Manual de Prácticas del Laboratorio de

Control Sanitario de los Alimentos

ELABORADO POR:
Dr. Marcelo Hernández Salazar
Dra. Patricia A. Quevedo Garza
MCN. Martha Castorena Alba
 Índice
Lavado correcto de manos ............................................................................................. 1

Factores que influyen en el crecimiento microbiano ....................................................... 3

Cuenta bacteriana de mesófilos aerobios ....................................................................... 6

Cuenta de organismos coliformes totales y fecales ........................................................ 9

Uso y aplicación de sanitizantes enmanipuladores de alimentos .................................. 12

Uso y aplicación de sanitizantes en superficies de trabajo ............................................ 14

Uso y aplicación de sanitizantes en alimentos .............................................................. 16

 LAVADO CORRECTO DE MANOS

ELABORADO POR:
Dr. Marcelo Hernández Salazar
Dra. Patricia A. Quevedo Garza
MCN. Martha Castorena Alba

OBJETIVO:

Que el alumno se familiarice con la forma correcta y descrita en laNorma Oficial

Mexicana del lavado de manos para manipuladores de alimentos.

RECOMENDACIONES:

Antes de proceder con la práctica, leer la siguiente norma:

NOM-251-SSA1-2009. PRÁCTICAS DE HIGIENE PARA EL PROCESO DE ALIMENTOS,
BEBIDAS O SUPLEMENTOS ALIMENTICIOS.

FUNDAMENTO:

Las buenas prácticas de higiene en manipuladores de alimentos son cruciales para evitar las
enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s).

Esto comienza con el lavado correcto de manos, ya que éstas son un vehículo importante en la
transmisión de enfermedades infecciosas y parasitarias. La mayoría de las personas le dan poca
importancia al lavado de manos porque ignoran el factor de adherencia que poseen las bacterias
y los quistes y huevos de parásitos. Por lo tanto, sólo se lavan las manos de una manera
convencional, o sea, se administran jabón y se frotan las manos para enjuagar al chorro de agua,
para después secarse las manos en una toalla o sobre la ropa.

Estas prácticas deficientes en el lavado de manos solo propician las ETA’s, ya que sólo mediante
el procedimiento del tallado con cepillo de cerdas suaves y jabón sanitizante, se logrará
desprender los agentes infecciosos presentes en las manos del manipulador de alimentos.

1
MATERIAL:

 Jabón sanitizante líquido

 Cepillo para manos de cerda suave
 Toallitas desechables o sistema de secado por aire

PROCEDIMIENTO:

Se humedecen las manos, se aplica jabón sanitizante y se frota hasta formar espuma, se talla cada
mano con el cepillo suave, a que se sienta bajo las uñas, interdígitos, toda la palma, dorso
de lamano, antebrazo hasta el codo y no deberá ser por un tiempo menor a 20 segundos por
brazo.

EJERCICIO:

1. Describe el nombre completo de la Norma Oficial Mexicana actualizada donde se

describe la forma correcta del lavado de manos.
2. Especifica en qué punto de la NOM habla del lavado correcto de manos.
3. Transcribe exactamente el texto de la NOM que se refiere al lavadocorrecto de
manos.
4. Enumera los elementos indispensables que componen el “centro delavado de manos”
en un servicio de alimentación.
5. Desde tu punto de vista, describe la importancia del lavado correcto demanos.

NOTA: Realizar el reporte de acuerdo con el formato especificado. Antecualquier cambio éste
no será revisado.

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 FACTORES QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

ELABORADO POR:
Dr. Marcelo Hernández Salazar
Dra. Patricia A. Quevedo Garza
MCN. Martha Castorena Alba

OBJETIVO:
Comprobar la capacidad microbiana de crecer bajo diversas condicionesambientales.

RECOMENDACIONES:

Antes de proceder con la práctica, leer la siguiente norma:

 NOM-251-SSA1-2009. BUENAS PRÁCTICAS DE HIGIENE Y SANIDAD EN LA

PREPARACIÓN DE ALIMENTOS QUE SE OFRECEN EN ESTABLECIMIENTOS FIJOS.

FUNDAMENTO:

Los microorganismos, al igual que todo ser vivo, tiene la necesidad de diversos
elementos para su crecimiento y reproducción, tales como un ambiente con pH adecuado,
humedad del medio, elementos nutritivos, temperatura adecuada y algunos requieren de una
atmósfera de gases especial. De tal manera, los microorganismos se pueden clasificar, en
forma muy general, de acuerdo con su requerimiento nutricional en autótrofos y heterótrofos;
de acuerdo con su temperatura de crecimiento en psicrófilos, mesófilos y termófilos; de
acuerdo con su capacidad de respiración en aerobios, anaerobios y anaerobios facultativo.

MATERIAL:

 5 tubos de ensaye con Caldo NutritivoCepa pura de Escherichia coli

 Ácido acético al 3% Hidróxido de sodio 1N.
+
 Equipo básico usado en microbiología

+
Asa de platino y mechero

3
PROCEDIMIENTO:

Inocular 3 tubos de ensaye con Caldo Nutritivo, con una asada de la cepa pura de E. coli.
Un tubo se incubará en la estufa a 80°C por 24 horas, otro tubo se guardará en el refrigerador
a 4°C por 24 horas y el último tubo en la incubadora a 37°C por 24 horas. Se comprueba
después de incubados los tubos cómo se comporta el crecimiento. El tubo incubado a 37°C en
este caso puede considerarse como testigo de crecimiento bacteriano.

Además, a un tubo de ensaye que contiene Caldo Nutritivo se le agrega 1 ml. de Ácido acético,
y a otro tubo con Caldo se le agrega 1 ml. de NaOH 1N. A los dos tubos se les inocula una
cepa pura de E. coli y se incuban los dos a 37°C por 24 horas. Se observa después de incubados
cómo se comporta el crecimiento. Los reactivos se agregan con pipeta que contenga un bulbo.
Por ningún motivo se debe pipetear con la boca.

EJERCICIO:

1. Ejemplifique en los espacios en blanco de la siguiente tabla, ALIMENTOS que representen

las características de los factores de crecimiento microbiano.

pH Acido: Alcalino:
Aw Alto: Bajo:
Nutrientes Proteínas: Carbohidratos:
Componentes antimicrobianos
(cuales):
Estructuras biológicas (cuales):

2. Describa detalladamente en la siguiente tabla, la CLASIFICACIÓN de los microorganismos

en base a los criterios de temperatura nutrición y respiración.

Clasificación en cuanto a: Características:

1
TEMPERATURA
2
3
4
NUTRICIÓN
5

4
 6
RESPIRACIÓN 7
8
9

3. De las clasificaciones ya enumeradas anteriormente, da un ejemplo en la tabla de los

MICROORGANISMOS que corresponda a cada uno de los números.

NOTA: Realizar el reporte de acuerdo con el formato especificado. Antecualquier cambio

éste no será revisado.

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 CUENTA BACTERIANA DE MESÓFILOS AEROBIOS
ELABORADO POR:
Dr. Marcelo Hernández Salazar
Dra. Patricia A. Quevedo Garza
MCN. Martha Castorena Alba

OBJETIVO:
Determinar la calidad microbiológica del alimento mediante el conteo de bacterias
mesófilas aerobias.

RECOMENDACIONES:
Antes de proceder con la práctica, leer las siguientes normas:
 NOM-110-SSA1-1994. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS
PARA SU ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.
 NOM-092-SSA1-1994. MÉTODOS PARA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN
PLACA.

FUNDAMENTO:

La técnica más utilizada para determinar el contenido de microorganismos vivos en un

alimento es la cuenta en placa. Esta técnica se aplica para una gran variedad de microorganismos
y su fundamento consisteen contar las colonias que se desarrollan en el medio de elección
después de cierto tiempo y temperatura de incubación, suponiendo que cada colonia proviene
de un solo microorganismo de la muestra en estudio.

La determinación de bacterias mesófilas aerobias ha sido empleada como índice

microbiano de calidad de los alimentos, sin embargo, esto no es válido para alimentos como
quesos y algunos embutidos, en donde por procesos de fermentación y maduración, dan lugar a
un gran número de bacterias.

El recuento de gérmenes mesófilos aerobios tiene un valor limitado a la hora de juzgar la

seguridad de los alimentos y si en la ejecución de la técnicase siguen fielmente las condiciones
que se señalan para el desarrollo de dichos microorganismos, puede llegar a ser lo bastante
reproducibles para dar elsignificado a los resultados que se obtengan.

Los alimentos en donde se pueden encontrar con más frecuencia son: agua, leche y
derivados, embutidos, cereales y mariscos.

6
MATERIAL:

 1 frasco de dilución con 90 ml. de Buffer de Fosfatos, pH 7.2

 3 placas de Petri*
 2 tubos de ensaye con 9 ml. de Buffer de Fosfatos, pH 7.2
 1 pipeta de 10 ml.*
 3 pipetas de 1 ml.*
 Agar para Cuenta Estándar (15 ml. por placa)
 Equipo básico usado en microbiología

*
Material limpio y estéril.
Asa de platino, mechero, gradilla para tubo de ensayo.

PROCEDIMIENTO:

 Preparar las diluciones como se indica en el ESQUEMA DE TRABAJO.

 Transferir, como ilustra el esquema, 1 ml. de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3. Dichas diluciones
se aconsejan en los casos en que no se conozca previamente el número de microorganismos
presentes en el alimento, pero pueden modificarse siempre que lo aconseja la cifra de
microorganismos esperada.
 Verter en cada placa inoculada, 15 ml. de medio de cultivo fundido y templado a 45°C +/- 1°C.
Mezclar el medio y el inóculo imprimiendo a la placa movimientos de vaivén en diferentes
direcciones, o formando el número 8 con movimientos lentos.
 Para un control de esterilidad, verter el mismo volumen de medio de cultivo en una placa de
Petri estéril sin inóculo.
 Una vez solidificado el medio de cultivo, invertir las placas e incubarlas a 35°C +/- 1°C durante
24 horas.
 Se escogerá para el conteo aquella placa que tenga entre 30 y 300 colonias. Contar todas las
colonias, incluyendo las puntiformes. De no ser posible el conteo directo, se deberá utilizar el
aparato cuenta colonias.
 Para obtener el número real de microorganismos presentes en la muestra, el numero
obtenido del conteo en placa se multiplicará por la dilución que corresponda a la placa
contada y se reportará como U.F.C./ml. (unidades formadoras de colonia por mililitro).

7
  El resultado deberá presentarse como lo marca la NOM. De no ser así, el reporte no tendrá
calificación.
 El resultado se reportará en función de “APTO” o “NO APTO” para elconsumo humano. Esto
se hará comparando el resultado obtenido por el equipo con el valor máximo permitido por
la NOM correspondiente.

EJERCICIO:

1. Describe en qué tipo de alimentos es aplicable la técnica de “Cuenta en Placa por Siembra en
Difusión”.
2. Menciona en qué tipo de alimentos no es aplicable el conteo de mesófilos aerobios y por qué.
3. ¿Qué características y condiciones de crecimiento presentan las bacterias Mesófilas
aerobias?
4. ¿Qué significado tiene en cuantificar este tipo de microorganismos y querepresentan en
el alimento?
5. ¿Por qué para el recuento en placa se utilizan aquellas que presentan entre30 y 300 colonias?

NOTA: Realizar el reporte de acuerdo con el formato especificado. Antecualquier cambio

éste no será revisado.

8
 CUENTA DE ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES Y FECALES
ELABORADO POR:
Dr. Marcelo Hernández Salazar
Dra. Patricia A. Quevedo Garza
MCN. Martha Castorena Alba
OBJETIVO:

Determinar la calidad microbiológica de un alimento, mediante la técnica de cuenta de

organismos coliformes.

RECOMENDACIONES:

Antes de iniciar la práctica se recomienda la lectura de:

 NOM-110-SSA1-1994. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS
PARA SU ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.

 NOM-113-SSA1-1994. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MICROORGANISMOS

COLIFORMES TOTALES EN PLACA.

FUNDAMENTO:

En este grupo de microorganismos se incluyen bacilos Gram negativos, no esporulados,

fermentadores de lactosa, productores de gas dentro de 48 horas cuando se incuban de 32°C a
35°C. Estas bacterias se encuentran en forma abundante y constante en la materia fecal del
hombre y animales superiores; así mismo, ciertas bacterias de este grupo son propias del suelo
y también se pueden encontrar en varios alimentos como son: carne, vegetales, leche
pasteurizada, etc.

La interpretación de la presencia y abundancia de los organismos coliformes no tiene un

carácter universal. En tanto que el agua, en términos generales, se considera que su presencia
revela una exposición reciente de contaminación fecal. Su significado no es el mismo en el caso
de la leche, sustrato en el cual son capaces de desarrollarse muy activamente.

En algunos tipos de quesos, número elevado de estos microorganismos no guardan

necesariamente relación con los antecedentes de manejo higiénico del producto y su presencia
carece de significado sanitario.

9
 La demostración y recuento de organismos coliformes puede realizarse mediante el
empleo de medios de cultivo sólidos, que los favorecenselectivamente y la diferencia de
los microorganismos con los que suele encontrarse asociados en alimentos, o bien recurriendo a
tubos de fermentación conteniendo Caldo Lactosado o Caldo Lauril-Sulfato de Sodio Triptosa y
computando su número con base en las tablas de numero más probable (N.M.P.).

Con el propósito de correlacionar más estrechamente un grado de riesgoa la salud, con

el hallazgo de algún grupo de microorganismos en el laboratorio, se ha logrado disponer de una
técnica que permite, con razonable seguridad, diferenciar los organismos coliformes fecales de
los restantes que incluye el grupo genérico. Al practicar la prueba es indispensable un estricto
control de temperatura con el fin de evitar falsos positivos o negativos.

MATERIAL:
 3 placas de Petri*
 3 pipetas de 1 ml*
 1 pipeta de 10 ml.*
 1 frasco de dilución con 90 ml. de Buffer de Fosfatos, pH 7.2
 2 tubos de ensaye con 9 ml. de Buffer de Fosfatos
 Agar Rojo Violeta Bilis
 Equipo básico usado en microbiología

PROCEDIMIENTO:

 Preparar la muestra y sus diluciones como se indica en el ESQUEMA DE TRABAJO.

 Transferir 1 ml. de la muestra y sus diluciones a placas de Petri y agregar15 ml. de medio
de cultivo Agar Rojo Violeta Bilis fundido y templado a45°C.
 Mezclar perfectamente el inóculo y el medio de cultivo, dejar solidificar. Sobre la superficie
del medio firme, depositar 4 ml. del mismo medio de cultivo, extendiéndolo para cubrir
completamente la superficie.
 Dejar solidificar e incubar las placas en posición invertida durante 24 horasa 35 °C. Contar
las colonias de coliformes desarrolladas.
 Las colonias de color rojo oscuro, con diámetro de 0.5 mm. O mayor, con halo de
precipitación, se consideran típicas de organismos coliformes en productos lácteos. En otros
productos puede no mostrar el halo.
 Estimar el número de organismos coliformes por ml. o por gramo de muestra y reportar
como “Cuenta de organismos coliformes en placa deAgar Rojo Violeta Bilis, incubadas a
35°C por 24 horas”.

10
  El resultado deberá presentarse como lo marca la NOM. De no ser así, el reporte no tendrá
calificación.
 El resultado se reportará en función de “APTO” o “NO APTO” para elconsumo humano. Esto
se hará comparando el resultado obtenido por el equipo con el valor máximo permitido por
la NOM correspondiente.

EJERCICIO:

1. Enlista las bacterias que pertenecen al grupo coliforme.

2. Describe las características morfológicas que caracterizan al grupo

coliforme.

3. Qué bacteria tomamos en nuestro país como índice de contaminación fecal, y que
bacterias se utilizan como índice en otros países.

4. Determina las prácticas inadecuadas en el manejo de alimentos que propician la

contaminación fecal-oral.

5. Describe que es el fecalismo al aire libre y menciona si es factibleobservarlo dentro del

hogar.

6. Investiga como se lleva a cabo la construcción y el mantenimiento de unafosa séptica.

7. Investiga que es un plásmido y cuál es su papel en la producción dediarreas por E. coli.

NOTA: Realizar el reporte de acuerdo con el formato especificado. Antecualquier cambio

éste no será revisado.

Asa de platino, mechero, gradilla para tubo de ensaye, espátula o cuchillo estéril.
Basado en técnicas de AOAC Internacional.

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 USO Y APLICACIÓN DE SANITIZANTES ENMANIPULADORES DE ALIMENTOS
ELABORADO POR:
Dr. Marcelo Hernández Salazar
Dra. Patricia A. Quevedo Garza
MCN. Martha Castorena Alba
OBJETIVO:

Demostrar la efectividad en la aplicación correcta de sanitizantes en gel de uso en seco

y jabones de manos con antibacterial.

FUNDAMENTO:
La vía de contaminación más cercana al alimento es cuando intervienen directamente
las manos y por consiguiente es de vital importancia el que se encuentren debidamente
higienizadas.
En la actualidad existen en el mercado gran variedad de productos engel que se
aplican en pequeñas cantidades y después de frotar las manos supuestamente se consigue la
higienización. Por otro lado, están los jabones líquidos o en barra con acción antibacterial.
En esta práctica se pretende determinar la efectividad de dichos productos y realizar
una comparación de la efectividad de estos.

MATERIAL:

 2 placas de Petri con agar Método estándar o agar Rojo Violeta Bilis
 2 hisopos*
 1 tubo de solución salina
 1 mechero

PROCEDIMIENTO:

Se toma con un hisopo humedecido en solución salina una muestra de lapalma de la

mano y se inocula con una sola estría toda la placa de EMB etiquetada previamente como
CONTROL. Posteriormente se utiliza el producto sanitizante a estudiar de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Con otro hisopo se toma la muestra de la misma palma de la mano
de la cual se tomó la muestra anterior y se frota en la otra placa de Petri con agar EMB,
previamente etiquetada como PROBLEMA.
Ambas placas se incuban a 37°C por 24 horas y se realiza la apreciación del % de
inhibición del crecimiento bacteriano que se obtiene con el producto utilizado.

12
 Todos los equipos reportarán una tabla con los resultados obtenidos portodo el grupo
como sigue:

CLAVE de SANITIZANTE % de % de
Laboratorio Nombre comercial Principio activo crecimiento inibición

NOTA: Se tendrá que subrayar (amarillo) el resultado de tu equipo ycompararlo con el resto
de los equipos.

EJERCICIO:

1. Investiga cual es principio activo del sanitizante con que te tocó trabajar

2. Menciona el nombre comercial de otros cinco agentes sanitizantesutilizados en la

higiene de manipuladores de alimentos.

3. De estos cinco agentes sanitizantes, determina el principio activo.

4. Determina el mecanismo de acción sobre las bacterias de estassustancias usadas

como principio activo.

NOTA: Realizar el reporte de acuerdo con el formato especificado. Ante cualquier

modificación al formato de reporte, éste no será revisado.

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 USO Y APLICACIÓN DE SANITIZANTES EN SUPERFICIES DE TRABAJO
ELABORADO POR:
Dr. Marcelo Hernández Salazar
Dra. Patricia A. Quevedo Garza
MCN. Martha Castorena Alba

OBJETIVO:

Demostrar la efectividad en la aplicación correcta de sanitizantes de uso doméstico sobre

superficies donde se procesan alimentos o utensilios de trabajo.

FUNDAMENTO:

Es sabido que la contaminación de los alimentos puede deberse a su propioorigen (como

raíces o tubérculos), al riego de frutas y vegetales con aguas contaminadas o al medio
ambiente (ríos o mares contaminados o forrajes y aguas de subsuelo contaminadas). Sin
embargo, muchas veces pasamos por alto la contaminación con origen al lugar, superficies y
utensilios con queprocesamos dichos alimentos.
Es importante tomar en cuenta que la contaminación se puede deber a que no tomamos la
precaución de higienizar los utensilios y superficies de trabajoal finalizar una jornada o a que
durante un proceso empleamos utensilios indistintamente para alimentos crudos como para
cocidos. Por ejemplo, utilizamos el mismo cuchillo para cortar una lechuga que apenas se va a
sanitizar y luego usamos el mismo cuchillo para picarla ya sanitizada.

MATERIAL:

 2 paquetes de hisopos
 Tubo con solución salina*
 2 placas de Petri con agar Müeller Hinton
 2 placas de Petri con agar Eosina azúl de metileno (EMB)
 1 vaso de precipitados para preparar solución de Cloralex
 Utensilios o superficie de trabajo a investigar

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PROCEDIMIENTO:

Impregnar en solución salina estéril un hisopo, tallar con éste la superficie a analizar,
como la parte interna de los dientes de un tenedor, laparte interior de las aspas de licuadora,
etc. y con esto frotar toda la placa con agar Müeller Hinton y una de EMB. Estas placas servirán
de control o 100% de crecimiento.
Se preparará una solución de cloro según el volumen que se requiera, a razón de 250 ml. de cloro
por litro de agua. Se sumerge el utensilio y se talla con otro hisopo estéril el sitio a analizar. Se
enjuaga con agua, se toma otra muestra con otro hisopo y se frota otro juego de placas de
Müeller Hinton y EMB. En este juego de placas se aprecia el % de inhibición con respecto a las
placas control.

EJERCICIO:

1. Investiga el nombre científico y la concentración a la cual se aplica elcloro de uso

doméstico.

2. Menciona otros tres agentes sanitizantes utilizados en la higiene desuperficies inertes.

3. De estos tres agentes sanitizantes, determina el principio activo.

4. Determina el mecanismo de acción sobre las bacterias de estassustancias usadas

como principio activo.

NOTA: Realizar el reporte de acuerdo con el formato especificado. Antecualquier cambio

éste no será revisado.

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 USO Y APLICACIÓN DE SANITIZANTES EN ALIMENTOS
ELABORADO POR:
Dr. Marcelo Hernández Salazar
Dra. Patricia A. Quevedo Garza
MCN. Martha Castorena Alba

OBJETIVO:

Demostrar la efectividad en la aplicación correcta de sanitizantes de uso en alimentos.

FUNDAMENTO:

Las enfermedades de origen alimentario (ETA’s) son muy comunes en nuestro medio y a
la vez fáciles de controlar. La desinformación del consumidor hace que la práctica de la
sanitización de los alimentos le parezca engorrosa y a veces por premura del tiempo, poco
práctica. En otras ocasiones la ignorancia redunda la falta de conocimiento de los sanitizantes
comerciales yutilizan prácticas poco ortodoxas como el sólo enjuague con agua de los alimentos
o ponerlos en limón.
En esta práctica se pretende utilizar por cada equipo algún sanitizante comercial para
verificar su efectividad y realizar una comparación global entre varios productos diferentes.

MATERIAL:

 2 frascos de dilución con 90 ml. de buffer de fosfatos pH 7.2

 1 vaso de Precipitados de 1 Lt.
 2 pipetas de 1 ml.
 4 placas de Petri*
 Agar Cuenta Estándar fundido
 Agar Rojo Violeta Bilis fundido
 Espátula*

PROCEDIMIENTO:

Se pesan 10 gr. de lechuga finamente picada, sin lavar, se ponen en un frasco de dilución
con 90 ml. de buffer de fosfatos, se agita vigorosamente durante 1 minuto. Se pasa 1 ml. con
pipeta estéril a cada una de 2 placas de petri limpias y estériles, a una se le vierte agar fundido de

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 Cuenta Estándar y a otro agar Rojo Violeta Bilis, se agitan, se dejan solidificar y se incuban a 37°C
durante 24 hr.
Se pesan 10 gr. de lechuga finamente picada, sin lavar, se ponen en un vaso de precipitados, se
agrega 1 lt. de agua y se agrega el sanitizante designado siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se deja reposar el tiempo indicado, se pasa la lechuga a un frasco de dilución con 90 ml. de
buffer de fosfatos, se agita vigorosamente por 1 minuto y se pasa 1 ml.

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