Tema 1

TEMA 1: REALIZACIÓN DEL
PROCESAMIENTO DE LA
MUESTRA
Profesor: Manuel Munuera

Asignatura: Procesamiento citológico y tisular
ÍNDICE
1. Materiales, reactivos y equipos en histotecnología y citotecnología.

2. Uso eficiente de recursos.
3. Seguridad y prevención de riesgos en el laboratorio. Gestión de residuos.
4. Características macroscópicas de la muestra.
5. Proceso de fijación tisular.
6. Decalcificación y reblandecimiento tisular.
7. Artefactos.
8. Registro y conservación de muestras.
1. Materiales, reactivos y equipos en
histotecnología y citotecnología
Casete de plástico
Bisturís, pinzas, tijeras

y sondas
acanaladas
Porta y cubreobjetos
Mechero de alcohol
- Formol, Xilol, Alcohol, agua destilada y parafina.
- Colorantes: hematoxilina, eosina, giemsa, Orange

G, …
- Pegamento especial para cubre y portaobjetos.
- Reactivos en polvo (nitrato de plata, ácido

fosfomolíbdico…) y reactivos líquidos (ácido
clorhídrico, ácido sulfúrico...)
Estación de tallado: con
aspiradores, grifos de
agua y todo el
instrumental para tallar
Procesadores:
sustituyen agua por
parafina
Parafinero Microtomo
Baño de flotación
Estufas
Centrífugas y citocentrífugas
Teñidores manuales y
automáticos
Montadores automáticos
2. Uso eficiente de recursos
3. Seguridad y prevención de riesgos
en el laboratorio. Gestión de residuos
LEY FUNDAMENTAL: Para poder llevar a cabo un trabajo seguro seguiremos los
preceptos recogidos en la Ley de Prevención de Riesgos Laborales (a partir
de ahora PRL) o Ley 31/95 de 3 de Diciembre de 2003.
CLASIFICACIÓN DE LOS RIESGOS: Fuentes:

LEY FUNDAMENTAL: Para poder llevar a cabo un trabajo seguro seguiremos los
preceptos recogidos en la Ley de Prevención de Riesgos Laborales (a partir
de ahora PRL) o Ley 31/95 de 3 de Diciembre de 2003.
CLASIFICACIÓN DE LOS RIESGOS: Fuentes:

- RIESGOS FÍSICOS:
- RIESGOS BIOLÓGICOS: Derivados de los agentes biológicos que se transporten

con y mediante las muestras que vayamos a procesar. La vía de entrada del
agente puede ser dérmica, aérea, digestiva o parenteral. Todas las muestras
deben considerarse como potencialmente infecciosas.
- RIESGOS QUÍMICOS: Derivados del contacto con

sustancias químicas. Tipos:
> Riesgo químico físico: explosivos,

inflamables, comburentes, gases a presión,
corrosivos…
> Riesgo químico para la salud humana:

tóxicos, corrosión o irritación de la piel,
lesiones oculares, mutagénicos,
carcinogénicos…
> Riesgo químico para el medio ambiente:

para el medio acuático principalmente.
- RIESGOS ERGONÓMICOS: Derivados de la carga de trabajo y la organización del
mismo
MEDIDAS DE PREVENCIÓN
- RECOMENDACIONES ANTE RIESGOS ELÉCTRICOS: no usar enchufes sin
toma de tierra, comprobar que los cables están en buen estado, seguir
las instrucciones de seguridad de los aparatos...
- RECOMENDACIONES ANTE RIESGOS BIOLÓGICOS: vacunación hepatitis

B, higiene personal (lavado de manos, protección de heridas…), uso
adecuado de EPIs, esterilización y desinfección de material y
superficies, uso de cabinas de seguridad cuando sea necesario.
- RECOMENDACIONES ANTE RIESGOS QUÍMICOS: ante dos posibles
sustancias con un mismo uso utilizar siempre la menos peligrosa,
atención a las etiquetas y fichas de seguridad de los productos
químicos, mantener siempre envases originales, uso de cabina de
extracción de gases si es necesario.
- RECOMENDACIONES ANTE RIESGOS ERGONÓMICOS: correcta
higiene postural, diseño ergonómico del puesto de trabajo, brazos a
90º y pies siempre apoyados.
TIPOS DE RESIDUOS Y SU ELIMINACIÓN.
- CLASES DE RESIDUOS: Existe una ley nacional (Ley 83/99) que regula las
directrices generales y que es desarrollada por cada CCAA. Se vio en Técnicas
de Laboratorio. Recordaremos las categorías principales:
I· Residuos generales (papel, cartón, comida, vidrio…)

II· Residuos biosanitarios asimilables a urbanos.
III· Residuos biosanitarios especiales (contienen infecciones altamente
virulentas, cortantes y punzantes, cualquier resto anatómico humano).
IV· Cadáveres y restos humanos de entidad suficiente.
V· Residuos químicos considerados peligrosos por la legislación vigente.
VI· Residuos citotóxicos.
VII· Residuos contaminados por sustancias radioactivas.
- ENVASADO DE RESIDUOS: Por lo general deben ser contenedores opacos, de un solo

uso, impermeables, resistentes a la humedad y de un volumen determinado. Según el
tipo de residuos tendrás otras características adicionales como ser rígidos para
punzantes, cumplir con las señalizaciones pertinentes, ser herméticos...
- TRASLADO INTERNO DE LOS RESIDUOS: Debe hacerse de forma

que se evite cualquier riesgo potencial para pacientes, visitantes
y personal.
- Envases cerrados.
- No trasvasar residuos.
- No usar métodos que pongan en riesgo la integridad
de los envases.
- Prohibido arrastrar envases.
- Trasladar los envases de diferentes clases de forma
separada.
- Si se usan carros o similares deben de usarse
exclusivamente para residuos y fáciles de limpiar.
- DEPÓSITO INTERMEDIO:
• En lugares designados
- DEPÓSITO FINAL:
• Cubiertos
• Señalizados • Sitios de fácil limpieza
• Con agua corriente y desagües
• Alejado de la ventilación
• Con dotación antiincendios
• Sin escalones ni pendientes
• De acceso restringido
• No mezclarse. Salvo los de tipo I y II

4. Características macroscópicas de la
muestra
 Muestras de pequeño tamaño:  En Órganos huecos:
 Tamaño  Tamaño, forma y serosa
 Color  Peso
 Consistencia  Pared (espesor, consistencia y hallazgos)
 Hallazgos  Mucosa (Color, pliegues, aspecto y hallazgos)
 En Órganos parenquimatosos:  Luz
 Tamaño, color, forma y superficie externa
 Peso
 Consistencia
 Hallazgos
 Superficie de corte
Quiste de ovario gigante

5. Proceso de fijación tisular
La fijación tisular consiste en interrumpir los procesos de degradación que

aparecen tras la muerte celular, procurando preservar lo más fielmente posible
tanto la arquitectura como la estructura de células y tejidos.
No existe un método universal de fijación, el fijador que es adecuado para un

tejido, puede no serlo para otro.
Fijación no es igual a conservación, no todos los fijadores conservan los tejidos

indefinidamente.
Hay que tener claras las ideas antes de empezar a fijar, y elegir correctamente
el fijador según el estudio que se vaya a realizar, ya que un error de fijación no
puede ser corregido de ninguna manera.
Autolisis
PROCESOS PREVIOS A LA FIJACIÓN DE LA MUESTRA:
 Registrar correctamente la muestra y todo lo que contenga el contenedor.

Con las precauciones necesarias para garantizar la correcta fijación.
Algunas piezas grandes o con cavidades requerirán la intervención del
patólogo. Evitar que las piezas floten en el fijador.
 Colocar la muestra en el líquido de fijación lo más

rápidamente posible, la cantidad de líquido
debe ser diez veces mayor al volumen que
ocupe el tejido a fijar, la presión osmótica y el pH
del líquido deben ser lo más aproximados
posibles a los de la muestra, controlar los tiempos
de fijación.
TIPOS DE FIJADORES Y NORMAS DE APLICACIÓN:
 FIJADORES DE MÉTODOS FÍSICOS: utilizan el frío para estabilizar las células.
Elegiremos estos métodos para estudios morfológicos o funcionales en los
que se necesite conservar intacta la estructura antigénica del tejido o su
contenido enzimático. La clave para una correcta fijación mediante
estos métodos es que sea instantánea, ya que la congelación lenta
provoca microcristales de hielo que pueden producir roturas tisulares que
dificultarán el diagnóstico.
 Nitrógeno líquido: debido a su excesivo frío (-196ºC) es difícil de manejar y vuelve los
tejidos muy quebradizos.
 Isopentano o metilbutano: necesita ser enfriado en congelador, su temperatura
óptima es de entre -50ºC y -70ºC.
TIPOS DE FIJADORES Y NORMAS DE APLICACIÓN:
 FIJADORES DE MÉTODOS QUÍMICOS: Existen multitud de agentes químicos que pueden ser
usados como fijadores, todos ellos ofrecen ventajas e inconvenientes que los harán más
indicados para ciertas muestras o estudios. El fijador ideal debe bloquear inmediatamente
la autolisis , respetar la arquitectura tisular e impedir la acción de las bacterias que
desencadena la putrefacción.
 También hay que tener en cuenta la velocidad de penetración y fijación que posea el fijador. La
velocidad de penetración es la rapidez con la que el fijador se difunde. Los fijadores más rápidos
son los alcoholes y la acetona.
 La velocidad de fijación es el tiempo que cada fijador tarda en precipitar y estabilizar los
componentes químicos de los tejidos.
 Estas dos velocidades no siempre están en concordancia.
EJEMPLOS DE FIJADORES SIMPLES: FORMALDEHIDO O FORMOL (CHOH)
 Es el fijador más importante y suele ser el que

mejores prestaciones presenta. Además es el
más barato así que es el que se usa de forma
rutinaria (ahora cada vez menos porque se
ha demostrado que es carcinógeno y
teratogénico).
 Funciona por reticularización de las proteínas.
En estado puro es un gas tóxico e irritante
para la mucosa que se disuelve muy bien en
agua.
FORMALDEHIDO O FORMOL (CHOH)
 Comercialmente se encuentra diluido al 35-40% en agua y estabilizado con metanol

(formol puro) o al 3,7-4% en agua y estabilizado con metanol (solución de trabajo).
 VENTAJAS: precio, desinfecta, no endurece excesivamente los tejidos, tiene escasa

retracción tisular, la velocidad de penetración es intermedia (1 mm/h) y esta se puede
acelerar o retrasar ajustando la temperatura.
 INCONVENIENTES: alta toxicidad, se va consumiendo durante el proceso por lo que hay

que poner siempre en exceso y que debido a su baja presión osmótica hacen que las
piezas aumenten considerablemente su peso y volumen.
 Actualmente empiezan a aparecer sustitutos igual de efectivos pero no carcinógenos.

OTROS TIPOS DE FIJADORES SIMPLES
OTROS TIPOS DE FIJADORES SIMPLES
FIJADORES COMPUESTOS
 Inmersión. En el método de inmersión las piezas de tejido se sumergen en
la solución fijadora. En algunos casos se necesitan fijar extensiones de
sangre o cortes por congelación sin fijación previa. En estos casos siempre
se fijan por inmersión en la sustancia fijadora. Hay que tener en cuenta
algunas precauciones:
1. Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5
cm de espesor para que el fijador alcance el
interior de la pieza antes de que ésta comience a
deteriorarse. La velocidad de penetración del
fijador depende de cada fijador y de las
características del tejido. Esta velocidad nos
condicionará el tamaño de la muestra. Para
fijadores lentos se recomiendan piezas de 0.2 cm
de tamaño. Esto también se ve afectado por el
tipo de tejido. Por ejemplo, si es poroso o con
grandes espacios la difusión del fijador será más
rápida.
2. El volumen recomendado de fijador es de 10 a 20
veces superior al volumen de la pieza.
3. La osmolaridad del tejido y de la solución fijadora

deben estar equilibradas.
4. El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico.
5. El tiempo de fijación, para un mismo tipo de muestra, depende de cada tipo de

fijador: velocidad de difusión y velocidad de fijación. Debe ser suficiente para
que la muestra quede bien fijada pero no excesivo para evitar deterioros o
alteraciones del tejido. Una agitación suave durante la fijación ayuda a la
penetración del fijador y disminuye el tiempo. En general no se recomiendan
fijaciones mayores de 24 horas, excepto en algunos casos como el formaldehído,
para el que se puede emplear una semana de fijación.
 Perfusión. Por este procedimiento

la solución fijadora se introduce a
través del sistema circulatorio por
el cual accede a todas las células
del tejido gracias a la red de
capilares.
Solo para histología en animales

6. Decalcificación y reblandecimiento
tisular
 Se llama decalcificación a la completa eliminación de las sales de calcio
presentes en los tejidos ya fijados. Se realizan de rutina en tejidos
mineralizados como los huesos o dientes y esporádicamente en biopsias
con calcificaciones que dificulten el correcto procesado y observación
microscópica.
 Se utilizan para esto ácidos fuertes o débiles solos o conjuntamente con
otros componentes.
tisular
NORMAS GENÉRICAS:
 La fijación debe haberse completado.

 La concentración del agente decalcificador debe ser
óptima.
 El volumen del decalcificador debe ser 20 veces el de la
muestra y debe ser renovado frecuentemente.
 No debe dejarse la muestra en el fondo del contenedor
ya que es donde se depositarán las sales de calcio.
 La temperatura ideal es de 25ºC.
 Después del proceso hay que neutralizar (generalmente
con agua corriente).
tisular
FORMAS DE ACELERAR:
 Siempre tener en cuenta no dañar los tejidos.

 Aumentar la temperatura hasta no más de 60ºC.
 Agitando manual o mecánicamente.
 Añadiendo alguna resina de intercambio iónico.
 Mediante ultrasonidos, pero esto desestructura las células.
7. Artefactos
Aplastamientos
Artefactos
naturales Fisuras
(Heces,…)
Artefactos
Material causados por la Fragmenta
quirúrgico
(grapas,…) técnica ciones
quirúrgica
Inflamación
Pseudoquistes
aguda
Hemorragias
7. Artefactos
Fijación
inadecuada
Mal Problemas
montaje en tallado
Artefactos
causados en el
procesamiento
de la muestra
en el laboratorio
Reactivos de
tinción en Problemas
malas en la
condiciones procesado
Mala
coloración
7. Artefactos
 Numerosos artefactos observados con el microscopio son consecuencia
de un proceso de necropsia, es decir, ha transcurrido un tiempo excesivo
entre el cese del flujo sanguíneo y la fijación del tejido. Por ejemplo, 3
minutos postmortem son suficientes para producir expansiones de las
vellosidades intestinales
7. Artefactos
 El tejido se observa de mala calidad, producto de una toma de muestra y
fijación inadecuadas. Se presenta cuando el tejido no es fijado
rápidamente o el volumen de fijador no es suficiente para el tamaño de la
muestra. Los fenómenos de autólisis ocasionados por la anoxia (falta de
oxígeno) ocasionan liberación de enzimas hidrolíticas por parte de los
lisosomas y los elementos celulares y tisulares se degradan
En esta imagen se aprecia un corte histológico de

la mucosa del intestino delgado, con defectos de En esta imagen, un preparado con
fijación y coloreado con Hematoxilina-Eosina. Se una fijación aceptable, muestra
pierde la morfología de las células y tejidos. mejores detalles de la morfología.
7. Artefactos
 Retracción: Ocasionada por los alcoholes o por sobre-calentamiento con
la parafina durante el proceso de inclusión. Los asteriscos en las imágenes
muestran el espacio producido por la retracción tisular y celular.
7. Artefactos
 En el círculo negro se aprecia un
precipitado que puede
corresponder a restos de
colorante, que en mayor cantidad
puede disminuir notablemente la
calidad de la imagen
microscópica
7. Artefactos
 CORTE:
 Muescas: Por irregularidades en el filo de la cuchilla.
 Arrugas y pliegues: Al realizar el montaje y no extender los cortes de manera correcta.
7. Artefactos
 Cuando los pliegues son muy
pronunciados dificultan la
observación de los elementos
histológicos.
7. Artefactos
 COLORACIÓN:
 Sobrecoloración: Sobre
exposición al extenderse en el
tiempo de coloración.
 Precipitados: Por no filtrar los
colorantes o por formación
de precipitados en cortes que
han sido elaborados hace
mucho tiempo (están
vencidos)
En esta microfotografía se puede apreciar exceso de

precipitados en el borde derecho del preparado
histológico coloreado con Hematoxilina-Eosina.
7. Artefactos
 En las técnicas de impregnación argéntica es frecuente observar

precipitados de las sales de plata (señalados con asteriscos). La letra P
demuestra un pliegue en el corte y en la parte superior derecha de la
imagen se aprecia una retracción.
7. Artefactos
 MONTAJE:
Burbujas de aire y gotas en
el medio de montaje.
El círculo blanco encierra dos

burbujas de aire que quedaron
atrapadas entre el tejido y el
cubre-objetos durante el proceso
de montaje final del preparado
histológico.
8. Registro y conservación de muestras
 Se realiza en cuanto la muestra entra en el laboratorio.

 Puede ser de forma manual o automática.
 Debe incluir los datos del paciente al que pertenece la biopsia, del servicio médico
que ha tomado la biopsia, a dónde hay que remitir los resultados y la fecha.
 También hay que incluir el origen anatómico de la muestra, la historia clínica del
paciente y la sospecha diagnóstica.
 Resumen de la historia clínica que puede ayudar al diagnóstico clínico.
 Posible diagnóstico por el que se remite a ser estudiado.
Cada laboratorio tiene su propio sistema de registro, normalmente por orden

correlativo.
8. Registro y conservación de muestras
¿ Qué hacemos con las muestras que no se van a estudiar?
 La parte de las biopsias que no van a formar parte del estudio (cuando la muestra no
se estudia en su totalidad) deben ser guardadas en un archivo temporal.
 En este caso las muestras deben ir en el mismo envase en el que fueron enviadas al
laboratorio.
 Este archivo debe estar bien ventilado, ser oscuro y tener acceso restringido.
 El tiempo que estas muestras permanezcan en el almacén vendrá dado por el tamaño
del mismo, pero no puede ser nunca inferior al tiempo necesario para alcanzar un
diagnóstico definitivo.

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TEMA 1: REALIZACIÓN DEL

Profesor: Manuel Munuera

1. Materiales, reactivos y equipos en histotecnología y citotecnología.

Bisturís, pinzas, tijeras

- Formol, Xilol, Alcohol, agua destilada y parafina.

- Colorantes: hematoxilina, eosina, giemsa, Orange

- Pegamento especial para cubre y portaobjetos.

- Reactivos en polvo (nitrato de plata, ácido

CLASIFICACIÓN DE LOS RIESGOS: Fuentes:

CLASIFICACIÓN DE LOS RIESGOS: Fuentes:

- RIESGOS BIOLÓGICOS: Derivados de los agentes biológicos que se transporten

- RIESGOS QUÍMICOS: Derivados del contacto con

> Riesgo químico físico: explosivos,

> Riesgo químico para la salud humana:

> Riesgo químico para el medio ambiente:

- RECOMENDACIONES ANTE RIESGOS BIOLÓGICOS: vacunación hepatitis

I· Residuos generales (papel, cartón, comida, vidrio…)

- ENVASADO DE RESIDUOS: Por lo general deben ser contenedores opacos, de un solo

- TRASLADO INTERNO DE LOS RESIDUOS: Debe hacerse de forma

• No mezclarse. Salvo los de tipo I y II

Quiste de ovario gigante

La fijación tisular consiste en interrumpir los procesos de degradación que

No existe un método universal de fijación, el fijador que es adecuado para un

Fijación no es igual a conservación, no todos los fijadores conservan los tejidos

 Registrar correctamente la muestra y todo lo que contenga el contenedor.

 Colocar la muestra en el líquido de fijación lo más

 Es el fijador más importante y suele ser el que

 Comercialmente se encuentra diluido al 35-40% en agua y estabilizado con metanol

 VENTAJAS: precio, desinfecta, no endurece excesivamente los tejidos, tiene escasa

 INCONVENIENTES: alta toxicidad, se va consumiendo durante el proceso por lo que hay

 Actualmente empiezan a aparecer sustitutos igual de efectivos pero no carcinógenos.

3. La osmolaridad del tejido y de la solución fijadora

4. El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico.

5. El tiempo de fijación, para un mismo tipo de muestra, depende de cada tipo de

 Perfusión. Por este procedimiento

Solo para histología en animales

 La fijación debe haberse completado.

 Siempre tener en cuenta no dañar los tejidos.

En esta imagen se aprecia un corte histológico de

En esta microfotografía se puede apreciar exceso de

 En las técnicas de impregnación argéntica es frecuente observar

El círculo blanco encierra dos

 Se realiza en cuanto la muestra entra en el laboratorio.

Cada laboratorio tiene su propio sistema de registro, normalmente por orden

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