TINCION DE PAPANICOALOU

Se debe a George Papanicolaou, médico de origen griego

nacido en el año 1883 quién estudió el ciclo menstrual en
cobayos.
Realizó frotis del material obtenido y los correlacionó con
frotis de mujeres.
En 1925 inició un estudio sistemático de frotis vaginales en
pacientes voluntarias.
TINCION DE PAPANICOALOU
.

Fue el primero en observar células neoplásicas en una paciente

portadora de cáncer. En 1928 convocó a nuevas pacientes con
cáncer y dio a conocer sus experiencias al mundo científico,
despertando escaso interés.
TINCION DE PAPANICOALOU

Al cabo de 13 años recién se valoró su hallazgo “que el

cáncer de cérvix pudiera ser descubierto mediante la
observación de las células recogidas en un portaobjetos”
ATLAS DE CITOLOGÍA EXFOLIATIVA

 .
CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO DE PAPANICOLAOU

 Es una técnica sencilla de realizar.

 Demora aproximadamente 20 minutos.

 Es de relativo bajo costo.

 Es una coloración que permite diferenciar el núcleo, el citoplasma.

 Y establecer grados de maduración y diferenciación celular.

CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO DE PAPANICOLAOU

 La tinción nuclear permite distinguir detalles finos de la estructura cromatínica y diferenciar células malignas de
benignas.
 La tinción citoplasmática permite reconocer permite reconocer subtipos celulares.

 Utiliza tres colorantes principales, uno para tinción nuclear y dos colorantes para tinción citoplasmática.
PROCEDIMIENTO

El método se inicia con la fijación de la muestra, en forma

inmediata.
Papanicolaou incluía cada lámina en una mezcla de alcohol y
éter al 50%.
FIJACIÓN

 La fijación tiene por finalidad preservar el detalle cromatínico, el detalle citoplasmático, y facilitar el diagnóstico
diferencial
COLORANTES

 El método de Papanicolaou es una coloración tricrómica que permite

distinción entre células basófilas, eosinófilas.
 Los colorantes utilizados son:
 Hematoxilina de Harris
 Orange G
 EA-50
PREPARACIÓN DE COLORANTES

 HEMATOXILINA DE HARRIS: consta de solución A y solución B

 Solución A: hematoxilina 15 gramos, alcohol 100° 150 c.c. Disolver la hematoxilina en el alcohol
 Solución B: alumbre de Potasio 150 gramos, agua destilada 3000 c.c. Disolver calentando, o dejar hasta el día
siguiente y se disuelve solo
 Volumen final 3 litros
PREPARACIÓN DE COLORANTES

 Mezclar solución A con solución B.

 Llevar hasta punto de ebullición.
 Retirar del fuego.
 Agregar 3,6 gramos de óxido rojo de mercurio, en forma muy lenta, y en un principio en pequeña cantidad,
porque puede rebasar violentamente.
 Volver a hervir por escasos minutos.
 Enfriar rápidamente (en algunos laboratorios la sumergen en agua con trozos de hielo).
 Una vez absolutamente fría, se agregan 9 c.c. de ácido acético glacial.
PREPARACIÓN DE COLORANTES

 ORANGE-G: consta de una solución stock y una solución de orange

 Solución stock: orange 15 gramos, agua destilada 150 c.c.
 Se disuelve el orange en el agua destilada en un vaso de precipitado calentando suavemente, sin que hierva
 Luego la solución stock se agrega a 2850 c.c. de alcohol de 95°
 Se mezcla bien y se agregan 0,45 gramos de ácido fosfotúngstico
 Mezclar, guardar en frasco ámbar
 Filtrar cada vez que se vaya a usar (cristaliza con gran facilidad)
PREPARACIÓN DE COLORANTES

 EA-50: este colorante está compuesto por una mezcla de colorantes, tales como Eosina, Verde luz, Pardo
Bismarck, en base alcohólica
 Es de difícil preparación por lo que se prefiere comprarlo preparado
 Existen diversas concentraciones de EA, como EA-25, EA-36, EA-50
 El EA-50 carece de pardo Bismarck, porque este colorante no aporta nada a la tinción en el espectro de luz
visible
MÉTODOS DE TINCIÓN

 Existen dos técnicas de tinción: progresiva y regresiva

 Papanicolaou recomienda la tinción regresiva, sobretiñendo los núcleos, y retirando luego el exceso de colorante
con solución de ácido clorhídrico. De ese modo los núcleos neoplásicos destacan fuertemente por su
hipercromasia.
PASOS DE LA TINCIÓN
 Lavado en agua corriente (3-5 minutos)
 Hematoxilina de Harris (3-5 minutos)
 Lavado en agua corriente (3-5 minutos)
 Agua ácida (2 inmersiones)
 Lavado en agua corriente(3-5 minutos)
 Alcohol de 95º (10 inmersiones)
 Alcohol de 95º (10 inmersiones)
 Orange G (3-5 minutos)
 Alcohol de 95º (10 inmersiones)
 Alcohol de 95º (10 inmersiones)
 EA-50 (1-3 minutos)
PASOS DE LA TINCIÓN

 Alcohol 95º (10 inmersiones)

 Alcohol 95° (10 inmersiones)
 Alcohol 100° (10 inmersiones)
 Alcohol 100° (10 inmersiones)
 Xilol (10 inmersiones)
 Xilol (10 inmersiones)
 Xilol (10 inmersiones)
 Xilol (10 inmersiones)
 Xilol de montaje
 Montaje con resina
RESULTADOS DE LA TINCIÓN DE PAPANICOLAOU

 Con la técnica de Papanicolaou las células epiteliales, presentan el núcleo de color azul, citoplasma rosado o verde
azulado, los glóbulos rojos de color rojo brillante y ocasionalmente de color verde, los leucocitos se tiñen de azul
pálido, núcleo azul oscuro, las bacterias se observan de color gris - violeta, verde o rosado y el mucus se tiñe de
color azul.
CONTROL DE CALIDAD EN LA COLORACIÓN

 Evitar efectuar pases demasiados enérgicos que puedan ocasionar pérdida celular.

 Drenar bien cada portaobjetos en los pasajes a diferentes soluciones, pero no permitir que el material se seque.

 Controlar cuidadosamente, los límites de tiempo en la coloración tal como indica la técnica.

 La permanencia por mayor tiempo del material citológico en los colorantes generalmente no es dañina, pero
tampoco es recomendable.
CONTROL DE CALIDAD EN LA COLORACIÓN

 Controlar la calidad de los colorantes, la acción de la Hematoxilina puede prolongarse, mediante adiciones diarias de pequeñas cantidades de
colorante fresco.

 Los colorantes citoplásmicos pierden su poder de coloración en menos tiempo, por tanto será necesario reemplazarlos cada semana o de
acuerdo al número de muestras que han sido procesadas.

 Es necesario filtrar diariamente la Hematoxilina antes de utilizarla, disminuir el tiempo recomendado cuando se emplea Hematoxilina nueva; la
intensidad de la coloración nuclear será regulada mediante examen microscópico; un aspecto opaco y grisáceo de las células, así como una falta de
contraste indica que las soluciones de colorantes deben ser reemplazadas.

 El reemplazo del agua, ácido clorhídrico, solución de hidróxido de amonio, así como la filtración o reemplazo de alcoholes y xilol reducirá el
riesgo de transferencia celular de un portaobjetos a otro y dará un aspecto claro a las células.

 La deshidratación, se efectúa con sustancias miscibles con el agua y que tengan afinidad por ella, el mejor agente deshidratante es el alcohol.
CONTROL DE CALIDAD EN LA COLORACIÓN

 También pueden emplearse la acetona y el alcohol isopropílico siendo el proceso de deshidratación gradual.

 El aclaramiento es una etapa de la tinción que además de eliminar el alcohol hace transparente el preparado microscópico, con este
objetivo se utiliza el xilol que es un buen agente aclarante.
 Cuando la deshidratación no es completa, este toma un aspecto lechoso al sumergirse la placa.

 El montaje permite obtener mejores resultados visuales, protege además el frotis teñido de las lesiones físicas y la decoloración.

 El medio de montaje debe secar sin provocar alteraciones en el aspecto de las células, no debe blanquear ningún colorante, así como
tampoco deberá producir pérdida del color en períodos prolongados.
CONTROL DE CALIDAD EN LA COLORACIÓN

 Al realizarse el montaje de los frotis, debe evitarse la formación de burbujas de aire, si existen
muchas burbujas, lo más aconsejable es repetir el procedimiento, si existen una o dos, pueden ser
expulsadas por presión ligera sobre el cubreobjetos, utilizando una pinza.
 Guardar los colorantes en frasco oscuro.
 Las modificaciones de la coloración de Papanicolaou se basan principalmente en la reducción en
el número de alcoholes, la preparación de las soluciones y los tiempos utilizados; esto se ajusta
en cada laboratorio hasta obtener la coloración deseada.
 Prof. Rosa Muñoz .Curso de educación continua.
 Dr. Luis Alberto Palaoro.