Introducción

El diagnóstico de las infecciones por vía respiratorias altas es complicado debido a la

presencia de la mayoría de los patógenos en personas sanas sin presentar síntomas.
Incluso S. pyogenes suele hallarse en pequeñas cantidades en la graganta de individuos
asintomaticos.La principal excepcion a esta regla es Neisseria gonorrhoeae, que se
encuentra sólo como una infección de transmisión sexual. La flora de la orofaringe de las
personas sanas se compone principalmente de​ Staphylococcus viridans, estreptococos
β -hemolíticos, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Streptococcus
pneumoniae, Moraxella catarrhalis​, muchas bacterias anaerobias, como especies de
Fusobacterium y ​Actinomyces israelii​, levaduras como ​Candida albicans​, etc; todos ellos
habitan las vías respiratorias altas sin causar enfermedad. En los individuos enfermos que
son internados en un hospital, la flora endógena cambia de grampositiva
(predominantemente estreptococos) a gramnegativa (​Enterobacteriaceae y especies de
Pseudomonas​). La razón de este cambio parece ser la pérdida de la fibronectina, una
proteína que aumenta la unión de las bacterias grampositivas a la superficie de las células
epiteliales de la orofaringe [1].
El estudio del exudado faríngeo y nasofaríngeo es importante para el diagnóstico de ciertas
enfermedades, tales como faringitis estreptocócica, difteria, algodoncillo (​Candida​); para
establecer el foco de infección de la fiebre escarlatina, fiebre reumática, glomerulonefritis
aguda; meningococo, ​Staphylococcus aureus y bacilo diftérico. El exudado nasofaríngeo se
recomienda para el aislamiento de meningococo, en portadores de ​Bordetella pertussis​,
portadores nasales de estafilococos coagulasa positivo y estreptococo [2].
El esputo es un espejo de los fenómenos biológicos que se realizan en el interior del
bronquio. La bacteriología del esputo muestra el agente infeccioso agresor; su bioquímica
refleja cómo se realiza la defensa orgánica y como están desarrollándose los fenómenos
alternativo y exudativo de la inflamación; su estudio fisicoquímico nos da la clave del porqué
de su viscosidad y de su mayor o menor facilidad para expulsarlo [3].
Un punto importante en la evaluación del esputo es la tinción de Gram, ya que permite
evaluar si la muestra es adecuada para el cultivo y ayuda a interpretar los resultados.
Los antibiogramas son estudios que se realizan in vitro y nos permiten determinar la
resistencia o el grado de sensibilidad de los microorganismos frente a diferentes
antimicrobianos; en lo posible tratan de reproducir las condiciones en que se encuentra el
agente infeccioso dentro de los tejidos o líquidos orgánicos [4 ].
Resultados

Resultados del exudado faríngeo

Agares Resultados

Agar Sangre -Crecimiento satisfactorio

-Colonias agrupadas
-No se puede ver morfologia colonial
-No se puedo evidenciar hemólisis

-Crecimiento satisfactorio
-Colonias incoloras
-No fermentadores de lactosa

Morfología Colonial
-Elevación: convexa
-Forma: circular
-Bordes: redondeados

Agar MacConkey

-Crecimiento satisfactorio
-Colonias blanquecinas
-Sin cambio en la coloración del medio

Morfología Colonial
-colonias pequeñas
- Forma circular
- Bordes redondeados
- superficie lisa y convexa
Agar Sal Manitol
 -No se observó crecimiento

Agar BiGGY

A partir de la morfología colonial presente en el agar macconkey, se inocularon las

pruebas bioquímicas.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Prueba Resultado

-RM positivo
-Fermentación de glucosa
-Productos ácidos

RM
 -VP negativo

VP

-Superficie/profundidad: K/A
-Lactosa negativa
-Sacarosa negativa
-Glucosa positiva
-Producción de H2S positiva
-Producción de gas negativo
-Cambio de coloración de naranja a pico
rojo fondo amarillo.

TSI

-Citrato permeasa positiva

-Cambio de coloración de verde a azul
intenso en pico de flauta.

CITRATO
 -Fenilalanina desaminasa positiva
-Viraje en pico de flauta y/o líquido de
condensación a verde.

FAD

-Desaminación de lisina positiva

-Superficie/profundidad: rojiza/amarilla
(ácida)
-Cambio de coloración de púrpura a pico
rojizo, fondo amarillo.
-Producción de H2S negativo

LIA

-Movilidad positiva
-Indol negativo
-Ornitina descarboxilasa positiva
-Cambio de color en el fondo del tubo de
púrpura a amarillo turbio.

MIO
 -Ureasa positiva
-Cambio de coloración del medio de rosa
claro a rosa intenso.

UREA

Antibiograma

Se realizó el antibiograma a partir de las colonias crecidas en el agar sal manitol (SM),
empleando un Multidisco II Bio-Rad® de papel filtro para evaluar la sensibilidad de la cepa
bacteriana a 12 antimicrobianos: FEP, CXM, CTX, SXT, GE, PE, TE, AM, E, LEV, CF, y DC.
Se transfirió un inóculo de colonia del cultivo SM con un hisopo humedecido sobre un medio
de agar mueller-hinton por siembra masiva y se colocó el multidisco con unas pinzas
estériles. Luego de 24 horas de incubación se observaron los siguientes resultados:

Se observó como zona de inhibición aquellas áreas que no mostraron un crecimiento obvio
visible, siendo positivo para ​FEP, CXM, CTX, SXT y GE. ​A partir de los cuales se midieron
los diámetros de las zonas de inhibición, incluyendo el diámetro del disco, usando una regla.
Los resultados se reportan de acuerdo con los diámetros estandarizados de la tabla
proporcionada por la NCCLS que define las categorías de resistencia (R), sensibilidad (S) y
sensibilidad intermedia (I).
Para aquellos discos en los que no se observaron halos de inhibición, no se tomarían en
cuenta, dado que para interpretar la susceptibilidad hacia algunos antibióticos es necesario
tiempos de incubación mayores.

Resultados del esputo

Medios de Cultivo

Se realizó la descarga de una alícuota de la muestra de esputo con un hisopo estéril en los
medios de cultivo seleccionados, estos fueron sembrados mediante la técnica de
aislamiento por agotamiento, luego de 24 horas de incubación se observaron los siguientes
resultados:

1.​ ​ Agar Sangre (AS): No fue posible observar crecimiento alguno.

2.​ ​Agar MacConkey (MCK): No fue posible observar crecimiento alguno.
3.​ ​Agar Sal Manitol (SM): No fue posible observar crecimiento alguno.
4.​ ​ Agar BIGGY (BG): No fue posible observar crecimiento alguno.
Los medios de cultivo se incubaron por otras 24 horas, sin embargo, los resultados fueron
los mismos.

Tinción de Gram

A partir de la muestra de esputo se realizó una tinción de gram con el fin de identificar la
morfología y características de la membrana de las posibles bacterias que pudieran
presentarse en la muestra. Una vez realizada la tinción se realizaron observaciones
empleando un microscopio y sus distintos objetivos, se observó lo siguiente:

Objetivos

40x: No fue posible la observación de bacterias, solo se observaron células epiteliales.

100x: No fue posible la observación de bacterias, solo se observaron células epiteliales.

Discusión

A partir de la muestra de exudado se llevó a cabo la inoculación de la muestra en los

siguientes medios de cultivo tales como:
Agar sangre
El agar sangre es un medio de cultivo enriquecido, utilizado para el aislamiento de
numerosos microorganismos, permite el crecimiento de microorganismos exigentes y
visualización de reacciones de hemólisis [--]. El microorganismo inoculado presentó
crecimiento, pero no se pudo llevar a cabo el aislamiento del mismo y por ende tampoco
comprobar la reacción de hemólisis.
Agar MacConkey
El agar MacConkey es un medio de cultivo que permite el aislamiento exclusivo de bacilos
Gramnegativos, por esta razón es un medio selectivo y además permite distinguir entre
bacilos fermentadores y no fermentadores de la lactosa, haciéndolo un medio diferencial. El
cambio de color es generado por la fermentación de la lactosa que genera la producción de
ácidos mixtos que acidifican el medio haciendo que el indicador vire[+]. La bacteria
inoculada en este medio presento crecimiento satisfactorio al igual que se permitio observar
la morfología de la misma. El microorganismo no es fermentador de la lactosa dado que no
se presentó un cambio en la coloración.
Agar sal manitol.
El agar sal manitol es un medio de cultivo selectivo y diferencial, para el aislamiento de
cocos Grampositivos. Es selectivo debido a la alta concentración de sal que posee,
actuando como sustancia inhibitoria y evita el crecimiento de bacterias grampositivas. El
manitol es el carbohidrato fermentable y presenta rojo de fenol como indicador, así las
bacterias capaces de fermentar el manitol producen ácidos, haciendo que las colonias y el
medio se torné de amarillo[--]. El microorganismo obtenido en este medio, no tiene la
capacidad de fermentar el manitol debido a que en el medio no se observó ningún cambio
de coloración, de igual manera se puede decir que se trata de una bacteria grampositiva.
Agar Biggy
El agar BIGGY o también conocido como agar de Nickerson es un medio parcialmente
selectivo para el aislamiento de levaduras, especialmente del género Candida, aunque
pueden crecer otros géneros. La diferenciación se basa en la morfología colonial y la
pigmentación típica que se presenta en este medio[--]. No se observó crecimiento
bacteriano esto debido a las características del agar y a su composición como el citrato de
amonio, bismuto y el sulfato de sodio que actúan como inhibidores del desarrollo bacteriano.
Para el caso de las pruebas bioquímicas, para llevar a cabo la identificación del
microorganismo, las pruebas realizadas fueron las siguientes:
El medio ​RMVP es una solución simple que contiene peptona, glucosa y un buffer de
fosfato. La prueba de rojo de metilo está diseñada para detectar microorganismos capaces
de realizar una fermentación ácida mixta, esta se puede verificar por la adición de rojo de
metilo después de la incubación, un viraje a color rojo indica un resultado positivo, al
contrario una coloración amarilla representa un resultado negativo. Para el caso de la
prueba de Voges Proskauer, se utiliza para identificar microorganismos que fermentan
glucosa y producen productos finales a un pH neutro. Se añade el alfa naftol e hidróxido de
potasio, si se produce un cambio de color rojo significa que es VP positivo y un cuando no
existe un cambio de color es negativo, esto para evidenciar la presencia de productos
finales neutros [Daysi]. La bacteria inoculada fue RM positivo, indicando la presencia de
productos finales ácidos y por lo tanto VP negativa.
El medio ​TSI es empleado para la diferenciación de enterobacterias en base a la
fermentación de los hidratos de carbono glucosa, lactosa, sacarosa y la producción de
sulfuro de hidrógeno. La fermentación de los azúcares se detectan por el rojo fenol que vira
a color amarillo en medio ácido. Las concentraciones de lactosa y sacarosa son mayor que
la de glucosa, por lo cual la fermentación de glucosa se observa en el pico y de los otros
azúcares en el fondo. Aunque la glucosa es suprimida por la oxidación de una pequeña
cantidad de ácido en el pico del tubo, genera una reacción de pH neutro cuando se
fermenta la glucosa. Con un pH neutro o alcalino el ácido sulfhídrico (producido por el
tiosulfato sódico) reacciona con la sal de amonio ferroso, lo que produce sulfuro de hierro de
color negro [Daysi]. Para la bacteria inoculada en este medio y según su viraje rojo en pico y
fondo ligeramente amarillo, la bacteria presenta la característica de ser fermentadora de
glucosa, pero también se observa la producción de sulfuro de hidrógeno por el
ennegrecimiento del medio.
El medio ​citrato de Simmons es una prueba en la cual el citrato de sodio es la única fuente
de carbono y el azul de bromotiol el indicador, por lo cual los organismos capaces de utilizar
el citrato como única fuente de carbono y las sales de amonio como fuente de nitrógeno,
crecerán alcalinizando el medio. Un resultado positivo se interpreta cuando el
microorganismo crece y alcaliniza el medio que vira de verde a azul, esto es cuando está
presente la enzima citrato permeasa; por el contrario, en un resultado negativo no hay
crecimiento y el medio permanece verde [Prats]. Para el caso del microorganismo inoculado
en este medio se puede observar el cambio de coloración del medio que fue de verde a azul
intenso como lo indica la literatura tomando este como un resultado positivo para la prueba,
indicando la presencia de la enzima citrato permeasa.
En el medio ​FAD​, se desamina la fenilalanina a ácido fenilpirúvico. Cuando existe ácido fenil
pirúvico y al añadir el cloruro férrico, el reactivo vira a color verde intenso, indicando la
presencia de la enzima fenilalanina desaminasa. Para el caso de la bacteria inoculada en
este medio, al añadir el reactivo de cloruro ferrico, el pico y el líquido de condensación
viraron a un color verde, lo cual indica la presencia de la enzima fenilalanina desaminasa.
El medio ​LIA está formulado para detectar la producción de lisina descarboxilasa, lisina
desaminasa y la producción de H2S. El medio contiene lisina y glucosa y el indicador es el
púrpura de bromocresol. La fermentación de la glucosa produce catabolitos ácidos haciendo
que la base del medio vire de violeta a amarillo. Si la lisina es descarboxilada se producen
catabolitos alcalinos que neutralizan los ácidos y dejan el medio del color inicial. La
desaminación de la lisina alcaliniza con mayor intensidad el medio y vira el indicador en la
pendiente a rojo. La producción de sulfuro de hidrógeno se visualiza por el ennegrecimiento
del medio formación de sulfuro de hierro [Prats]. La bacteria inoculada en este medio
presentó la característica para inferir que hay una desaminación de la lisina debido al viraje
de la pendiente a rojizo,, pero no hubo producción de H2S.
La prueba ​MIO es para detectar la descarboxilación de la ornitina, producción de indol y
movilidad de la bacteria. Este medio contiene glucosa, la cual al ser fermentada acidifica el
medio virando a color amarillo, si se produce descarboxilación de la ornitina, se alcaliniza el
medio y se compensa la acidez, por lo que el medio no varía de color lila. La movilidad se
manifiesta por el enturbiamiento desde la picadura a través de todo el agar. Al añadir
reactivo de Kovacs se detecta la producción de indol a partir del triptófano virando a color
rojo [Prats]. La bacteria inoculada presentó una coloración púrpura en la superficie,
indicando la presencia de la ornitina descarboxilasa, también se vio el enturbiamiento del
medio indicando su movilidad y al agregar el reactivo de Kovac, el reactivo permaneció del
mismo color indicando un resultado negativo.
La prueba de ​urea consiste en una solución tamponada de peptona y glucosa, se añade
urea y rojo fenol como indicador. La presencia de amonio a partir de la urea alcaliniza el
medio y el indicador vira a un color rosa intenso [Prats]. La bacteria inoculada en este medio
presento la enzima ureasa que es capaz de hidrolizar la urea haciendo que vire el medio.

Antibiograma

Una vez obtenidos los resultados se observaron ciertas discrepancias en estos, por
ejemplo, Staphylococcus es sensible a la Cefotaxima y la Cefepima, sin embargo, nuestros
resultados indicaron que la bacteria fue resistente a estos antibióticos. Esto puede deberse
a la diversidad de cepas existentes de Staphylococcus, en particular, a la cepa de
Staphylococcus resistente a metilciclina (SARM).

La cepa SARM no responde de igual manera de la que lo hace el Staphylococcus “común”

no resistente a metilciclina, además de ser resistente a metilciclina presenta una resistencia
a derivados ß-lactámicos y en general a varios grupos de antibióticos, dichas resistencias se
obtienen mediante la producción de β -lactamasas, fenómenos de tolerancia y resistencia
por proteínas fijadoras de penicilina (PBP).

Entre los antibióticos a los cuales se reporta que SARM posee resistencia se mencionan la
Cefotaxima, Cefepima y Cefuroxima, lo cual concuerda con nuestros resultados, de igual
manera, cuando se presentan casos de infecciones por SARM se emplean
Timetoprim-sulfametaxol y Gentamicina, estos son mencionados como tratamientos
efectivos contra esta cepa resistente, lo cual de igual manera concuerda con los resultados
obtenidos.

Tomando en cuenta que en los resultados se presentó una resistencia a antibióticos que
son comúnmente efectivos contra Staphylococcus, y que se presentó una sensibilidad a
antibióticos que son empleados como tratamiento para tratar infecciones por cepas
resistentes se puede sugerir se trata de una cepa de Staphylococcus resistente a
metilciclina.
Discusión esputo

Medios de cultivo y tinción de Gram

De acuerdo a los resultados obtenidos, tras 24 horas de incubación en ninguno de los

medios de cultivo fue posible el aislamiento ni el crecimiento de ningún microorganismo, si
bien los medios de cultivo selectivos pudiesen haber presentado un resultado negativo de
manera normal, esto no debió haber ocurrido en los medios enriquecidos en los cuales
puede crecer una gran variedad de microorganismos.

Esta indeterminación puede estar fuertemente atribuida a las condiciones de la recepción de

la muestra, ya que el cultivo de esputo presenta una sensibilidad baja (40-60%) debido a la
pérdida de bacterias por retraso en el procesamiento, presencia de agentes etiológicos
difíciles de cultivar y, sobre todo, por su contaminación con la microbiota orofaríngea.

En este caso particular, la muestra estaba mezclada en gran parte por saliva lo que conlleva
el arrastre de componentes entre los que se encuentran células del epitelio respiratorio del
huésped, proteínas y otros materiales de secreción producidos en los pulmones como
resultado de la respuesta inflamatoria; mismos que representan una contaminación para el
procesamiento de la muestra.

Por otro lado, de acuerdo a la selección de los medios para la recuperación del
microorganismo, en el medio de enriquecimiento del agar sangre se observó el mínimo
crecimiento de unas colonias particulares que podrían ser indicativas de la microflora
normal.

La razón que justifica llevar a cabo la tinción de Gram de la muestra de esputo, es porque
se considera como un criterio estandarizado de cribado que permite determinar el grado de
contaminación y la calidad de la muestra antes de la realización del cultivo y establecer de
este modo, unos criterios de rechazo. Sin embargo, la tinción se realizó una vez que se
inocularon los medios. No obstante, la tinción de Gram presenta también problemas, por su
gran variabilidad en la especificidad, sensibilidad y reproducibilidad, dependiendo de
factores como la muestra y la experiencia del observador.

Conclusión
De acuerdo a los resultados obtenidos se llega a concluir que las consecuencias de una
muestra mal tomada y/o mal enviada pueden suponer un fracaso en el aislamiento del
agente etiológico o aislamiento de posibles microorganismos contaminados que pueden
generar tratamientos innecesarios o inadecuados. En base a los resultados de los medios
de cultivo y pruebas bioquímicas se identificó la probable presencia de ​Proteus mirabilis, ​y
de acuerdo a los resultados del antibiograma se identificó la probable presencia de
Staphylococcus resistente a metilciclina.
Cuestionario
1. Explica el fundamento de los medios de cultivo empleados.
El agar MacConkey es un medio selectivo y diferencial que contiene lactosa, sales
biliares, rojo neutro y cristal violeta. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el
crecimiento de bacterias Gram positivas. Los productos ácidos de la fermentación de
la lactosa disminuyen el pH alrededor de la colonia produciendo un viraje de una
coloración roja, mientras que las no fermentadoras mantienen el color normal del
medio [+ ].
El agar Sal manitol es un medio de cultivo altamente selectivo, pues tiene una alta
concentración de cloruro de sodio (7.5 %), que impide el crecimiento de la mayoría
de las bacterias pero, tolerada por el grupo de los Staphylococcus.Además, el medio
contiene manitol como único carbohidrato y rojo de fenol como indicador de pH, cuyo
ámbito de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).Cuando hay producción
de ácido a causa de la fermentación del manitol, las colonias aparecen rodeadas de
un halo amarillo; el medio permanecerá sin cambio de color o actuará el rojo de
metilo, cuando las colonias no fermentan el manitol [ --].
El agar Sangre es un medio enriquecido, diferencial y no selectivo.
Es un medio enriquecido porque lleva como aditivo principal 5 -10% de sangre sobre
una base de agar. Ambos compuestos contienen alto contenido de nutrientes y esta
propiedad permite que en él puedan crecer la mayoría de las bacterias cultivables.
Así mismo, el agar sangre es un medio diferencial, ya que permite distinguir 3 tipos
de bacterias: los beta-hemolíticos, alfa –hemolíticos y gamma-hemolíticos.
Los beta-hemolíticos son aquellos que tienen la capacidad de lisar o romper
completamente los glóbulos rojos, formando un halo claro alrededor de las colonias,
por tanto producen hemólisis ß ó ß –hemólisis y los microorganismos son llamados
ß-hemolíticos.
Los alfa-hemolíticos son los que realizan una hemólisis parcial, donde la
hemoglobina es oxidada a metahemoglobina, generando una coloración verdosa
alrededor de las colonias. A este fenómeno se le conoce como hemólisis α ó α
–hemólisis y a las bacterias se les clasifica como α – hemolíticos.
Por último, están las bacterias denominadas gamma-hemolíticas o no hemolíticas.
Estas crecen sobre el agar sin generar cambios sobre el mismo, efecto conocido
como γ –hemólisis, y los microorganismo son γ –hemolíticos [--]
El agar Biggy es considerado un medio parcialmente selectivo para el aislamiento de
levaduras, especialmente del género Candida, aunque pueden crecer otros géneros.
También es un medio diferencial porque dependiendo de la especie involucrada se
observarán características distintas en cuanto aspecto, color, forma y tamaño. El
color que presentan las colonias de las levaduras se debe a la presencia de sulfito
de bismuto en el agar. Este agar contiene extracto de levadura y dextrosa, lo que
proporciona la fuente de nutrientes básicos y energía para el desarrollo de las
levaduras. La glicina es un estimulante para el crecimiento de las levuras, mientras
que el citrato de amonio y bismuto inhiben el desarrollo de ciertas bacterias.

2. Explica el fundamento de la técnica de Barlett.

El Índice de Bartlett es útil para valorar la calidad de la muestra de esputo. Cuenta el
número de leucocitos y de células epiteliales escamosas observadas en no menos
 de 10 campos del microscopio (100x). El índice de Bartlett se obtiene al efectuar la
suma algebraica del total de leucocitos vs células epiteliales presentes. Cualquier
valor positivo es válido para aceptar la muestra como apropiada para cultivo [ ¿].
3. ¿Por qué es importante, en el procesamiento de esputo, primero evaluar la
calidad de la muestra?
Se han propuesto varias guías para la evaluación de la calidad del esputo, utilizando
diferentes combinaciones y puntos de corte respecto al número de células epiteliales
escamosas y/o leucocitos polimorfonucleares (PMN), sin que ninguna haya demostrado una
eficacia claramente superior. En general, la muestra se considera adecuada y clínicamente
útil si se observan al microscopio 25 o más PMN y menos de 10 células epiteliales por
campo a 100 aumentos. La presencia de múltiples tipos de bacterias sugiere contaminación
con microflora oral. Una buena recolección conlleva a que se realice un buen estudio y
diagnóstico. Si el esputo es rechazado y no se cultiva, se debe avisar al clínico y se debe
repetir la toma de muestra.
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