de la lista).
- Finalmente en el programa BLAST NCBI
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PA
GE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&
LAST_PAGE=tblastn) deberemos ingresar la secuencia fasta de
cada primers, especificamos el organismo (especie) y damos
clic en BLAST, de esta manera encontraremos los porcentajes
de identidad (ideal 100% de similitud) y e-value, este último
deberá tener un valor ideal menor a 0.05, mientras más bajo
sea mejor opción de elección tendrá por su valor de
especificidad. Se debe tomar en cuenta que para la elección del
primers se debe considerar los requisitos, generalmente el valor
que más se acerque a 0.

https://rapid.ensembl.org/Felis_catus_GCA_018350175.1/Transcript/Summary?g=ENSFCTG0000500
3963;r=E3:39396378-39441593;t=ENSFCTT00005010701

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https://rapid.ensembl.org/Felis_catus_GCA_018350175.1/Transcript/Summary?g=ENSFCTG0000500
3963;r=E3:39396378-39441593;t=ENSFCTT00005010701

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=Felis%20catus&INPUT_SEQU
ENCE=NC_058383.1&PRIMER5_END=39428882&PRIMER3_START=39429154&PRIMER5_START
=39428669&PRIMER3_END=39429430&PRIMER_PRODUCT_MAX=761&SHOW_SVIEWER=true

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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=Felis%20catus&INPUT_SEQU
ENCE=NC_058383.1&PRIMER5_END=39428882&PRIMER3_START=39429154&PRIMER5_START
=39428669&PRIMER3_END=39429430&PRIMER_PRODUCT_MAX=761&SHOW_SVIEWER=true

2.2. Gráfica de primers

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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1688523851&job_ke
y=m5FEAFgbVbNyjU-IQuhrujjzeogV4GGVFA

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2.3. Tabla representativa

TAMAÑO DEL ΔG
NOMBRE DEL SECUENCIA TM ΔG HAIRPIN ΔG SELF-DIMER BLAST
SENTIDO AMPLICÓN LARGO %GC HETERODIMER
PRIMER 5’→ 3’ (ºC)
(PB) (KCAL/MOL) (KCAL/MOL) (KCAL/MOL) % Identidad (e-value)

Forward TCCTGTGGGAGTAGGTCTGG 20 60.00 59.96 -0.83 -4.67 100% 0,0030


Primer1 460 -8.2 kcal/mol
Reverse CAGGACGAGAGAAAGGCTGG 20 60.00 60.11 0.25 -3.61 100% 0,0030

Forward GGGCTAATCTCTGACGGCTG 20 60.00 60.25 -0.03 -3.61 100% 0,003


Primer2 629 -4.87
Reverse GACCACATAGGTCACCAGGC 20 60.00 60.11 -3.12 -5.99 100% 0,003

Forward GGCTAATCTCTGACGGCTGG 20 60.00 60.25 -0.03 -3.61 100% 0,0030


Primer3 522 -6.21
Reverse CCTCGCCTCACTTTCTCAGG 20 60.00 60.11 0.21 -4.67 100% 0,0030

Forward CACTGGGTTTCCTGTGGGAG 20 60.00 60.25 -2.44 -4.64 100% 0,0030


Primer4 486 -6.14
Reverse CCCTCGCCTCACTTTCTCAG 20 60.00 60.11 0.62 -3.61 100% 0,0030

Forward CAGGGTCACTGGGTTTCCTG 20 60.00 60.25 -0.95 -6.62 100% 0,0030


Primer5 521 -6.62
Reverse GACAGAGCCATCAGGTCCAG 20 60.00 59.82 -0.52 -3.14 100% 0,0030

Forward TAATCTCTGACGGCTGGCTG 20 55.00 59.54 0.76 -3.61 100% 0,0030


Primer6 622 -6.62
Reverse CACATAGGTCACCAGGCACA 20 55.00 59.68 0.23 -4.41 100% 0,0030

Forward GTCACTGGGTTTCCTGTGGG 20 60.00 60.54 -2.99 -3.3 100% 0,0030


Primer7 518 -6.62
Reverse AGACAGAGCCATCAGGTCCA 20 55.00 60.25 -0.52 -3.14 100% 0,0030

Forward GGTCACTGGGTTTCCTGTGG 20 60.00 60.54 -2.99 -3.3 100% 0,0030


Primer8 590 -6.62
Reverse ACATAGGTCACCAGGCACAC 20 55.00 59.68 0.23 -4.41 100% 0,0030

Forward GCTGTGACACTCGCTCAACT 20 55.00 60.60 0.14 -3.61 100% 0,0030


Primer9 454 -6.21
Reverse CCACATAGGTCACCAGGCAC 20 60.00 60.39 0.01 4.41 100% 0,0030

Forward GGGTTTCCTGTGGGAGTAGG 20 60.00 59.38 -0.83 -4.67 100% 0,0030


Primer10 513 -6.62
Reverse GAGACAGAGCCATCAGGTCC 20 60.00 59.54 -0.52 -3.14 100% 0,0030

Tabla 1. Sets de primers diseñados para el exón 25 del gen PKD en felinos.

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III. CONCLUSIONES

1. Después de generar la lista de 10 primers, evaluamos y determinamos que


solo 2 de ellos cumplían con las condiciones necesarias en relación a la
Temperatura de Melting (Tm): El Primer6 y el Primer10.
Esto debido a que identificamos que su Temperatura de melting (Tm) estaba
dentro del rango de 57°C a 60°C. Además, verificamos que no hubiera una
diferencia de más de 5°C entre la temperatura del primer en sentido Forward
y la temperatura del primer en sentido Reverse.

2. Luego, entre estos Primers se analizó la energía para la generación de


estructuras secundarias ΔG (kcal.mole-1). Concluyendo que el Primer6
cumplía con mayor éxito con esta característica, ya que la energía de su
cadena Reverse estaba más cerca de la energía 0.

3. Finalmente, concluímos que el Primer6 sería la mejor opción a considerar en


la compra de un Primer para este estudio, ya que además de cumplir también
con la condición de tener un nivel de energía más cercano a 0, su diferencia
de Temperatura de melting (Tm) -entre su sentido Forward y su sentido
Reverse- era menor en comparación al resultado del Primer10, 0.14 y 0.16
respectivamente.

DISEÑO DE PRIMERS PARA EL EXÓN 10 DEL GEN PKD EN GATOS 18


IV. REFERENCIAS

Cortés, I. L. (2016). Enfermedad renal poliquistica e hipoplasia renal en una gata


persa. Vanguardia Vet.
https://www.vanguardiaveterinaria.com.mx/efecto-del-acido-docsahexaenoico

De, F., Veterinarias, C., Pecuarias, Y., De, E., & Bosco, E. (2007). Estudio
Epidemiológico de Casos de Enfermedad Renal Poliquística en Gatos Persa.
Repositorio.Uchile.Cl/.
https://repositorio.uchile.cl/bitstream/handle/2250/130876/Estudio-epidemiolo
gico-de-casos-de-enfermedad-renal-poliquistica-en-gatos-Persa.pdf?sequenc
e=1

Eaton, K. A., Biller, D. S., Dibarto-La, S. P., Radin, M. J., Wellman, M. L.


1997.
Autossomal dominant polycystic kidney disease in persian and
persian-cross cats. Veterinary pathology. Columbus. 34 (2): 117-126

Ferreira, G.S.1, Galvão, A.L.B.1, Socha, J.J.M. (2010). Vista de Enfermedad renal
poliquística en gatos: Revisión de la literatura. Revistas.um.es.
https://revistas.um.es/analesvet/article/view/125011/117041

Lyons, L. A., Biller, D. S., Erdman, C. A., Lipinski, M. J., Young, A. E., Roe, B. A., Qin,
B., & Grahn, R. A. (2004). Feline polycystic kidney disease mutation identified
in PKD1. Journal of the American Society of Nephrology: JASN, 15(10),
2548–2555. https://doi.org/10.1097/01.ASN.0000141776.38527.BB

Montaña, A., Patiño, N., Larrate, C., Zambrano, F. A., Martínez, J., Lozano, H., &
Lozano, E. (2018). Actualización en enfermedad renal poliquística. Revista de
La Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia, 66(1), 107–116.
https://doi.org/10.15446/revfacmed.v66n1.60760

What is polycystic kidney disease? (2023, Febrero 27). National Institute of Diabetes
and Digestive and Kidney Diseases; NIDDK - National Institute of Diabetes
and Digestive and Kidney Diseases.
https://www.niddk.nih.gov/health-information/kidney-disease/polycystic-kidney
-disease/what-is-pkd

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V. ANEXOS

Anexo 1
PKD1 polycystin 1, transient receptor potential channel interacting [ Felis catus
(domestic cat) ]. NCBI.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100144606

Anexo 2
OMIA:000807-9685 : Polycystic kidney disease in Felis catus. OMIA.

https://www.omia.org/OMIA000807/9685/

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Anexo 3
Proteína modificada del gen PKD. NCBI.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ipg/XP_011289012.3

Anexo 4
Estructura de la policistina-1 (PC1). UNIPROT.

https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q7Z443/entry

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