PROCESO

HISTOLÓGICO
MTRA. ANA LUISA HERNÁNDEZ ÁVILA
 INTRODUCCIÓN

L a mayoría de las técnicas histológicas van

encaminadas a preparar el tejido para su
observación con el microscopio, bien sea éste
óptico o electrónico. Ello es debido a dos
razones: a) que la composición de los tejidos,
salvo contadas ocasiones, no tienen contraste
ni colores que permitan diferenciar sus
estructuras de una manera clara y b) que la
mayoría de las estructuras tisulares y celulares
no se pueden discriminar a simple vista sino
con la ayuda de los microscopios. Por ello hay
que procesar las muestras , primero para que
no se deterioren y después para resaltar sus
estructuras y poder estudiarlas en detalle
¿QUÉ ES EL PROCESO HISTOLÓGICO?

Denominamos proceso histológico a una serie de métodos y

técnicas utilizados para poder estudiar las características
morfológicas y moleculares de los tejidos.

Hay diversos caminos para estudiar los tejidos, es decir,

diversas series de técnicas que se utilizarán dependiendo de qué
característica deseemos observar. Hay que tener en cuenta que
existen muchas variantes a estos "caminos" y su elección
dependerá del resultado final que queramos obtener.
 OBJETIVO
E l objetivo de toda técnica histológica es observar y estudiar
la estructura general o detallada de los diferentes
componentes tisulares. Estas características observadas
deberían ser iguales a las que poseían los tejidos en su estado
vivo. Aunque las técnicas histológicas actuales están
diseñadas para disminuir al máximo las alteraciones de las
características de los tejidos durante su aplicación, todas las
técnicas introducen modificaciones más o menos importantes
que pueden afectar de manera diferencial a diferentes
componentes tisulares
FIJACIÓN
 PROCESO
Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las que poseía
en su estado vivo, la fijación disminuye los cambios en los tejidos desde que se obtienen hasta que se observan, tanto en
organización estructural como en composición química. Es como hacer una fotografía del tejido vivo para poder
observarla, tras algún tratamiento, con el microscopio. Una buena fijación es importante porque de ello depende una
interpretación correcta la observación tisular. Puede ser la diferencia entre un buen y un mal diagnóstico de una
patología, basado en diferencias en la organización del tejido o en las características de los núcleos de las células

Hay fijadores físicos, que son calor o congelación, y químicos, que son aquellos que
forman enlaces químicos con moléculas del tejido. Cada uno tiene sus ventajas e
inconvenientes. Los más usados hoy en día para microscopía óptica y electrónica son los
fijadores químicos

El método ideal de fijación química es por perfusión. Para ello se introduce el fijador a
través del sistema vascular, asegurando de esta manera que todas las células del órgano
perfundido reciben el fijador casi instantáneamente y al mismo tiempo. Obviamente esto se
puede hacer en animales de experimentación. Sin embargo, para biopsias o para plantas el
método de fijación es la inmersión, es decir, sumergir la muestra en el fijador, el cual llegará
a todas las partes de la muestra por difusión
 VELOCIDAD DE PENETRACIÓN
CARACTERÍSTICAS El proceso de fijación ha de ser
rápido y la velocidad de difusión de
VELOCIDAD DE FIJACIÓN
Esta característica no
la sustancia fijadora en los tejidos dependen de la velocidad de

FIJADORES es un factor determinante. En la

fijación por inmersión este
difusión sino de las
propiedades químicas del
fijador y condiciona el tiempo
parámetro condiciona el tamaño de
que debe permanecer el tejido
QUÍMICOS la pieza que queramos fijar, más
pequeña cuanto menor sea la
en contacto con el fijador.
Téngase en cuenta que la
velocidad de difusión del fijador fijación es una reacción
empleado. También determina el química
tiempo de fijación, mayor cuanto
menor tiempo de difusión

ÓSMOSIS Y PH
ENDURECIMIENTO
Es indispensable evitar cambios de
Los fijadores volumen en la célula producidos por una
generalmente osmolaridad del fijador diferente a la
del tejido. Por tanto, en muchas
endurecen los tejidos, ocasiones hay que equilibrar la
lo cual depende del tipo osmolaridad de las soluciones fijadoras
de fijador y del tiempo y la de los tejidos a fijar. Son sales que
que el tejido haya no afectan a la capacidad del fijador.
Normalmente se suelen usar soluciones
estado expuesto a él amortiguadoras que mantienen un pH
semejante al del tejido e isoosmóticas
con dicho tejido.
CARACTERÍSTICAS T EMPERATURA
EFECTO MORDIENTE .
Algunas estructuras tisulares son
difíciles de teñir puesto que tienen

FIJADORES La fijación a temperaturas

más altas que la temperatura
ambiente suelen incrementar
la velocidad de fijación del
poca apetencia por los colorantes.
Esta apetencia puede ser
incrementada con un tratamiento
previo. Algunos fijadores, además

QUÍMICOS tejido, pero también acelerar

la degradación del tejido que
de fijar, modifican químicamente a
ciertas estructuras celulares para
que posteriormente puedan unirse
todavía no ha sido fijado
a ellas los colorantes. Este este
tipo de modificación química se le
denomina efecto mordiente.

ARTEFACTOS
Una artefacto es cualquier alteración
introducida en eltejido consecuencia del
proceso histológico. La fijación podría
decirse que es el paso que más influye
en el procesamiento histológico. Al
contrario que la tinción o una pobre
inclusión en parafina, la fijación es
irreversible. Los procesos de fijación,
dependiendo del fijador o del método de
fijación, pueden acarrear alteraciones
tisulares tales como variaciones
morfológicas, cristalización de
compuestos, desplazamiento de
sustancias, etcétera.
 CLASIFICACIÓN

COAGULANTES ENLACES CRUZADOS OTRA CLASIFICACIÓN

al extraer agua de
los tejidos
producen establecen enlaces Aditivos y no aditivos
coagulación y químicos entre
desnaturalización moléculas del
de las proteínas,
tejido.
sobre todo las de la
matriz extracelular
FIJADORES
SIMPLES
 ETANOL, METANOL, ACETONA
E l etanol, metanol, acetona fijan por deshidratación y coagulación de las proteínas. Extraen los lípidos de
los tejidos, pero no afectan a los carbohidratos. El metanol es mejor fijador que el etanol puesto que no
causa tanto endurecimiento del tejido y aporta una mejor preservación. En general, son buenos fijadores de
muestras de pequeñas, y preservan bien algunas proteínas como las enzimas, glucógeno, y pigmentos.
Tienen algunos inconvenientes como producir endurecimiento y la retracción de los tejidos, muy evidentes
en bloques de tejido muy grandes. Carecen de efecto mordiente.

ÁCIDO ACÉTICO
No fija directamente a las proteínas sino que su proceso de fijación consiste en cambiar el estado coloidal
de las proteínas. Se utiliza a una concentración que varía entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para ácidos
nucleicos y nucleoproteínas. Como inconvenientes cabe destacar la destrucción de las mitocondrias y mala
fijación de membranas y citoplasma. Se suele usar en combinación con otros fijadores.

CLORURO O SULFATO DE ZINC

El cloruro de zinc se utilizó inicialmente como fijador único, pero más tarde pasó a ser un componente de
mezclas fijadoras. Se emplea normalmente en combinación con el paraformaldehído. El cloruro de zinc
ayuda a la fijación y preserva la antigenicidad si se necesita el tejido para pruebas inmunocitoquímicas, ya
que contrarresta el enmascaramiento de antígenos
 ÁCIDO PÍCRICO
L a fijación por ácido pícrico se produce gracias a que las sales del tipo picrato coagulan las proteínas de
los tejidos. Se suele usar del 2 al 15 % de una solución saturada de ácido pícrico. Preserva bien la estructura
celular, no produce retracciones cuando el tiempo de fijación es óptimo, preserva bien glucógeno y lípidos. Es
un buen fijador para tinciones generales puesto que tiene efecto mordiente y favorece la unión de algunos
colorantes.
FORMALDEHÍDO
El formaldehído es un fijador ampliamente usado por la buena preservación del tejido, actúa como
conservante, produce poca retracción tisular, es compatible con la mayoría de las técnicas y tinciones
histológicas, incluidas las de inmunocitoquímica. Este fijador se puede unir a diferentes grupos como: amino,
sulfidrilos, guanidilos, grupos hidroxilos alifáticos, etcétera.
L a fijación normalmente es de 24 a 50 h, aunque puede ser de 1 a 2 semanas. Si el tejido va destinado a inmunohistoquímica es suficiente con 12-24 h a 4ºC. Fijaciones
muy prolongadas endurecen el tejido y pueden provocar inestabilidad de los ácidos nucleicos.

Glutaraldehído
El glutaraldehído tiene poca velocidad de penetración, por lo que la fijación por perfusión vascular es
recomendada. Se usa a una proporción de entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para preservar la
estructura celular puesto que es capaz de entrelazar el tejido más fuertemente que otros aldehídos, por lo
que es el fijador de referencia para observación de ultraestructuras celulares con el microscopio electrónico.
 MEZCLAS FIJADORAS

Para el trabajo se han utilizado las

siguientes mezclas
 MEZCLAS FIJADORAS
En la mayor parte de los procesos de fijación usan varias
sustancias fijadoras , bien mezcladas en la solución acuosa
inicial o utilizadas sucesivamente en el tiempo . Con ello se
aprovechan las ventajas de cada una de ellas y se pueden
contrarrestar sus desventajas. Hay multitud de formas de usar
los diferentes fijadores, tanto en sus componentes como en las
proporciones de éstos, dependiendo de las necesidades
posteriores, es decir, qué tipo de tejido queremos fijar y qué
queremos ver de dicho tejido.
 MEZCLAS
LÍQUIDO DE BOUIN
L a solución de Bouin está formada por ácido pícrico, formaldehído y ácido acético glacial. Es una solución muy
utilizada para el procesamiento de tejidos que se incluirán en parafina y a cuyas secciones se le pueden aplicar
un amplio espectro de tinciones. Es muy útil para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el núcleo y el
glucógeno. Hay que tener cuidado con el tiempo de fijación. No está recomendado para el riñón ni para el
estudio de las mitocondrias.ón, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones por inmersión.

SOLUCIÓN DE CLARKE
E stá solución está compuesta por etanol y ácido acético glacial (3:1). Fue una de las primeras soluciones
fijadoras usadas, buena para muestras que se incluirán en parafina.

CARNOY
E l Carnoy es un buen fijador para el glucógeno, para los hidratos de carbono simples y para las proteínas
fibrosas. Es bueno para visualizar los ácidos nucleicos, aunque no la morfología nuclear. Puede producir
retracciones tisulares. Está formado por etanol absoluto, cloroformo y ácido acético glacial.
 MÁS MEZCLAS.....
MEZCLAS CON FORMALDEHÍDO
E l formaldehído es quizá el fijador más usado hoy en día, tanto para técnicas histológicas comunes como para otras como la
inmunocitoquímica o la hibridación de ácidos nucleicos. Lo más frecuente es utilizarlo en solución al 4 % junto con otros fijadores.
Para fijaciones de tejidos destinados a microscopía electrónica se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehído y
glutaraldehído. La función del formaldehído es iniciar una fijación rápida, por su mayor capacidad de penetración, mientras que el
glutaraldehído realizará una fijación más poderosa, pero más lenta que no afectará a la estructura tisular puesto que el formaldehído
ya ha realizado una fijación previa.

GLUTARALDEHÍDO-TETRÓXIDO DE OSMIO
L os fijadores en combinación no tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los tejidos destinados a microscopía
electrónica sean inicialmente fijados en glutaraldehído (1 al 3 %) y paraformaldehído (2 al 4 %), para posteriormente ser postfijados en
tetróxido de osmio al 1 % en solución tamponada. Este último es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre todo de las
membranas, en cooperación con los aldheídos. Esto es importante porque el proceso para microscopía electrónica supone incubar el tejido en
solventes orgánicos y polimerización de resinas a 60 °C, durante las cuales el tejido debe ser preservado.
INCLUSIÓN
 L a inclusión es el método más común de endurecer el tejido
y consiste en infiltrar la muestra con sustancias líquidas
que tras un proceso de polimerización o enfriamiento se
solidifican, sin afectar a las características del tejido. Con ello
se consigue obtener cortes del orden de µm a nm, según el
medio de inclusión, sin que el tejido se rompa o se deteriore
Además, son un buen método para preservar las muestras
durante largos periodos de tiempo. Existen diferentes
sustancias o medios de inclusión dependiendo del grosor del
corte y de la técnica que necesitemos realizar. Cuando se
quieren hacer secciones para su observación con el
microscopio óptico el medio de inclusión más frecuentemente
usado es la parafina , mientras que si vamos a realizar
observaciones con el microscopio electrónico la inclusión se
realiza con resinas , principalmente de tipo acríclicas o epoxy.
 INCLUSIÓN EN PARAFINA

Para la inclusión de muestras que han de observarse con el microscopio óptico se

utiliza sobre todo la parafina, y en menor medida la celoidina, como medio de
inclusión.
L a parafina es una sustancia de aspecto ceroso que está formada por mezclas
de hidrocarburos saturados. A temperatura ambiente es sólida y su punto de
fusión puede variar entre 40 °C y 70 °C. Las parafinas más usadas tienen un
punto de fusión en torno a los 60 °C. Podemos también modificar las
características de las parafinas añadiendo sustancias para variar su dureza,
viscosidad, fragilidad, etcétera.
 L a parafina no es miscible con agua , mientras que todos los tejidos están
formados principalmente por agua. Además, la mayoría de los fijadores son
soluciones acuosas. Esto implica que para que la parafina líquida pueda penetrar
completamente en el tejido ha de sustituirse el agua por un solvente orgánico, lo
que se consigue mediante la deshidratación del tejido en alcoholes, normalmente
etanol, de gradación creciente hasta alcohol de 100°. La deshidratación debe ser
completa porque de no ser así afectará a la infiltración posterior de la parafina.
Posteriormente se transfiere el tejido a un líquido que es miscible tanto con el
alcohol de 100° como con la parafina, denominado sustancia intermediaria , como
es el benceno, xileno, tolueno o el óxido de propileno, entre otros. El tiempo de
incubación de la pieza en algunos de estos líquidos intermediarios como el tolueno
o xileno no debe ser excesivo puesto que estas sustancias endurecen la pieza y
crean problemas al hacer las secciones.

https://youtu.be/irlymU-anio?si=9gjWn1jZhcOKcKNM