24/05/2023

Reservorio de Fase móvil

HPLC Bomba

(High Performance Liquid Chromatography)

Automuestreador

Cromatografía de Líquidos de Alta Eficiencia

Inyector
(Válvula Rheodyne) Horno
(Columna)
Columna

Guardacolumna Detector UV - Vis

Elementos del sistema cromatográfico

 Soporte: Columna de acero inoxidable
 Fase estacionaria: En función del principio fisicoquímico
empleado
 Fase móvil: Liquida (Compuesta por uno o más disolventes)
 Analito: Disuelto en la fase móvil (disolvente adecuado)
HPLC:
Es una técnica analítica que permite trabajar mezclas complejas de
sustancias de diversa procedencia, con el propósito de separarlas
(purificarlas), identificarlas, cuantificarlas.
En ésta, la muestra debe ser soluble en la FM, y se hace pasar junto con
un disolvente líquido a alta presión a través de una columna, llena de un
material adsorbente sólido.
La presión en el sistema se eleva con la ayuda de bombas.

Componentes de un HPLC:
Reservorio de la Fase móvil:
- Frascos de vidrio
- Polímero resistente
Reservorio de Fase Móvil Tapa que prevenga ingreso de partículas del ambiente.
Bomba
Inyector Automuestrador
Horno Función:
Columna Precolumna
Filtro de acero
Guarda columna (poro: 2 – 10 μm)

Detector
Colector de fracciones
PC

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BOMBA: Tipo de Bombas:

Función:
 Bombas reciprocantes.
 Bombas de desplazamiento.
Características:  Bombas neumáticas.

 Intervalo de caudal 0.1 a 10 ml/min.

 Exactitud en el caudal.
 Generación de presiones de hasta 6000 psi ( lbs / pulgada² ).
 Flujo libre de pulsaciones.
 Componentes resistentes a la corrosión (juntas de teflón), y al
desgaste mecánico.
 Sistema de corte.

Bombas de Desplazamiento: Bombas (Sistemas de bombeo):

FM contenida en un cilindro  Impulsada por el movimiento contínuo y hacia  Binarias
adelante de un pistón.
 Cuaternarias

 Flujo de FM:

1 - 2 mL/min  Sistema Analítico

Ventaja :
Ausencia de pulsos. 4 – 5 mL/min  Sistema Preparativo
Desventaja:
Se recarga la cámara cuando se vacía  Flujo y tR .

Inyector manual:
Elución de la muestra:
Función:
Loop
Elución Isocrática: Intercambiable
5 – 2000 μL
Elución en Gradiente:

 Muestras complejas.
 La polaridad de los componentes es muy diferente.
 La elución comienza con un disolvente débil y se incrementa de
forma progresiva la proporción del componente fuerte.
Válvula Rheodyne

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Inyector: Columnas analíticas:

Guarda columna
Columna:
• Acero inoxidable
• FE Función:

Función:

Característica Dimensiones Efecto

Longitud (cm) 5, 7.5, 10, 15, 25, 30
Diámetro interno (mm) 3.9 – 4.6
Tamaño de partícula FE (μm) 1.8, 3.5, 5, 10
Forma de la partícula Esférica o irregular

Horno:
Detector:
Permite ver, ubicar en tiempo y espacio la posición de cada
• Temp. amb - 45°C. componente de una muestra a la salida de la columna cromatográfica.

• Reproducibilidad tR
• Solubilidad de la muestra. Características de un detector ideal:

• Viscosidad FM  Presión que se genera x FM  Adecuada sensibilidad.

 Buena reproducibilidad.
• Temperatura influyen sobre k’ e impacta en
la resolución.  Respuesta lineal.
 Tiempo de respuesta corto.
 Respuesta semejante para todos los analitos.

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 No destructivo de la muestra. Detectores universales:

 No afectarse por cambios de temperatura.  Indice de refracción.
 Cuentan con celda de flujo entre 1 – 10 μl.  Conductividad.

Clasificación:
Detectores selectivos:
 UV/VIS
• Detectores universales:
 Arreglo de diodos
Miden el cambio de alguna propiedad física de la FM que contiene al
analito en comparación con la FM pura.  Fluorescencia
 Electroquímico
• Detectores selectivos:  Infrarrojo
Miden alguna propiedad del analito.
 Masas.

Detector:
DETECTOR SENSIBILIDAD
UV/VIS (Absorbancia) 1 ng. - 100 pg.
Fluorescencia 1pg. - 10 pg.
Electroquímico 1 ng. - 10 pg.
Indice de refracción 1 μg. - 100 ng.
Conductividad 1 ng. - 500 ng.
FT-IR 1 μg
Espectrómetro de 1 ng - 100pg.
masas

Tuberia de Acero inoxidable. Tuberías:

 Grado 304 (uso general
cromatográfico). Características:
 Grado 316 (máxima  Inertes.
resistencia a la corrosión)  Resistentes a altas presiones.
 Acero inoxidable 316 ó 304.
 Poliméricas (polipropileno o teflón).
Tuberia para equipos HPLC
Tuberías de acero inoxidable:
 Diámetro externo 1/16 de pulgada.
Tuberia PEEK (poliéter)  Diámetro interno:
0.18 mm por donde circula la muestra.
0.5 a 0.7 mm por donde no circula la muestra.

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Uniones: Fase móvil:

 Disolventes grado HPLC.
 Longitud de onda de corte.

 Debe ser pura, sin contaminantes.

 No debe reaccionar con el empaque de la columna.
 Ser compatible con el detector.
 Debe disolver la muestra.
 Tener baja viscosidad.
Disolventes grado HPLC
 Debe permitir la fácil recuperación de la muestra.
 No debe degradar o disolver a la FE.
 Polaridad adecuada para permitir la retención adecuada del analito en la FE.

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 Filtración:
 Eliminar partículas de la FM. Filtros para muestras
 Membranas:
• Nylon
• Teflón
• Celulosa
(0.45 ó 0.2 μm)

Membranas de 0.45 μm

Fase estacionaria

• Fases no Polares
Desgasificación de la FM:

Sonicador
(15 – 20 min) 50 52

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• Fases polares: • Intercambio iónico:

Tipos de cromatografía en HPLC

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Cromatografía en fase normal Fase móvil de baja polaridad

Cromatografía líquida:

Señal del detector

De acuerdo a la polaridades relativas de la FE y de la FM

a) Fase normal FE:

• FE: Elevada polaridad (Alúmina, sílica gel)
• FM: Baja polaridad

El componente menos polar eluye primero, debido a Fase móvil de polaridad media
que es el más soluble en la FM.
b) Fase Reversa
• FE: No polar (con frecuencia hidrocarburos) Los disolventes de polaridad media provocan una
• FM: Relativamente polar (agua , CH3OH, CH3CN) disminución del tiempo de elución (tR)

Polaridad de los analitos: A > B > C

Cromatografía en fase reversa Adsorción:

Fase móvil de Alta polaridad

FE:

Fase móvil de polaridad media

Los componentes más polares aparecen primero.

Un aumento de la polaridad de la FM aumenta el tiempo de elución (tR)

Mecanismo: Retardo por interacciones de la superficie polar de la fase estacionaria

Polaridad de los analitos: A > B > C con partes polares de las moléculas.

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Partición: Intercambio Iónico:

Mecanismo: Retardo por interacciones de la cadena apolar hidrocarbonada de la fase

estacionaria con partes apolares del analito. Mecanismo: Retención por unión iónica reversible del analito a grupos con carga de la
fase estacionaria.

Exclusión por tamaño: • Cromatografía de Fase Enlazada

(Fase Químicamente Unida)
• Cromatografía de Fase Normal
• Cromatografía de Fase Reversa

Partículas del gel

• Supresión Iónica:
• FE: C18, C8.
• FM: Buffers, H3PO4 pH 3, CH3COOH al 1%.
Metanol (CH3OH) , Acetonitrilo (CH3CN).
• Analito: Solutos Ionizables.
Mecanismo: Retardo de moléculas pequeñas al pasar a través de los poros, exclusión
estérica de moléculas mayores. (Retención en función del tamaño y forma de las
• Interacciones: ?
moléculas).

FE: (Fase Reversa):

• Analito retenido:
• No polar (No iónico)
• Analito no retenido:
• muy polar (Iónico)

• Debe evitarse la ionización del analito

• Retención: Modificada por pH y Fuerza iónica Forma no ionizada Forma ionizada
Equilibrio desplazado a Equilibrio desplazado a
R-COOH R-COO⁻ + H⁺ la forma no ionizada la forma ionizada

R-NH2 + H⁺ R-NH3⁺

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Ácidos Carboxílicos:
pH 2 - 4 se evita la ionización.
Ion-Par:
Bases:
pH 7 – 8 Estructuras altamente hidrofílicas, bases o ácidos orgánicos
(Valor incompatible con el soporte de columnas con base de silica gel.) que se mantienen en forma iónica a pH recomendados para
preservar la integridad de la Fase Estacionaria.

 Columnas: pH entre 2 y 7.
 Columnas de FR que resisten pH entre 11 y 13.

Contraiones:
FE: C18, C8.  Bases (formadoras de cationes):
Contraiónes aniónicos:
FM: Contiene un contraion (especie química de carga opuesta al analito).
Puede contener metanol o acetonitrilo. Butil a Dodecil Sulfonato de Sodio
(Ejm: Sal sódica de Ac. heptan sulfónico)
En este tipo de cromatografía se debe preservar el estado iónico
del analito.

Ácidos:
pH 6.5 – 7.5
Bases:
pH 2.5 – 3.5

 Ácidos (Formadores de aniones) Mecanismo:

Compuestos de Alquil amonio
(Tetrabutil, tetraetil, tetrametilamonio o
trimetil alquil amonio (Alquil: C4 a C12)
El reactivo de par iónico posee una parte apolar
que puede interactuar con la cadena hidrocarbonada de
la fase estacionaria.

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Cromatograma
Fase reversa
Columna: C18
Muestra:
Propilparabeno
Metilparabeno

Detección de picos (analitos): Cromatograma

Factor de capacidad: Selectividad (α):

Capacidad de un sistema de FE y FM para discriminar entre dos componentes.
k’A = tR – t0
t0
k’B
α=
k’ Es un indicador de que tan fuertemente un analito es k’A
retenido en una columna. k’B: de la especie más fuertemente retenida.
k’A: de la especie menos retenida o que eluye más rápido.
k’ : 1 – 5
α >1
k’ < 1
(tR)B – t0
k’ : 20 ó 30 α=
(tR)A – t0

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Métodos para describir la eficiencia de la columna:

L
N= H
N: Número de platos teóricos.
L: Longitud del relleno de la columna (cm).
H: Altura de plato teórico.

tR
N= 16 ( )²
W
W: Ancho de Pico.
N: herramienta de diagnóstico para una columna que envejece.

t𝐑
N= 5.54 ( )²
W½

Eficiencia vs Tamaño de partícula

Platos teóricos:

tR
W ²
N= 16 ( )

Comparación entre diferente tamaño y forma de partícula.

Resolución (Rs):
Medida cuantitativa de la capacidad de una columna para separar
dos analitos.

2 [ (tR)B – (tR)A ]
RS =
WA + WB

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Solapamiento de 4 % Solapamiento de 0.3 %.

Resolución (Rs): Asimetría (As)

Pico simétrico Asimetría posterior

Asimetría anterior

Asimetría: (10 % de la altura del pico). Errores de integración provocados por coleo (Tailing):

B
A=
A

As= 1 Pico Gausiano

As > 1 Coleo (Tailing)
As < 1 Fronteo.

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Resolución:
Baja resolución
Baja selectividad

Alta resolución
Alta selectividad
(Mayor eficiencia)

Alta resolución
Alta selectividad
(Menor eficiencia)

St interno
Normalización de área:

Permite establecer el porcentaje de cada componente en la muestra.

Se calcula dividiendo el área de cada componente entre el área total y multiplicando por
100%, es decir:

Á
%𝐴 = x 100
Á

Factor de respuesta:
Ci= FiAi F= C ⁄ A
F: Factor de respuesta del detector
A: Área bajo la curva
C: Concentración

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Muestra

•Para los componentes que eluyen a 4.99 y 6.08 min calcular el factor de capacidad
de cada uno de ellos, además calcular su selectividad. Longitud de la columna 15 cm.

•Calcular el factor de coleo Calcular la resolución (Rs)entre los picos A y B

(asimetría)

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Ensanchamiento de banda:
Contribución a la altura equivalente de planto teórico (H):

Ecuación de Van Deemter:

𝑩
H= A + + Cu
𝒖
A: Proceso multipaso (o de caminos múltiples).
B/u: Difusión Longitudinal
Cu: Resistencia a la transferencia de masa en la FM
y en la FE.

UHPLC
• Presiones: 15 000 psi.
• Columnas: Partículas con DI de 1.7 μm.

Partículas de alta eficacia para UHPLC, que toleran la presión:

 Partículas híbridas de 1.7 µm con puentes de etileno (BEH).

 Partículas de sílice de alta resistencia (HSS) de 1.8 µm.

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