UNIVERSIDAD DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

Departamento de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Biología Celular

Nombre y apellido:

Programa:

Grupo: Código:

Laboratorio No.3

MEDICIONES CON EL MICROSCOPIO, MANEJO Y PRESENTACIÓN

DE IMAGENES

INTRODUCCIÓN

Los procedimientos para medición directa para determinar el tamaño de un organismo

es posible realizarlo utilizando equipos de medición exacta como es el micrómetro o las
escalas incorporadas en los microscopios, pero también es posible estimar este tamaño
utilizando métodos indirectos que nos ofrecerán resultados aproximados.

Para realizar mediciones directas se utiliza el OCULAR MICROMETRICO o REJILLA

OCULAR, que sirve de escala de referencia, en la cual se ha calibrado el valor de una
división con la ayuda de una escala ubicada en el sitio de observación del campo óptico,
donde se muestra segmentos con unidades determinadas; debiéndose realizar el
calibrado por cada aumento. Un método más sencillo, pero aproximado es el de estimar
el tamaño del microorganismo objeto observado, cuando conocemos el DIÁMETRO
DEL CAMPO OPTICO ().

La unidad básica de medición del microscopio es el MICRÓMETRO = m, que

equivale a 1/1000 mm, anteriormente conocida como micra = m. Podemos citar
algunos ejemplos que nos ayuden apreciar esta medida: el diámetro real de las bacterias
oscila entre 0.5 y 1.0 m, y generalmente hay que observarlas a 100X. Entre otros
ejemplos de tamaño de organismos podemos citar que una bacteria esférica tiene el
diámetro de 1.0 m, un eritrocito de 7.5 m y un micoplasma de 0.1 m, y en este caso
si el poder de resolución del microscopio óptico oscila entre 0.2 y 0.4 m, entonces
necesitaremos un microscopio electrónico para poder observar el micoplasma.

OBJETIVOS.

- Utilizar el método de medición indirecta con base en el diámetro del campo óptico.
- Desarrollar el concepto de medida y estimación del tamaño de los microorganismos.
- Aprender el manejo básico de algunos programas para la presentación de imágenes.

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MATERIALES
Granos de polen, epitelio de cebolla cabezona, célula epitelial (humana), corte de papa, papel
mantequilla milimetrado, azul de metileno, Lugol (concentrado y diluido), hisopos, microscopio
e implementos habituales.

PROCEDIMIENTO

Medición Indirecta

Determinación del diámetro del campo óptico () a menor aumento.

Tome una muestra del papel milimetrado y enfoque en menor aumento un cuadrado
dejando el margen hacia uno de los lados del campo visual como indica la figura.

Distancias Aproximadas

Alinear hacia el
diámetro del campo Diámetro Alineado
Para poder realizar la medición aproximada de un objeto u organismo es necesario
primero estimar el diámetro del campo óptico que se podrá realizar ubicando el
cuadrado en el plano diametral y midiendo el diámetro con los objetivos 4X, 10X,
realice el cálculo para conocer el  en m en los objetivos de 40X y 100X, complete la
siguiente tabla en los espacios donde aplique.

Aumento ( )x Diámetro aproximado Diámetro calculado

4X -
10X
40X
100X

Entonces podemos observar que a medida que la imagen se aumenta tantas veces, el
campo óptico se reduce proporcionalmente con el aumento empleado, teóricamente se
podría calcular de la siguiente manera:

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( del campo óptico a 10x) X 10x = ( del campo óptico a 40x) X 40x

( del campo óptico a 40x) = ( del campo óptico a 10x) X 10x

40x
Después de haber determinado el  del campo óptico, realice micropreparados indicados
por el auxiliar del laboratorio, obsérvelos y determine el tamaño de la célula en tres
objetivos diferentes.

Realice los dibujos de sus observaciones, a menor y mayor aumento, o en caso de

ser necesario cambie el gráfico a mayor aumento por el del objetivo de inmersión
(tome fotografías). Ordene las gráficas y fotografías en una plancha y complete la
tabla con sus resultados.

A B

Figura A. Micrómetro ocular; Figura B. Micrómetro ocular ensamblado en

microscopio de luz; Figura C. Regla de la Lámina Calibradora.

En la parte externa presenta un tornillo similar al micrométrico de un microscopio

óptico, que permite mover una pequeña guía o aguja en el interior del ocular (esta solo
es visible al observar a través del ocular).

Ahora teniendo los factores proceda a determinar el tamaño del objeto en el aumento(s)
que pueda ser totalmente visible.

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 Muestra Aumento Tamaño Tamaño
(aproximado) Programa

TOMADO DE: TURNER, LILIANA; COLLAZOS, LIBRADA; RIVERA, FREDY Y

RODRÍGUEZ, MARCO. Protocolos de Laboratorio Biología Celular. Universidad del
Tolima, Departamento de Biología, 2007. 142h. ISBN 978-958-44-1645-2.

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5
Programas de procesamiento de imágenes

En microscopía óptica, al igual que con fotografía, obtenemos la imagen de un objeto al

enfocar la luz (reflejada, transmitida, emitida) procedente del mismo en un detector.
Tradicionalmente estas imágenes se capturaban mediante películas fotográficas, pero,
con el desarrollo tecnológico de los ordenadores y de la fotografía digital, hoy en día
son capturadas en forma de archivos informáticos fácilmente editables con cualquier
programa de edición de imágenes fotográficas como Adobe Photoshop, el propio Paint
de Windows o ImageJ (Tapia, 2013; Campa, 2017).

Zerene Stacker (Software para apilado)

La técnica de apilado -focus stacking- o apilamiento de imágenes es una metodología

para obtener una fotografía totalmente enfocada. Cuando se trabaja a distancias muy
cortas entre el objetivo y el motivo a fin de obtener mejores ampliaciones, como por
ejemplo al fotografiar insectos o elementos diminutos, la principal barrera con la que
nos encontramos es la mínima profundidad de campo que obtenemos. En muchos casos
del orden de mm. En estos casos la solución en obtener n-fotos, cada una con un plano
de enfoque sucesivo, de forma que después y gracias a la utilización de software de
apilado de suman todas las fotos en una para conseguir el motivo totalmente a foco.
Uno de los mejores programas para esta técnica es Zerene Stacker. Al tener varias
fotografías distintas que entre sí tienen una mínima diferencia de enfoque, se puede
seleccionar la mejor parte de cada una – la parte enfocada – y crear una imagen suma de
todas ellas y una profundidad de campo mayor. Zerene Stacker en el programa de
apilado más utilizado por los fotógrafos referencia en esta modalidad de la
macrofotografia extrema. Incorpora un sistema de alineamiento de imágenes ya que es
normal que todas las fotografías tengan un pequeño movimiento entre cada una. Zerene
Stacker se ocupa de estas diferencias para apilar correctamente su información. Maneja
de manera excelente los halos que se producen en los pelos y cerdas: estas áreas son
problemáticas ya que su información “fiel”, el pelo o la cerda en sí, es muy poco ancha,
pero a la hora de desenfocarse producen halos muy grandes. Posteriormente incorpora
funcionalidades para editar y mejorar partes de la imagen final Tomado de:
macrofotografia.info/index.php/setup/item/software-para-apilado-zerene-3

Entrar al link: http://zerenesystems.com/cms/stacker

Descargar programa (teniendo en cuenta el equipo)

Ver video:
http://fotoigual.com/focus-stacking-zerene-stacker/

El cual enseña el manejo del programa.

ImageJ

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ImageJ es un programa independiente de plataforma. El programa puede descargarlo
gratuitamente, seleccione el sistema operativo, así como la versión que corresponda a su
equipo (32 o 64 bit). Una vez instalado, el acceso directo aparecerá en el escritorio. Al
dar doble clic sobre el ícono, la primera vez aparecerá un mensaje de autoconfiguración,
elija la opción “Aceptar”, e inmediatamente se mostrará la interfase principal del
programa.

ImageJ - Programa Fiji

Entrar al link: https://imagej.net/Fiji/Downloads
Descargar programa (teniendo en cuenta el equipo)

Tome la escala de referencia, las escales comerciales son excelentes para realizar
excelentes mediciones, se presentan en termino de micras (µM), o también se puede
tomar una cámara de Neubauer, o para nuestro ejercicio papel milimetrado. Tomé
una fotografía en cada aumento (menor y mayor aumento de la cámara que estemos
usando).

Posteriormente se realiza el montaje del objeto u organismo a medir y se toma una

fotografía en el aumento que se enfoque mejor. Se realizan los siguientes pasos:

1. Descargar las fotografías en el computador y abrir el programa Fiji.

2. Inicialmente se debe establecer la escala en la que se va a realizar la medición, por lo

tanto se selecciona en qué aumento se observa mejor el objeto u organismo a medir y se
abre en Fiji la imagen de la escala de referencia correspondiente al mismo aumento
con el siguiente comando: File - Open y se selecciona el archivo.
3. Una vez abierta la imagen de la escala de referencia con la herramienta de “Straight”
que permite realizar líneas rectas, seleccionamos un segmento de línea en la imagen.

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Figura. Selección de un segmento de longitud con el programa Fiji

4. A continuación vamos a “Analyze” – “Set Scale”. En el recuadro que aparece, dentro

de la opción “Known distance” se coloca la medida del segmento de la escala de
referencia que se conoce, y en “Unit of leght” se apunta la unidad de medida que se
está usando, y se selecciona la opción “Global” para que este parámetro se aplique a
todas las imágenes en adelante al pulsar “Ok”. Cierre la imagen de la cámara de escala
de referencia.

5. Abre la imagen donde se encuentra el objeto u organismo a medir y se realiza la

medición de la misma manera pero en lugar de elegir la opción “Set scale” se elige la
opción “Measure” que inmediatamente despliega un cuadro de resultados donde se
puede ver la medida del objeto u organismo (dar Analyze - Measure después de cada
medición).

6. Ubicación de barra de escala

Para realizar este paso se requiere que ImageJ esté previamente calibrado y que la
imagen sea de tipo RGB color [ver secciones “Manejo de Imágenes” y “Empalmado de
canales (merge)”]. Luego, presione “Analyze” / “Tools” / “Scale bar…”. En “Width in
µm:” colocar el valor en micras que se quiere mostrar; en “Height in pixels” colocar la
altura de la barra; si se selecciona “Hide Text” la leyenda debajo de la escala
desaparecerá. Una vez que se hayan seleccionado las opciones deseadas, dar click en
“OK”. Guardar la imagen resultante en formato TIFF (Menú “File” / “Save As” /
“Tiff..”. Para guardar la imagen con la escala “File – Save As – Jpeg, Gif…”

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 Ahora establezca el tamaño del objeto u organismo:
Finalmente, establezca una comparación entre los dos métodos de medición (comente
ventajas, desventajas y márgenes de error en cada metodología)

Programa GIMP o
GIMP es un programa de distribución gratuita que permite realizar tareas como retoque
fotográfico, creación de imágenes y composición.

Entrar al link: http://www.gimp.org.es/descargar-gimp.html

Descargar programa

Revisar los siguientes link para su manejo:

https://www.genbeta.com/a-fondo/tutorial-basico-de-gimp-como-iniciarte-en-el-uso-de-
este-editor

https://docs.gimp.org/2.4/pdf/es.pdf
También puede realizar las planchas con:

CorelDRA
W Paint
PhotoScape

Ejercicio

Realizar una plancha con cada una de las cuatro muestras a las cuales le realizó la
fotografía (involucrar gráficos y fotografías), se hace referencia como Figura.

Mencionar el programa con el cual realizó las planchas (escribir detalladamente el

instructivo para conseguir las planchas).