PRACTICA 3 A

Métodos de diagnóstico micóticos

I. EVALUACION DE CONOCIMIENTOSPREVIOS

Lo sé en Soy capaz
No sé Lo sé forma de
N ÍTEM
Nada Poco regular explicarlo

x
1 ¿Cuáles son las características específicas de los hongos?
X
2 ¿Qué es un micelio?
x
3 Defina hifas cenocíticas
X
4 Defina dermatofito

¿Cuáles son los procedimientos y técnicas de laboratorio que se usan para la x

5
identificación de hongos?

II.FUNDAMENTO TEÓRICO

¿Qué son los hongos?

Son seres eucariotas, normalmente multinucleados, que se reproducen por medio de esporas, móviles o inmóviles,
sexuales o asexuales. Son heterótrofos, sin clorofila, y se alimentan por absorción (raramente por fagocitosis, como es el
caso de los hongos ameboides). El talo (soma o cuerpo vegetativo) puede ser unicelular o típicamente
filamentoso (con algunas excepciones), y está recubierto de una pared de quitina o de celulosa. Los hongos son
omnipresentes y cosmopolitas; pueden aparecer prácticamente en cualquier sitio, y alimentarse de lo más insospechado.
Casi todos son organismos aerobios, aunque algunas levaduras son anaerobias facultativas, y hay algunos que son
fermentadores obligados
Los hongos se clasifican como un reino independiente debido a innumerables características específicas como son:
  La unidad fundamental es la hifa que su conjunto forma los micelios.
 No efectúan lafotosíntesis
 Son inmóviles
 Su forma de reproducirse que es por medio de esporas sexuales y asexuales.
 Contienen glucógeno como material de reserva.
 Su alimentación es heterótrofa requiriendo materiales orgánicos ya elaborados como: azúcares,
aminoácidos, ácidos grasos, glicerol y vitaminas.
 Pueden vivir asociados a otros individuos como comensales en simbiosis ocomo parásitos.

He aquí algunos récords fúngicos curiosos, recogidos aquí y allá en Internet:

 máxima concentración de esporas (161.037 por m3);
 micelio más extenso (Armillaria, 890 ha en Norteamérica);
 mayor cuerpo fructífero (Rigidoporus ulmarius, 163 x 140 x 50 cm de alto en febrero de 1995 y
sigue creciendo);
 cuerpo fructífero más pesado (Laetiporus sulphureus, 45,4 kg);
 mayor hongo comestible (Langermannia gigantea, 2,64 m de circunferencia, 22 kg);
 más venenoso (Amanita phaloides, 5-7 mg de amanitoxinas son letales);
 talo más viejo (algunos líquenes en Alaska, más de 3500 años).

ESTRUCTURA DE LOS HONGOS

Tras la germinación de una espora se forma el cuerpo vegetativo o talo del hongo. El talo fúngico más típico es
filamentoso (en verdad, los hongos podrían considerarse como pelusas dotadas de vida), y recibe el nombre de
micelio. Cada filamento individual del micelio es una hifa.
Las hifas pueden estar divididas por tabiques o septadas; o carecer de ellos (cenocíticas), salvo para separar las
estructuras reproductoras. Los tipos de septos varían en los distintos grupos fúngicos.
En otras ocasiones el talo es unicelular levuriforme (es decir, con aspecto de levadura) o consiste en un rizomicelio,
unplasmodio ounpseudoplasmodio. Hayhongos dimórficos quepuedenexistir tanto en forma miceliar como
levuriforme.

CLASIFICACIÓN DE ESPORAS
a. Astroconidios:seformanporlafragmentación dehifas, generalmentesonrectangularescondoble pared gruesa.
b. Blastoconidios: se forman en las levaduras por la gemación a partir de una célula preexistente.
Anteriormente se les llamaba blastosporas.
c. Clamidoconidios: se forma cuando las condiciones del medio se tornan adversas, las células aumentan de
tamaño y se hinchan.
d. Microconidias: son esporas unicelulares que se presentan en una variedad de tamaños, formas y colores.
Son producidos por los conidióforos mediante el estrangulamiento sucesivo en el punto de unión.
e. Macroconidias: sonesporasmulticelulares, las hayde diversas formas. Sepuedendividir endoso más células
por tabiques transversales y pueden adoptar forma de uso o de clava.
f. Esporangiosporas: son esporas producidas dentro de estructuras especializadas llamadas
esporangios, que son sacos redondos unidos al micelio vegetativo por una estructura especial
llamada esporangióforo.
Consideran do las características anteriores, una clasificación útil de los hongos es:
1. MOHOS: Organismos multicelulares, con paredes, rígidas, paralelas, ramificados, tabicados, mayores
de 1µm de diámetro

2. LEVADURAS: Organismos unicelulares, redondeados u ovales, que producen brotes (blastosporos o

blastoconidios)
3. DIMORFOS: Presentan morfología micelial en su estado saprofítico (28 ºC) y forma levadura cuando invaden los
tejidos del huésped (37 ºC).
Una micosis es una infección de la piel o de las mucosas provocada por los hongos parásitos. Estas levaduras viven
normalmente en la piel y pueden llegar a ser perjudiciales para el organismo bajo ciertas circunstancias.
Una forma habitual de clasificar las micosis ha sido atendiendo a su localización anatomo-clínica. De acuerdo a ese
criterio podemos clasificar las micosis en:
a. Superficiales,
b. Subcutáneas,
c. Profundas o Sistémicas.

Procedimientos y técnicasde laboratorio para la identificación de hongos Examen

directo.
Este procedimiento proporciona información preliminar o presuntiva al ser una técnica rápida que puede serútilalclínico
yenalgunos casos llegar aserdiagnóstica. Esasí, que lapresenciade hifas cenocíticasen
pacientes con cetoacidosis diabética puede ser de gran valor para iniciar tratamiento contra posible
mucormicosis. No sustituye al cultivo. Entre los principales exámenes directos tenemos:
 La tinción de Azul de lactofenol o azul de algodón
Es una tinción simple (un sólo colorante) y como tal está basada en la afinidad del colorante por
componentes de las células, en este caso por las estructuras fúngicas (tiene la capacidad de
adherirse a las hifas y conidios de los hongos microscópicos.)
Elazuldelactofenoltiene características quelohacenespecial paraobservardichas estructurasen los hongos
del tipo moho obtenidos en los cultivos por aislamiento.
Elfenolinactiva las enzimas líticas dela célula e impide queéstaserompa; de igual forma, destruye la flora
acompañante e inactiva a la célula, quitándole el grado de patogenicidad; además, actúa como mordiente
cuando se usa en combinación con colorantes. El ácido láctico preserva las estructuras fúngicas al
provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que genera una película
protectora. El azul de algodón es un colorante ácido, que tiñe el citoplasma y la quitina presente en las
células fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda la preparación.
 Hidróxido de potasio(KOH)
Disuelve rápidamente las células permitiendo digerir material proteico, observando con mayor nitidez
los elementos fúngicos, su efecto de clarificar puede incrementarse al calentar a la llama ligeramente
lapreparación. Adicionalmente, sepuedeemplear colorantes parapigmentar lapared de los hongos y
mejorar la visualización.
 Tinta china
Es un método de contraste. Permite visualizar la cápsula de polisacárido de Cryptococcus
neoformans, mediante la presencia de un halo claro y nítido alrededor de la levadura. Existen
artefactos(hematíes, burbujas de aire, leucocitos, gotas de grasa ypartículas de talco) que pueden interferir y
confundir al analista.
 Coloración Giemsa
Es de utilidad para el diagnóstico de histoplasmosis, neumocistosis y otras micosis. Permite
visualizar blastoconidias intracelulares alpolimorfonuclear, comolafasetisular del H. capsulatum.
 Coloración Gram
Es útil para observar blastoconidias y pseudomicelios de las especies del género Candida,
Malassezia y Cryptococcus, las cuales son Gram positivas con variaciones en la intensidad de la
coloración.
III. CAPACIDADES
a. Usa procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de hongos
b. Identifica y describe las estructuras micóticas
c. Reconoce las diferentes clases de agentes fúngicos en muestras biológicas

IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Reactivos Materiales Equipo Material biológico Otros

-Hidróxido de Potasio Portaobjetos Microscopio Muestras de alimentos con Bolsas de
(KOH) al 20 % Cubreobjetos Mechero de crecimiento fúngico (1) plástico
- Azul de Lactofenol Asa Micológica Bunsen. Muestras de colonias fúngicas de
-Medio de cultivo Encendedor. cultivo
Sabouraud. Muestras de escamas depiel, uñas.

 Conanticipación (almenos 5 díasantesdelapráctica), prepararunacámarahúmeda, queconsiste en: Colocar

fruta, verdura (material orgánico en el que le interese haya desarrollo fúngico) en una bolsa de plástico con
un grado suficiente de humedad y dejarla a temperatura ambiente; la cámara debe conservar el grado de
humedad durante los 5 días. Cierre la bolsa de plástico dejando unos pequeños orificios paraoxigenar.

Experimento 1
a. Encender mechero. Trabajar en un radio alrededor de 10 cm aproximadamente.
b. Colocar una gota de azul de lactofenol en un portaobjeto.
c. Calentar el asa bacteriológica al rojo vivo y enfriarla en un medio de cultivo.
d. Extraer muestra de la colonia.
e. Colocar la misma sobre el lactofenol y cubrirla con laminilla.
f. Calentar suavemente el preparado para disolver el agar y clarificar.
g. Observar al microscopio óptico las características morfológicas del cultivo.
h. Tomar una muestra del cultivo apoyando un trozo de cinta sobre el mismo y luego la cinta ponerla sobre el
porta-objetos y observar al microscopio.

Experimento 2:
En una placa de Agar Sabouraud, medio de cultivo específico para desarrollo de hongos, muestrear
diferentes lugares de la Universidad como baños, cafetería, aulas, dirección, departamento, depósitos de aguaetc.
Solamente se necesita abrir la tapa de la caja Petri por 10 minutos paracultivo ambiental, esdecir, delaire circulante
deesaáreaenparticular. Sisetratadealguna superficie específica, serequerirá detomar con un hisopo estéril e
inocular el medio de cultivo con él.
Llevará al laboratorio elmedio inoculado, bien rotulado indicando fecha, horay lugar delatomademuestra, así como el
equipo de trabajo y grupo al que pertenece. Se dejará incubar a temperatura ambiente y fuera de la estufa de cultivo
por una semana.

El día de la observación:
a. Contará el número de las diferentes colonias.
b. Morfología colonial: Observará cada colonia y describirá sus características como color, textura y forma,
tanto por el anverso como por el reverso, ya que hay hongos que presentan diferente
aspectoycolorensusmiceliosaéreosyenlosvegetativos(losqueestáninmersosenelagar)
c. Observación Microscópica: tomará muestra de las diferentes colonias para su observación,
procediendo de la siguiente manera:
  En un portaobjetos limpio coloque una gota de Azul de Lacto fenol.
 Esterilizar el asa y dejar enfriar, sin salirse del área estéril del mechero (10 cm alrededor de la
flama). Tomar con ella una porción de la parte aérea de la colonia que le resulte más
interesante y colocarla en el Azul de Lacto fenol.
 Coloque con cuidado el cubreobjetos formando un ángulo de 45 o evitando así la formación de
burbujas.
 Observe las preparaciones enfocando con 10x y enseguida con 40 x.
 Las preparaciones en fresco requieren de poca luz para observarse. Condensador a la mitad y el
diafragma a la mitad de su capacidad

Resultados
Dibuje todas las observaciones macroscópicas y microscópicas de lo observado en clase.
 PRÁCTICA 3B
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

I. EVALUACION DE CONOCIMIENTOS PREVIOS

Lo sé en Soy capaz
No sé Lo sé forma de
N ÍTEM
Nada Poco regular explicarlo

1 ¿Qué es la parasitología?

2 ¿Cómo se clasifican los parásitos?

3 ¿Qué enfermedad conoces que es causada por parásitos?

¿Qué muestras comúnmente se utilizan para el diagnóstico de

4
parasitosis?

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Para las clases prácticas se cuenta con material microscópico y macroscópico que permite conocer las
característicasmorfológicas delosparásitos causantesde infeccionesen elhombreysusciclosevolutivos.

Definiciones:
a) Preparacionesmacroscópicaso de museo: Los parásitos completos ó parte de ellos se colocan en
recipientes de vidrio o plástico, algunos con formol al 10% y otros alcoholes 70%.
b) Preparaciones microscópicas: Son aquellas que deben ser visualizadas con la ayuda del microscopio
compuesto. Estas pueden ser:

1. Permanentes: Son preparaciones sometidas a procesos especiales como fijación, deshidratación, coloración
ymontaje por lo general con bálsamo de Canadá que se cubre con una laminilla para proteger el
material a observar. Este material permite estudiar los detalles estructurales que facilitan la identificación. Para
los protozoos se utiliza las coloraciones: Tricrómica de Gomori, Hematoxilina férrica, Giemsa, etc. Para los
helmintos se usa Carmín de Semichón, Hematoxilina Delafield, etc. Para los artrópodos se utiliza Fucsina, previa
decoloración con Hidróxido de Potasio (KOH) o Hidróxido de Sodio (NaOH) al 10% ó al natural.

2. Temporales o en fresco: Son de dos tipos:

Muestras recién obtenidas: heces, sangre, tejidos o cultivos en donde los elementos parasitarios estén activos
para la observación in vivo, que se colocan en láminas portaobjetos con una gota de suero fisiológico; para
observar con ayuda del microscopio formas vegetativas o móviles a 10 y 40x, se oscurece ligeramente el campo
cerrando el diafragma. Se puede agregar lugol que permite cierta coloración al núcleo y a las vacuolas de
glicógeno.
Muestras conservadas: en solución de formol sal al 10% o formol al 10%.

c) Preparaciones de cortes histológicos: Permiten reconocer e identificar al parásito o parte de él en los tejidos ya sea
trofozoito, amastigotes y/o quiste de protozoos y el estadio adulto o larvario de helmintos; también se
puede observar la respuesta del hospedero ante el parásito. Rutinariamente se utiliza la coloración de
Hematoxilina-Eosina.
 RECOLECCION Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS FECALES
Están formadas por alimentos no digeridos, secreciones digestivas, bacterias, hongos y agua. La frecuencia
deevacuaciónpuedeser 1 ó 2 vecesaldía. Lacantidadnormaleliminada diariamente esaproximadamente de 100 a 200
gr. en el adulto. Normalmente son de consistencia blanda, moldeadas, cilíndricas, de color amarillo castaño claro u
oscuro, dependiendo de los alimentos ingeridos, de olor desagradable pero no fétido. Estascaracterísticas pueden
variar debido ala dieta,medicamentos oestadospatológicos.
Recoleccióndela muestra: Dependiendo del tipo de parasitosis que se sospeche lacolección de la muestra puede ser:
expulsión natural, en lactantes o niños pequeños la muestra puede tomarse del pañal, recién emitida o utilizando la
cucharilla rectal.
El examen debe ser seriado, no menos de tres muestras, que deben ser colocadas en envases de plástico con tapa de
rosca, etiquetada y una ficha de datos.

RECONOCIMIENTO DE ELEMENTOS ANORMALES Y NORMALES EN LAS MUESTRAS DE HECES

Entre los elementosanormales(parásitosdeltubodigestivo)presentes en lashecesse puedenobservar:

Trofozoíto de Entamoeba histolytica Huevo de Meloidogyne sp

Quistes de E. histolytica Trofozoíto Huevo de Heterodera sp
de Entamoeba coli Quiste de E. HuevodeTrichostrongylussp Huevo
coli de Taenia sp

Quiste de Endolimax nana Quiste Proglótido grávido de Taeniasaginata

de Iodamoeba butschlii Proglótido grávido de Taenia solium
Trofozoíto de Giardia lamblia Huevode Diphyllobothriumpacificum.
Quiste de Giardia lamblia Proglótido de D. pacificum.
Trofozoíto de Chilomastix mesnili
Huevo de Hymenolepis diminuta. Huevo
Quiste de Chilomastix mesnili
de Hymenolepis nana Cápsula ovígera
Trofozoíto de Trichomonas hominis
de Dipylidium caninum. Huevo de
Trofozoíto de Balantidium coli
Fasciola hepatica.
Quiste de Balantidium coli
Huevo de Paragonimus mexicanus.
Trofozoíto uninucleado de Dientamoeba fragilis
Huevo de Schistosoma mansoni
Trofozoíto binucleado de D. fragilis Ooquiste
de Cryptosporidium sp.

Ooquiste de Cyclospora cayetanensis

Ooquiste de Cystoisospora belli
Huevo infértil de Ascarislumbricoides
Huevo fértil de Ascaris lumbricoides
Huevo de Enterobius vermicularis
Huevo de Trichuris trichiura Huevo
de Uncinarias

Larva rabditoide de Strongyloides stercoralis

Entre los elementos normales de origen vegetalpresentesen las hecessepuedenobservar: Granos de
almidón Estructura vascular vegetal
Pelo vegetal Células vegetales
Paredcelular vegetal Grano de polen
Gotas de grasa Fibra de algodón
Células vegetales en empalizada Levaduras
Hongos

Entre los elementos normales deorigenmineralpresentes enlashecesse pueden observar:

Fosfatoamónico magnésico Fosfato cálcico neutro
Oxalato de calcio Ácido úrico
Cistina Leucina
Colesteral Carbonato de calcio
Sulfanil amida Cristales de Charcot Leyden
Acidos grasos
 CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS GENERALES DE
PROTOZOOS Y HELMINTOS

PROTOZOOS
Organismosunicelulares, algunos devidalibre yotrosparásitosdeplantas yanimales. Eucarióticos, microscópicos,
connúcleo, citoplasma ymembranacitoplasmática definida. Elnúcleo estárodeado de una membrana y
contiene el material genético. El citoplasma presenta vacuolas y otras inclusiones. Algunas especies
poseen organelas especiales (toxonemas, anillo polar) ó mitocondrias conteniendo ADN ó quinetoplastos,
como en los Kinetoplastidae.
OBSERVE el movimiento de los siguientes Protozoos: amebas mediante la emisión de seudópodos, flagelados
mediante sus flagelos y ciliados mediante cilios.
Algunos Protozoos presentan membrana ondulante que les sirve para su desplazamiento, p.e.

Trypanosoma.
Algunos Protozoos presentanformaderesistencia, que les sirve, también, paracompletarsusciclos vitales; estas
formas son llamadas quistes (amebas y flagelados) esporoquistes u ooquistes (esporozoos).
Las amebas y los flagelados presentan reproducción asexual por división binaria longitudinal. Los
ciliados presentan reproducción asexual por división binaria transversal y una llamada reproducción
sexual por conjugación. Los Esporozoarios presentan reproducción asexual y sexual.
OBSERVE los quistes de los siguientes grupos de Protozoos: amebas, flagelados, ciliados y coccideos
 HELMINTOS
Organismosmulticelulares, generalmente macroscópicos, algunos devidalibre yotrosparásitos de animales y
plantas. Presentan reproducción sexual. Reptan para sus desplazamientos. Algunas especies presentan ciclos
biológicos variados y complejos.
Se clasifican en Plathyhelminthes ó gusanos planos (Tremátodes y Céstodes) y Nemathelminthes ó gusanos
redondos (Nemátodes).

TREMÁTODES:
En su ciclo evolutivo necesitan de uno o dos hospederos intermediarios, que suelen ser moluscos y crustáceos.
Adulto: Se movilizan por movimiento reptante, sin cavidad corporal y presentan aparato digestivo rudimentario.
OBSERVE la forma del cuerpo, la presencia de las ventosas oral y ventral. Son hermafroditas, a excepción
deSchistosomamansoniquepresentansexos separados. Guíese con eldibujo.
Huevos: EXAMINE la superficie, opérculo y el color.
Adulto: Tienen forma acintada. Se movilizan por movimiento reptante, sin cavidad corporal y carece de
aparatodigestivo.
EXAMINE el escólex. OBSERVE las ventosas y otras estructuras de fijación, la estróbila y los
diferentes tipos de proglótidos. Son hermafroditas. Guíese por el dibujo adjunto.
Huevo: EXAMINE la superficie ó forma y características del embrión. Larva:
OBSERVE los diferentes tipos de larvas, forma y estructura interna. Guíese en
sus observaciones por el dibujo adjunto.

NEMATODOS

Adulto: Presentan cuerpo cilíndrico, cavidad corporal, aparato digestivo desarrollado. Ponga atención a la
forma del cuerpo, al extremo anterior, la boca con labios, estiletes, cápsula bucal y a las diferencias
másnotorias entreambossexos. Elmachopresentaelextremoposterior incurvado o
presentacampanaobolsacopulatriz. OBSERVE, en la hembralos órganosreproductores.
Larvas: OBSERVE y DIFERENCIE las larvas rabditoides de las filariformes.
 Huevos:
EXAMINE
las
diferentes formas de las diversas especies, así como las características de sus membranas.

III. CAPACIDADES
a. Realiza el examen directo de especímenes biológicos.
b. Identifica la estructura básica de agentes parasitarios

IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO

Reactivos Materiales Equipo Material biológico Otros
Lugol parasitológico Portaobjetos Microscopio Muestras fijadas
NaCl 0.85% Cubreobjetos Mechero bunsen Pool de parasitos.
Palillos

DESCRIPCION DE LOS PROCEDIMIENTOS

 Agregueunagota delugolen un extremo de unportaobjeto yen el otro extremouna gota de
solución salina
 Con un palillo tome una pequeña muestra de la materia fecal y disuélvala en la solución
salina, con otro palillo realice el mismo procedimiento pero en la gota de lugol
 Observe con objetivo de 40X, buscando Huevos, quistes, Larvas otrofozoitos de parásitos
 Dibuje los resultados
INVESTIGACIÓN

1.- Dibuje lo observada en los procedimientos

2.- ¿Qué es el examen coproparasitológico?

- es un examen de laboratorio para encontrar organismos en las heces que puedan causar
enfermedad y síntomas gastrointestinales.

3.- ¿Qué es un coprológico funcional y como se realiza?

- Evacue las heces directamente en un envase limpio. No evacue en la taza del inodoro. Use la
cuchara que viene en la tapa del frasco para recolectar una pequeña parte de las heces, del
tamaño de una aceituna.

4.- ¿Qué es un coproparasitológico seriado?

- Este examen sirve para establecer la presencia de parásitos intestinales.

5.- ¿Por qué es importante aprender a reconocer los elementos vegetales que pueden
encontrarse en la materia fecal?

- La importancia de reconocer los restos no parasitarios radica simplemente en no

confundirlos con los parásitos.

¿Cómo se clasifican los protozoos?

- La clasificación habitual de ellos se distingue entre cuatro tipos, los flagelados, los ciliados, los
esporozoos y los rizópodos.

¿En qué consisten las siguientes coloraciones permanentes: Tricrómica de Gomori, Giemsa,
Carmín de Semichón, Hematoxilina Delafield?

- Tricrómica de Gomori: es un método idóneo para teñir fibras, tejido muscular y citoplasmas,
donde destaca esencialmente el condrioma como un fino granulado rojizo.

- Giemsa: permite la diferenciación de las distintas células sanguíneas. La solución

de Giemsa colorea y revela eritrocitos, basófilos, eosinófilos, polimorfonucleares, linfocitos,
plaquetas y la cromatina de los núcleos.

- Carmín de Semichón: para detección de glucógeno y sustancias mucoides, para tinción

nuclear tras impregnación con plata o para tinción vital.

- Hematoxilina Delafield: Método clásico para colorear e identificar estadios de protozoos

patógenos y comensales comunes en heces del humano, sobre todo cuando sólo hay
trofozoítos o cuando hay infecciones mixtas.
Realice un mapa conceptual de los diferentes protozoos, helmintos y nematodos, sus formas
de presentación y las enfermedades relacionadas con los mismos

Lee las “Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología” publicado en Revista

investigación en discapacidad en Vol. 3, Núm. 1 Enero-Marzo 2014 pp 10-18. Dirección
electrónica: http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf