CROMATOGRAFÍA POR

EXCLUSIÓN DE
TAMAÑO

9 DE NOVIEMBRE DE 2022
TRIANA RODRIGUEZ SEQUEROS
Ensayos biotecnológicos
 Cromatografía por exclusión de tamaño

Índice
1. Objetivos...........................................................................................................................3
2. Fundamento......................................................................................................................3
3. Materiales y equipos.......................................................................................................4
Materiales...............................................................................................................................4
Reactivos................................................................................................................................4
Muestras.................................................................................................................................4
4. Procedimiento..................................................................................................................5
5. Resultados........................................................................................................................6
6. Conclusión........................................................................................................................7
7. Webgrafía..........................................................................................................................8

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 Cromatografía por exclusión de tamaño

1. Objetivos

 Preparar una columna de exclusión molecular.

 Separar una mezcla de proteínas de acuerdo con su tamaño molecular.
 Comprender en que consiste la técnica de la Cromatografía.

2. Fundamento
La cromatografía se usa comúnmente en biotecnología para purificar
moléculas biológicas, como proteínas, para medicina u otros usos. La
cromatografía separa los componentes individuales de las mezclas
complejas. La cromatografía consta de una fase móvil (disolvente y las
moléculas a separar) y una fase estacionaria bien sea en papel (en
cromatografía en papel) o en perlas de vidrio, denominadas resina, (en
cromatografía en columna), a través de las cuales viaja la fase móvil. Las
moléculas viajan a través de la fase estacionaria a diferentes velocidades
debido a su química. La cromatografía de filtración en gel, comúnmente
conocida como cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), se
empaquetan en una columna perlas microscópicas que contienen orificios
diminutos. Cuando una mezcla de moléculas se disuelve en un líquido y
luego se aplica a una columna de cromatografía que contiene perlas
porosas, las moléculas grandes pasan rápidamente alrededor de las perlas,
mientras que las moléculas más pequeñas ingresan por los diminutos
orificios de las perlas y atraviesan la columna más lentamente.
Dependiendo de las moléculas, las proteínas se pueden separar,
basándose únicamente en su tamaño, y se pueden recolectar las fracciones
que contienen las proteínas aisladas. Para esta práctica se utiliza la
hemoglobina (marrón rojizo) que es mucho más grande que la vitamina B12
(rosa), y por lo tanto pasa a través de la columna más rápidamente que la
vitamina B12. La masa de perlas dentro de la columna a menudo se
denomina lecho de la columna. Las perlas actúan como "trampas" o
"tamices" y funcionan para filtrar pequeñas moléculas que quedan
atrapadas temporalmente dentro de los poros. Las moléculas más grandes
pasan alrededor de las microesferas o se "excluyen de ellas". A medida que
el líquido fluye a través de la columna, las moléculas por debajo de los
60.000 Dalton ingresan a las perlas y pasan a través de la columna más
lentamente. Cuanto más pequeñas son las moléculas, más lento se mueven
a través de la columna. Las moléculas mayores de 60,000 pasan alrededor
de las perlas y se excluyen de la columna, también conocido como el límite
de exclusión de una columna. El líquido de la fase móvil se recoge, en
forma de gotas, en tubos de recogida que se ordenan secuencialmente.
Por lo general, se recoge un número determinado de gotas en cada tubo.
Las moléculas más grandes que pasan rápidamente a través de la columna
terminarán en los primeros tubos o "fracciones". Las moléculas más
pequeñas que penetran en los poros de la fase estacionaria terminan en las

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fracciones posteriores. La hemoglobina, que es marrón, tiene un peso

molecular de 65.000 Dalton y, por lo tanto, se excluye de la columna. La
hemoglobina pasará más rápidamente a través de la columna y aparecerá
en los primeros tubos o fracciones de recolección. La vitamina B12, de
color rosa, tiene un peso molecular de 1.350 Dalton y, por tanto, es
fraccionada por la columna. Las moléculas de vitamina B12 penetran en los
poros de las perlas y quedan atrapadas temporalmente. Como resultado,
pasan mucho más lentamente a través de la columna y aparecen en las
últimas fracciones.

3. Materiales y equipos

Materiales
 12 tubos
 1 columna de cromatografía
 Marcador permanente
 Pipeta o micropipeta
 Gradilla

Reactivos
 Eluyente para la cromatografía
Muestra
 Mezcla de proteínas que contiene Hemoglobina y Vitamina B12.

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4. Procedimiento

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5. Resultados

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Para comenzar con la cromatografía de exclusión por tamaño se prepara la

columna de cromatografía y añadimos la muestra a separar.

Ilustración 1. Preparación de columna. Ilustración 2. Columna con la muestra. Ilustración 3. Muestra utilizada

Tras unos minutos se comienza a apreciar que los dos componentes de la

muestra, hemoglobina y B12, se separan dentro de la columna.

Ilustración 4. Muestra de hemoglobina y B12 separada en la columna.

Se depositan 5 gotas del liquido drenado por la columna en cada uno de los
tubos obteniendo el siguiente resultado.

Ilustración 5. Tubos de ensayo con hemoglobina (color amarronado) y B12 (color rosa) separadas.

6. Conclusión.

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Tras la realización de esta práctica podemos concluir que es posible separar

una mezcla de proteínas con el método de cromatografía por exclusión de
tamaño. Esto ocurre porque en nuestro caso, la hemoglobina es una proteína
mucho más grande que la B12 por lo que se drena antes. Por este mismo
motivo la B12 se introduce por las micro perlas que se encuentran en el gel de
la columna, por lo que tardan más en drenarse y de este modo se separan. En
nuestros resultados se puede observar como la hemoglobina de color marrón
ocupa los primeros tubos de ensayo y por lo tanto en los siguientes de color
rosa podemos encontrar la B12. Con esta práctica se puede ver claramente el
funcionamiento de la cromatografía siendo este el siguiente. La cromatografía
consta de una fase móvil (disolvente y las moléculas a separar) y una fase
estacionaria que en nuestro caso son perlas, denominadas resina, (en
cromatografía en columna), a través de las cuales viaja la fase móvil. Las
moléculas viajan a través de la fase estacionaria a diferentes velocidades y por
eso se consigue la separación de las moléculas.

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7. Webgrafía
1. Ruiz G. Cromatografía de exclusión por tamaño [Internet]. Net Interlab. Net-
InterLab S.A.; 2022 [citado el 29 de noviembre de 2022]. Disponible en:
https://net-interlab.es/cromatografia-de-exclusion-por-tamano/

2. Studocu.com. [citado el 29 de noviembre de 2022]. Disponible en:

https://www.studocu.com/es-mx/document/universidad-juarez-del-estado-de-
durango/quimicas/fundamento-de-la-cromatografia-por-exclusion-de-tamano/
10251055

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