Resumen: La ferroptosis ha surgido como una potente forma de muerte celular no

apoptótica que ofrece una alternativa prometedora para evitar la quimiorresistencia

de las vías apoptóticas y sirve como vulnerabilidad del cáncer. En este trabajo
hemos construido un nanosistema biomimético de autoensamblaje de
nanofármacos que permite la administración conjunta de gefitinib (Gefi), ferroceno
(Fc) y dihidroartemisinina (DHA) para el tratamiento combinado de la ferroptosis y
la apoptosis. En el microambiente tumoral, este nanofármaco es capaz de
desensamblarse y desencadenar la liberación del fármaco bajo niveles elevados
de GSH. Curiosamente, el DHA liberado puede regular a la baja el nivel de GPX4
para potenciar la ferroptosis intracelular de Fc, ejecutando además la muerte de
las células tumorales con la quimioterapia concomitante de Gefi. Y lo que es más
importante, este nanofármaco proporciona una capacidad de focalización
altamente homóloga mediante el recubrimiento de membranas celulares
relacionadas y muestra una inhibición excepcional del crecimiento tumoral y la
metástasis, así como ningún efecto secundario perceptible durante los
tratamientos. Este sencillo nanofármaco autoensamblado de pequeño tamaño
molecular proporciona una nueva modalidad razonablemente diseñada para la
quimioterapia combinada con ferroptosis.

1. Introducción
La ferroptosis, como modo emergente no apoptótico de muerte celular, depende
de la oxidación del hierro y está mediada por peroxidaciones lipídicas (LPO), que
pueden inducir la muerte de células tumorales y reducir la quimiorresistencia de
las vías apoptóticas tradicionales [1-4]. Como forma de muerte celular
ferrondependiente, la ferroptosis está estrechamente relacionada con la presencia
de hierro ferroso (Fe2+) biodisponible, que participa en la reacción de Fenton con
peróxido de hidrógeno (H2O2), dando lugar a la producción de -OH virulento [5].
Por lo tanto, la administración in vivo de Fe2+ desempeña un papel importante en
el desencadenamiento de la ferroptosis específica del tumor, pero a menudo se ve
restringida por las características de oxidabilidad de la naturaleza, la inestabilidad
en las circulaciones sanguíneas y la baja selectividad tumoral. Para superar estos
obstáculos, en los últimos años se han iniciado muchos trabajos centrados en la
administración de la fuente de Fe2+ en nanomedicina, aunque la mayoría de los
estudios siguen basándose en los diferentes nanotransportadores para cargar
Fe2+ [6-12]. Sin embargo, todavía se enfrentan a algunos problemas en la carga
de Fe2+ debido a la oxidación del Fe2+ durante el transporte con una pobre
eficiencia de carga del fármaco. Por lo tanto, evitar la oxidación y mejorar la
eficiencia de carga del fármaco se han convertido en problemas urgentes a
resolver en la nanomedicina de ferroptosis. El ferroceno (Fc), como complejo
metal-orgánico, está compuesto por dos ciclopentadienos y Fe2+, que presenta
una excelente estabilidad química, hidrofobicidad y no toxicidad, y puede servir
como fuente eficaz de Fe2+ en el tratamiento de la nanomedicina de la ferroptosis
[13-16].
Recientemente, pruebas sólidas revelaron que algunas vías de señalización
antioxidante pueden inhibir eficazmente la sobreexpresión de peróxidos lipídicos
(LPOs), induciendo además la resistencia a la ferroptosis contra la muerte celular
[17-20]. La glutatión peroxidasa 4 (GPX4) es una glutatión (GSH) y glutatión
peroxidasa dependiente de selenio que desintoxica la formación de LPOs durante
el estrés oxidativo, que desempeña un papel importante en la vía de señalización
antioxidante (sistema xc -GSH-GPX4) [21-23]. El desarrollo de inhibidores de
GPX4 en el sistema xc -GSH-GPX4 puede disminuir la resistencia a la ferroptosis
y potenciar el efecto terapéutico [24]. Estudios recientes han demostrado que la
dihidroartemisinina (DHA) como un derivado de la artemisinina compuesto natural,
no sólo ampliamente utilizado en el tratamiento de la malaria, pero también se
utiliza como un inhibidor de GPX4 para la inhibición de la resistencia ferroptosis
por el sistema xc -GSH-GPX4 [25-31]. Por lo tanto, el uso de la estrategia de co-
entrega de fármacos de Fc y DHA para lograr la terapia de combinación puede
proporcionar un nuevo enfoque para resolver el problema de la escasa eficacia
terapéutica en ferroptosis. El nano-fármaco de auto-ensamblaje molecular
pequeño mediado por enlace disulfuro ha sido explorado para integrar las ventajas
de la terapia de combinación y el profármaco, que es capaz de lograr la co-
distribución de diferentes fármacos con alta carga de fármaco y buena selectividad
tumoral [15, 32-34]. En estos nanofármacos, el enlace disulfuro es crucial para la
mediación del comportamiento de autoensamblaje y también actúa como enlace
GSH-responsivo para desencadenar la liberación del fármaco. Además, este
comportamiento de autoensamblaje también puede cargar algunas moléculas de
fármacos mediante interacciones hidrofóbicas y de enlaces de hidrógeno, lo que
proporciona una estrategia "todo en uno" de terapia combinada para mejorar aún
más los efectos terapéuticos [35-38].

En este trabajo desarrollamos un sistema biomimético de nanofármacos para la

administración conjunta de fármacos contra la ferroptosis (Fc y DHA) y fármacos
contra el cáncer (gefitinib, Gefi) para la quimioterapia combinada con ferroptosis.
Como se muestra en el Esquema 1, el enlace disulfuro de Fc y Gefi en el pequeño
profármaco molecular dotado de buen comportamiento de auto-ensamblaje para
formar una nanopartícula estable (GSSF), siguiendo por la adición de DHA con
GSSH en solución acuosa, un nano profármaco de tres componentes DHA @
GSSF podría obtener más. En el microambiente tumoral (TME), el Fc podría
desencadenar la reacción de Fenton e inducir la ferroptosis, y el comportamiento
de desensamblaje del DHA@GSSF podría ser desencadenado por un alto nivel de
GSH, dando lugar a la liberación selectiva del fármaco en el tumor. La introducción
de la membrana de la célula cancerosa relacionada en el DHA@GSSF condujo a
un suministro eficaz dirigido al tumor y a la estabilidad en la circulación sanguínea,
lo que dio lugar a una buena acumulación del nanofármaco biomimético (CM-
DHA@GSSF) en la zona del tumor. Finalmente, se investigó la inhibición in vivo
del crecimiento tumoral y la metástasis, así como la bioseguridad en diferentes
modelos de ratón, lo que proporcionó una quimioterapia combinada con ferroptosis
sencilla y de alta eficacia.

2. Materiales y métodos.
2.1 Materiales e instrumentos.

El ácido ferrocenocarboxílico, el 2,2'-ditiodietanol, el cloruro de oxalilo, la N, N-

diisopropiletilamina (DIPEA), el gefitinib, el trifosgeno, la 4-dimetilaminopiridina
(DMAP), el azul de metileno (MB), el verde de indocianina (ICG), el sulfato de
sodio anhidro, el acetato de etilo, el metanol y el diclorometano (DCM) se
adquirieron a Aladdin Reagents. El BODIPY™ 581/591 C11, el tampón de lisis y
extracción RIPA y el kit de ensayo de proteínas BCA se adquirieron a Thermo
Fisher Scientific. D-Luciferina sal potásica, DAPI, kit de ensayo ROS, kit CCK8, kit
de detección de apoptosis Annexin V-FITC y kit de ensayo de
viabilidad/citotoxicidad celular fueron proporcionados por Beyotime. Todos los
anticuerpos se obtuvieron de Proteintech. El kit de gel SDS-PAGE y el tampón de
carga fueron proporcionados por Solarbio Science & Technology Co. Ltd.

Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se registraron en un

espectrómetro de RMN Bruker Avance 500 MHz. La espectrometría de masas de
alta resolución (HR-MS) se midió en el sistema LC/MS Agilent 6224 Accurate-
Mass TOF. Los espectros de absorbancia se obtuvieron en un espectrofotómetro
UV-Vis (Hitachi U-3010). Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión
(TEM) se realizaron en un Hitachi HT7700. Los potenciales DLS y zeta de las
nanopartículas se determinaron en el Malvern Nano-ZS90. Las imágenes de
fluorescencia en célula se realizaron en un microscopio de fluorescencia (Olympus
IX71). Las imágenes CLSM en célula se obtuvieron en Leica TCS SP8. La
citometría de flujo se realizó en el citómetro de flujo BD Accuri C6. Las imágenes
de fluorescencia in vivo y ex vivo se realizaron en un sistema de imagen
multimodal BLT AniView.

2.2 Síntesis de 2-((2-hidroxietil)disulfaneil)ferrocenocarboxilato de etilo

Bajo atmósfera de nitrógeno, el ácido ferrocenocarboxílico (2 mmol, 460 mg)
disuelto en DCM (10 ml) se sometió a adición gota a gota de cloruro de oxalilo (10
mmol, 850 µl), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después
de agitar, el disolvente se evaporó, y el residuo se disolvió en DCM (5 ml). A
continuación, la solución se añadió a la mezcla de 2,2'-ditiodietanol (6 mmol, 924
mg) y DIPEA (4 mmol, 900 µl) disuelta en DCM (10 ml) gota a gota. La reacción se
agitó durante 4 h a temperatura ambiente. Después, la mezcla resultante se
extrajo, se lavó y se secó. Posteriormente, el producto se purificó mediante
cromatografía en columna (DCM: MeOH=100:1, v/v) para obtener 2-((2-
hidroxietil)disulfaneil)ferrocenocarboxilato de etilo como un sólido de color marrón
oscuro (388 mg, 53%). RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6) δ 4,93 (t, J = 5,5 Hz, 1H),
4,76 (t, J = 1,9 Hz, 2H), 4,51 - 4,50 (m, 2H), 4,40 (t, J = 6. 2 Hz, 2H), 4,25 (s, 5H),
3,66 (td, J = 6,4, 5,4 Hz, 2H), 3,07 (t, J = 6,2 Hz, 2H), 2,86 (t, J = 6,5 Hz, 2H).
2.3 Síntesis de 2-((2-((3-cloro-4-fluorofenil)(7-metoxi-6-(3- morfolinopropoxi) 7
uinolina-4-il)carbamoil)oxi)etil)disulfaneil)ferrocenocarboxilato de etilo:

Gefitinib (0,89 mmol, 398 mg) y DMAP (2,67 mg, 410 mg) se disolvieron en DCM
(10 ml), al que se añadió gradualmente gota a gota trifosgeno (0,36 mmol, 105
mg) disuelto en DCM (2 ml). Tras agitar durante 1,5 h, la mezcla en suspensión de
color blanco se transformó en una solución de color rojo oscuro. Posteriormente, el
compuesto 2-((2-hidroxietil)disulfaneil)ferrocenocarboxilato de etilo (0,89 mmol,
326 mg) disuelto en DCM (3 ml) se añadió gota a gota a la solución y se agitó
durante toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla resultante se extrajo, se
lavó y se secó. El producto se purificó mediante cromatografía en columna (DCM:
MeOH=20:1, v/v) para obtener 2-((2-((3-cloro-4-fluorofenil)(7-metoxi-6-(3-
morfolinopropoxi) 7 uinolina-4-il)carbamoil)oxi)etil)disulfaneil)ferrocenocarboxilato
de etilo como un sólido marrón rojizo (514 mg, 69%). RMN 1H (500 MHz,
cloroformo-d) δ 9,05 (s, 1H), 7,48 (dd, J = 6,4, 2,7 Hz, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,27 - 7.
24 (m, 2H), 7,12 (t, J = 8,6 Hz, 1H), 7,09 (s, 1H), 4,78 (t, J = 1,9 Hz, 2H), 4,48 (t, J
= 6,3 Hz, 2H), 4. 41 - 4,40 (m, 2H), 4,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 4,19 (s, 5H), 4,14 (t, J
= 6,3 Hz, 2H), 4,04 (s, 3H), 3. 75 (s, 4H), 2,92 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,88 (t, J = 6,3
Hz, 2H), 2,61 (m, 2H), 2,53 (m, 4H), 2,15 - 2,08 (m, 2H). 13C RMN (126 MHz,
Cloroformo-d) δ 171,57, 157,72, 156,91, 155,65, 153,82, 153,57, 151,13, 150,84,
136,94, 128,51, 126,12, 121,53, 117. 67, 116.97, 116.80, 107.07, 101.79, 71.51,
70.54, 70.18, 69.86, 67.42, 66.73, 64.37, 61.81, 56.52, 55.32, 53.60, 37.46, 37.14,
25.71. HR-MS (ESI): calcd para C39H42ClFFeN3O7S2 + ([M+H]+ ) 838.1481,
encontrado: 838.1484.

2.4 Fabricación del nanofármaco DHA@GSSF

La nanopartícula DHA@GSSF se preparó mediante un sencillo método de
nanoprecipitación. Durante el procedimiento, se introdujo gradualmente una
solución de GSSF (4 mg) y DHA (2 mg, como fármaco de carga) en DMSO (200
l) en 10 ml de agua desionizada, y la mezcla se agitó enérgicamente a
temperatura ambiente durante 12 h. A continuación, la dispersión obtenida se
sometió a diálisis contra agua destilada mediante una bolsa de diálisis (MWCO
1.000 Da) durante 24 h para eliminar el disolvente orgánico y el DHA libre de las
nanopartículas de DHA@GSSF.

La carga de DHA en DHA@GSSF se realizó mediante el método de absorción

ultravioleta [30]. Brevemente, una solución de DHA@GSSF (1 mg) en DMSO (2
ml) se incubó con NaOH al 0,2% durante 30 min a 50 °C, y la solución se midió
utilizando un espectrómetro UV-vis a 290 nm. A continuación, la proporción de
carga del fármaco (DLR) de DHA se calculó como 30,6% mediante la ecuación:

DLR (%)= Masa de DHA cargado / Masa de DHA@GSSF  100% De forma

similar, cambiamos el fármaco de carga como blanco o ICG para obtener NPs de
GSSF y nanopartículas de ICG@GSSF.
2.5 Preparación del nanofármaco biomimético CM-DHA@GSSF
Para preparar el nanofármaco biomimético CM-DHA@GSSF, se utilizó el método
de recubrimiento de la membrana de células cancerosas [10]. En resumen, se
cosecharon las células A549 y se lavaron con PBS, después de lo cual las células
se mezclaron con una solución de inhibidor de proteasa sin EDTA en el tampón de
lisis y se disolvieron mecánicamente con un aparato de ultrasonidos a 200 W
durante 5 minutos, después se centrifugaron a 3.200 g durante 10 minutos. El
sobrenadante resultante se recogió y se centrifugó a 20.000 g durante 20 min, tras
lo cual el sobrenadante se centrifugó de nuevo a 100.000 g durante 30 min para
obtener la membrana. Para fabricar las nanopartículas recubiertas de membrana
celular, las membranas de A549 se mezclaron con la solución de DHA@GSSF o
ICG@GSSF y, a continuación, la mezcla se extruyó mediante la miniextrusora
Avanti con membrana de policarbonato (250 nm) durante 10 veces para obtener el
nanofármaco biomimético CM-DHA@GSSF y CM-ICG@GSSF.

2.7 Evaluación de la generación de -OH

Se utilizó un método colorimétrico basado en la degradación del MB para evaluar

la generación de -OH de varias muestras. Las distintas formulaciones se
incubaron con H2O2 (1 mM), GSH (10 mM) y MB (20 μM) en soluciones con
distintos valores de pH (pH 7,4, 6,8 y 5,5) a 37 °C durante 1 h. El porcentaje de
degradación del MB se calculó monitorizando la absorbancia UV-vis del MB a 664
nm en puntos temporales razonables.

3. Resultados y discusión.

3.1. Preparación y caracterización del CM-DHA@GSSF

La ruta de síntesis del pequeño profármaco molecular GSSF se representó en la
Fig. S1, que se sintetizó mediante reacción de esterificación y amidación con ácido
ferrocenocarboxílico (Fc), 2,2'- ditiodietanol, trifosgeno y gefitinib, y se caracterizó
mediante RMN 1H, HR-MS y RMN 13C (Fig. S2-S5). Como se muestra en la Fig.
1A, el nanofármaco biomimético CM DHA@GSSF estaba compuesto por
DHA@GSSF y membrana celular A549, que se preparó mediante un método de
dos pasos. En primer lugar, el GSSF molecular pequeño se autoensambló en
nanopartículas DHA@GSSF mediante el método de nanoprecipitación por adición
de DHA en solución acuosa. En la Fig. 1B se muestra el espectro de absorbancia
de GSSF, DHA, Fc y Gefi. El espectro de GSSF se solapa con el de Fc y Gefi, lo
que indica que la síntesis de GSSF se ha realizado con éxito. Además, las
pequeñas moléculas de GSSF podían transformarse en nanopartículas a través
del comportamiento de autoensamblaje mediado por disulfuro en una solución
acuosa, y el tamaño de las partículas y la morfología de las NPs de GSSF se
mostraban en la información complementaria (Fig. S6), que podían formar
nanopartículas estables y regulares. Para confirmar la capacidad de carga de
fármaco de las NPs GSSF por su buen comportamiento de autoensamblaje, se
utilizó la dispersión dinámica de luz (DLS) para determinar el diámetro
hidromecánico del DHA@GSSF en torno a 84,2 nm con distribución estrecha (PDI
= 0,093), y la TEM mostró que la morfología de las partículas era esférica bien
formada (Fig. 1C). Mientras tanto, también medimos la distribución elemental del
DHA@GSSF, como se muestra en la Fig. 1D, los elementos O, S o N estaban
bien solapados con los elementos Fe, lo que indica el éxito de la preparación del
DHA@GSSF. En segundo lugar, se recubrió la membrana celular A549 sobre la
superficie del DHA@GSSF para construir el nanofármaco biomimético CM-
DHA@GSSF. Tras recubrir la membrana celular, el diámetro hidromecánico del
DHA@GSSF aumentó unos 35 nm hasta 118,7 nm, y su distribución y morfología
fueron más estructuradas (PDI = 0,087), lo que mostró una imagen clara de
estructura esférica de dos capas, indicando que la membrana celular estaba bien
recubierta (Fig. 1E). Además, la potencial zeta reveló claramente que el
recubrimiento de la membrana celular de A549 cambiaba el potencial de positivo a
negativo de forma significativa debido a la electronegatividad de la membrana
celular (Fig. 1F). Además, también realizamos un experimento SDS-PAGE para
confirmar el éxito del recubrimiento de la membrana celular de la nanopartícula.
En la Fig. 1G, no se observaron bandas proteicas evidentes en el DHA@GSSF,
mientras que las bandas proteicas del control y del CM-DHA@GSSF eran casi
idénticas a las encontradas en las membranas de las células A549 tras el
recubrimiento.

Para investigar más a fondo los comportamientos de liberación de fármacos de

CM-DHA@GSSF, incubamos CM-DHA@GSSF con diferentes concentraciones de
GSH y registramos la proporción de liberación de DHA, Gefi y Fc. Como se
muestra en las Figs. 1H, 1I y S7, las proporciones de liberación de DHA, Gefi y Fc
se incrementaron al aumentar el tiempo de incubación y el nivel de GSH. Por otra
parte, la TEM y DLS de CM-DHA@GSSF después de la liberación también se
llevó a cabo en la Fig. 1J, el diámetro y PDI crecieron notablemente, y la imagen
de TEM fueron cambiados a ser más morfología amorfa. Además, también
investigamos la estabilidad de CM-DHA@GSSF en tampón PBS, y no hubo
ningún cambio obvio en el tamaño hidrodinámico detectado por DLS durante 7
días (Fig. S8), lo que indica que CM-DHA@GSSF podría almacenarse durante
mucho tiempo. Estos resultados sugieren que nuestro nano-fármaco mostró un
buen comportamiento de liberación en la EMT con un alto nivel de GSH y fue
estable en condiciones fisiológicas.

4. Conclusión

En resumen, hemos desarrollado con éxito un nanofármaco biomimético basado

en el autoensamblaje de pequeñas moléculas para la inhibición del crecimiento
tumoral y la metástasis in vivo, lo que se consiguió mediante la administración
conjunta de gefitinib, Fc y DHA para mejorar la quimioterapia combinada con
ferroptosis. El nanofármaco era estable en el entorno fisiológico normal y podía
desensamblarse en la EMT mediante la escisión del enlace disulfuro debido al alto
nivel de GSH, liberando así Fc, DHA y gefitinib para llevar a cabo una
quimioterapia combinada con ferroptosis mejorada. El DHA liberado podría inhibir
eficazmente la resistencia a la ferroptosis para potenciar la ferroptosis del Fc,
mejorando aún más el efecto terapéutico del gefitinib. En modelos de ratones
portadores de tumores, nuestros nanofármacos mostraron una supresión tumoral y
una capacidad antitumoral de metástasis extraordinarias, y no se observaron
efectos secundarios notables durante los tratamientos. El presente estudio integra
de forma innovadora la estrategia de co-distribución dirigida y la forma de terapia
combinada en un pequeño nano-fármaco de auto-ensamblaje molecular con una
eficacia terapéutica y bioseguridad satisfactorias, lo que proporciona una nueva
modalidad razonablemente diseñada para la quimioterapia combinada con
ferroptosis.