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Producción de bioetanol a partir del residuo de la poda del olivo

Book · January 2010

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Juan Francisco García Martín Sebastián Sánchez

Universidad de Sevilla Universidad de Jaén
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Vicente Bravo Rodríguez

University of Granada
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Juan Francisco García Martín nació
en Linares el 1 de junio de 1979.
Licenciado en Química, realizó
sus estudios y su Tesis Doctoral en
la Universidad de Jaén. Versada en
el aprovechamiento del residuo de
poda del olivo, la Tesis Doctoral fue
dirigida por los Catedráticos de Uni-
versidad D. Sebastián Sánchez Vi-
llasclaras (Universidad de Jaén) y D.
Vicente Bravo Rodríguez (Universi-
dad de Granada). Especialista en la
valoración de los subproductos del
olivar, trabaja actualmente como Per-
sonal Docente e Investigador en la
Universidad de Granada.
Juan Francisco García Martín
1
Sebastián Sánchez Villasclaras
Vicente Bravo Rodríguez
Producción de bioetanol a partir
del residuo de la poda del olivo
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Producción de bioetanol a partir

del residuo de la poda del olivo
Juan Francisco García Martín
Sebastián Sánchez Villasclaras
Vicente Bravo Rodríguez
 A Ekaterina Tektonidi, Esteban Gallegos y
los Drs. Manuel Cuevas y Sergio Morales,
por su amistad y disponibilidad permanente.

A mis hermanos, Javier y Roberto, y, como no,

a mi madre, sin la cual no sería nada.

Mi más sincero agradecimiento.

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reproducción, distribución, comunicación pública o transformación
de esta obra sólo puede ser realizada con la autorización de los JUAN FRANCISCO GARCÍA MARTÍN
titulares de los derechos que se indican en los créditos. Diríjanse al
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Enero 2010
Edita: Fundación ECA Bureau Veritas
Fotocomposición: Curbet CG
ISBN: 978-84-92718-33-7
© del texto: Juan Francisco García Martín

Coordinación editorial:
Curbet Comunicació Gràfica, SL
www.ccgedicions.cat
Ap. de Correos 762 - 17080 Girona
Tel. 972 200 084

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Depósito legal:
 5

ÍNDICE

1. RESIDUO DE PODA DE OLIVAR ................................................. 7

1.1. Producción y vías de aprovechamiento ..................................... 7
1.2. Caracterización .............................................................. 10

2. PROCESOS DE HIDRÓLISIS: PRETRATAMIENTOS .............................. 13

3. AUTOHIDRÓLISIS DEL RESIDUO DE PODA DEL OLIVO ........................ 19

3.1. Desarrollo del proceso de autohidrólisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2. Severidad del tratamiento .................................................. 23
3.3. Caracterización del hidrolizado ............................................. 24
3.4. Caracterización del residuo sólido .......................................... 26

4. HIDRÓLISIS ÁCIDA .............................................................. 29

5. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA ....................................................... 33

6. PROCESOS DE FERMENTACIÓN ................................................ 37

6.1. Microorganismos utilizados ................................................. 39
6.2. Vías metabólicas ............................................................ 50
6.3. Bioproductos ................................................................ 51

7. FERMENTACIÓN DE HIDROLIZADOS CON Candida tropicalis ................ 57

8. PRODUCCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE HIDROLIZADOS

DE PODA DE OLIVO ............................................................. 61
8.1. Desarrollo del proceso de fermentación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
8.2. Formación de biomasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
8.3. Consumo de sustrato y formación de bioetanol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

9. CONCLUSIONES ................................................................. 71

10. BIBLIOGRAFÍA ................................................................. 73

APÉNDICE: MÉTODOS GRAVIMÉTRICOS

DE DETERMINACIÓN DE FIBRAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
 7

1. RESIDUO DE PODA DE OLIVAR

1.1. Producción y vías de aprovechamiento

Hasta el momento, para el residuo de poda de olivo, al igual que para la mayoría
de los residuos agrícolas, no se han encontrado aplicaciones tecnológicas y eco-
nómicamente viables. En la mayor parte de los casos se deja sobre los terrenos
para ser incinerado o incorporado al suelo (una vez triturado), con los inconve-
nientes que esto supone: contaminación atmosférica, mineralización del suelo,
incremento de riesgo de incendios, propagación de plagas, producción inútil de
dióxido de carbono, etc. Existen fundamentalmente dos vías para el aprovecha-
miento de estos residuos: conversión termoquímica y conversión bioquímica.
El olivar es uno de los cultivos más importantes en España, siendo la superfi-
cie cultivada de, aproximadamente, 2,55 106 ha (Ministerio de Medio Ambiente
y Medio Rural y Marino, 2009). Puesto que la hectárea del olivar produce como
término medio 3 103 kg de residuos por año (Sánchez y col., 2002b), se puede es-
timar que la producción total anual de este residuo es superior a 7,7 109 kg. La
biomasa procedente de la poda del olivar resulta de la operación que se aplica a
los árboles tras la recolección, por lo común cada dos años, para contribuir a man-
tener las copas de los árboles perfectamente aireadas e iluminadas, rejuvenecer
el árbol y prepararlo para la próxima cosecha. La poda tiene además otra serie de
beneficios como son alargar la vitalidad del árbol y mantener equilibradas las fun-
ciones productiva y reproductiva. Las ramas de menor diámetro se suelen deno-
minar ‘ramón’. Las ramas de diámetro superior a 8−10 cm, que se conocen como
leña, suelen aprovecharse como combustible doméstico o en pequeñas industrias
(cerámicas, panaderías, cementeras, etc.) de las zonas rurales.
Tras la separación entre ramas gruesas y ‘ramón’, este último suele apilarse
para ser incinerado directamente en los campos de cultivo en un tiempo muy breve
con el objeto de evitar la propagación de ciertas plagas. Esta operación supone
un coste relativamente elevado para el agricultor y lleva consigo la falta de apro-
vechamiento de la energía liberada. En muy pocos casos, las ramas finas se apro-
vechan incorporándolas al suelo tras su picado. Esta práctica se desarrolla con el
doble objeto de elevar el nivel de materia orgánica del suelo, contribuyendo a me-
jorar las características estructurales y la fertilidad liberando elementos nutriti-
 8 9
vos tras un lento proceso de mineralización, y de evitar las pérdidas de humedad
del horizonte superficial. Sin embargo, cuenta con detractores debido a que puede
impedir la mecanización de otras labores, ya que la descomposición es muy lenta,
su presencia en el suelo prolongada, puede aumentar algunos problemas fitosa-
nitarios y, en especial, tiene un mayor coste de incineración.
Fig. 1. Detalle del residuo de poda del olivo en el campo.
La incineración ‘in situ’ de estos residuos, además del perjuicio económico,
origina numerosos problemas medioambientales, como anteriormente se ha in-
dicado.
Una vía de aprovechamiento de los residuos de poda de olivar es la produc-
ción de energía, puesto que:
a. Existen extensas superficies de cultivo aprovechables.
b. Su eliminación presenta un coste para el agricultor.
c. Es una de las alternativas que actualmente pueden ser viables econó-
micamente.
Los procesos de conversión termoquímica más habituales para esta biomasa
de tipo lignocelulósico son la combustión, la pirólisis y la gasificación, siendo
ésta última la que comporta mayores ventajas (Sánchez y col., 2002b). También
cabe destacar que, dentro de la vía de aprovechamiento termoquímico, distintas
empresas tratan de producir ‘pellets’ a partir del residuo de poda del olivar en la
provincia de Jaén. Esta producción va destinada a su uso en calderas de calefac-
ción domésticas y de grandes comunidades. La formación de ‘pellets’ evitaría la
generación de finos de biomasa que podrían disminuir el rendimiento de las cal-
deras de calefacción.
El ‘pellet’ (granulado) es un combustible de madera virgen seca y prensada en
pequeños cilindros, sin aditivos. El peso específico del ‘pellet’ a granel es de apro-
ximadamente 6−700 kg m-3, mucho más alto que el de otros combustibles no pren-
sados de madera (astillas). El poder calorífico alcanza las 4200 kcal kg-1, con una
densidad energética de 3000–3400 kW h m-3.
Debido a su forma cilíndrica y a su pequeño tamaño, el ‘pellet’ tiende a com-
portarse como un fluido, lo que facilita el movimiento del combustible y la carga
automática de las calderas. La alta densidad energética y la facilidad de movi-
miento hacen del ‘pellet’ el combustible vegetal más indicado para sistemas de
calefacción automáticos de todos los tamaños. El ‘pellet’ de madera puede utili-
zarse en las calderas de astillas o en calderas proyectadas especialmente para este
combustible. Es posible incluso utilizar el ‘pellet’ en algunos modelos de calde-
ras de gasóleo, a través de quemadores especiales.
Basándose en el poder calorífico del ‘pellet’ y en los rendimientos de conver-
sión, el consumo horario de combustible a la potencia nominal de la caldera es
de aproximadamente 0,25 kg h-1 (0,35 dm3 h-1) por kW. Un silo de 10 m3 pro-
porciona, por tanto, alrededor de 1500 horas de autonomía de funcionamiento a
la máxima potencia para una caldera de 20 kW.
El ‘pellet’ está disponible en el mercado en diferentes formas:
• Bolsas pequeñas de 15 kg, utilizadas para estufas, chimeneas y pe-
queñas calderas con depósito de carga manual.
• Bolsas grandes de 800–1000 kg (‘big bags’), las cuáles se pueden uti-
lizar con la inserción de un alimentador de tornillo sin fin o en siste-
mas con silo de almacenaje enterrado.
• A granel, transportado mediante un camión cisterna especialmente equi-
pado para bombearlo directamente en un silo de almacenaje.
Otra vía de aprovechamiento de los residuos de poda de olivar es el fraccio-
namiento mediante hidrólisis de sus principales componentes: celulosa, hemice-
lulosa y lignina. El proceso de hidrólisis, ácida o enzimática, de este residuo pro-
porciona una disolución de azúcares procedentes de las fracciones hemicelulósica
y celulósica que, por fermentación con levaduras u hongos, puede conducir a la
obtención de productos de interés industrial como bioetanol y el xilitol.
 10 11

es el realizado por Jiménez y Sánchez (1989), el cual se muestra en la Tabla 2.

Estos autores llaman madera a los troncos con diámetro superior a 5 cm y ramas
1.2. Caracterización
La biomasa lignocelulósica representa una de las fuentes renovables más abun-
al conjunto de troncos de menor diámetro, tallos y hojas.
dantes y menos costosas de la Tierra. Se puede decir que está compuesta de tres
fracciones principalmente. La primera, del orden del 35 al 50% (Ogier y col.,
Tabla 2
1999), es la celulosa, un polímero de elevada masa molecular formada por uni-
CARACTERIZACIÓN DE RESIDUOS DE PODA DE OLIVO
dades de D-glucosa unidas mediante enlaces β-1,4 que suele aparecer como una Jiménez y Sánchez (1989)
estructura cristalina. La segunda, denominada fracción hemicelulósica, del orden
del 20 al 30% (Ogier y col., 1999), es también un polisacárido, muy ramificado, Parámetros Madera σ Ramas σ
Humedad, % 6,87 0,22 6,41 0,39
constituido fundamentalmente por pentosas (D-xilosa y L-arabinosa) y, en menor
Cenizas, % 1,18 0,11 3,26 0,12
proporción, D-galactosa, D-glucosa, D-manosa y ácidos urónicos (Saka, 2001).
Solubles en agua fría, % 15,81 0,26 13,54 0,53
La tercera es la lignina, polímero aromático de estructura compleja formada por
Solubles en agua caliente (100ºC), % 17,67 0,33 18,10 0,04
precursores fenilpropanoicos, que puede constituir del 15 al 25% de la biomasa
Solubles en disolución al 1% de NaOH, % 30,75 0,58 40,79 0,26
lignocelulósica (Ogier y col., 1999).
Extractos alcohol-benceno, % 12,49 0,20 12,32 0,38
Los materiales lignocelulósicos suelen caracterizarse principalmente según su Pentosanos, % 20,17 0,25 18,46 0,11
contenido en fibras mediante las normas TAPPI (‘Technical Association of the Lignina, % 17,53 0,02 19,61 0,48
Pulp and Paper Industry’) correspondientes y los métodos estandarizados pro- Holocelulosa, % 69,23 0,13 62,39 0,90
puestos por Van Soest y Wine (1967). α-celulosa, % 40,95 0,20 38,48 0,90
Una clasificación de estos materiales atendiendo a su contenido en fibras es σ = desviación típica
la propuesta por McGinnis y col. (1983), en la cual los residuos de poda de oli-
var quedarían englobados, en principio, en las plantas forrajeras (Tabla 1). Por último, en un trabajo previo (Sánchez y col., 2002b) se consiguió separar
el ‘ramón’ propiamente dicho de la hoja, caracterizando la madera y la hoja por
Tabla 1 separado, así como ambas sin separar (total). Los resultados obtenidos se mues-
COMPOSICIÓN DE ALGUNOS RESIDUOS LIGNOCELULÓSICOS tran en las Tablas 3 y 4.
McGinnis y col. (1983)

Fuente Celulosa, % Hemicelulosa, % Lignina, % Tabla 3

Maderas blandas 45−50 25−35 25−35 COMPOSICIÓN DEL RESIDUO DE PODA DE OLIVO
Maderas duras 40−55 24−40 18−25 Sánchez y col. (2002b)
Forrajeras, paja de
25−40 25−50 10−30 Propiedad Madera Hojas Total
cereales, caña de azúcar
Humedad, % 10,7 8,5 10,2
Cenizas, % 1,5 5,0 3,3
En la caracterización de los residuos de poda del olivar se suele diferenciar
Lignina, % 14,7 23,1 20,8
entre madera y ‘ramón’ propiamente dicho. En este sentido, uno de los primeros
Celulosa, % 32,8 5,3 36,6
análisis encontrados en bibliografía y que engloba gran cantidad de parámetros Hemicelulosa, % 26,9 16,3 19,7
 12 13

Tabla 4
ANÁLISIS ELEMENTAL DEL RESIDUO DE PODA DE OLIVO
2. PROCESOS DE HIDRÓLISIS: PRETRATAMIENTOS

Sánchez y col. (2002b) Los procesos de hidrólisis tienen como objetivo recuperar la máxima cantidad de
Elemento Madera Hojas Total azúcares de las fracciones celulósica y hemicelulósica para su posterior fermen-
Carbono, % 45,5 48,7 44,6 tación. La lignina no suele ser atacada, ya que su degradación genera compues-
Hidrógeno, % 6,4 7,1 6,7 tos fenólicos que inhiben los procesos fermentativos. En el caso de operar en con-
Nitrógeno, % 0,3 1,4 0,8 diciones más drásticas para hidrolizar la lignina, el objetivo será la recuperación
Azufre, % 0,0 0,0 0,0 de estos fenoles para utilizarlos como agentes antimicrobianos.
En hidrólisis se suelen utilizar comúnmente los conceptos rendimiento y con-
Como es característico de los materiales lignocelulósicos procedentes del olivo, versión (o solubilización en algunos casos). El concepto rendimiento va aso-
el residuo de poda no contiene azufre. ciado generalmente a la producción de azúcares o a la propia hidrólisis. Así por
ejemplo, se define el rendimiento en D-glucosa como los kg de este azúcar ob-
tenidos tras el proceso de hidrólisis por cada kg de biomasa lignocelulósica seca
empleada. El término conversión se aplica a las fibras (componentes estructu-
rales de la biomasa lignocelulósica). De este modo, se definen las conversio-
nes en lignina, celulosa y hemicelulosa como los kg de cada una de estas fibras
transformados (es decir, hidrolizados o solubilizados) por cada kg de biomasa
lignocelulósica.
La celulosa y, eventualmente, la hemicelulosa, son los objetivos de la hidróli-
sis enzimática. Sin embargo, la accesibilidad de los enzimas a estas fibras es li-
mitada. Por esta razón un pretratamiento de la biomasa debe preceder a la etapa
de hidrólisis enzimática.
El pretratamiento está destinado a modificar las propiedades físicas y fisico-
químicas del material lignocelulósico, como pueden ser el grado de polimeriza-
ción y el estado cristalino de la celulosa. Desde un punto de vista económico, es
preferible que el pretratamiento conduzca a una hidrólisis total de la hemicelu-
losa, de forma que se puedan recuperar las pentosas y separarlas de la fracción
celulósica. La hidrólisis de la hemicelulosa depende de las condiciones de ope-
ración; temperaturas elevadas aumentan la cinética de solubilización de la he-
micelulosa y tiempos de reacción cortos limitan la degradación de azúcares y la
producción de compuestos inhibidores (Saddler y col., 1993). La fracción he-
micelulósica, una vez solubilizada, puede ser separada del material pretratado
mediante una etapa de extracción con agua.
 14 15

La lignina puede ser extraída de la fracción insoluble por una disolución al- netra más fácil y más rápidamente en la matriz lignocelulósica (Sad-
calina. La extracción del residuo alcalino que contiene la lignina se puede hacer dler y col., 1993) y permite trabajar a temperaturas algo más suaves
mediante agentes oxidantes como el peróxido de hidrógeno (Ramos y col., 1992; (Weil y col., 1994), pero que debido a su toxicidad no se presenta como
Yang y col., 2002). Sin embargo, esta etapa no es necesaria para mejorar la di- una alternativa de futuro. A pesar de ello, esta técnica ha conocido un
gestibilidad enzimática de la celulosa. Permite, no obstante, disminuir el volu- desarrollo a escala planta piloto (Fein y col., 1991).
men del reactor de hidrólisis y el consumo de energía de la etapa de hidrólisis de
b.2. Hidrólisis a presión, tratamiento hidrotérmico o autohidrólisis. Con-
la celulosa, así como aumentar la concentración de azúcares en el reactor (Ogier
siste en calentar el material lignocelulósico con agua bajo fuerte pre-
y col., 1999).
sión. El proceso es similar al de un simple autoclave (proceso discon-
Existen un gran número de pretratamientos de la biomasa lignocelulósica.
tinuo) y permite la solubilización completa de la hemicelulosa y una
Según Ogier y col. (1999), se pueden clasificar en:
solubilización significativa de la lignina (Van Walsum y col., 1996). El
término autohidrólisis ha sido adoptado por algunos autores (Tortosa
a. Pretratamientos físicos. Tienen como objeto reducir el grado de polimeri-
y col., 1995) para referirse al proceso de solubilización de la hemice-
zación de la celulosa y la lignina, así como de aumentar la superficie acce-
lulosa en suspensión acuosa, a temperaturas entre 165 y 225ºC, que
sible para los enzimas. Suelen ser ineficaces y poco rentables, como pue-
provoca la hidrólisis de los grupos acetilo contenidos en las cadenas
den ser la molienda y las técnicas de irradiación.
hemicelulósicas. Como consecuencia, se produce la autogeneración de
un medio ácido suficiente para, solo o con efectos mecánicos de ex-
b. Pretratamientos fisicoquímicos.
plosión y cizalla, romper estas cadenas en fragmentos solubles. Es una
b.1. Pretratamiento por explosión con vapor. Durante este proceso la bio-
técnica interesante ya que conduce a rendimientos de hidrólisis eleva-
masa es sometida a altas temperaturas (180-240ºC) por inyección de
dos y minimiza la formación de productos de degradación. A pesar de
vapor a presión (1700-4500 kPa) durante un tiempo variable (desde 10
ello, no se conoce ninguna aplicación industrial (Ogier y col., 1999).
segundos a varios minutos). El pretratamiento finaliza con una des-
compresión brusca del sistema. A pesar de ser una técnica muy anti-
c. Pretratamientos químicos.
gua, se presenta como un método atractivo, sobre todo utilizando un
c.1. Pretratamientos en medio alcalino. Se tratan de procesos desarrollados
ácido como catalizador, ya que permite rendimientos en D-xilosa ele-
en su mayor parte en plantas piloto de la industria pastero-papelera.
vados. Una variación de esta técnica es la explosión con vapor catali-
Suelen llevarse a cabo con NaOH al 8-12% (p/p), en el rango de 80-
zada. El uso de ácido sulfúrico como catalizador conduce a una solu-
120ºC y durante 30-60 minutos (Pourquié y Vandecasteele, 1993). Como
bilización y una hidrólisis total de la hemicelulosa en sus monómeros
consecuencia de este pretratamiento la lignina es solubilizada casi en
constituyentes, sin degradación en furfural (Ogier y col., 1999). La uti-
su totalidad así como una parte de la hemicelulosa. Presentan algunas
lización de un catalizador ácido permite disminuir la temperatura del
desventajas como son las pérdidas inevitables de un 30 a un 35% de la
proceso (150-200ºC) y mejora la posterior hidrólisis enzimática (Pour-
materia seca inicial (Pourquié y Vandecasteele, 1993). Por otra parte,
quié y Glikmans, 1986). Se ha ensayado también el uso de dióxido de
los costes actuales de los reactivos químicos tales como la sosa les con-
azufre (siendo en este caso el catalizador el ácido sulfúrico generado
fieren una difícil viabilidad económica.
por reacción con el agua de la materia vegetal) el cual, como gas, pe-
16 17

c.2. Pretratamientos con ácido diluido. Estos pretratamientos se llevan a celulósica son bajos. Cabe también destacar como desventaja el uso de
cabo con ácido sulfúrico diluido, en proporción del 1 al 3% en relación un producto peligroso como el amoniaco.
a la biomasa lignocelulósica seca. Las temperaturas y los tiempos de
c.4. Pretratamiento con dióxido de carbono. Es una técnica idéntica a la an-
pretratamiento varían según las técnicas utilizadas (Pourquié y Vande-
terior en la que se emplea dióxido de carbono en lugar de amoniaco,
casteele, 1993): 200ºC para tiempos inferiores a 10 segundos utilizando
con las ventajas que ello conlleva (Ogier y col., 1999). Sin embargo,
reactores tubulares y 120-150ºC para procesos del orden de 30 minu-
esta técnica no ha sido jamás desarrollada.
tos empleando reactores por percolación. El objetivo es aumentar la su-
perficie de la celulosa accesible a los enzimas, gracias a la extracción Finalmente, aunque Ogier y col. (1999) no la han considerado en su clasi-
de la fracción hemicelulósica. Sin embargo, tienen poco efecto sobre ficación, la ozonolisis se puede incluir como un pretratamiento químico. Con-
el grado de cristalinidad de la celulosa (Weil y col., 1994). Estos pro- siste en tratar la materia con ozono (el oxidante químico más potente después
cesos conducen a buenos rendimientos de hidrólisis de la hemicelulosa del flúor). En un principio, esta técnica se utilizó para eliminar la lignina de
en sus monómeros constituyentes, lo cual mejora la digestibilidad en- la biomasa lignocelulósica con el fin de facilitar su posterior degradación en-
zimática de la celulosa. Un incremento de la temperatura también fa- zimática. La utilización del ozono presenta las siguientes ventajas:
vorece la digestibilidad enzimática de la celulosa, pero aumenta las pér-
• No deja residuos constituidos por ácidos o bases minerales (el ozono
didas en materia seca. Los rendimientos de hidrólisis de la celulosa
se descompone pocos minutos después de su generación).
disminuyen del 98 al 45% al descender la temperatura de 220ºC a 180ºC
• El ozono puede ser generado en la propia planta de ozonización evi-
para una concentración de ácido sulfúrico constante al 1% (Weil y col.,
tando el problema del transporte y almacenamiento de productos quí-
1994). Aunque se han ensayado otros ácidos (nítrico, fosfórico, para-
micos tóxicos.
cético, fórmico,...), los rendimientos obtenidos no son superiores. No
• Las reacciones de ozonización se suelen desarrollar a temperaturas y
obstante, el ácido fosfórico presenta cierto interés, ya que el fósforo re-
presiones ambientales.
sidual (en forma de ión PO43- ) puede ser utilizado como nutriente por el
microorganismo en la posterior etapa de fermentación. Sin embargo, debido al elevado coste de producción del ozono y su ines-
tabilidad intrínseca, que impide postergar excesivamente el periodo de uso
c.3. Pretratamiento ‘Afex’. Este proceso consiste en el tratamiento de la
tras su producción, no es una técnica empleada como pretratamiento. Algu-
biomasa lignocelulósica con amoniaco líquido bajo presión moderada
nos autores (Tortosa y col., 1994) han orientado la ozonolisis hacia la obten-
seguido de una fuerte descompresión con objeto de evaporar el amo-
ción de oxiaromáticos a partir de fracciones de origen lignocelulósico (ligni-
niaco y explosionar el sustrato. Se puede considerar una variante de la
nas organosolvolíticas), en especial mediante su acoplamiento a procesos de
explosión a vapor, pero en condiciones de temperaturas (50-80ºC) y
fraccionamiento. Esta posibilidad es más atractiva desde el punto de vista
presión (1500 kPa) más suaves debido al uso del amoniaco, minimi-
económico.
zando de esta forma la producción de compuesto inhibidores (Weil y
col., 1994). El amoniaco (o bien el ión NH+4 ) residual puede ser utili-
d. Pretratamientos biológicos. Se llevan a cabo con hongos basidiomicetos,
zado como nutriente por el microorganismo en la posterior etapa de fer-
bajo determinadas condiciones en las que pueden degradar activamente la
mentación. Sin embargo, este tipo de pretratamiento es ineficaz con
lignina. La lentitud de los procesos y la dificultad de controlar las condi-
sustratos leñosos y los rendimientos de hidrólisis de la fracción hemi-
18
ciones de operación hacen que no se conozcan ensayos a una escala supe-
rior al nivel de laboratorio.
e. Proceso ‘Organosolv’. Esta técnica, cuyo origen también se encuentra en la
industria pastero-papelera, consiste en adicionar disolventes orgánicos (prin-
cipalmente metanol o etanol) o una mezcla de alcoholes y ácidos (como por
ejemplo el proceso ‘Acetosolv’, en el cual se emplea ácido acético concen-
trado y, como catalizador, ácido clorhídrico) durante el pretratamiento con
el fin de disolver y extraer la lignina (Mutjé y col., 2006; Xu y col., 2006).
Al final del proceso la lignina y la hemicelulosa son solubilizadas, quedando
un residuo constituido fundamentalmente por celulosa. El disolvente orgá-
nico es extraído por evaporación, y después reciclado. La lignina precipi-
tada es recuperada por simple centrifugación o filtración. En general, el pro-
ceso ‘Organosolv’ permite obtener buenos rendimientos de recuperación de
azúcares, pero tiene el inconveniente del coste del disolvente. Con el fin de
evitar la degradación de una parte de la celulosa, el disolvente orgánico se
puede sustituir por una etanolamina en medio alcalino (Mutjé y col., 2005).
f. Extrusión. Esta técnica permite combinar la acción térmica, mecánica y quí-
mica con una intensidad relativa variable (Ogier y col., 1999). Ha sido em-
pleada tanto para la extracción alcalina de la hemicelulosa (N’Dyayes y col.,
1996) en condiciones suaves de temperatura (25-70ºC), como para su hi-
drólisis ácida (Qiabi y col. 1994). Aplicado al residuo de la poda del olivo,
la extrusión ha sido ensayada bajo diferentes condiciones de temperatura
(70-100ºC), concentración de ácido sulfúrico (1-3 N) y de caudal de entrada
de disolución ácida (5-15 dm3 h-1). A pesar de que bajo estas condiciones se
solubiliza una parte considerable de la holocelulosa presente en el residuo
(principalmente hemicelulosa), los rendimientos en azúcares son bajos. Sin
embargo, en las condiciones de operación más extremas conduce a una im-
portante solubilización de la lignina (superando el 40% a 100ºC), lo que con-
vierte a la extrusión en una técnica con un gran porvenir como pretratamiento
de la hidrólisis enzimática (García y col., 2008a).
19
3. AUTOHIDRÓLISIS DEL RESIDUO DE PODA DEL OLIVO
La autohidrólisis, uno de los pretratamientos fisicoquímicos citados anteriormente,
puede ser utilizada para solubilizar la hemicelulosa y fermentar el hidrolizado re-
sultante. Para este estudio, se ha empleado residuo de poda de olivar procedente
de árboles de la variedad ‘Picual’ de una finca situada en el término municipal de
Arjonilla (Jaén), recogido durante el mes de febrero de 2003. Este residuo había
sido picado en el campo mediante una máquina de la firma Pimasur S.L., y se se-
paró el ‘ramón’ propiamente dicho de la hoja mediante una mesa densimétrica a
escala industrial.
Fig. 2. Separación del ‘ramón’ de la hoja según sus densidades.
El residuo de poda de olivo tratado en la mesa densimétrica fue llevado a los
laboratorios del Departamento de Ingeniería Química, Ambiental y de los Mate-
riales de la Universidad de Jaén, donde fue secado a temperatura ambiente du-
rante un tiempo prolongado. Una vez alcanzada la humedad de equilibrio en el
residuo, éste sufrió una etapa de molturación. El molino utilizado fue un molino
de cuchillas, Retsch Mod. SM1.
Dado que el tamaño de partícula puede ser una variable que influya significa-
tivamente en el desarrollo de los tratamientos aplicables al residuo, se procedió
a su clasificación por tamaño de partícula mediante una tamizadora Retsch, Mod.
Vibro. Se utilizaron tamices de 500, 120, 50, 40, 30, 20 y 16 mallas ASTM, según
la norma ISO 3310-1, cuya luz de malla es 0,025, 0,125, 0,300, 0,425, 0,600,
 20 21

0,850 y 1,200 mm, respectivamente. La fracción elegida para este trabajo fue la Las características del reactor son las siguientes:
comprendida entre 0,425 y 0,600 mm.
Anchura 39,37 cm
Altura 81,28 cm

El cuerpo del reactor (Fig. 6) está construido en

acero inoxidable T316. Sus características son:

Diámetro interno 10,16 cm

Altura interna 26,67 cm
Fig. 5. Reactor a presión.
Capacidad 2 dm3

Teóricamente permite trabajar como máximo a

Fig. 3. Detalle del residuo de poda de olivo utilizado antes de ser acondicionado.
13100 kPa, aunque esta presión está limitada por un
disco de ruptura que la reduce en un 30%, por lo que
la presión máxima real a la que puede operar es 9170
kPa (equivalente a una temperatura de 300ºC).
El sistema de agitación (Fig. 7) se compone de dos
turbinas de disco con seis palas planas (turbina Rus-
hton). La intensidad de agitación se modifica mediante
un motor de velocidad
variable, alcanzándose
una velocidad má- Fig. 6. Detalle del
xima de 700 rpm. El cuerpo del reactor.
sistema de agitación
Fig. 4. Detalle del residuo de poda de olivo molido y tamizado funciona correctamente para reacciones con mez-
a un tamaño comprendido entre 0,425 y 0,600 mm. clas de viscosidad inferior a 25 g cm-1 s-1. Para
cargas más viscosas, la cabeza fija puede ser equi-
El equipo empleado para la autohidrólisis fue un reactor discontinuo tipo tan- pada con unidades magnéticas y motores más po-
que agitado a presión, Parr Mod. 4522, con una cabeza de agitación, Mod. tentes capaces de mantener la agitación requerida.
A1120HC (Fig. 5 y 6). Este equipo dispone de un dispositivo eléctrico para el ca-
lentamiento de la carga, siendo la potencia máxima de calefacción 1500W, y un
sistema de serpentines internos para su enfriamiento. Además, posee un contro-
Fig. 7. Detalle del
lador PID de temperatura y lectores digitales de temperatura, presión y agitación.
sistema de agitación.
 22
3.1. Desarrollo del proceso de autohidrólisis
Se pesa el residuo correspondiente a la cantidad de residuo seco requerido y se
introduce en el vaso del reactor junto con el volumen de agua ultrapura necesa-
rio para la relación sólido/líquido deseada en el interior del mismo, estando com-
prendidas las relaciones ensayadas en este trabajo en el rango de 1/4 a 1/20 (p/v).
Se coloca la tapa, se introduce en el reactor y se cierra el sistema. Se conecta el
equipo y se enciende la calefacción. Cuando la temperatura alcanza los 100ºC se
anota como inicio de toma de tiempos y se registra la presión y la temperatura
cada 2 minutos hasta que ésta alcance los 200ºC para calcular posteriormente la
velocidad de calentamiento. En ese momento se apaga la calefacción y se intro-
duce agua fría en la camisa del vaso, la cual provoca una gran descompresión en
el sistema y con ella la hidrólisis parcial del residuo. Se continúan tomando datos
de presión y temperatura cada 2 minutos hasta que la temperatura descienda a
100ºC para el cálculo de la velocidad de enfriamiento.
Fig. 8. Curvas de calentamiento y enfriamiento para las autohidrólisis con relación S/L 1/5 (p/v).
Con objeto de terminar de enfriar más rápidamente el reactor (e indirectamente
la mezcla de su interior), se introduce en un baño de hielo hasta que la tempera-
tura en la pared sea la ambiente o inferior.
Para la separación del residuo sólido de la disolución de azúcares, se filtra
sobre un filtro de pliegues de papel de celulosa y se lava el residuo con agua des-
23
tilada hasta alcanzar un volumen de 2 dm3 de hidrolizado, el cuál se conserva en
frío para el posterior estudio de su contenido en azúcares reductores totales, D-
glucosa y ácido acético.
El residuo sólido, una vez seco, se pesa y se conserva para realizar los análi-
sis correspondientes de humedad y materia volátil, cenizas, celulosa, hemicelu-
losa y lignina.
3.2. Severidad del tratamiento
Se han determinado las velocidades de calentamiento y de enfriamiento, así como
el parámetro de severidad de la autohidrólisis, R0, según el procedimiento des-
crito por Overend y Chornet (1987). Según estos autores, la severidad del pro-
ceso viene definida por la ecuación:
T(t)-TR
[1] R0 = ∫0t exp w dt
donde T(t) es la función que relaciona la temperatura en ºC con el tiempo de hi-
drólisis en minutos. Esta función se calcula gráficamente a partir de las curvas de
calentamiento y enfriamiento anteriores (Fig. 8). TR es una temperatura de refe-
rencia por debajo de la cual el proceso de autohidrólisis puede ser considerado
poco significativo, y que en nuestro caso corresponde a 100 ºC. Para el paráme-
tro* se eligió el valor 14,75, pues ha sido propuesto para otras biomasas lignoce-
lulósicas similares al residuo de la poda de olivo (Cuevas y col., 2009). El pará-
metro R0 se utiliza generalmente en su forma logarítmica. En este trabajo se ha
obtenido un valor medio para log R0 de 3,54 ± 0,06.
Inicialmente, no se ha apreciado relación entre las velocidades de calenta-
miento y de enfriamiento y el factor de severidad con la carga introducida en el
reactor. En cuanto a la presión, se ha observado que aumenta en el interior del re-
actor conforme lo hace la temperatura, obteniéndose un valor máximo de 1951,2
kPa para la relación S/L = 1/6.
RT2R
* w=
Ea
 24 25

ción hemicelulósica, D-xilosa, es prácticamente nula. D-xilosa se degrada con

más facilidad que D-arabinosa (García y col., 2008b), y podría además isomeri-
3.3. Caracterización del hidrolizado
Se han determinado las concentraciones en azúcares reductores totales siguiendo
zarse a D-xilulosa en presencia de los enzimas glucosa isomerasa o xilosa iso-
el método propuesto por Miller (1959). D-glucosa y ácido acético han sido cuan-
merasa. La D-glucosa obtenida puede proceder de la denominada celulosa amorfa,
tificados siguiendo los métodos enzimáticos propuestos por Trinder (1969) y
pequeña fracción de celulosa sin estructura ordenada y soluble en agua, más fácil
Bergmeyer y Möllering (1974), respectivamente.
de hidrolizar que la hemicelulosa.
A partir de los valores de concentración de azúcares reductores totales, D-glu-
cosa y ácido acético obtenidos al final de cada experimento de autohidrólisis se
han calculado los rendimientos correspondientes, mostrados en la Tabla 5. Se
aprecia que ni la relación sólido/líquido ni el factor de severidad determinan una
variación definida en los rendimientos, oscilando entre 12,1 y 19,7% en el caso
de los azúcares reductores totales. Los rendimientos en D-glucosa son pequeños
en comparación con los obtenidos en azúcares reductores totales, por lo que la
mayoría de los azúcares podrían permanecer al final de la autohidrólisis en forma
de oligosacáridos. En cuanto a los rendimientos en ácido acético, se encuentran
entorno al 0,6%.

Tabla 5
FACTORES DE SEVEDIDAD (log R0) Y RENDIMIENTOS Fig. 9. Cromatograma obtenido para una autohidrólisis con relación inicial S/L = 1/6.
EN AZÚCARES REDUCTORES TOTALES (YART),
D-GLUCOSA (YGLU) Y ÁCIDO ACÉTICO (YAc) Adarve (2001), utilizando el mismo tipo de residuo con una relación 1/5 (p/v)
y la misma instalación experimental observó que, trabajando a 200ºC y modifi-
S/L log R0 YART, % YGLU, % YAc, % cando el tiempo de operación entre 0 y 120 minutos, al aumentar el tiempo de
1/4 3,49 ± 0,01 17,0 ± 0,9 0,8 ± 0,2 0,6 ± 0,2 contacto los rendimientos en azúcares disminuían, posiblemente debido a la de-
1/5 3,50 ± 0,00 15,4 ± 0,7 0,5 ± 0,0 0,5 ± 0,1 gradación que sufrían al estar expuestos a tan alta temperatura durante un periodo
1/6 3,59 ± 0,10 14,8 ± 1,9 0,7 ± 0,1 0,7 ± 0,0 prolongado de tiempo.
1/10 3,57 ± 0,00 12,1 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,5 ± 0,1 Los hidrolizados fueron concentrados en un rotavapor para aumentar la con-
1/20 3,54 ± 0,01 19,7 ± 0,6 2,0 ± 0,1 0,7 ± 0,0 centración de azúcares en los mismos. El agua retirada durante la concentración
S/L = relación sólido/líquido (p/v) en el interior del reactor. presentaba en todos los casos un pH comprendido entre 3 y 4, lo cual indica que
con esta operación se han retirado inhibidores (ácido acético, ácido fórmico, ...)
En la Fig. 9, obtenida mediante cromatografía líquida iónica de alta resolu- para una posterior fermentación. El ácido acético procede directamente de la de-
ción, se observa que D-arabinosa y D-glucosa han sido los azúcares mayoritarios gradación de la fracción hemicelulósica. El ácido fórmico puede proceder de la
obtenidos, mientras que la concentración del principal monosacárido de la frac- degradación del furfural o bien del 5-hidroxi-metil-furfural (HMF). El furfural
 26 27

procede de la degradación de D-xilosa y el HMF de la degradación de hexosas Tabla 7

(Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000). CONVERSIÓN FRACCIONAL

log R0 XCEL, % XHEM, % XLIG, %

3.4. Caracterización del residuo sólido 3,49 28,2 85,6 7,6
3,50 27,8 80,5
Los residuos obtenidos tras la autohidrólisis, al igual que el residuo de poda de 1,5
3,54 31,7 92,7 6,4
partida, se caracterizaron según su contenido en humedad y materia volátil (HMV),
3,57 30,7 92,4
celulosa (CEL), hemicelulosa (HEM), lignina (LIG) y cenizas (CEN) mediante 9,5
3,59 33,4 97,0 5,2
los métodos analíticos descritos en el Apéndice. Los datos obtenidos se muestran
en la Tabla 6.

Tabla 6
CARACTERIZACIÓN FISICO-QUÍMICA DEL RESIDUO

log R0 HMV, % CEL, % σ HEM, % σ LIG, % σ CEN, %

Residuo poda 8,3 36,4 - 21,5 - 17,1 - 2,3
3,49 7,5 44,6 1,8 5,2 2,7 28,2 1,1 2,4
3,50 7,7 44,6 0,3 7,1 0,4 28,5 0,5 2,2
3,54 6,3 47,4 - 3,0 - 30,5 - 2,4
3,57 10,7 47,7 0,6 3,1 0,3 29,3 0,4 2,0
3,59 6,7 45,0 3,4 1,2 0,6 32,9 3,3 1,9
Fig. 10. Variación de XCEL (•) y XHEM (•) con el factor de severidad.
σ = desviación típica. log R0 = factor de severidad.

En general, los resultados experimentales muestran que la relación sólido/lí-

Se puede observar que estos residuos están compuestos fundamentalmente por
celulosa y lignina, lo que los convierte en una materia prima excelente para la fa-
bricación de ‘pellets’, pues hay que tener en cuenta que un alto contenido en lig-
nina favorece la cohesión del granulado tras la compactación.
A partir de los contenidos en fibras se han determinado las conversiones frac-
cionales en celulosa (XCEL), hemicelulosa (XHEM) y lignina (XLIG) para cada una
de las severidades (log R0) ensayadas, mostradas en la Tabla 7.
quido no tiene una influencia definida en el grado de conversión de celulosa (XCEL)
y de hemicelulosa (XHEM). Sin embargo, como muestran la Tabla 7 y la Fig. 10,
el aumento en la severidad del tratamiento influye ligeramente en el grado de con-
versión, fundamentalmente de la fracción hemicelulósica.
Adarve (2001), trabajando con temperaturas comprendidas entre 175 y 225ºC,
observó que la conversión de hemicelulosa y celulosa aumenta con la tempera-
tura, a pesar de que la concentración máxima en D-glucosa la registró para la tem-
peratura de 175ºC. Asimismo, observó que al aumentar el tiempo de operación
entre 0 y 120 minutos (lo cuál conlleva a un aumento de la severidad del trata-
 28
miento) se reduce ostensiblemente los rendimientos en azúcares reductores tota-
les y en D-glucosa. Esto puede indicar que tanto un aumento de la temperatura
como del factor de severidad, a pesar de favorecer las conversiones de las fibras,
provoca una degradación elevada de los productos obtenidos.
En principio, y atendiendo a los resultados obtenidos, se podría afirmar que la
autohidrólisis del residuo de poda de olivo, al menos en las condiciones ensaya-
das, solubiliza prácticamente toda la hemicelulosa presente en el residuo y una
fracción importante de la celulosa. Como resultado se obtiene una disolución de
azúcares y, principalmente, de cadenas de oligosacáridos parcialmente hidroliza-
dos que permanecen en la disolución tras la autohidrólisis, pero que pueden cons-
tituir un buen medio de cultivo para la obtención de bioetanol por fermentación.
29
4. HIDRÓLISIS ÁCIDA
Los primeros procesos de hidrólisis desarrollados fueron de tipo químico, utilizando
generalmente ácidos como agentes hidrolizantes, y datan de principios del siglo XX
(Sánchez, 1990), como pueden ser los ensayos de Bertrand con paja de avena y
Hudson con trigo en 1899 y 1917, respectivamente. El objetivo de estos procesos
era la obtención de etanol. Después de la Segunda Guerra Mundial, esta vía de ob-
tención de etanol deja de ser económicamente viable siendo sustituida por la del
etileno obtenido a partir de fracciones del petróleo. Sin embargo, tras la crisis del
petróleo de los años setenta, volvieron a aparecer numerosos trabajos sobre hidró-
lisis ácida de residuos y materiales lignocelulósicos. Habitualmente se ha optado
por el uso de ácido sulfúrico en lugar de clorhídrico debido a su baja volatibilidad,
menor corrosión en los equipos y coste más reducido por mol de protón.
La hidrólisis ácida de la celulosa se presenta ‘a priori’ difícil. Además de las
asociaciones de la celulosa con otros carbohidratos del material lignocelulósico,
otro obstáculo es la propia estructura cristalina que presenta. La orientación de
los enlaces β-1,4 glucosídicos da como resultado la formación de seis enlaces de
hidrógeno, cuatro intramoleculares y dos intermoleculares (Zhbankov, 1992).
Cuando los seis enlaces de hidrógeno se forman, la celulosa presenta una estruc-
tura ordenada y muy compacta, que dificulta el ataque ácido (Weil y col., 1994).
Esta hidrólisis requiere elevadas temperaturas o altas concentraciones de ácido
para hidrolizar total o parcialmente la fracción celulósica. Se puede trabajar con
ácido diluido (1-5%) y altas temperaturas (180-240ºC), o con ácido concentrado
(superior al 20%) y temperaturas inferiores a los 100ºC (Sánchez, 1990). Esto se
traduce en notables costes de reactivos y en la formación de numerosos subpro-
ductos y compuestos inhibidores que convierten a los hidrolizados en disolucio-
nes difícilmente fermentables. Además, en el caso de trabajar con ácido diluido,
los rendimientos en azúcares son reducidos (50-65%). Si por el contrario se tra-
baja con ácido concentrado, presenta los graves inconvenientes de su peligrosi-
dad, intensa corrosión en los equipos y la necesidad de restablecer la concentra-
ción, tras la hidrólisis, para hacerla económicamente rentable (Silvers y Zacchi,
1995). Por ello esta técnica, al no ser competitiva, ha sido desplazada por la hi-
drólisis enzimática cuando el objetivo es aprovechar la celulosa de la biomasa
 30 31

lignocelulósica, pudiéndose utilizar, como ya se ha indicado, como un pretrata-

miento del proceso enzimático.
Sin embargo, una hidrólisis ácida de materiales lignocelulósicos realizada en
condiciones suaves de temperatura (100-150ºC) y de ácido (del 1 al 8%) permite
solubilizar selectivamente la hemicelulosa. La celulosa, al igual que la lignina,
es poco atacada, permaneciendo en fase sólida debido a la dificultad que su es-
tructura cristalina opone al acceso del agente hidrolizante en las cadenas poli-
méricas (Rahman y col., 2007). Si el objetivo es la producción de D-xilosa, las
condiciones deben ser aún más suaves para evitar su degradación, y entonces el
proceso es denominado por muchos autores como prehidrólisis (Sánchez, 1990;
Parajó y col., 1995). Como resultado de esta prehidrólisis se obtiene una mezcla
compleja de productos, como pueden ser:

a. Azúcares, que a su vez incluyen hexosas (D-glucosa, D-manosa, D-galac-

tosa) y pentosas (D-arabinosa y D-xilosa, principalmente). D-glucosa puede
provenir tanto de la hidrólisis de los heteropolímeros hemicelulósicos como Fig. 11. Productos y subproductos de degradación formados durante la hidrólisis
de la degradación de la celulosa (Fig. 11). ácida de la biomasa lignocelulósica (Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000).

b. Productos de degradación de los azúcares, tales como el furfural generado
a partir de las pentosas, y 5-hidroxi-metil-furfural y ácido levulínico gene-
rados a partir de hexosas (Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000).
c. Ácido acético, resultante de la hidrólisis de los grupos acetilo de la hemi-
celulosa (Parajó y col., 1995; Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000).
d. Productos procedentes de la fracción de extractos y de la degradación de la
lignina.
En este sentido, el residuo de poda del olivo ha sido sometido a hidrólisis con
ácido clorhídrico, sulfúrico y trifluoroacético en condiciones suaves de tempera-
tura (70-90ºC) y de concentración de ácido sulfúrico (0-1 N) con el fin de obte-
ner D-xilosa y D-glucosa fermentables (García y col., 2008b; Moya y col., 2008).
A 90ºC, los tres ácidos consiguen hidrolizar completamente la hemicelulosa em-
pleando una concentración de ácido 1 N (Moya y col., 2008), lo que permite ob-
tener unos altos rendimientos en D-xilosa (9,4%) y en D-glucosa (12,9%) (Gar-
cía y col., 2008b). La temperatura se ha mostrado como el factor determinante
para la producción de azúcares (especialmente D-xilosa), lo que permite dismi-
nuir la concentración de ácido en el reactor, con la consiguiente reducción de cos-
tes y formación de compuestos inhibidores. Se ha comprobado que la lignina per-
manece casi íntegramente en el residuo y que la concentración de compuestos
fenólicos en el hidrolizado es mínima (< 2,5 mg m-3). La celulosa apenas es ata-
cada, por lo que el residuo obtenido tras la hidrólisis está compuesto fundamen-
talmente por celulosa y lignina, lo que lo convierte en una materia prima exce-
lente para la fabricación de ‘pellets’.
 33

5. HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA

La hidrólisis enzimática es un método específico, realizado en condiciones rela-

tivamente suaves (50ºC), que permite rendimientos de hidrólisis superiores a los
obtenidos vía química, principalmente de conversión de celulosa y celobiosa a
D-glucosa. Por este motivo, en los últimos quince años han aparecido numero-
sos trabajos con el fin tanto de optimizar la producción de enzimas y su eficacia,
como de mejorar las etapas de pretratamiento, para mejorar la rentabilidad eco-
nómica del proceso.
El estudio de la hidrólisis enzimática comenzó en la década de los setenta del
pasado siglo al disponerse de las primeras preparaciones comerciales de bioca-
talizadores. Pronto se observó que esta nueva vía de tratamiento presentaba gran-
des ventajas frente a la hidrólisis ácida: condiciones suaves de trabajo (tempera-
turas de 45-50ºC y pH alrededor de 5,0) eliminándose, además, los problemas de
corrosión en los equipos derivados del uso de ácidos o bases fuertes (Duff y Mu-
rray, 1996). Al mismo tiempo, el uso de enzimas mostró a los investigadores que
estas macromoléculas seguían pautas de actuación en muchos aspectos comple-
jas y desconocidas, sobre todo si se usaban en sistemas heterogéneos.
La complejidad de la biomasa lignocelulósica impide que pueda ser hidroli-
zada por una sola enzima. Así por ejemplo, la hidrólisis enzimática de la celulosa
resulta de la acción sinérgica de tres tipos de enzimas: las celulasas (endo 1,4 β-
glucanasas y exo 1,4 β-glucanasas), que hidrolizan la celulosa en cadenas más
cortas y en celobiosa, y las β-glucosidasas, que hidrolizan la celobiosa en D-glu-
cosa. Las celulasas y las β-glucosidasas son inhibidas por la celobiosa y D-glu-
cosa, respectivamente (Ogier y col., 1999; Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000).
Si además se quiere hidrolizar la hemicelulosa, se deberán adicionar xilanasas.
La hidrólisis enzimática conduce a mayores rendimientos en monosacáridos que
la hidrólisis ácida, ya que las enzimas catalizan sólo la reacción de hidrólisis, y
no la degradación de azúcares (Parisi, 1989).
Los inconvenientes de esta técnica son el elevado coste de las enzimas, la afi-
nidad de éstas (o de los complejos enzimáticos) por la lignina o el complejo lig-
nino-carbohidrato de la biomasa pretratada (Berlin y col., 2006), y la eliminación
de los azúcares hemicelulósicos en el pretratamiento que la precede (general-
 34
mente de tipo fisicoquímico). Normalmente se elimina el hidrolizado resultante
del pretratamiento en el cual se encuentra solubilizada la hemicelulosa, ya que la
fermentación tras el ataque enzimático se suele llevar a cabo con levaduras de-
nominadas tradicionales, incapaces de fermentar pentosas (D-xilosa o D-arabi-
nosa). Esto podría solucionarse con uso de levaduras no tradicionales, que fer-
mentan tanto hexosas como pentosas, y que podría conducir a la formación no
solamente de etanol, sino de otros productos de valor añadido como el xilitol y
el arabitol.
El procedimiento más común consiste en poner en contacto una suspensión de
sustrato lignocelulósico pretratado con la disolución de enzimas, manteniendo el
pH, la temperatura y la homogeneidad de la mezcla durante todo el proceso. Una
vez determinadas las condiciones óptimas de pH y temperatura, las posibilidades
de optimización son bastante limitadas.
Una vía de reducción de costes sería la reutilización de las enzimas una vez
terminado el proceso de hidrólisis. Estas técnicas suelen estar basadas en las pro-
piedades de adsorción de las enzimas sobre la celulosa residual y, probablemente,
sobre la lignina (Deshpande y Eriksson, 1984; Sutcliffe y Saddler, 1986). Otra
vía, según Ogier y col. (1999), sería mejorar la eficiencia de las enzimas, con el
fin de que se aproximen lo máximo posible a la actividad de las amilasas, enzi-
mas que tienen la función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azú-
cares simples, y que se producen principalmente en las glándulas salivares (glán-
dulas parótidas) y en el páncreas.
Por último, el desarrollo de la técnica conocida como SFS (sacarificación y
fermentación simultáneas) permite mejorar la eficiencia de las enzimas minimi-
zando la inhibición de éstas por los productos formados. Esta técnica se basa en
el uso de microorganismos capaces de hidrolizar las cadenas celulósicas y de fer-
mentar simultáneamente la D-glucosa obtenida a etanol, principalmente. Su in-
conveniente estriba en la diferencia de temperatura que existe entre la óptima de
la hidrólisis enzimática y la de la fermentación. Las celulasas tienen una activi-
dad óptima a 50ºC, mientras que la temperatura óptima de las levaduras es igual
o inferior a 35ºC. Por tanto, para esta técnica se utilizan levaduras denominadas
termotolerantes, capaces de trabajar a temperaturas superiores a los 35ºC (Spin-
dler y col., 1988; Ballesteros y col., 2004). Ciertas cepas de Saccharomyces ce-
35
revisiae son capaces de crecer a 37ºC, de la misma manera que ciertas cepas de
Schizosaccharomyces pombe pueden crecer a 41ºC (Barnett y col., 1985). Según
Beall y col. (1992), Kluyveromyces marxianus y Kluyveromyces fragilis son las
mejores levaduras para la producción de etanol a temperaturas elevadas. Balles-
teros y col. (1991) ensayaron la capacidad de 27 cepas de los géneros Candida,
Saccharomyces y Kluyveromyces de crecer y fermentar D-glucosa entre 32 y 45ºC
obteniendo como resultado que de nuevo K. marxianus y K. fragilis son los me-
jores microorganismos productores de etanol, con rendimientos en este biopro-
ducto próximos a 0,5 kg kg-1.
Las ventajas de la SFS parecen ser numerosas. Al ser los azúcares fermenta-
dos inmediatamente después de su generación, el riesgo de inhibición por pro-
ductos de degradación es mínimo, lo que conlleva un aumento en las tasas de con-
versión, en los rendimientos y en la concentración de etanol, así como una
reducción de la concentración de enzima necesaria (Ballesteros y col., 1991, 2004;
Spindler y col., 1991; Philippidis y Smith, 1995). Además, el coste de los equi-
pos es reducido, ya que ambos procesos se llevan a cabo en el mismo reactor, y
la presencia de etanol durante la hidrólisis disminuye los riesgos de contamina-
ción (Ogier y col., 1999). Sin embargo, no se conoce ninguna cepa termotole-
rante capaz de fermentar pentosas, lo que se traduce en una pérdida de rendi-
miento global en la transformación de una biomasa lignocelulósica en etanol, ya
que la hemicelulosa debe ser eliminada en el pretratamiento y, por tanto, sus azú-
cares desaprovechados.
A pesar de las ventajas citadas, no se han obtenido rendimientos elevados en
etanol utilizando esta técnica sobre el residuo de poda del olivo y la viabilidad
económica del proceso aún está por demostrar, debido al alto coste de las enzi-
mas. Por tanto, el proceso SFS debe ser optimizado, y los estudios en el desarro-
llo de esta técnica deben orientarse a:
a. La influencia de la relación ‘enzima/sustrato’ sobre la productividad en etanol.
b. El efecto de los pretratamientos sobre la eficacia de la SFS.
c. El desarrollo de nuevas cepas termotolerantes, capaces de mejorar los ren-
dimientos y ser más resistentes al etanol.
 37

6. PROCESOS DE FERMENTACIÓN

Se denomina fermentación a la transformación de un compuesto orgánico o in-

orgánico (sustrato) por la acción de enzimas, bien se encuentren éstas en las cé-
lulas (in vivo) o aisladas de las células que las produjeron (Camacho y col., 1986).
Para el primer tipo de fermentación, los microorganismos requieren un medio de
cultivo adecuado, en el cual crecen, se reproducen, consumen los distintos sus-
tratos del medio y producen, como consecuencia de su metabolismo, diversos
productos de forma intracelular o extracelular.
Una vez realizada la inoculación en un biorreactor discontinuo, el número de
células viables del microorganismo varía con el tiempo. El crecimiento comienza
con una fase ‘lag’ o de latencia, en la cual el microorganismo adapta los sistemas
enzimáticos para metabolizar el nuevo sustrato, pero sin desarrollarse. En gene-
ral, la duración de esta fase depende de la magnitud de las diferencias entre las
condiciones del inóculo y las del medio. Posteriormente, tiene lugar un rápido
crecimiento donde el número de células aumenta exponencialmente con el tiempo.
Esta etapa, llamada de crecimiento exponencial, puede ser cuantificada por la
ecuación,

[2] x = xI exp (µm t)

donde x representa la concentración de biomasa a un tiempo t, y xI la concentra-

ción de biomasa que existe al comienzo de la fase de crecimiento exponencial.
La ecuación anterior se podría aplicar de la forma,

[3] ln (x / xI) = µm t

con lo que una representación de los valores del primer miembro frente al tiempo
conduciría a una línea recta que pasaría por el origen de coordenadas y cuya pen-
diente proporcionaría el valor de la velocidad específica máxima de crecimiento,
µm, que por definición es,

1 —
dx
[4] µm = —
x dt
 38 39

No obstante, como xI no es un valor conocido a priori, se modifica la ec. [3] crecimiento lineal durante un intervalo de tiempo relativamente amplio, de forma
según, que puede caracterizarse por,

[5] ln (x / x0) = a + µm t [6] x=c+bt

existiendo una ordenada en el origen no nula ya que al sustituir la concentración
de biomasa del inicio de la fase exponencial por la del inicio del experimento dis-
continuo, x0, quedaría incluida la fase ‘lag’ o de adaptación del microorganismo.
En el caso de que la fase ‘lag’ fuese totalmente despreciable, xI tendería a x0 y
por lo tanto la ordenada en el origen sería nula.
La Fig. 12 muestra ejemplos de formación de biomasa por fermentación con
la levadura Candida tropicalis de hidrolizados obtenidos por hidrólisis con ácido
sulfúrico de residuo de poda del olivo (García, 2007). Sólo en uno de los experi-
mentos se aprecia fase ‘lag’. La pendiente obtenida permite el cálculo de la ve-
locidad específica máxima de crecimiento, µm.
donde b representa la productividad volumétrica en biomasa para dicho intervalo.
En los ejemplos de la Fig. 12 se observa que el periodo de crecimiento lineal
de la levadura Candida tropicalis en los experimentos mostrados está compren-
dida aproximadamente entre las 25 y 200 h, un rango relativamente amplio en
comparación con la etapa de crecimiento exponencial.
6.1. Microorganismos utilizados
Los azúcares obtenidos por hidrólisis de la biomasa lignocelulósica son pentosas
(D-xilosa y D-arabinosa), disacáridos (celobiosa) y hexosas ( principalmente D-
glucosa). Según si el proceso está orientado hacia la formación de etanol o de xi-
litol (los bioproductos más importantes), difieren los microorganismos a utilizar.

Fermentación etanólica de azúcares

En una fermentación etanólica, la reacción que tiene lugar en ausencia de oxí-
geno por un microorganismo anaerobio cuando el sustrato es D-glucosa es:
ln (x / x0)

[7] C6H12O6 microorganismo

2 C2H5OH + 2 CO2 + Energía

mientras que cuando la fuente de carbono es D-xilosa la reacción es:

Fig. 12. Curvas de crecimiento obtenidas en diferentes cultivos.

[8] C5H10O5 microorganismo 5

— C2H5OH + _5 CO2 + Energía
Naturalmente, en una fermentación discontinua el número de células no puede 3 3
aumentar indefinidamente. Por tanto, a la fase de crecimiento exponencial le sigue
una fase de desaceleración, en la que algún nutriente del medio de cultivo em-
El rendimiento teórico de ambas reacciones (denominado coeficiente de Gay-
pieza a limitar el crecimiento. Con frecuencia, en esta fase puede admitirse un
Lussac) es de 0,511 kg kg-1, y representa la máxima eficiencia en la conversión
 40
a etanol. Este valor nunca se alcanza en la práctica, ya que los microorganismos
utilizan al menos un 5% del sustrato en su mantenimiento celular y en la forma-
ción de otros productos minoritarios como glicerol, ácido acético, ácido láctico,
ácido succínico, 2,3-butanodiol y algunos alcoholes superiores (Amin y col.,
1983).
Sin embargo, cuando hay un exceso de oxígeno en el medio, la ruta metabó-
lica se desvía hacia la respiración, con producción de dióxido de carbono y agua.
En este caso, las reacciones de oxidación completa de D-glucosa y D-xilosa, según
Woehrer y Roehr (1981), son:
[9] C6H12O6 + 6 O2 microorganismo
6 CO2 + 6 H2O + Energía
[10] C5H10O5 + 5 O2 microorganismo
5 CO2 + 5 H2O + Energía
La mayoría de las industrias de fermentación alcohólica utilizan la levadura
tradicional Saccharomyces cerevisiae, ya que transforma muy fácilmente D-glu-
cosa en etanol y es muy resistente a este bioproducto. Actualmente, con ningún
otro microorganismo se obtienen mejores resultados de conversión de D-glucosa
en condiciones estériles, llegándose a alcanzar un rendimiento del orden de 0,47
kg etanol kg-1 D-glucosa, una productividad de aproximadamente 5 kg m-3 h-1 y
concentraciones finales de etanol en torno al 10% en volumen (Ogier y col., 1999).
Además, se puede emplear en la industria en procesos en continuo, con las ven-
tajas que ello conlleva (Bayrock e Ingledew, 2005), aunque hoy en día se siga uti-
lizando la fermentación discontinua. Sin embargo, las pentosas son raramente fer-
mentadas por los microorganismos, como ocurre con las levaduras denominadas
tradicionales.
En los últimos años, numerosos trabajos han aparecido sobre la búsqueda o
mejora de cepas que fermenten las pentosas en etanol. Se han estudiado princi-
palmente 4 tipos de microorganismos: levaduras naturales que fermentan pento-
sas, cepas recombinadas de S. cerevisiae, bacterias termófilas y bacterias mesó-
filas que metabolicen pentosas.
41
a. Levaduras capaces de fermentar pentosas.
A principios de los años 80 del siglo pasado, importantes investigaciones se
llevaron a cabo con el fin de aislar cepas capaces de fermentar de forma natural
D-xilosa a etanol (Toivola y col., 1984; du Preez y Prior, 1985; Tran y Chambers,
1985). Como resultado, se identificaron 3 especies de levaduras como las más
eficaces: Pichia stipitis, Candida shehatae y Pachysolen tannophilus. Sánchez y
col. (2002a), estudiaron la fermentación de mezclas de D-glucosa y D-xilosa puras
obteniendo similares resultados con estas 3 levaduras. Sin embargo las capaci-
dades fermentativas obtenidas con estos microorganismos son bajas en compa-
ración a la obtenida con S. cerevisiae sobre D-glucosa. Además, la fermentación
etanólica de D-xilosa con estas cepas sólo es posible en condiciones microaeró-
bicas (du Preez, 1994), por lo que el caudal de oxígeno introducido debe ser ri-
gurosamente ajustado. Un exceso de oxígeno favorece el crecimiento celular en
detrimento de la producción de etanol (Bruinenberg y col., 1983). Por otra parte,
estos microorganismos son particularmente sensibles al ácido acético producido
en el proceso de hidrólisis (Palmqvist y col., 1999) y al etanol que generan (Hahn-
Hägerdal y col., 1991; du Preez, 1994), y son inhibidos a partir de una concen-
tración del orden del 3 al 5% (p/p) en etanol, por lo que hay que realizar una ex-
tracción continua de este bioproducto para obtener buenos rendimientos (Ogier
y col., 1999). A pesar de los numerosos estudios realizados con estas levaduras,
las desventajas citadas y los bajos rendimientos en etanol alcanzados con ellas
no han sido significativamente mejorados.
b. Cepas recombinadas de Saccharomyces cerevisiae.
Aunque S. cerevisiae es incapaz de fermentar D-xilosa a etanol, presenta la
capacidad de fermentar D-xilulosa obtenida por isomerización de D-xilosa
(Fig. 13).
 42
Fig. 13. Conversión de D-xilosa en D-xilulosa-5-fosfato en levaduras
y bacterias según McMillan (1996).
Se ha ensayado la isomerización enzimática de D-xilosa a D-xilulosa adicio-
nando una isomerasa al medio de fermentación de la levadura, llegándose a ob-
tener rendimientos superiores al 90% del teórico, pero con una velocidad de fer-
mentación muy lenta (Gong y col., 1981). Este proceso, denominado SFIX
(‘simultaneous fermentation and isomerisation of D-xylose’), es bastante limi-
tado debido al precio de la D-xilosa isomerasa comercial y a la inestabilidad de
la enzima en el seno de hidrolizados lignocelulósicos (Hahn-Hägerdal y col.,
1991), así como por la diferencia entre las condiciones óptimas de isomerización
(pH = 7) y las de fermentación (pH = 4).
c. Bacterias termófilas.
Las bacterias termófilas son aquellas que se desarrollan a temperaturas su-
periores a 45ºC, pudiendo superar incluso los 100ºC (hipertermófilas) siempre
43
que exista agua en estado líquido, lo que se consigue si la presión es elevada,
como ocurre en las profundidades oceánicas. Varias especies de estas bacterias
son capaces de producir etanol a partir de todas las hexosas utilizables del medio
de cultivo, así como de di- y polisacáridos, y de algunas pentosas como ribosa
y D-xilosa. Según diversos autores (Ogier y col., 1999; Avci y Dönmez, 2006),
su utilización a temperaturas elevadas puede presentar dos ventajas: disminu-
ción de riesgos de contaminación y su posible acoplamiento a técnicas de ex-
tracción y recuperación de etanol como la pervaporación (evaporación selectiva
de un componente de una alimentación líquida al poner ésta en contacto con una
membrana semipermeable). Su utilización tampoco presenta problemas de agi-
tación, aeración y enfriamiento (Avci y Dönmez, 2006). Rendimientos próximos
al 90% del rendimiento teórico se han obtenido con Thermoanaerobacter etha-
nolicus (Carreira y col., 1983; Lacis y Lawford, 1985, 1988, 1991 y 1992), pero
a partir de concentraciones iniciales de D-xilosa muy bajas. Clostridium ther-
mohydrosulfuricum ha sido también muy estudiada haciendo uso de la técnica
conocida como DMC (‘direct microbial conversion’), ya sea utilizando esta bac-
teria individualmente, o en cocultivos con otras cepas (Cl. thermocellum, Cl.
ethanolicus, ...), sin mejoras significativas en los resultados (Ben-Bassat y Zei-
kus, 1981; Weigel y col., 1983). La utilización de estas bacterias para la fer-
mentación de pentosas se presenta difícil debido a los bajos rendimientos en eta-
nol y a la formación de diversos bioproductos. Por otra parte, su poca tolerancia
al etanol hace que sean imprescindibles concentraciones iniciales bajas en azú-
cares. Finalmente, su fuerte sensibilidad a los inhibidores y la necesidad de adi-
cionar factores de crecimiento al medio restan mucho interés al empleo de bac-
terias termófilas (Ogier y col., 1999).
d. Bacterias mesófilas.
Las bacterias mesófilas son aquellas que tienen una temperatura óptima de cre-
cimiento comprendida entre 20º y 45ºC. Algunas de estas bacterias, a pesar de no
ser capaces de fermentar pentosas, conducen a rendimientos elevados de con-
versión de D-glucosa, gracias a una vía de asimilación eficaz (vía de Entner- Dou-
doroff), tal y como sucede con la especie Zymomonas mobilis (Ogier y col., 1999).
Este microorganismo tiene una gran tolerancia al etanol, conduce a rendimientos
 44
elevados usando como sustrato D-glucosa y crece en medios con elevadas con-
centraciones de azúcares. Zhang y col. (1995), introduciendo en esta bacteria 4
genes de E. coli que codifican D-xilosa isomerasa, xiluloquinasa, transquetolasa
y transaldolasa, utilizaron la cepa recombinada en un medio con D-xilosa como
única fuente de carbono, obteniendo rendimientos en etanol de 0,44 kg kg-1 (87%
del rendimiento teórico) y una productividad volumétrica de 0,57 kg m-3 h-1. Estos
autores han obtenido también cepas recombinadas capaces de fermentar D-ara-
binosa (Deanda y col., 1996). Otras bacterias mesófilas presentan las ventajas de
poder fermentar de forma natural las pentosas en ausencia de oxígeno y tener
tasas de crecimiento elevadas. Dentro de este grupo, las más estudiadas son las
enterobacterias Escherichia coli y Klebsiella. En condiciones anaeróbicas, E. coli
produce sobre todo ácidos orgánicos con bajos rendimientos en etanol. Aunque
se ha ensayado la introducción de genes de Z. mobilis con rendimientos en eta-
nol cercanos al máximo (Ogier y col., 1999), se siguen produciendo ácidos or-
gánicos (Hahn-Hägerdal y col., 1993). A pesar de que se han ensayado otras cepas,
según Ogier y col. (1999) el uso de estas bacterias presenta los inconvenientes de
la poca estabilidad de las cepas recombinadas, el tener que llevar a cabo la fer-
mentación a pH elevados (aumento del riesgo de contaminación), la sensibilidad
de estos microorganismos al etanol y a otros inhibidores, los bajos rendimientos
cuando se trabaja con hidrolizados y, sobre todo, el tener que enriquecer el medio
de cultivo con nutrientes (factores de crecimiento, vitaminas).
Existen otras técnicas para la producción de etanol a partir de la biomasa lig-
nocelulósica. Ogier y col. (1999) exponen detalladamente cada una de ellas. De
forma resumida, estas técnicas son:
a. Fermentación de celobiosa. Algunas cepas de los géneros Hansenula y Can-
dida pueden fermentar de 100 a 200 kg m-3 de celobiosa produciendo de 40
a 95 kg m-3 de etanol. Con el uso de estos microorganismos, la fermenta-
ción de hidrolizados puede ser más completa.
b. Fermentación en cocultivo. Consiste en cultivar juntos dos microorganis-
mos que fermenten uno D-glucosa y otro D-xilosa, a etanol. Su principal
problema es que la fermentación de D-xilosa es mucho más lenta que la de
45
D-glucosa, y por tanto el etanol producido a partir de D-glucosa inhibe al
microorganismo que fermenta D-xilosa.
c. Sacarificación y fermentación simultáneas (SFS). Esta técnica ya se detalló
en el apartado 5 sobre hidrólisis enzimática.
d. Conversión microbiana directa (DMC). Es una variante de la SFS, en la que
sólo existe una etapa (y generalmente un solo microorganismo) para la pro-
ducción de enzimas, hidrólisis de la celulosa y fermentación alcohólica de
los azúcares. Como ya se indicó anteriormente, la técnica DMC requiere el
uso de bacterias termófilas.
Fermentación de D-xilosa a xilitol
Los microorganismos asimilan y fermentan fácilmente D-glucosa. Sin em-
bargo, sólo existe un pequeño número de bacterias, levaduras y hongos capaces
de asimilar y fermentar D-xilosa a xilitol, etanol y otros compuestos (Winkel-
hausen y Kuzmanova, 1998).
Algunas bacterias como Corynebacterium sp. (Yoshitake y col., 1971), Ente-
robacter liquefaciens (Yoshitake y col., 1973, 1976) y Mycobacterium smegma-
tis (Izumori y Tuzaki, 1988) han sido empleadas para la producción de xilitol.
Las dos primeras bacterias usaban como sustrato D-xilosa, mientras que la última
metabolizaba D-xilulosa o D-xilosa isomerizada por D-xilosa isomerasa comer-
cial en forma inmovilizada. Sin embargo, debido a las pequeñas cantidades de
este bioproducto que generan, las bacterias productoras de xilitol no presentan
gran interés. En cuanto a los hongos, el único interesante encontrado en biblio-
grafía es Petromyces albertensis (Dahiya, 1991). Este hongo genera alrededor de
40 kg m-3 de xilitol a partir de 100 kg m-3 de D-xilosa en un tiempo próximo a
240 h. Sin embargo, después de un estudio inicial sobre las condiciones de ope-
ración en la producción de xilitol con este hongo, ninguna publicación más ha
sido encontrada.
En general, entre los microorganismos, las levaduras son consideradas como
las mejores productoras de xilitol. Este bioproducto puede ser fácilmente obte-
 46
nido a partir de la fermentación de D-xilosa con levaduras apropiadas en condi-
ciones microaeróbicas (Roseiro y col., 1991, Agblevor y col., 2001). Las leva-
duras del género Candida fermentan con mucha facilidad D-xilosa (Winkelhau-
sen y Kuzmanova, 1998), siendo las que conducen a mayores concentraciones de
xilitol (Parajó y col., 1998). Entre éstas, C. tropicalis es considerada como la
mejor productora de xilitol sin co-producción de etanol (Gong y col., 1981).
El número de levaduras empleadas en la fermentación de D-xilosa a xilitol es
muy elevado. Caben destacar, aparte de las del género Candida, otras levaduras
no tradicionales como Hansenula polymorpha (Sánchez y col., 1998), Debar-
yomyces hansenii (Domínguez y col., 1996; Girio y col., 1996; Nobre y col.,
2002), Pachysolen tannophilus. Estas levaduras transforman D-xilosa a xilitol
porque poseen el enzima D-xilosa reductasa.
La producción de xilitol por las levaduras es un proceso complejo en el que
influyen numerosos factores. En general, los principales son los siguientes:
a. Edad del inóculo. La edad del inóculo parece estar relacionada con la acti-
vidad metabólica de las células (Sreenath y Jeffries, 1986; du Preez, 1994).
Así por ejemplo, variando la edad del inóculo de 15 a 70 h con C. guillier-
mondii FTI 20037, Roberto y col. (1994) llegaron a la conclusión de que
con inóculos menores de 24 h se obtenían las menores productividades en
xilitol, pero sin que se viera afectada la concentración final y los rendi-
mientos. Sin embargo, Sreenath y Jeffries (1986), utilizando Candida she-
hatae FPL-702, encontraron que un inóculo de 24 h producía 20 kg de xili-
tol m-3 mientras que otro de 72 h sólo producía 9 kg de xilitol m-3.
b. Efecto de la concentración celular inicial. Cao y col. (1994) observaron que
el efecto de la concentración celular inicial de Candida sp. B-22 en la pro-
ducción de xilitol era lineal y que el tiempo de fermentación se reducía drás-
ticamente al aumentar la concentración celular inicial en el rango de 3,8 a
26 kg m-3 de levadura. Estos mismos autores comprobaron que una alta con-
centración inicial de C. boidinii NRRL Y-17213 aumentaba tanto el rendi-
miento como la productividad volumétrica en xilitol.
47
c. Efecto del pH. El valor óptimo del pH inicial depende de la levadura em-
pleada, aunque se suelen cultivar en el rango de 4 a 6. Cuando el pH ha sido
controlado y mantenido constante durante todo el proceso de fermentación,
el mejor pH inicial fue 5,5 para D. hansenii (Domínguez y col., 1996), en
el rango de 4 a 6 para Candida sp. (Cao y col., 1994), 4 para C. tropicalis
(Yahashi y col., 1996b), ... Si no es controlado, el pH baja durante la fer-
mentación y entonces el valor del pH inicial debe ser mayor que cuando el
pH es controlado.
d. Efecto de la temperatura. Se ha considerado 30ºC como la temperatura más
adecuada para la producción de xilitol con levaduras (Winkelhausen y Kuz-
manova, 1998), aunque pueden generar este bioproducto en el rango de 24−
45ºC (Parajó y col., 1998), dependiendo del género y la especie.
e. Efecto de la composición del medio de cultivo. La composición del medio y
la naturaleza de las fuentes de carbono y nitrógeno influyen en la acumula-
ción de polioles en las levaduras (Parajó y col., 1998). Normalmente, el uso
de fuentes de nitrógeno orgánico conduce a mayores productividades y ren-
dimientos en xilitol. Algunos autores consideran fundamental el uso de ex-
tracto de levadura o urea como fuente de nitrógeno. Vandeska y col. (1996),
por ejemplo, obtuvieron mayores productividades cuando en el medio de fer-
mentación se suplementaba urea en lugar de sulfato amónico. Sin embargo,
Silva y col. (1994), encontraron un comportamiento diferente con C. gui-
lliermondii, ya que las fuentes de nitrógeno inorgánicas (sulfato o clorito
amónico) conducían a mayores productividades volumétricas que la urea.
f. Efecto de la concentración inicial de sustrato. Concentraciones elevadas de
D-xilosa favorecen la formación de xilitol a expensas de la formación de
etanol, lo que se traduce en un aumento de la relación xilitol/etanol (Roseiro
y col., 1991; Vandeska y col., 1996), aunque disminuye la velocidad espe-
cífica máxima de crecimiento, lo cual es un indicio de inhibición por sus-
trato (Winkelhausen y Kuzmanova, 1998). En mezclas de D-glucosa y D-
48
xilosa, las levaduras consumen primero la hexosa y, cuando ésta ha sido
completamente consumida, metabolizan la pentosa (Oh y Kim., 1998; Pa-
rajó y col., 1998; Winkelhausen y Kuzmanova, 1998; Sánchez y col., 2008).
La presencia de D-glucosa en el medio incrementa la producción de xilitol,
como comprobaron Sreenath y Jeffries (1986) con C. shehatae FPL-702, Oh
y Kim (1998) con C. tropicalis KFCC-10960, Sánchez y col. (2008) con C.
tropicalis NBRC 0618 y otros grupos de investigación con otras levaduras
no tradicionales. Así por ejemplo, Yahashi y col. (1996a), utilizando C. tro-
picalis IFO 0618 inmovilizada, observaron que D-xilosa era convertida más
eficientemente a xilitol en presencia de D-glucosa, la cuál era metabolizada
y transformada en biomasa más rápidamente que D-xilosa, permitiendo la
regeneración del NADPH consumido en la transformación de D-xilosa a xi-
litol (Fig. 13), a través del ciclo de la pentosa fosfato. Sin embargo, otros
autores, como Ooi y col. (2002), trabajando con C. guilliermondii NRC 5578
y C. tropicalis IFO 0618, encontraron que la presencia de D-glucosa en el
medio de cultivo inhibe la formación de xilitol.
g. Efecto del nivel de aeración. Bajo condiciones aeróbicas, no se produce xi-
litol, mientras que bajo condiciones anaeróbicas, ninguna levadura consigue
crecer en apreciable extensión a partir de D-xilosa (Schneider, 1989). Según
numerosos autores, la conversión de D-xilosa a xilitol se produce solamente
bajo condiciones microaeróbicas (Roseiro y col., 1991, Oh y Kim, 1998; Pa-
rajó y col., 1998; Sánchez y col., 1998; Winkelhausen y Kuzmanova, 1998;
Agblevor y col., 2001), siendo éste, junto a la concentración inicial de D-xi-
losa, el factor más importante en la producción de xilitol (Parajó y col., 1998).
h. Efecto del xilitol producido. El xilitol generado produce inhibición sobre
las levaduras solamente con concentraciones muy elevadas de este poliol.
Así por ejemplo, Silva y Afschar (1994) encontraron que a partir de 200 kg
m-3 de xilitol C. tropicalis era inhibida. El xilitol apenas es consumido por
las levaduras. Sin embargo, Girio y col. (1996) observaron el consumo del
etanol y del xilitol producido por D. hansenii una vez que toda la D-glucosa
fue consumida.
49
Actualmente se está intentando cambiar las características genéticas de los mi-
croorganismos, en lugar de optimizar las variables de operación. En este sentido
S. cerevisiae es de nuevo la levadura más estudiada. Se ha probado, hasta el mo-
mento, 2 alternativas. La más empleada es crear una cepa recombinada con el gen
que codifica el enzima D-xilosa reductasa procedente de Pichia stipitis. Hallborn
y col. (1991), utilizando P. stipitis CBS 6054, obtuvieron rendimientos en xilitol
cercanos al teórico. Esta cepa recombinada necesitaba un cosustrato para mante-
ner su crecimiento. El que mejor resultado generó fue D-glucosa en condiciones
anaeróbicas. Se ha investigado a nivel de laboratorio la producción de xilitol en
continuo con dos cepas recombinadas e inmovilizadas de S. cerevisiae (H475 y
S641), expresando baja y alta actividad de D-xilosa reductasa. Las mejores pro-
ductividades volumétricas se obtuvieron también usando como cosustrato D-glu-
cosa en condiciones anaeróbicas (Roca y col., 1996). La otra posibilidad es la ex-
presión de D-xilosa isomerasa bacteriana, como Jeppsson y col. (1996) ensayaron
con S. cerevisiae ATCC 24860. A pesar de los buenos rendimientos y producti-
vidades obtenidas con estas cepas modificadas, todavía queda por mejorar su es-
tabilidad en el medio de fermentación.
Poca información se puede encontrar en bibliografía acerca de la recuperación
del xilitol obtenido tras la fermentación. El método más usado de purificación es
la cristalización del poliol gracias a la formación de cristales de gran pureza y ta-
maño uniforme, lo cual facilita las posteriores etapas de filtración, lavado y se-
cado del bioproducto. Así por ejemplo, Martínez y col. (2007), tras la fermenta-
ción de sus hidrolizados de bagazo de caña con C. guilliermondii, centrifugaron
el cultivo resultante para la eliminación de la biomasa y neutralizaron con NaOH
antes de proceder a su filtración y concentración. Para cristalizar el xilitol fue su-
ficiente descender la temperatura del licor resultante hasta la temperatura de sa-
turación de la mezcla. De esta forma obtuvieron cristales de xilitol del 85% en
pureza. Añadiendo al proceso un tratamiento con resinas de intercambio iónico,
la pureza rozó el 95%, valor más próximo al del xilitol comercial (99,8%). Sam-
paio y col. (2006), tras la fermentación de un medio sintético con D. hansenii
UFV-170, eliminaron las células por centrifugación y microfiltraron el medio fer-
mentado con membranas de 0,2 µm de diámetro de poro. El licor obtenido fue
tratado con carbón activo y concentrado en rotavapor a 30ºC, para posteriormente
 50 51

ser introducido en un baño de etilenglicol a una temperatura comprendida entre Gliceraldehído-3-fosfato y fructosa-6-fosfato son productos de la fase no oxi-
-10 y 15ºC durante 5 minutos, donde cristalizó el xilitol (con la ayuda de una pe- dativa del ciclo de las pentosas fosfato. Ambos pueden ser transformados en pi-
queña adición de xilitol comercial con el fin de favorecer la formación de núcleos ruvato en el ciclo de Embden-Meyerhoff-Parnas, como ya se vio en el caso de D-
de cristales). Los resultados experimentales mostraron que tanto concentraciones glucosa para posteriormente obtener etanol y CO2.
elevadas de carbón activo como la presencia de D-xilosa residual disminuían con-
siderablemente la recuperación del xilitol obtenido. Por otra parte, aunque al dis-
minuir la temperatura el rendimiento en cristalización de xilitol aumentaba, la
pureza de los cristales obtenidos presentaba el comportamiento opuesto.

6.2. Vías metabólicas

En general, la fermentación etanólica de D-glucosa discurre a través de la vía de
Embden-Meyerhoff-Parnas. En ella D-glucosa es fosforilada a D-glucosa-6-
fosfato y después isomerizada a D-fructosa-6-fosfato, por medio de las enzimas
hexoquinasa y fosfohexoisomerasa, respectivamente, para acabar degradada en
piruvato. La descarboxilación del piruvato a acetaldehído y la reducción de éste
a etanol son, sin embargo, exclusivas de las levaduras y algunos hongos actino-
micetos, y es una alternativa a su degradación en el ciclo de los ácidos tricarbo-
xílicos. El piruvato se transforma en acetaldehído por la acción de la enzima pi-
ruvato descarboxilasa con liberación de CO2. Posteriormente, el acetaldehído se
transforma en etanol por la acción de la enzima alcohol deshidrogenasa (Fig. 14).
En cuanto a D-xilosa, se acepta generalmente que la primera etapa es su trans-
Fig. 14. Representación esquemática del metabolismo de D-xilosa en levaduras.
formación a xilitol en el interior celular. Entonces puede o bien ser excretado
fuera de la célula o bien ser oxidado a D-xilulosa por la enzima xilitol deshidro-
genasa NAD- o NADPH-dependiente. Estas dos reacciones son consideradas la
etapa limitante en la fermentación de D-xilosa, y dependen en gran medida de las
6.3. Bioproductos

condiciones de aeración del medio de cultivo. La fosforilación de D-xilulosa a
xilulosa-5-fosfato es catalizada por la enzima xiluloquinasa. Bajo esta forma, las
pentosas pueden pasar al ciclo de las pentosas fosfato, en el cual, tras una serie
de fases no oxidativas, se obtienen hexosas y triosas fosfato. También se obtiene
por esta vía no oxidativa ribosa-5-fosfato, utilizada para la síntesis de ácidos nu-
cleicos e histidina, así como eritrosa-4-fosfato, necesaria para la síntesis de ami-
noácidos aromáticos.
Los bioproductos más importantes que se obtienen tras una fermentación micro-
biana son etanol y xilitol.
Bioetanol
El etanol es un líquido transparente e incoloro, con sabor a quemado y un olor
agradable característico. Debido a su bajo punto de congelación, ha sido em-
pleado como fluido en termómetros para medir temperaturas inferiores al punto
 52
de congelación del mercurio (-40°C), y como anticongelante en radiadores de
automóviles.
Normalmente el etanol se concentra por destilación de disoluciones diluidas.
El de uso comercial contiene un 95% en volumen de etanol y un 5% de agua.
Ciertos agentes deshidratantes extraen el agua residual y producen etanol abso-
luto. El etanol tiene un punto de fusión de -114,1°C, un punto de ebullición de
78,5°C y una densidad relativa de 0,789 g cm-3 a 20°C.
Desde la antigüedad, el etanol se ha obtenido por fermentación de azúcares.
Todas las bebidas con etanol y casi la mitad del etanol industrial aún se fabrican
mediante este proceso, utilizando principalmente la levadura Saccharomyces ce-
revisiae. El líquido fermentado, que suele contener entre un 7 y un 12% de eta-
nol, se concentra hasta llegar a un 95% mediante una serie de procesos de desti-
lación. En la elaboración de ciertas bebidas como el whisky y el brandy, algunas
de sus impurezas son las encargadas de darle su característico sabor final. La
mayor parte del etanol no destinado al consumo humano se prepara sintética-
mente, principalmente a partir de productos del craqueo de la industria del pe-
tróleo. También se elabora en pequeñas cantidades a partir de pulpa de madera.
El bioetanol de primera generación es producido por fermentación de pro-
ductos azucarados (remolacha y caña de azúcar). También puede obtenerse a par-
tir de granos de cereales (trigo, cebada y maíz), previa hidrólisis o transforma-
ción en azúcares fermentables del almidón contenido en ellos. El principal
inconveniente es que gran parte de estos cultivos energéticos se utilizan también
en el sector alimentario. Por tanto, las investigaciones actuales se orientan en los
denominados biocombustibles de segunda generación, obtenidos a partir de resi-
duos lignocelulósicos, tal y como es el residuo de la poda del olivo.
El bioetanol se utiliza en vehículos como sustitutivo de la gasolina, bien como
único combustible o en mezclas que, por razones de miscibilidad entre ambos pro-
ductos, no deben sobrepasar el 5−10% en volumen de etanol en climas fríos y tem-
plados, pudiendo llegar hasta un 20% en zonas más cálidas. El empleo del bioe-
tanol como único combustible debe realizarse en motores específicamente diseñados
para este combustible. Sin embargo, el uso de mezclas no requiere cambios sig-
nificativos en los vehículos, si bien en estos casos el etanol debe ser deshidratado,
para evitar los efectos indeseables producidos por el agua sobre la mezcla.
53
Un biocarburante derivado del bioetanol es el ETBE (etil ter-butil-éter) que se
obtiene por reacción del bioetanol con el isobutileno, subproducto de la destila-
ción del petróleo. El ETBE posee las ventajas de ser menos volátil y más misci-
ble con la gasolina que el propio etanol y, al igual que éste, se adiciona a la ga-
solina en proporciones del 10−15%. En ambos casos el objetivo es aumentar el
índice de octanos de la gasolina, evitando el uso de sales de plomo. También se
utilizan el bioetanol y el ETBE como sustitutivos del MTBE (metil ter-butil-éter)
de origen fósil, que en el pasado se utilizó como componente de la gasolina sin
plomo.
Actualmente, Estados Unidos y Brasil son las dos potencias líderes en con-
sumo y producción de bioetanol. España y el resto de países de la Unión Euro-
pea se han comprometido a que los biocombustibles alcancen al menos una cuota
del 5,75% de los carburantes para transporte en el año 2010 (Directiva 2003/30/CE,
de 8 de mayo). En el caso particular de España, el Plan de Fomento de las Ener-
gías Renovables (PFER), para el periodo 2000−2010, establecía una producción
de biocarburantes de 500 ktep para el año 2010, de los cuales el 80% correspon-
día a bioetanol. Sin embargo, el Nuevo Plan de Energías Renovables (PER) para
el periodo 2005−2010, incrementa esta cantidad a 2200 ktep, con el objetivo de
que el consumo de biocarburantes represente en el año 2010 el 5,83% del con-
sumo de gasolina y gasóleo para el transporte, lo que supone un plan incluso más
ambicioso que el europeo.
Xilitol
La industria productora de alcoholes de azúcares edulcorantes está registrando
un gran auge debido a la elevada demanda actual de chicles sin azúcar y produc-
tos con bajo contenido calorífico. Entre ellos están el sorbitol (procedente de D-
glucosa), el dulcitol (o galactitol, de D-galactosa), el manitol (de D-manosa) y el
xilitol (de D-xilosa). Este último se ha convertido en un producto muy atractivo
como sustituto del azúcar debido a su gran poder edulcorante (similar al de la sa-
carosa, pero con un tercio menos de calorías). Por este motivo, suplementándolo
en dietas, limita la tendencia a la obesidad (Pepper y Olinger, 1988).
El xilitol es uno de los edulcorantes de mayor demanda en el mundo y, aun-
que lleva más de 20 años en el mercado, su reciente éxito se debe, como ya se ha
 54
dicho, a la creciente tendencia por los alimentos ‘light’, ya que posee la cualidad
de endulzar con bajas calorías. Admitido en más de 35 países y a pesar de su fácil
producción, sólo existen seis empresas que se dedican a su elaboración, distri-
buidas en Finlandia, Suiza, Japón y China. A principios de la década de los no-
venta se registró una producción mundial de 5000 t año-1, y de acuerdo con estu-
dios económicos del Instituto Tecnológico de Veracruz (Méjico), la inclinación
por este producto va en aumento, lo que demuestra la oportunidad de negocio que
implica la producción de este edulcorante.
Una ventaja añadida de los alcoholes procedentes de azúcares es que no fa-
vorecen el crecimiento de las bacterias causantes de la caries dental. De hecho,
el xilitol tiene un efecto anticaries muy importante, ya que inhibe el crecimiento
de dichas bacterias y, por tanto, reduce la formación de placa bacteriana. Ade-
más, mejora tanto la mineralización de las lesiones provocadas por caries así como
el flujo de saliva sin disminuir su pH (Beckers, 1988). Por estos motivos se uti-
liza en la fabricación de productos de confitería.
Por otra parte, su metabolismo no es regulado por la insulina (Pepper y Olin-
ger, 1988), y no necesita la acción del enzima D-glucosa-6-fosfato deshidroge-
nasa. Por ello, el xilitol es un edulcorante ideal para diabéticos y personas con
deficiencia en dicho enzima (Nigam y Singh, 1995).
El uso del xilitol en la industria alimentaria está también muy extendido ya
que este poliol no sigue la reacción de Maillard, responsable tanto del oscureci-
miento como de la reducción del valor nutricional de las proteínas. Su incorpo-
ración en alimentos mejora tanto el color como el sabor sin causar cambios no
deseables en las propiedades de los alimentos durante su almacenamiento.
También se ha demostrado que el xilitol tiene un efecto preventivo contra la
otitis aguda en niños debido a que inhibe el crecimiento del principal otopató-
geno, Streptococcus pneumonia, y reduce la adherencia de S. pneumonia y Hae-
mophilus influenzae a las células de la nariz y faringe (Uhari y col., 1998).
En resumen, el xilitol se emplea en panadería, especies y condimentos, mer-
meladas, confitería, chicles, chocolate, gelatina, budín, helados, leche conden-
sada, jalea, pasta, así como en la preparación de productos farmacéuticos. Aun-
que el xilitol está presente en algunas frutas y verduras, su extracción no es viable
económicamente debido al alto coste del proceso y al pequeño contenido en xi-
55
litol de dichas fuentes, inferiores a 900 mg xilitol 100 g-1 (Pepper y Olinger, 1988).
Actualmente, a escala industrial, el xilitol se obtiene mediante reducción química
de D-xilosa, la cual suele proceder de hidrolizados de materiales lignocelulósi-
cos. El proceso convencional de producción de xilitol incluye, principalmente, 4
etapas: hidrólisis ácida del material lignocelulósico, purificación del hidrolizado
para obtener D-xilosa cristalina pura o en disolución, hidrogenación de D-xilosa
a xilitol en presencia de un catalizador de níquel, y cristalización del xilitol re-
sultante. La hidrogenación permite transformar en xilitol el 50−60% de la D-xi-
losa inicial (Nigam y Singh, 1995). La etapa crítica de este proceso es la separa-
ción y purificación de la D-xilosa obtenida tras el proceso de hidrólisis, muy
costosa económicamente, ya que la hidrólisis ácida produce cantidades conside-
rables de D-galactosa, L-arabinosa y D-manosa junto con D-xilosa.
La existencia de estas desventajas ha motivado la búsqueda de vías alternati-
vas para la producción de xilitol a partir de dichos hidrolizados lignocelulósicos.
La técnica más atractiva hoy en día es la vía bioquímica. Como ya se ha dicho
anteriormente, entre los microorganismos, las levaduras son consideradas como
las mejores productoras de este bioproducto, generalmente en condiciones de ope-
ración microaeróbicas (Roseiro y col., 1991, Agblevor y col., 2001).
La obtención de xilitol a partir del residuo de poda de oliva por la vía bioquí-
mica ya ha sido ensayada a nivel de laboratorio utilizando la levadura Candida
tropicalis NBRC 0618 (García, 2007), obteniéndose unos resultados prelimina-
res aceptables a partir de hidrolizados obtenidos con ácido sulfúrico en condi-
ciones suaves de concentración de ácido y temperatura.
 57

7. FERMENTACIÓN DE HIDROLIZADOS CON

Candida tropicalis

La mayoría de los trabajos que actualmente se pueden encontrar en bibliografía

con esta levadura tratan sobre la fermentación de D-xilosa o de mezclas de azú-
cares (incluida esta pentosa), llegándose a alcanzar rendimientos muy elevados
de conversión a xilitol. Pocos datos se ofrecen sobre la conversión de D-glucosa
(u otros azúcares, incluido D-xilosa) a etanol. Los equipos utilizados (a nivel de
laboratorio) son muy diversos, pasando desde agitadores orbitales hasta biorre-
actores de volúmenes importantes, pero las condiciones de operación son muy
parecidas, trabajándose casi siempre a 30º C, un pH en torno a 5 y medios de cul-
tivo similares a los empleados con otras levaduras. Sin embargo, pocos trabajos
hay publicados sobre hidrolizados procedentes de materiales lignocelulósicos, y
los rendimientos en xilitol obtenidos a partir de ellos son bastantes más bajos que
los obtenidos con azúcares sintéticos.
C. tropicalis fermenta secuencialmente D-glucosa y D-xilosa, tanto en fer-
mentaciones de azúcares sintéticos como de hidrolizados de materiales lignoce-
lulósicos. El consumo de D-glucosa es muy rápido (pocas horas) y los rendi-
mientos de su transformación a biomasa y etanol elevados (Sánchez y col., 2008).
D-xilosa es consumida más lentamente y, en condiciones microaeróbicas, es me-
tabolizada principalmente a xilitol y, en menor medida, a etanol. En este sentido,
en la fermentación de mezclas de D-glucosa y D-xilosa en medio sintético por
las cepas KFCC-10960 (Oh y Kim, 1998) y por NBRC 0618 (Sánchez y col.,
2008), queda demostrado que la presencia de pequeñas cantidades de D-glucosa
en el medio no sólo favorece el consumo de D-xilosa, sino que aumenta de ma-
nera considerable los rendimientos y las productividades volumétricas en xilitol.
Oh y Kim (1998) determinaron que la relación óptima D-glucosa/D-xilosa era
del 15%. No obstante, poca información se puede encontrar en bibliografía sobre
la obtención de etanol a partir de otros azúcares lignocelulósicos como D-arabi-
nosa y D-galactosa.
Por el contrario, otros autores han encontrado un efecto negativo en la pre-
sencia de D-glucosa en los hidrolizados a fermentar con C. tropicalis. Oii y col.
(2002), usando la cepa ATCC 96745, encontraron que la inhibición por D-glu-
 58
cosa es mayor en medio sintético que con hidrolizados de madera de álamo. Tras
una triple hidrólisis ácida secuencial durante 3 h, cada una con ácido sulfúrico al
2% (p/v), obtuvieron un rendimiento del 16,4% en D-xilosa. El rendimiento en
xilitol de esta pentosa en relación a la D-xilosa presente en el cultivo tras la fer-
mentación fue solamente del 25%. Para mejorar sus resultados, estos autores re-
tiraron por centrifugación las células cuando se había consumido la D-glucosa
del medio, introduciendo en ese momento levadura fresca. El rendimiento au-
mentó hasta un 56%. Este incremento en la conversión a xilitol parece ser debido
a que las nuevas células no están inhibidas por la hexosa.
Esta idea de sustituir las células inhibidas de C. tropicalis ha sido posterior-
mente puesta en práctica por otros investigadores. Kim y col. (2004), en medio
sintético, reciclaron hasta 14 veces por centrifugación las células del medio con-
siguiendo aumentar 2,4 veces la productividad volumétrica en xilitol obtenida
en un fermentador simple. Rao y col. (2006), en la fermentación con C. tropi-
calis de hidrolizados de fibra de maíz y de bagazo de caña de azúcar, obtenidos
mediante hidrólisis ácida, obtuvieron unos rendimientos en xilitol en relación a
la D-xilosa inicial presente en el medio de cultivo de 0,43 y 0,45 kg kg-1, res-
pectivamente. Para mejorar el crecimiento de la levadura y la producción de xi-
litol con los hidrolizados, los cuales contienen inhibidores, las células fueron
adaptadas en el medio del hidrolizado mediante un subcultivo, de hasta 25 ci-
clos. Así, con el hidrolizado de fibra de maíz, el rendimiento en xilitol aumentó
de 0,43 a 0,46, 0,49, 0,52 y 0,58 kg kg-1, tras 5, 10, 15 y 20 ciclos de reciclaje
de células. Con el hidrolizado procedente de bagazo de caña de azúcar (que con-
tenía casi el doble de D-xilosa que el de fibra de maíz), el rendimiento en xili-
tol se incrementó desde 0,45 a 0,48, 0,52, 0,57 y 0,65 kg kg-1, tras 5, 10, 15 y 20
ciclos de reciclaje de células. Después de 25 ciclos, no se apreció un aumento
en los rendimientos.
A pesar de estas mejoras en la producción de xilitol, la centrifugación es de-
masiado compleja para ser viable a escala industrial debido al alto coste de los
equipos. En este sentido, Kwon y col. (2006), con el fin de abaratar costes, en-
sayaron el empleo de una membrana de reciclaje de células en un reactor de mem-
brana sumergido con succión de presión y purga de aire, como el que ha sido em-
pleado en el tratamiento de aguas residuales. La cepa osmofílica utilizada fue C.
59
tropicalis KCTC 10457, también en medio sintético, por lo que los resultados no
pueden extrapolarse a hidrolizados.
Por último, cabe destacar que otra posible aplicación de esta levadura, aparte
de la obtención de productos de alto valor añadido, es la producción de proteí-
nas. Comparados con otros microorganismos, las levaduras son más adecuadas
como fuentes de alimentos, ya que contienen más nitrógeno que las algas y los
hongos, y más cenizas que las bacterias. Por este motivo, la industria alcohólica
brasileña ha aumentado sistemáticamente la producción de un concentrado de
proteína de levadura para alimentación animal, ya que la aceptación de levadu-
ras secas por los rumiantes es muy elevada (D’Arce y col., 1985). A partir de ba-
gazo de caña de azúcar, Pessoa y col. (1996) fermentaron el hidrolizado resul-
tante con C. tropicalis IZ 1824; para favorecer la formación de biomasa, trabajaron
con caudales de aire en el cultivo de 1 y 2 v/v/min, llegando a alcanzar rendi-
mientos en biomasa de 0,30 y 0,31 kg kg-1, respectivamente. La biomasa produ-
cida en el medio presentó un contenido total en proteínas del 31,3%, lo cual llevó
a estos autores a pensar que este residuo y esta levadura pueden emplearse para
la obtención tanto de productos comerciales como de proteínas unicelulares.
Sánchez y col. (2008), para determinación de la concentración de C. tropica-
lis NBRC 0618 en sus cultivos de fermentación, obtuvieron una recta de cali-
brado de crecimiento celular de esta levadura relacionando el peso seco (biomasa)
y la absorbancia a 620 nm de la suspensión de células.. La recta de calibrado que
proponen estos autores es la siguiente:
[11] x (kg m-3) = 0,353 A620 – 0,016
Esta recta permite, mediante medida directa de la absorbancia de una muestra
de cultivo, determinar la concentración de células de esta levadura en el cultivo.
Las células de C. tropicalis suelen ser de forma esférica o ligeramente ovalada
(Fig. 15) y de gran tamaño (hasta 10 µm en cultivos inhibidos). No poseen fla-
gelos, por lo que son inmóviles. Según lo observado en fermentaciones con esta
levadura, las células tienden a formar largas cadenas y colonias durante el creci-
miento del cultivo. Se reproduce por gemación y bipartición, indistintamente. Son
bastante resistentes a la contaminación bacteriana hasta que, una vez que los sus-
 60 61

tratos se encuentran prácticamente agotados, se produce rotura celular y el cul- 8. OBTENCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE HIDROLIZADOS
tivo se hace más vulnerable a la contaminación. DE PODA DE OLIVO

La levadura utilizada para la fermentación de los hidrolizados obtenidos mediante

autohidrólisis del residuo de poda del olivo procede del ‘National Institute of
Technology and Evaluation, Biological Resource Center’ de Osaka (Japón), y su
denominación actual es Candida tropicalis NBRC 0618 (previamente denomi-
nada IFO 0618).
La levadura se conserva en tubos de ensayo de 0,1 dm3 de capacidad (Fig. 16)
sobre un medio sólido de la siguiente composición:

Extracto de levadura 3 kg m-3

Fig. 15. Células de C. tropicalis observadas mediante un microscopio óptico. Extracto de malta 3 kg m-3
Peptona 5 kg m-3
D-xilosa 10 kg m-3
Agar-agar 20 kg m-3

Fig. 16. Conservación de la levadura en tubos de agar.

El medio sólido se prepara por disolución de todos los componentes, excepto

el agar, en agua ultrapura, ajustando el pH a 7 para favorecer el poder gelificante
del agar. A continuación, se calienta la disolución hasta comienzo de ebullición,
manteniéndola en agitación, y se disuelve el agar. Una vez disuelto completa-
mente, se traspasan unos 25 cm3 de esta suspensión a cada tubo de ensayo, se
tapan con un algodón graso y se esterilizan en un autoclave Raypa Mod. AE-110
durante 30 minutos a una sobrepresión comprendida entre 58,8 y 78,5 kPa. Por
último, los tubos se almacenan colocándolos de forma inclinada para conseguir
mayor superficie de inoculación.
El microorganismo se inocula sobre este medio en una cabina de flujo lami-
nar, Telstar Mod. Micro-V, en condiciones estériles (previo uso de luz ultravio-
 62
leta), empleando un asa de platino. Finalmente, los tubos inoculados se conser-
van en una estufa de cultivo. Cada cierto tiempo, la levadura se transfiere a medio
sólido fresco. Para los experimentos de fermentación, entre 48 y 60 h antes del
comienzo, se inocula la levadura sobre el medio de cultivo sólido y se mantiene
en la estufa de cultivo a 30ºC, con el objeto de obtener células en un mismo es-
tado de crecimiento.
La instalación experimental diseñada para la realización de los experimentos
de fermentación llevados a cabo con la levadura Candida tropicalis NBRC 0618
se muestra en la Fig. 17. Esta instalación consta de 2 a 4 reactores de cultivo
construidos en vidrio Pyrex, encamisados, de forma cilíndrica, cuyas caracte-
rísticas son:
Volumen útil: 2,0 dm3
Diámetro interno: 10,5 cm
Diámetro externo: 13,5 cm
Altura interior: 25,0 cm
Altura exterior: 26,5 cm
Fig. 17. Instalación experimental de fermentación.
Los biorreactores (1) están provistos de una tapa con cuatro orificios. En uno
de ellos se coloca una pieza para toma de muestra con extremo esmerilado (2), y
en otra entrada se coloca un tapón de vidrio 29/32 (3) de manera que no esté del
todo cerrado, para que la fermentación sea microaeróbica, o se conecta a un ma-
63
nómetro diferencial cuando en el biorreactor se introduce un mayor caudal de
aire. En condiciones microaeróbicas se han utilizado soportes y pinzas que man-
tienen ligeramente levantados los tapones de vidrio. Las otras dos aperturas se
mantienen cerradas con tapones de vidrio 14/23 (4). En la pieza para toma de
muestra con extremo esmerilado se coloca un pequeño tubo de goma de silicona.
La muestra se toma a través del tubo con la ayuda de una jeringa estéril de 5 cm3.
Hasta el momento de la toma de muestra, se mantiene cerrada con una pinza Hoff-
man (2) para evitar la contaminación del cultivo.
Los biorreactores están unidos entre sí por gomas de silicona, por donde cir-
cula el agua de termostatación, las cuales se utilizan también para la conexión
con el baño de agua (5), con termostato y bomba de circulación, Selecta Mod.
Digiterm S-542 (6), que alimenta el agua a la temperatura deseada (30 ºC) a la
camisa del vaso de cultivo de espesor 1 cm.
Cada reactor de cultivo lleva instalado un equipo de agitación, compuesto por
un agitador magnético, Heidolph Mod. MR2000 (7), situado debajo del vaso, y
una varilla de agitación de teflón (8), de forma cilíndrica de 8 mm de diámetro y
40 mm de altura, en el interior. La agitación inicial es de 500 rpm para un volu-
men inicial de medio de cultivo en el biorreactor de 500 dm3. Esta relación agi-
tación/volumen dentro del biorreactor se mantiene constante durante todo el ex-
perimento de fermentación. Por otra parte, gracias al vórtice de agitación que se
genera, se consigue la entrada del aire en el cultivo. Para controlar el nivel de agi-
tación en los reactores se ha utilizado un cuentarrevoluciones, Heidolph Mod. Di-
gital 2002 (9), que se conecta al agitador magnético.
La introducción del medio de cultivo en los biorreactores, a través de filtros
esterilizados (10), se llevado a cabo mediante una bomba peristáltica, Millipore
cat. nº. XX80 202 30 (11), a través de uno de los orificios de la tapa del reactor.
Por último, para la medida del pH en cada reactor, se ha utilizado un pHmetro,
Crison Mod. GLP 22
Se ha optado por modificar el suministro de aire desde condiciones microae-
róbicas (Q = 0 v/v/min, que equivale al suministro de aire a través del vórtice de
agitación y con un coeficiente volumétrico de transferencia de materia, KLa = 2,9
h-1) hasta un caudal de entrada de aire en el biorreactor de 0,5 v/v/min. En los ex-
perimentos en los que se ha controlado el caudal de aire introducido, éste ha sido
 64
suministrado por una bomba-compresor, Rena Mod. 301 (12), que dispone de un
regulador de caudal. Se ha elegido una conducción de silicona con un diámetro
adecuado, que desemboca en el interior de los biorreactores e inmediatamente
encima de la varilla de agitación, para favorecer la formación de burbujas de pe-
queño tamaño en el seno del cultivo. El aire pasa por un frasco lavador (13) que
contiene agua ultrapura a la temperatura de trabajo, cuya misión es humidificar
el aire antes de su entrada a los biorreactores, reduciendo así la evaporación del
medio de cultivo. El manómetro diferencial de dos líquidos (14), agua y alcohol
amílico coloreado con yodo, calibrado previamente con un medidor de burbujas,
permite controlar con gran exactitud el aire suministrado. Por último, antes de la
entrada a cada biorreactor, se coloca un filtro, Millipore Mod. Millex-FG50 (15),
de 0,2 µm de tamaño de poro, para la esterilización del aire que llega al cultivo.
8.1. Desarrollo del proceso de fermentación
En primer lugar se realiza una concentración de los hidrolizados en un rotavapor,
Resona Technics Mod. Labo-rota C-311, para aumentar el contenido en azúcares
fermentables. La temperatura no debe sobrepasar los 50ºC durante este proceso,
ya que se corre el riesgo de degradar los azúcares.
Seguidamente, se ajusta el pH de los hidrolizados al pH inicial del cultivo co-
rrespondiente. Por tanto, se toman los 500 cm3 necesarios para cada biorreactor
y se ajusta el pH en cada uno de ellos a un valor de 5, 5,5 o 6,5 empleando para
tal efecto NaOH 0,1 N y un pHmetro, Crison Mod. GLP 22.
Por último, se adicionan a los hidrolizados los nutrientes necesarios para la
conservación y crecimiento de la levadura. El medio de cultivo utilizado en los
reactores es el medio formulado por Lindegren y col. (1958) constituido por, ade-
más de los azúcares presentes en el hidrolizado, los siguientes componentes:
Extracto de levadura 4,00 kg m-3
Peptona 3,60 kg m-3
(NH4)2SO4 3,00 kg m-3
MgSO4.7H2O 2,05 kg m-3
KH2PO4 2,00 kg m-3
65
Los reactores, portafiltros (con filtros de acetato de celulosa, de porosidad 0,45
y 0,80 µm, y prefiltros) y restante material se esterilizan en un autoclave, Raypa
Mod. AE-110, durante 30 minutos a una sobrepresión de 117,7 kPa.
Con ayuda de una bomba peristáltica y a través de los filtros esterilizados, se
transfiere los hidrolizados a los reactores (ver Fig. 17) y se adiciona el volumen
de inóculo líquido necesario para que la concentración inicial de levadura en cada
reactor sea de 0,025 kg m-3. En este momento se toma el origen de tiempos.
En el transcurso del experimento se van tomando muestras de 6 cm3 de los re-
actores de cultivo empleando una jeringa estéril. De este volumen, 1 cm3 se uti-
liza para la determinación del pH con un pHmetro Crison Mod. GPL 22. Si el
valor del pH no es el correcto, se ajustará con HCl o NaOH 0,1 N. Los otros 5
cm3 restantes se utilizarán para la medida del crecimiento celular y, una vez cen-
trifugados y desechado el sólido, se conservan las muestras en el congelador para
determinaciones posteriores de sustratos y bioproductos. Los azúcares reducto-
res totales se han cuantificado siguiendo el método propuesto por Miller (1959).
Las concentraciones de D-glucosa residual, etanol, xilitol y ácido acético han sido
determinadas siguiendo los métodos enzimáticos propuestos por Trinder (1969),
Beutler y Michal (1977), Beutler y Becker (1977) y Bergmeyer y Möllering (1974),
respectivamente.
8.2. Formación de biomasa
Las concentraciones obtenidas son superiores a las alcanzadas en un trabajo pre-
vio con mezclas sintéticas de D-glucosa y D-xilosa (Sánchez y col., 2008). Este
aumento en la producción de biomasa puede ser debido a que, como se ha de-
mostrado en trabajos recientes (Yan y col., 2005; Weng y col., 2006), C. tropi-
calis metaboliza fenol y derivados fenólicos produciendo biomasa. Al haberse hi-
drolizado una parte de la lignina en la autohidrólisis, los grupos fenólicos generados
podrían haber servido de sustrato para la levadura, en lugar de actuar como inhi-
bidores microbianos, como tradicionalmente se ha observado en otras levaduras.
Se detecta una fase de crecimiento exponencial caracterizada por el parámetro
µm (velocidad específica máxima de crecimiento) seguida de una fase lineal de des-
aceleración del crecimiento, cuantificada mediante el parámetro b (productividad
 66 67

volumétrica en biomasa). Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 8. Este pe-
riodo de crecimiento lineal post-exponencial ha sido detectado por otros autores en
otras levaduras (Detroy y col., 1982; Jeffries, 1982; Slininger y col., 1987; Sánchez
y col., 2002a) y es característico de procesos controlados por etapas de naturaleza
física. En este caso particular el control cinético del bioproceso reside en la trans-
ferencia de oxígeno molecular en el interior de la suspensión de células.
se parte de bajas concentraciones de inóculo) para a continuación descender brus-
camente hasta que se encuentra muy agotado, momento en que se vuelve a ob-
servar un consumo lento. Este comportamiento determina que normalmente sea
difícil ajustar todo el intervalo de tiempo mediante ecuaciones simples. En nues-
tro caso, para aplicar el método diferencial de tratamiento de datos cinéticos y
evaluar la velocidad específica de consumo de sustrato, qs , se ha utilizado una
D

ecuación propuesta en un trabajo previo (Sánchez y col., 2008) y con la que se

Tabla 8 obtiene una aceptable reproducibilidad de los datos (s vs t)
µm)
VELOCIDADES ESPECÍFICAS MÁXIMAS DE CRECIMIENTO (µ
s β t ln α
Y PRODUCTIVIDADES EN BIOMASA (b) [12] qs =
β-1

x
D

Q, v/v/min pH µm, h-1 r2 bx10, kg m-3 h-1 r2 donde s y x son la concentración de sustrato (azúcares) y la biomasa producida a
0,50 5,0 0,033 0,999 0,710 0,948 un tiempo t, y α y β parámetros adimensionales calculados según el método des-
0,25 5,0 0,041 0,984 0,585 0,991 crito por Sánchez y col. (2008).
0,00 5,0 0,036 0,985 0,584 0,999 En todos los experimentos se ha confirmado la presencia de las dos zonas de
0,00 5,5 0,041 0,994 0,122 0,984 consumo de sustrato, una correspondiente principalmente a D-glucosa y otras he-
0,00 6,5 0,027 0,962 0,021 0,952 xosas, y la segunda a D-xilosa y resto de azúcares (principalmente pentosas) que
se puedan ir generando por hidrólisis de las cadenas de oligosacáridos. Estas ve-
Los valores de velocidades específicas máximas de crecimiento son inferio- locidades disminuyen a lo largo del transcurso de los procesos de fermentación.
res a los obtenidos con mezclas sintéticas de D-glucosa y D-xilosa en un trabajo El rendimiento instantáneo en biomasa, Yx/s, puede definirse como el cociente
previo (Sánchez y col., 2008), los cuales oscilan entre 0,29 y 0,57 h-1, y a los ob- entre la biomasa neta producida (x-x0) y el sustrato neto consumido (s0-s) en un
tenidos por Yan y col. (2005) usando como sustrato fenol puro, quienes alcanza- instante dado del cultivo, por lo que se podrá expresar en la forma,
ron valores de hasta 0,48 h-1. Este hecho es un indicador de la fuerte inhibición a
la que están sometidos los cultivos debido a los productos de degradación pro- [13] d (x-x0)
Yx/s = ———
cedentes del proceso de hidrólisis, ya que la fase exponencial tiene una duración d (s0-s)
considerablemente prolongada. Con respecto a las productividades volumétricas
en biomasa, los valores son similares a los registrados en las fermentaciones de donde s0 y x0 son las concentraciones de sustrato y biomasa al principio del ex-
azúcares sintéticos. perimento de fermentación. Si este rendimiento permanece constante a lo largo
del experimento una representación de los valores de (x-x0) a distintos tiempos
frente a (s0-s) debería conducir a una recta de pendiente Yx/s y de ordenada en el
8.3. Consumo de sustrato y formación de bioetanol origen nula. Aunque no sea nula, el rendimiento obtenido mediante la pendiente
En numerosas fermentaciones discontinuas se observa que la concentración de correspondería a todo el experimento y, para distinguirlo del instantáneo, se po-
sustrato disminuye lentamente en las primeras horas del cultivo (sobre todo cuando dría denominar rendimiento medio o global, Yx/s. Al igual que para las veloci-
G
 68 69

dades de consumo de sustrato, se observa también la presencia de 2 zonas linea- pendiente Yxi/s y de ordenada en el origen nula. Si esto sucede este rendimiento
les diferentes. Una corresponde al consumo casi exclusivo de D-glucosa y resto constante corresponderá al global y se simboliza como Yxi/s. G

de hexosas, y permite el cálculo del rendimiento global en biomasa referido a di- Asimismo, el rendimiento instantáneo en etanol, Ye/s, se puede definir como,
chas hexosas. La segunda zona corresponde al consumo de D-xilosa y D-arabi-
nosa (y otros azúcares, incluido D-glucosa, que se vayan generando por hidróli- [15] d (e-e0)
Yx/s = ———
sis de los oligosacáridos presentes en el medio de cultivo), y hace posible el cálculo d (s0-s)
del rendimiento global en biomasa en relación a las pentosas.
Los rendimientos en biomasa siguen el comportamiento esperado, como mues- donde e0 y e son las concentraciones de etanol inicial y a un tiempo determinado,
tra la Tabla 9. Lógicamente, un incremento en el caudal de aire introducido en el respectivamente. Si el rendimiento permanece constante a lo largo del experi-
medio de cultivo determina una mayor formación de biomasa a partir de D-glu- mento representará un rendimiento global que se simbolizará como Ye/s. La Fig. G

cosa. A valores de pH más elevados parece que el crecimiento de este microor- 18 muestra la representación gráfica de xi y e frente a s0-s para uno de los expe-
ganismo se encuentra menos favorecido. rimentos de la serie. Lógicamente, no se consideran las concentraciones inicia-
les de xilitol y de etanol (xi0 y e0) puesto que a t = 0 h ⇒ xi0 = 0 y e0 = 0.
Tabla 9
RENDIMIENTOS GLOBALES EN BIOMASA (Yx/s), G

ETANOL (Ye/s) Y XILITOL (Yxi/s) G

Q, v/v/min pH Yx/s (hexosas), kg kg-1

G
Yx/s (pentosas), kg kg-1
G
Ye/s, kg kg-1 Yxi/s, kg kg-1
G

0,50 5,0 0,96 0,40 0,16 0,086

0,25 5,0 0,44 - 0,15 0,011
0,00 5,0 0,25 0,38 0,44 0,13
0,00 5,5 0,13 0,36 0,23 0,030
0,00 6,5 0,082 0,11 0,22 0,018

De forma similar al rendimiento en biomasa, se pueden definir los rendimientos

en los principales bioproductos. El rendimiento instantáneo en xilitol se define por
Fig. 18. Rendimientos en xilitol (•) y etanol (•) para el experimento de fermentación
llevado a cabo pH = 5,0 y Q = 0 v/v/min sobre un hidrolizado a presión.

[14] d (xi-xi0)
Yxi/s = ————
d (s0-s) En el caso del etanol, no ha sido posible el cálculo de los rendimientos globa-
les en los procesos de fermentación llevados a cabo con mayores niveles de en-
donde xi0 y xi son las concentraciones de xilitol inicial y a un tiempo t, respecti- trada de aire (Q > 0 v/v/min) debido a las pérdidas de este bioproducto por eva-
vamente. Si este rendimiento permanece constante en el transcurso del cultivo, poración. Por tanto, se ha optado por calcular los rendimientos instantáneos
una representación de xi-xi0 frente a s0-s debería conducir a una línea recta de correspondientes al punto con mayor concentración de etanol, cuyos valores se
 70
muestran en la Tabla 9. Los rendimientos registrados tanto en etanol como en xi-
litol son superiores a los obtenidos por Moya y col. (2008) en la fermentación
con Pachysolen tannophilus ATCC 32691 de hidrolizados de residuo de poda de
olivo empleando los ácidos clorhídrico, sulfúrico y trifluoroacético.
Considerando solamente los rendimientos en bioproductos, las condiciones de
operación más favorables serían las correspondientes a las de un pH de 5 y un
nivel de aeración de 0 v/v/min (condiciones microaeróbicas), obteniéndose ren-
dimientos en etanol cercanos al máximo teórico (0,51 kg kg-1) y un rendimiento
aceptable en xilitol que puede mejorar el balance económico del bioproceso. Te-
niendo en cuenta el proceso global (hidrólisis a presión, concentración en rota-
vapor y fermentación con C. tropicalis), se obtendrían 7,4 g de bioetanol y 1,24
g de xilitol por cada 100 g de residuo de poda de olivo seco utilizado.
Finalmente, en relación a las concentraciones de ácido acético presentes en los
hidrolizados al principio de los experimentos, se ha observado que este sustrato
es consumido completamente por la levadura en los cultivos con caudales de aire
superiores a 0 v/v/min, debido quizás a la gran demanda de sustrato para la for-
mación de biomasa en estos niveles de entrada de aire.
71
9. CONCLUSIONES
A partir de lo expuesto en los capítulos precedentes se han establecido las si-
guientes conclusiones:
1. El residuo de poda de olivo es, ‘a priori’, una excelente materia prima para
la producción de bioetanol. La optimización de la vía bioquímica (hidróli-
sis y fermentación) y termoquímica (granulado para calderas de calefac-
ción) de aprovechamiento de este residuo podría conducir a un aprovecha-
miento integral de esta biomasa lignocelulósica, con las ventajas
medioambientales y económicas que conllevaría.
2. La hidrólisis a presión o autohidrólisis del residuo de poda de olivo en un
reactor discontinuo tipo tanque agitado a 200ºC, a pesar de conducir a
elevadas conversiones de hemicelulosa (XHEM = 81−97%) y altos rendi-
mientos en azúcares reductores totales (YART = 12−20%), produce un hi-
drolizado rico en oligosacáridos, pero pobre en sus monómeros constitu-
yentes (D-glucosa, D-xilosa). El parámetro más influyente en los
rendimientos es el factor de severidad descrito por Overend y Chornet
(1977). La autohidrólisis produce una solubilización de la celulosa en
torno al 30% y una ligera solubilización de la lignina, alcanzando una
conversión máxima del 9,5%.
3. La fermentación con Candida tropicalis de los hidrolizados obtenidos me-
diante autohidrólisis conduce a la formación de elevadas concentraciones
de biomasa, con valores próximos a 8,4 kg m-3. Este comportamiento se jus-
tifica considerando que C. tropicalis produce biomasa no sólo a partir de
los azúcares presentes en el hidrolizado, sino también de los compuestos fe-
nólicos procedentes de la degradación de la lignina. Los valores de µm son
muy inferiores a los obtenidos en la fermentación de mezclas sintéticas de
D-glucosa y D-xilosa con la misma levadura (Sánchez y col., 2008), osci-
lando entre 0,027 y 0,041 h-1. Este hecho es un indicador de la inhibición
detectada en los cultivos debida a los productos de degradación generados
72
en el proceso de autohidrólisis. Tanto las velocidades específicas máximas
de crecimiento (µm) como las productividades y rendimientos en biomasa
aumentan con el caudal de aire introducido en el biorreactor y disminuyen
cuando el pH se incrementa de 5,0 a 6,5.
4. Candida tropicalis consume secuencialmente los sustratos presentes en el
medio de cultivo. En primer lugar metaboliza D-glucosa y, cuando la con-
centración de esta hexosa en el cultivo es prácticamente nula, consume D-
xilosa (y el resto de azúcares). Las velocidades específicas de consumo de
ambos sustratos disminuyen durante el proceso de fermentación. La con-
versión de azúcares a etanol por C. tropicalis se aproxima al máximo teó-
rico, obteniéndose un rendimiento instantáneo en etanol de 0,44 kg etanol
kg-1 sustrato.
5. Considerando el proceso global de aprovechamiento de residuo de poda de
olivo descrito (hidrólisis a presión del residuo de poda de olivo y fermen-
tación de los hidrolizados resultantes), las condiciones de operación más fa-
vorables conducen a la formación de 9,34 cm3 de bioetanol y 1,24 g de xi-
litol por cada 100 g de residuo de poda de olivo seco utilizado. La eliminación
de una posible etapa de hidrólisis enzimática y la obtención de pequeñas
cantidades de xilitol como subproducto podrían convertir a esta vía bioquí-
mica de aprovechamiento del residuo de poda de olivo en un proceso in-
dustrial económicamente viable de obtención de bioetanol, quedando tras
la etapa de la hidrólisis un residuo rico en celulosa y lignina susceptible de
ser aprovechado vía termoquímica hacia la producción de ‘pellets’ para ca-
lefacción.
73
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APÉNDICE: MÉTODOS GRAVIMÉTRICOS DE

DETERMINACIÓN DE FIBRAS

Humedad y materia volátil (HMV)

Para la determinación de la humedad y materia volátil presentes en el residuo
se sigue la norma TAPPI T 11 m-59.
La humedad del residuo se calcula a partir de la pérdida de peso experimen-
tada por el sistema cuando se somete a una temperatura de 105 ± 1ºC, durante un
tiempo suficiente para alcanzar pesada constante.
El residuo, previamente acondicionado, se deja en contacto con el ambiente
para que alcance la humedad de equilibrio. Se pesa una muestra de aproximada-
mente 1 g (m0) utilizando una balanza de precisión. La muestra se seca en estufa
a 105 ± 1ºC hasta pesada constante (mf). Se determina finalmente el contenido
en humedad en %, mediante la expresión:

m0 - mf
HMV(%) = ———
m0 100

Cenizas (CEN)
Se ha seguido la norma TAPPI T 15 os-58.
Por cenizas se entiende el residuo que queda tras someter la muestra a una tem-
peratura de 575 ± 25ºC durante el tiempo necesario para incinerar el sistema car-
bonoso; este tiempo es del orden de unas tres horas, aunque se puede modificar
para garantizar que el residuo resultante tenga color blanco. Las cenizas consti-
tuyen una medida del contenido en sales minerales de la muestra.
En crisoles de porcelana, previamente tarados, se pesa alrededor de 1 g (m0)
de residuo completamente seco (o de humedad conocida) y se calienta en un
horno de mufla a una temperatura de 575ºC durante 3 h. Con este tiempo se ga-
rantiza una calcinación completa del residuo. Posteriormente, se deja enfriar y
se pesa (mf).
mf
CEN(%) = ——— m0 100
 86
Fibra neutro detergente (FND)
Se sigue el método propuesto por Van Soest y Wine (1967).
La FND es el resto insoluble, correspondiente a lignina, celulosa y hemicelu-
losa, que se obtiene tras someter una muestra a ebullición lenta con disolución
neutro detergente. La fracción soluble está constituida por sustancias fácilmente
asimilables como azúcares sencillos y otras materias solubles en agua.
Se pesa una muestra de 1 g y se le añaden 100 cm3 de disolución neutro de-
tergente, 0,5 g de sulfito sódico anhidro y algunas gotas de 1-pentanol, que actúa
como antiespumante, y se somete a ebullición durante 1 h en un matraz de fondo
esférico de 500 cm3. A continuación, se filtra a vacío a través de una placa po-
rosa, previamente tarada, se lava varias veces con agua destilada caliente y des-
pués con acetona, y se seca en estufa a 105 ± 1ºC hasta pesada constante.
La disolución neutro detergente se prepara disolviendo 37,2 g de Na2(EDTA)
y 16,2 g de Na2B4O7.10H2O en agua ultrapura calentado suavemente. Se añaden
entonces 60 g de lauril sulfato sódico y 20 cm3 de etilenglicol. Aparte se disuel-
ven 12,9 g de fosfato monoácido de sodio que se unen a la primera disolución en-
rasando a un volumen final de 2 dm3 con agua ultrapura.
La fibra neutro detergente (FND) se puede calcular mediante la siguiente ex-
presión:
mi
FND(%) = ——— m0 100
donde:
mi: masa de la fracción insoluble, en g.
m0: masa de la muestra seca, en g.
Fibra ácido detergente (FAD)
Se sigue también el método propuesto por Van Soest y Wine (1967).
La FAD es la parte insoluble, formada fundamentalmente por lignina y celu-
losa, obtenida tras someter la muestra a una ebullición lenta con una disolución
ácido detergente. La fracción soluble corresponde al contenido celular y a las he-
micelulosa, ya que son sustancias fácilmente despolimerizables por este disol-
vente.
87
La disolución ácido detergente se prepara disolviendo 20 g de bromuro de N-
cetil-N,N,N-trimetil amonio con ácido sulfúrico 1 N, enrasando a 1 dm3.
Se pesa 1 g de residuo y se le añaden 100 cm3 de disolución ácido detergente
y algunas gotas de 1-pentanol, que actúa como antiespumante, y se somete a ebu-
llición durante 1 h en un matraz de fondo esférico de 500 cm3. A continuación,
se filtra a vacío a través de una placa porosa, previamente tarada, se lava varias
veces con agua destilada caliente y después con acetona, y se seca en estufa a 105
± 1ºC hasta pesada constante.
La fibra ácido detergente (FAD) se puede calcular mediante la siguiente ex-
presión:
mi
FAD(%) = ——— m0 100
donde:
mi: masa de la fracción insoluble, en g.
m0: masa de la muestra seca, en g.
La determinación de la FAD es importante pues permite calcular la hemice-
lulosa presente en el material mediante:
% HEM = % FND - % FAD
Celulosa (CEL)
Se sigue también el método propuesto por Van Soest y Wine (1967).
Según este método, la celulosa es el residuo pastoso de color blanco que se
obtiene tras el ataque con permanganato potásico a la fibra ácido detergente.
Se llena la placa porosa que contiene la fibra ácida detergente obtenida en el
epígrafe anterior con 25 cm3 de disolución mixta y se mantiene en contacto, agi-
tando de vez en cuando con una varilla, durante 1,5 h. Durante este periodo, si el
color de la disolución vira de de violeta a marrón (lo cual implica que la disolu-
ción está saturada), se filtra y se añade disolución mixta fresca. Transcurrido este
tiempo se filtra la placa a vacío y se lava el residuo con disolución desminerali-
zante hasta que las fibras queden de color blanco. Entonces se lava 2 veces más
con etanol del 80%, se aclara 2 veces con un poco de acetona, y se seca en estufa
a 105 ± 1ºC hasta pesada constante.
 88
Las disoluciones utilizadas en este método se preparan de la siguiente manera:
– Permanganato potásico saturado: Se disuelven 50 g de KMnO4 en 1 dm3 de
agua destilada.
– Disolución tampón: Se disuelven 6 g de Fe(NO3).9H2O y 0,15 g de AgNO3
en 100 cm3 de agua destilada. Una vez disueltos, se mezclan con 500 cm3 de
ácido acético puro y 5 g de CH3COOK y se añaden 400 cm3 de ter-butanol.
– Disolución mixta: Se añaden 2 volúmenes de permanganato potásico satu-
rado a 1 volumen de disolución tampón.
– Disolución desmineralizante: Se disuelven 50 g de HOOC-COOH.2H2O en
700 cm3 de etanol del 96% y se adicionan 50 cm3 de HCl del 35% y 250 cm3
de agua destilada.
La cantidad de celulosa presente en el residuo se puede calcular mediante la
expresión:
mi
CEL(%) = ——— m0 100
donde:
mi: masa de la fracción insoluble, en g.
m0: masa de la muestra seca antes de aplicarle la disolución ácido detergente,
en g.
Si se ha determinado la lignina mediante el método descrito a continuación,
la celulosa presente en el residuo se puede calcular por diferencia entre la fibra
ácido detergente y la lignina:
% CEL = % FAD - % LIG
Lignina (LIG)
La lignina es una resina aromática amorfa que contiene grupos metoxi e hidroxi.
Esta determinación se lleva a cabo aplicándose la norma TAPPI T 222 os-74,
según la cual la lignina se define como el constituyente de la madera insoluble
en H2SO4 del 72%. El procedimiento operatorio es el siguiente:
89
Se pesa una muestra de aproximadamente 1 g de residuo, se lleva a un vaso
de precipitado de 100 cm3 de capacidad y se adicionan 15 cm3 de H2SO4 del 72%.
Durante la dispersión del material se mantiene el vaso, cubierto con ‘Parafilm’,
a 20ºC durante un tiempo de 2 h agitando frecuentemente. Transcurrido este tiempo
se vierte en un matraz de 1 dm3 donde se adiciona agua ultrapura hasta llegar a
un volumen de 575 cm3. A continuación se hierve la disolución durante 4 h man-
teniendo constante el volumen mediante un condensador de reflujo. Se deja que
el material insoluble (lignina) se deposite y se filtra a través de una placa filtrante
provista de una mata de lana de vidrio, puesto que la lignina suele formar dis-
persiones coloidales que obstruyen los poros de la placa, lavándola con agua des-
tilada caliente. Por último se seca la lignina, junto con la placa, en una estufa a
105 ± 1ºC hasta pesada constante.
La cantidad de lignina presente en el residuo se puede calcular mediante la ex-
presión:
mi
LIG(%) = ——— m0 100
donde:
mi: masa de la fracción insoluble, en g.
m0: masa de la muestra seca, en g.
Si se ha determinado la celulosa según el método descrito en el epígrafe ante-
rior, la lignina presente en el residuo se puede calcular por diferencia entre la fibra
ácido detergente y la celulosa:
% LIG = % FAD - % CEL
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