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Sesin Terico-Prctica 3
Manipulacin de muestras para su estudio al microscopio ptico1
PARTE TERICA2
3.1. Naturaleza y origen de las muestras.
3.2. Fijacin y conservacin de las muestras.
3.3. Diseccin o extraccin de partes de una muestra.
3.4. Tincin de las muestras.
3.5. Inclusin y montaje de la muestras.
Introduccin
La preparacin, o manipulacin, adecuada de las muestras es fundamental para llevar
a cabo su correcto estudio microscpico. Una deficiente preparacin de la muestra puede
llevarnos a su incorrecta visualizacin y, por tanto, a un mal estudio e interpretacin, que ni
el mejor de los instrumentos microscpicos nos podra solucionar. Las tcnicas para la
manipulacin y la preparacin de las muestras son muy numerosas y cada una est
orientada a conseguir unos resultados concretos; pero el tipo de muestra y lo que queramos
ver en ella tambin es determinante en la eleccin de una tcnica u otra. Los procedimientos
para la preparacin de muestras se pueden dividir en diferentes fases, o pasos tcnicos,
aunque, dependiendo del tipo de muestra, no todos son necesarios. Estos pasos se pueden
englobar en: fijacin, conservacin, diseccin o extraccin de partes, tincin, inclusin, y
montaje.
Tcnicas de microscopa
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origen no biolgico, suelen presentar ms dificultades para su estudio con este tipo de
microscopa, aunque con una preparacin especfica el anlisis puede ser totalmente
satisfactorio. Debido a la naturaleza del haz luminoso usado en la microscopia ptica, los
materiales opacos, o relativamente opacos, no suelen ser fcilmente observables con
fuentes de luz diascpica (luz transmitida), a no ser que, o bien se utilicen instrumentos
pticos especialmente diseados, o bien las muestras tengan pequeo tamao o se hayan
conseguido cortar en lminas muy finas. Un ejemplo de este ltimo caso lo encontramos en
el estudio de muestras geolgicas, para las que existen tipos de microscopio especficos,
denominados petrogrficos (materiales transparentes o semitransparentes) y metalogrficos
o metalognicos (materiales opacos), que combinan una iluminacin discopica y/o
episcpica (luz incidente) con la polarizacin del haz luminoso.
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Lmina 1. A.- Aspecto de un microscopio petrogrfico; B y C.- Imagen al microscopio petrogrfico de una lmina de pirita,
calcopirita y esfalerita obtenida por episcopa; C.- Imagen al microscopio petrogrfico de una lmina de dolomita obtenida
por diascopa
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coadyuvante, como los cidos actico y pcrico del Bouin. Los reactivos utilizados para fijar o
conservar son muy numerosos, existen tantos como necesidades, por lo que sera una tarea
ardua dar un listado completo.
Finalmente, la congelacin es tambin un mtodo de fijacin en muestras de origen
biolgicos, existiendo un gran nmero de dispositivos especficos para su manipulacin
posterior.
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sintticas, para obtener secciones ms finas destinadas al estudio microscpico tanto ptico
como electrnico. Algunas materiales inertes, como las fibras textiles, tambin tienen que ser
incluidas cuando quieren estudiarse en secciones.
A
Lmina 2. Proceso de inclusin en parafina. A.- Disposicin de la muestra en un molde; B.- Rellenado del molde con
parafina para hacer un bloque; C.- Cortado del bloque en un microtomo, donde se observa la obtencin de secciones
seriadas; D.- Captura de las secciones que estn depositadas en un bao de agua tibia; E.- Disposicin de la seccin
capturada sobre un portaobjeto.
Tanto las secciones, como las muestras completas o despiezadas, para ser
estudiadas al microscopio ptico deben disponerse sobre una pieza de cristal, o portaobjeto,
y ser cubierta por otra pieza de cristal, o cubreobjeto, generalmente ms fino. Para que la
muestra quede bien sujeta y preservada es necesario embeberla en un medio de montaje,
permitiendo, por otro lado, disminuir el fenmeno refractivo de la luz al atravesar la muestra.
Las secciones obtenidas de los bloques de parafina se les ha de eliminar la parafina para su
montaje final. Los medios de montaje puede ser hidroflicos (miscibles en agua) o
hidrofbicos (no miscibles en agua), siendo las muestras montadas con este ltimo tipo
mucho ms duraderas; pero tienen la desventaja que la muestra se ha de deshidratar.
Medios de montaje tambin hay muchos, pudiendo destacar el Hoyer como hidroflico y el
Blsamo de Canad como hidrofbico, aunque actualmente hay muchas resinas sintticas
que se asemejan bastante a este ltimo (DPX, por ejemplo). Aparte de preservar la muestra,
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Tcnicas de microscopa
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el medio de montaje tambin debe tener un buen ndice de refraccin, no dar color a la
muestra y no retraerse con el tiempo.
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A
Lmina 3. Proceso de tincin y montaje de la muestra. A.- Teido manual de la muestra; B.- Teido automtico de la
muestra; C.- Colocacin del cubreobjeto.
Figura 2.- Resumen de los pasos que se siguen para incluir una muestra en parafina
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Figura 2.- Resumen de los pasos que se siguen para teir un corte procedente de un bloque de parafina con la tincin de
rutina de hematoxilina-eosina
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Fuentes de informacin
1. Locquin, M. y Langeron, M. Manual de microscopia. Editorial Labor, S.A., Barcelona, 1985.
2. Molist, P., Pombal, M.A. y Megas, M. Atlas de Histologa Vegetal y Animal: Tcnicas histolgicas (on
line). Departamento de Biologa Funcional y Ciencias de la Salud. Universidad de Vigo
3. Paniagua, R., Nistal, M. Sesma, P., lvarez-Ura, M. y Fraile, B. Citologa e histologa vegetal y animal.
Biologa de las clulas y tejidos animales y vegetales. McGraw-Hill-Interamericana de Espaa, Madrid,
1993
4. The Internet Pathology Laboratory for Medical Education. Mercer University School of Medicine. The
Univesity of Utah
5. Unidad de Histologa. Departamento de Biologa Celular, Fisiologa e Inmunologa de la Universidad
Autnoma de Barcelona
6. Departamento de Edafologa y Qumica Agrcola de la Universidad de Granada
7. Departamento de Cristalografa y Mineraloga de la Universidad Complutense de Madrid
8. Molist, P., Pombal, MA. y Megas, M. 2009. Atlas de Histologa Vegetal y Animal (On line). Departamento
de Biologa Funcional y Ciencias de la Salud. Facultad de Vigo.
Las figuras B y C de la lmina 1 han sido obtenidas de J. Luque y J. Sierra, Prcticas de Mineraloga (no
Silicatos), Departamento de Cristalografa y Mineraloga de la Universidad Complutense de Madrid. Las
fotografas se encuentran en la direccin: http://www.ucm.es/info/crismine/Mine_nosilicat/Guion_visu.htm.
Las figuras de las lminas 2 y 3 han sido obtenidas en su totalidad de la pgina web The Internet Pathology
Laboratory for Medical Education, Mercer University school of Medicine de la University of Utah. Las fotografas se
encuentran en la direccin: http://library.med.utah.edu/WebPath/HISTHTML/HISTOTCH/HISTOTCH.html.
Los esquemas de las Figuras 1 y 2 se han obtenido de Molist, P., Pombal, MA. y Megas, M. 2009. Atlas de
Histologa Vegetal y Animal (On line). Departamento de Biologa Funcional y Ciencias de la Salud. Facultad de
Vigo. Los esquemas se encuentran en las direcciones: http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/3-resina.php y
http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/5-general.php