(1) Biologia molecular

For example, Salmonella enterica serotype Typhi (29), Helicobacter pylori (5), Neisseria gonorhoeae (28),
and Haemophilus influenzae (22) are pathogens with specificities for human or primate hosts, while
Rhizobium leguminosarum forms mutualistic nodules only with Phaseolae legumes (30). La base
molecular que subyace a la especificidad del rango de hospedantes se comprende bien en el mutualismo
entre las Rhizobiaceae y sus plantas hospedantes: la especificidad se logra mediante la interacción entre
factores de señalización y receptores bacterianos y vegetales (15). Aunque se ha propuesto una miríada
de rasgos para contribuir a la especificidad del rango de hospedantes (16, 21, 36), no se ha demostrado
directamente que ninguno de ellos desempeñe un papel en la determinación del rango de hospedantes
del animal.

Los nematodos parásitos de insectos del género Steinernema se asocian mutualistamente con bacterias
del género Xenorhabdus. Esta asociación es un modelo natural y manejable para comprender la
ecología, la evolución y los fundamentos moleculares de las interacciones bacterianas con huéspedes
animales. La etapa infectiva que habita en el suelo de un nematodo Steinernema es colonizada por
bacterias simbióticas Xenorhabdus, que transporta y libera en un insecto huésped. La bacteria
Xenorhabdus proporciona actividades que suprimen la inmunidad de los insectos, matan al insecto y
degradan enzimáticamente el cadáver para apoyar la reproducción del nematodo. Cuando el cadáver
del insecto se agota, la bacteria Xenorhabdus coloniza la progenie de nematodos Steinernema, que
emergen del cadáver del insecto gastado para cazar nuevas presas de insectos (14).

(2) CITA: Control biológico: Los nematodos entomopatógenos se caracterizan por

relaciones mutualistas con bacterias simbióticas. Los nematodos brindan protección y transporte a sus
simbiontes bacterianos. Los simbiontes bacterianos contribuyen a la relación mutualista matando a los
insectos huéspedes, estableciendo y manteniendo condiciones adecuadas para la reproducción de los
nematodos y proporcionando nutrientes y sustancias antimicrobianas que inhiben el crecimiento de una
amplia gama de microorganismos. La interacción entre nematodos entomopatógenos, bacterias
simbióticas e insectos huéspedes puede ser una de las principales fuerzas que impulsan la diversificación
y especialización de estos organismos. La comprensión de estas interacciones multitróficas entre los
nematodos, sus bacterias simbióticas y los insectos huéspedes es de fundamental importancia para la
infectividad, la reproducción masiva y el registro de los nematodos como agentes de control biológico.

MEJORA GENÉTICA

En la última década, los nematodos entomopatógenos se han establecido como un importante agente
de control biológico entre los productos disponibles comercialmente. Sin embargo, los mercados de
nematodos entomopatógenos son relativamente pequeños y las plagas objetivo tienen una importancia
limitada (40). La mejora genética de los nematodos se ha basado en la reproducción selectiva, la
mutación o ingeniería genética (43). La biología molecular ha proporcionado conocimientos
fundamentales y protocolos técnicos para el mejoramiento de nematodos entomopatógenos mediante
ingeniería genética (41). Se han encontrado marcadores moleculares para estudiar la expresión génica.
Se han identificado varios genes que codifican rasgos útiles y se han desarrollado métodos de
transformación eficientes. Aunque muchos países tienen regulaciones sobre la liberación de organismos
modificados genéticamente, la estrategia para recibir la aprobación de la liberación puede incluir inducir
un gen comercial en lugar de ecológico en los nematodos y sobreexpresar un gen existente en lugar de
introducir uno extraño.

Los enfoques de biología molecular y reconstrucción filogenética ayudarán en el desarrollo de futuros

estudios sobre conceptos de especie y estructura de población, así como mejores estrategias para su
uso como agentes de control biológico contra plagas de insectos. De los enfoques moleculares
disponibles, la secuenciación del ADN proporciona los datos más prolíficos y confiables para estudiar la
estructura, la identificación y la reconstrucción filogenética de la población. Debido a que la información
filogenética contenida en diferentes genes puede variar, los métodos de análisis deben adaptarse
cuidadosamente al nivel taxonómico particular o la pregunta que se investiga.

Los nematodos entomopatógenos son uno de los agentes biológicos más importantes para las plagas de
insectos. Sin embargo, el control de insectos plaga con nematodos entomopatógenos no ha logrado su
misión de reducir de manera significativa el uso de plaguicidas químicos. La biología molecular
contribuyó significativamente a dilucidar la estructura genética de la población y la identificación de
aislados y especies y de nematodos entomopatógenos. La reconstrucción filogenética desempeñó un
papel importante en la iluminación de la sistemática, la coespeciación y la coadaptación de los
nematodos entomopatógenos y sus bacterias simbióticas.

La identificación precisa y la información sistemática son fundamentales para la implementación

racional cuando se utilizan nematodos entomopatógenos como agentes de control biológico. La
ingeniería genética basada en las técnicas de la biología molecular y la genética se ha mostrado
prometedora para la mejora racional de los nematodos entomopatógenos para superar las limitaciones
relacionadas con la eficacia, la estabilidad y la economía inadecuadas para realizar todo su potencial de
control de plagas. Hay muchas razones para creer que el uso de nematodos entomopatógenos para el
control de plagas de insectos aumentará sustancialmente en el futuro cercano.

(3)Early colonization:
El ciclo de vida natural de los nematodos S. carpocapsae incluye etapas reproductivas que ocurren
exclusivamente dentro de los insectos en etapa larvaria y que no son colonizados por X. nematophila y
también incluye una etapa no reproductiva, que no se alimenta y que habita en el suelo conocida como
el juvenil infectivo (IJ ), que está colonizado, en una ubicación intestinal discreta denominada vesícula,
por un monocultivo de la bacteria X. nematophila
Los IJ colonizados existen en el suelo hasta que invaden un huésped insecto susceptible, buscando el
sistema sanguíneo o la hemolinfa. Una vez allí, los IJ liberan sus simbiontes X. nematophila mediante la
defecación. En este punto de sus ciclos de vida, las bacterias y los nematodos existen por separado
aunque muy cerca unos de otros. La bacteria X. nematophila liberada contribuye a la muerte del insecto
huésped y crece hasta alcanzar una alta densidad en el cadáver resultante. Estas bacterias específicas
son esenciales para el crecimiento y desarrollo de los nemátodos, presumiblemente tanto sirviendo
como fuente directa de alimento como suministrando nutrientes a través de la degradación del cadáver
del insecto.

Cuando el número de nematodos aumenta y los nutrientes se vuelven limitantes en el cadáver del
insecto, la progenie del nematodo S. carpocapsae se vuelve a asociar con la bacteria X. nematophila y se
diferencia en la forma IJ colonizada que no se alimenta y emerge en el suelo para buscar un nuevo
huésped (23). La formación de IJ y la colonización concomitante con X. nematophila es un modelo del
proceso mediante el cual se desarrolla una asociación específica e íntima entre un microbio y un
huésped eucariótico en una relación benigna (9, 27). Una comprensión más profunda de las
interacciones X. nematophila-nematodo proporcionará información sobre los mecanismos generales
que median en el desarrollo y mantenimiento de las interacciones microbio-huésped benignas y
también permitirá una comparación de las interacciones benignas con aquellas que son patógenas (27).

Elegimos caracterizar las primeras etapas de la colonización de nematodos por X. nematophila para
comprender mejor el proceso mediante el cual se inicia y mantiene esta interacción mutualista. Una
característica de la etapa IJ del nematodo, que se desarrolla dentro del cadáver gastado del insecto
antes de emerger al suelo, es su boca y ano sellados (18). Por lo tanto, el IJ no ingiere recursos ni excreta
desechos intestinales durante su existencia fuera de un insecto y debe ser colonizado por X.
nematophila antes de desarrollarse en esta etapa. Hasta ahora, no se han informado experimentos que
exploren el inicio de la colonización por X. nematophila del nematodo pre-IJ.

Consideramos dos modelos posibles para explicar cómo los IJ maduros (es decir, aquellos que han
surgido de un insecto huésped) obtienen un complemento completo de bacterias colonizadoras (13, 19).
En el modelo más simple, postulamos que un JI en desarrollo ingiere una gran cantidad de bacterias de
su entorno antes de dejar de alimentarse y que estas bacterias, en lugar de ser digeridas, se retienen en
la vesícula intestinal. Un modelo más complejo supone que un nematodo pre-IJ retiene solo una o unas
pocas bacterias de manera selectiva y, después de que el IJ deja de ingerir bacterias externas, estas
pocas bacterias crecen hasta alcanzar la densidad total que se encuentra en un IJ maduro.

Para probar estos modelos, realizamos experimentos utilizando una técnica de cultivo in vitro en la que
se cultivan nematodos S. carpocapsae en un césped de bacterias X. nematophila (31). Esta técnica
permite el seguimiento de los nematodos a lo largo de su ciclo de vida reproductivo, y los IJ de la
progenie que emergen de estos céspedes se colonizan a niveles comparables a los de los IJ producidos a
partir de la infección por insectos (13). Además de esta técnica, desarrollamos y/o implementamos
varias herramientas nuevas que facilitaron el examen de etapas tempranas en la asociación entre
nematodos y bacterias. Presentamos datos que documentan el proceso por el cual los nematodos
alcanzan el estado totalmente colonizado, diferenciando entre la colonización hipotética
modelos descritos anteriormente, y proporcionan información sobre los mecanismos que median los
eventos de colonización temprana.

Resultados_ El crecimiento bacteriano ocurre en la vesícula de los IJ en maduración. La observación de

que los IJ inmaduros contienen pocas bacterias, a pesar de que sus bocas y anos ya están sellados, indica
que la vesícula completamente colonizada típica de un IJ maduro resulta del crecimiento bacteriano
dentro de la vesícula intestinal. Para monitorear este proceso, se cultivó una población de nematodos
en HGB340 hasta que comenzaron a formarse IJ inmaduros y se eliminaron de X. nematophila exógena
mediante enjuague con grandes volúmenes de agua destilada (ver Materiales y Métodos).

Estos nematodos se observaron intermitentemente mediante microscopía de fluorescencia durante 138

h después del aislamiento. Los IJ individuales en esta población de nematodos se distinguieron por
características morfológicas específicas de IJ (20) y se calificaron de acuerdo con la cantidad de bacterias
fluorescentes verdes que cada una parecía contener (Fig. 2). Los IJ se calificaron como pertenecientes a
uno de tres grupos: (i) aquellos que no contenían bacterias fluorescentes observables, (ii) aquellos en los
que la vesícula estaba oligocolonizada (Fig. 1B y C), y (iii) aquellos con vesículas llenas o casi llenas
(aproximadamente un tercio o más completamente colonizados) (Fig. 1A). Los porcentajes de IJ
oligocolonizados y aquellos sin bacterias observables disminuyeron con el tiempo, mientras que el
número de IJ casi total o totalmente colonizados aumentó con el tiempo. En cada momento de
observación, se cuantificó el número promedio de UFC por IJ (ver Materiales y métodos) y se encontró
que aumentaba con el tiempo, lo que se correlacionó con el aumento en el número de IJ con vesículas
fluorescentes brillantes. Además, los IJ oligocolonizados no se observan en poblaciones de IJ maduros
(es decir, 150 h después del aislamiento), lo que sugiere que la tendencia hacia una mayor colonización
no es reversible (datos no mostrados)

Trabajos previos de muchos laboratorios han establecido que la etapa IJ de los nematodos
Steinernematid está específicamente colonizada por una sola especie de bacteria Xenorhabdus (2, 11; C.
E. Cowles y H. Goodrich-Blair, datos no publicados) y que esta colonización se limita a la vesícula
intestinal (6, 21, 22). Sin embargo, hasta que se realizó el presente estudio, no se había informado sobre
un examen de los primeros eventos en el proceso de colonización.

Nuestros resultados nos han permitido diferenciar entre los dos modelos de colonización hipotéticos
que hemos propuesto y demostrar la existencia de dos etapas tempranas no descritas previamente en la
asociación entre S. carpocapsae y X. nematophila. El primero es un evento de iniciación competitiva que
típicamente resulta en la colonización por una población monoclonal u oligoclonal de X. nematophila.
Esta etapa se demostró mediante dos experimentos en los que las cepas de tipo salvaje marcadas
diferencialmente competían por la colonización (Fig. 4). La observación de que las poblaciones de X.
nematophila son frecuentemente de origen oligoclonal se corresponde con la observación directa de
que al principio del proceso de colonización se pueden ver muy pocas bacterias marcadas con GFP
ocupando la vesícula (Fig. 1) y apoya la hipótesis de que un pequeño número de X. nematophila las
bacterias inician la colonización de vesículas y posteriormente crecen dentro del huésped. La segunda
etapa de colonización temprana que hemos identificado en este trabajo es una fase de crecimiento
durante la cual las bacterias se reproducen dentro del intestino de un IJ y finalmente alcanzan su
máxima densidad de población. La evidencia de esta etapa incluye el hecho de que

los IJ inmaduros derivados de céspedes de bacterias fluorescentes X. nematophila contienen

notablemente menos bacterias fluorescentes (Fig. 1B a D) que los IJ que se han dejado madurar (Fig. 1A)

La segunda línea de evidencia para una etapa de crecimiento proviene del hecho de que una población
pura de IJ que no se alimentan exhibe un aumento cuantitativo en el número promedio de UFC por IJ a
lo largo del tiempo (Fig. 2 y 3) y que este aumento en el número bacteriano puede ser localizado
microscópicamente en la vesícula intestinal (Fig. 2)

Dado que la única fuente de bacterias dentro de la población IJ es la que se encuentra dentro de la
vesícula intestinal, este aumento en el recuento de células bacterianas a lo largo del tiempo debe
resultar del crecimiento de las bacterias colonizadoras iniciales dentro de la vesícula. Una característica
reproducible de los patrones de crecimiento in vivo observados para X. nematophila son las oleadas
repetidas de aumento y disminución de la población. Esta observación demuestra la naturaleza dinámica
de la población de X. nematophila dentro del IJ que no se alimenta y sugiere que el nematodo puede
estar controlando la población bacteriana de alguna manera (ver más abajo).

La aclaración de los procesos a través de los cuales los nematodos no colonizados se vuelven
persistentemente colonizados por X. nematophila proporcionará una base útil para proponer y probar
hipótesis sobre los mecanismos moleculares que median en las interacciones bacteria-nematodo. Por
ejemplo, los ensayos de competencia de colonización (Fig. 4 y 5) y la capacidad de marcar cepas
mutantes de X. nematophila con proteínas autofluorescentes descritas en este informe pueden ayudar a
revelar las etapas precisas de colonización que están bloqueadas en mutantes de colonización descritos
recientemente. (13, 27). Además, nuestro trabajo proporciona información sobre los primeros eventos
en el desarrollo de la etapa IJ colonizada que será útil en la producción masiva y la aplicación de campo
de nematodos para el control biológico.

Este hallazgo suscita las siguientes preguntas: ¿cómo se limita el inicio de la colonización a unas pocas
bacterias y qué mecanismos explican su eficiencia? Una posibilidad es que exista un contacto físico
específico entre la bacteria y el nematodo, tal como una interacción mediada por un receptor adhesivo,
que esté anatómicamente restringida a la región en la que tiene lugar la iniciación. Si existe una
interacción física esencial entre la bacteria y el nematodo, entonces predecimos que la colonización
podría ser inhibida por la presencia de bacterias competidoras que sean capaces de unirse a la región de
iniciación y quizás también por la presencia de moléculas pequeñas, proteína pura o anticuerpos que
interferir con la interacción inicial

(4)Genes para la colonización

Las relaciones estables entre los microbios y los huéspedes son omnipresentes, a menudo
específicas y, por lo general, esenciales para uno o todos los socios (McFall-Ngai, 1998). Un
enfoque para comprender los componentes moleculares que median en las relaciones estables
es estudiar sistemas tratables experimentalmente en los que un solo microbio se asocia
específicamente con una planta o un animal huésped (McFall-Ngai, 1998), como la simbiosis
mutuamente beneficiosa entre la bacteria Gram-negativa Xenorhabdus nematophila (antes X.
nematophilus; Euzéby y Boemare, 2000) y el nematodo entomopatógeno Steinernema
carpocapsae (Vivas y Goodrich-Blair, 2001). Juntos, estos dos organismos pueden infectar,
matar y reproducirse dentro de la etapa larval de muchos tipos de insectos (Poinar, 1979). La
relación mutualista se basa en el hecho de que X. nematophila es necesaria tanto para la
destrucción del insecto huésped como para el desarrollo del nematodo dentro del huésped
(Poinar y Thomas, 1967; Boemare et al., 1983), mientras que el nematodo es necesario como
vector para traer X. nematophila en un insecto (Poinar y Thomas, 1967) y posiblemente para
protección fuera del insecto (Poinar, 1979; Morgan et al., 1997).
La forma infectiva del nematodo que habita en el suelo, conocida como juvenil infectivo (IJ), no
se alimenta y lleva un monocultivo extracelular de la bacteria X. nematophila en una región
intestinal denominada vesícula (Bird y Akhurst, 1983). La bacteria X. nematophila parece tener
la capacidad máxima para ocupar este nicho; Las especies de Xenorhabdus distintas de X.
nematophila no pueden colonizar los intestinos de S. carpocapsae de manera eficiente. Se ha
informado que las bacterias Xenorhabdus no son necesarias para el desarrollo de la vesícula en
sus huéspedes nematodos (Bird y Akhurst, 1983). Sin embargo, todavía no se han examinado
posibles cambios sutiles en las células vesiculares del huésped, como los perfiles de la
estructura de la superficie, la densidad de las microvellosidades o el tamaño celular. Al infectar
las larvas de insectos, los nematodos S. carpocapsae IJ viajan al hemocele y liberan X.
nematophila, que mata al insecto. Dentro del cadáver del insecto, el nematodo lleva a cabo
varios ciclos de desarrollo vegetativo y reproducción hasta que emergen varias decenas de
miles de descendientes IJ, que llevan X. nematophila, para buscar nuevos huéspedes (Woodring
y Kaya, 1988). En el suelo, los IJ que no se alimentan son capaces de sobrevivir y mantener su
patogenicidad (es decir, bacterias viables) hasta por 16 semanas (Kung et al., 1990a), y la tasa
de disminución depende del tipo de suelo, pH, temperatura, el nivel de oxígeno, la humedad y
la abundancia de depredadores naturales (Ishibashi y Kondo, 1986; Kung et al., 1990a,b; 1991).

No se ha examinado el estado fisiológico de X. nematophila, ya que reside en el intestino de los

IJ, y nuestro trabajo está dirigido a una mejor comprensión de esto, así como a caracterizar la
base molecular de las interacciones del nematodo X. nematophila. Poco se ha publicado hasta
la fecha sobre las características moleculares que promueven la colonización de X. nematophila
y la supervivencia dentro de los nematodos S. carpocapsae. Se ha caracterizado el perfil de
expresión de abundantes proteínas de la membrana externa (OMP) de X. nematophila (Forst et
al., 1995; Tabatabai y Forst, 1995; Forst y Leisman, 1997), pero no se han informado funciones
para OMP específicas en la colonización de nematodos. Además, existe evidencia de que X.
nematophila produce una señal de detección de quórum difusible, posiblemente
hidroxibutanoil homoserina lactona, necesaria para la virulencia hacia los insectos (Dunphy et
al., 1997). Sin embargo, no se han identificado los genes necesarios para la producción y la
respuesta a la supuesta señal de detección de quórum, y no se han publicado experimentos que
prueben las posibles funciones de dicha señal en la asociación mutualista con el nematodo.
Recientemente, informamos que una inserción en el gen rpoS, que codifica un factor sigma de
"estrés", σs, evita que X. nematophila colonice los intestinos de los nematodos, pero no afecta
gravemente la resistencia al estrés de esta bacteria o su virulencia hacia los insectos (Vivas y
Goodrich-Blair, 2001). Estos resultados sugieren que un gen o genes dependientes de σs
pueden ser necesarios para la colonización, y la caracterización del regulón σs de X.
nematophila está en curso para identificar tales genes.
Para obtener más información sobre los mecanismos moleculares de las interacciones X.
nematophila-nematodo, y para revelar posibles mecanismos de comunicación entre ellos,
examinamos mutantes bacterianos para detectar la pérdida de la capacidad de asociarse con la
vesícula del nematodo. En la naturaleza, los nematodos S. carpocapsae dependen de X.
nematophila para reproducirse dentro de las larvas de insectos muertos. La progenie de IJ que
no se alimenta, que lleva simbiontes de X. nematophila, emerge de los cadáveres gastados para
buscar nuevos huéspedes. Este proceso se puede imitar en el laboratorio en ausencia de
insectos cultivando nematodos en céspedes de la bacteria X. nematophila (Wouts, 1984).

HGB310 (nilA), HGB312 (nilB), HGB314 (nilC) y HGB315 (nilD) mostraron fenotipos de tipo
salvaje en todos los ensayos excepto por una disminución parcial en la actividad de hemolisina
para HGB310 (nilA). Por el contrario, se observaron múltiples fenotipos perturbados para
HGB317 (aroA), HGB316 (serC), HGB321 (lrp) y HGB322 (rpoE) (Tabla 3). Debido a los defectos
pleiotrópicos de estos mutantes, centramos el resto de nuestros estudios en los mutantes
nulos.
Nota: es decir de todos los genes que se anlizaron, solo nilA,B,C y D no ocasionaron cambios, se
les denomino de tipo salvaje. Son mas parecidos a la realidad, y que éstos debido a estos no se
pudo lograr la coloniacion de X nematophila al nematodo.

Además de su capacidad para colonizar los intestinos de los nematodos de forma mutualista, X.
nematophila es capaz de matar insectos en estado larvario cuando se administra directamente
en el sistema sanguíneo (Forst y Clarke, 2002). Las mutaciones que impiden que X. nematophila
colonice los intestinos de los nematodos también podrían afectar su virulencia hacia los
insectos. Por lo tanto, probamos la capacidad de los mutantes nulos para matar larvas de
Manduca sexta (gusano cornudo del tabaco) en etapa larvaria después de la inyección. El
porcentaje de mortalidad de insectos 24 o 72 h después de la inyección con cualquiera de los
mutantes nulos no difirió significativamente del de los insectos inyectados con el progenitor de
tipo salvaje, lo que indica que los mutantes nulos no son defectuosos en virulencia hacia las
larvas de insectos M. sexta (Tabla 4).
Los loci nilA, nilB y nilC están vinculados

La secuenciación del ADN que flanquea los insertos en nilA, nilB y nilC reveló que estos loci
están conectados en una región de 4 kb que hemos denominado SR1 (simbiosis región 1) (Fig.
1). Esta área genética contiene varias secuencias similares a transposasas y está flanqueada en
5′ por un homólogo truncado de E. coli argD, que codifica acetilornitina aminotransferasa, y en
3′ por un ORF (designado orfX) con similitud de secuencia con Clostridium thermocellum xynX,
que codifica xilanasa. SR1 se sometió a un análisis de contenido de GC de ventana deslizante (se
usaron ventanas de 50, 100 y 200 pb), que reveló contenidos de GC del 39 %, 29 % y 45 % de los
ORF nilA, nilB y nilC respectivamente (datos no mostrados). Un estudio de ≈50 kb de la
secuencia de X. nematophila reveló un contenido medio de GC del 44 % (K. Heungens y H.
Goodrich-Blair, resultados no publicados), lo que indica que nilB y, en menor medida, nilA son
ricos en AT y , en ese sentido, difieren del resto del genoma. nilA y nilB están orientados en
tándem y separados por 109 nucleótidos, lo que sugiere que pudieran ser co-transcritos.
Estudios de complementación y expresión de SR1

Para verificar que las alteraciones genéticas mediadas por transposones son responsables de la
pérdida de colonización, los mutantes SR1 se transformaron con plásmidos que portaban
fragmentos genómicos específicos de X. nematophila de tipo salvaje (para conocer las
ubicaciones esquemáticas de los subclones genómicos, consulte la Fig. 1). En ningún caso un
plásmido fue capaz de restaurar los niveles de colonización de tipo salvaje a un mutante. Las
posibles causas de la complementación incompleta podrían ser niveles inapropiados de
expresión génica nula de plásmidos multicopia, mantenimiento variable de plásmidos
multicopia durante el ensayo de colonización, creación de alelos negativos dominantes
mediante la inserción de transposones o la presencia de mutaciones secundarias
contribuyentes en cada mutante. Para solucionar el problema del plásmido multicopia, los
fragmentos también se subclonaron en un vector de pocas copias (dos o tres copias por célula)
(Keen et al., 1988) y se analizó su capacidad para complementar los defectos de colonización.
Otra vez,
en ningún caso un plásmido fue capaz de restaurar los niveles de colonización de tipo salvaje a
un mutante (datos no mostrados).

Discusión
Este artículo es el primer informe del uso del método STM (Hensel et al., 1995) en una simbiosis
mutualista. La pantalla resultó en la identificación de un conjunto de loci requeridos por X.
nematophila para colonizar la vesícula intestinal de su huésped nematodo. La proporción de
mutantes de colonización mutualista que observamos (0,5 %) fue menor que la proporción de
mutantes que STM descubrió que tenían una virulencia atenuada en otros sistemas, que suele
ser superior al 2 % y, en ocasiones, hasta el 15 % (Hamer et al., 2001). Los detalles técnicos,
como nuestra nueva prueba individual de supuestos mutantes en ausencia de competencia de
las cepas de tipo salvaje y nuestro estricto nivel de corte, pueden explicar parte de esta
discrepancia. Sin embargo, el porcentaje relativamente bajo de mutaciones que dan lugar a un
defecto de colonización también podría implicar que X. nematophila requiere pocos genes para
su asociación mutualista. Esta suposición se ve respaldada por el hecho de que se obtuvieron
múltiples inserciones independientes, cada una en una ubicación diferente, dentro de tres de
los nueve loci identificados en esta pantalla. Aunque esto podría reflejar en parte una
propensión de Tn5 a insertarse dentro de estos loci, también argumenta que, en total, los
genes de colonización de X. nematophila comprenden un pequeño objetivo para la
transposición.
Quizás no sea sorprendente que X. nematophila requiera un pequeño conjunto de genes para la
colonización; las diferencias en la naturaleza biológica de las interacciones mutualistas frente a
las patogénicas podrían requerir un número y conjunto de genes diferentes. Por ejemplo, X.
nematophila reside extracelularmente en el tracto digestivo del nematodo y no parece invadir
los tejidos del huésped del nematodo (Bird y Akhurst, 1983). Por lo tanto, es poco probable que
los genes que codifican las funciones requeridas para la invasión de células o tejidos sean
necesarios para las interacciones X. nematophila-huésped. Sin embargo, se podría esperar que
X. nematophila requiera funciones para la unión a células vesiculares, adquisición o síntesis de
nutrientes, comunicación molecular y resistencia al estrés impuesto por el huésped, así como
mecanismos reguladores para controlar la expresión de estas funciones. Los genes de
colonización descritos en este informe ahora se pueden analizar más a fondo para proporcionar
información sobre la fisiología de X. nematophila dentro del nematodo que no se alimenta y la
naturaleza del entorno del huésped.
Una clase de genes identificados, designados como nulos (nulos significa los Nils), no tienen
homología con los genes de la base de datos pública de secuencias o tienen homología con
genes de función desconocida. Los mutantes nulos son de particular interés para nosotros, ya
que no tienen defectos evidentes de crecimiento, supervivencia, comportamiento o actividad
exoenzimática. El único defecto fenotípico detectado en los mutantes nilB, nilC y nilD es la
pérdida de la capacidad de colonizar los intestinos de los nematodos de manera eficiente, lo
que sugiere que estos genes juegan un papel directo en la colonización de los nematodos.
Varias mutaciones se agruparon en una sola región genómica de 4 kb, SR1, que contiene cuatro
genes putativos, nilA, nilB, nilC y tn2. El requisito de nilB y nilC en la colonización se confirmó
mediante análisis de complementación. El análisis completo de los promotores de SR1 debería
revelar la estructura del operón y los posibles mecanismos de regulación, lo que a su vez puede
proporcionar información sobre las funciones de los productos génicos codificados en esta
región. Teniendo en cuenta el papel demostrado de nilB y nilC en la colonización y la ubicación
predicha en la membrana externa de sus productos, especulamos que NilB y NilC pueden estar
involucrados en una interacción directa con el entorno vesicular del nematodo. Con base en la
ubicación genética y las funciones putativas de sus homólogos en otros organismos (Myers et
al., 1998; Stojiljkovic y So, 1999), NilB podría participar en la eliminación de hierro, una
importante función de supervivencia para los microbios dentro de los huéspedes (Ratledge y
Dover, 2000).
La caracterización de los fenotipos relacionados con el hierro de los mutantes SR1, como la
supervivencia en condiciones limitantes de hierro, puede revelar si alguno de los genes en esta
región juega un papel en la homeostasis del hierro y si esta función es importante para la
colonización. La función de NilC no puede deducirse de los análisis comparativos de secuencias
debido a la falta de un homólogo de función conocida o sospechada. Las regiones de similitud
con las proteínas flagelina y pilina podrían indicar que NilC forma una estructura de orden
superior y/o está involucrada en una interacción física con la vesícula huésped. La elucidación
del papel de NilC en la colonización requerirá análisis fundamentales de la regulación de la
expresión génica, localización de proteínas, mutagénesis mutágena, interacciones proteína-
proteína e interacciones NilC-células vesiculares

Un segundo locus que se encontró involucrado en la colonización se denominó SR2. En este

punto, no podemos identificar de manera concluyente si un ORF en SR2 es necesario para la
colonización y, de ser así, cuál. El fragmento SR2-9, que alberga una mutación que altera los
codones de inicio superpuestos de orf1 y orf2 pero no afecta la secuencia de aminoácidos
predicha de orf3, no complementa el defecto de colonización de HGB315 (nilD). Este resultado
sugiere que orf1 u orf2 podrían estar involucrados en la colonización, pero es probable que orf3
no sea necesario. Una hipótesis alternativa es que el factor de colonización es ARN mensajero
transcrito desde la región nilD en lugar de un producto peptídico. Hay precedentes de ambas
posibilidades. Los ARN no traducidos ahora se reconocen como elementos reguladores
importantes en E. coli (Wassarman et al., 1999) y también se cree que están involucrados en la
expresión de determinantes de virulencia en patógenos de plantas y animales (Altier et al.,
2000; Kreikemeyer et al. ., 2001; Ma et al., 2001). Se sabe que los péptidos pequeños
sintetizados por ribosomas están involucrados en cascadas reguladoras que incluyen la
esporulación en B. subtilis (Lazazzera et al., 1997) y el desarrollo de heterocistos fijadores de
nitrógeno en cianobacterias (Yoon y Golden, 1998). Nuestros datos muestran que las
transcripciones se generan a partir de ambas hebras del locus nilD (Fig. 4), lo que sugiere que
tanto los productos 'sentido' como 'antisentido' (ya sea ARN o proteína) podrían estar
involucrados en la colonización. Se están realizando experimentos para distinguir entre el
posible requisito de ORF pequeños codificados por nilD, ARN no traducido o ambos en la
colonización de nematodos por X. nematophila. No se ha probado el papel potencial de la
región de repetición SR2 (ubicada a 400 nucleótidos de nilD6::Tn5) en la colonización. Sin
embargo, su proximidad al locus nilD y la presencia de secuencias repetidas invertidas dentro
del locus nilD plantean la posibilidad provocativa y comprobable de que las secuencias
repetitivas también juegan un papel en la colonización.
Las especies de Xenorhabdus tienen rangos específicos de hospederos de nematodos, y la base
de esta especificidad no ha sido definida. Es posible que se requiera SR1 y/o SR2 para la
colonización porque codifican determinantes de especificidad que definen el rango de
huéspedes de X. nematophila. Si es así, se podría predecir que la presencia o la secuencia de
estas regiones varíen entre especies estrechamente relacionadas de Xenorhabdus. De hecho, la
evidencia preliminar sugiere que la región SR2, pero no la región SR1, está presente en el ADN
genómico de X. beddingii ATCC49542 y X. poinarii ATCC49121 (datos no mostrados). Estas
bacterias colonizan nematodos Steinernema (Akhurst, 1983b, 1986) pero no colonizan S.
carpocapsae de manera eficiente (Akhurst, 1983a; C. E. Cowles y H. Goodrich-Blair, resultados
no publicados). Se están realizando estudios para examinar si se producen variaciones en la
secuencia de SR2 entre las cepas, y si SR1, SR2 o ambos podrían ser suficientes para ampliar la
gama de huéspedes de Xenorhabdus spp no afines. para incluir S. carpocapsae.

(5)NilABC genes:
Los nematodos parásitos de insectos del género Steinernema se asocian mutualistamente con
bacterias del género Xenorhabdus. Esta asociación es un modelo natural y manejable para
comprender la ecología, la evolución y los fundamentos moleculares de las interacciones
bacterianas con huéspedes animales. La etapa infectiva que habita en el suelo de un nematodo
Steinernema es colonizada por bacterias simbióticas Xenorhabdus, que transporta y libera en
un insecto huésped. La bacteria Xenorhabdus proporciona actividades que suprimen la
inmunidad de los insectos, matan al insecto y degradan enzimáticamente el cadáver para
apoyar la reproducción del nematodo. Cuando el cadáver del insecto se agota, la bacteria
Xenorhabdus coloniza la progenie de nematodos Steinernema, que emergen del cadáver del
insecto gastado para cazar nuevas presas de insectos (14).
Los estudios filogenéticos y de campo indican que en la naturaleza se encuentran pares
específicos de especies de Xenorhabdus y Steinernema (10, 11, 35). Además, varios estudios
han demostrado que ciertas asociaciones Steinernema-Xenorhabdus son exclusivas en el
sentido de que los pares no cognados no se asociarán durante la mezcla experimental (1, 31).
Por lo tanto, es probable que la bacteria Xenorhabdus haya desarrollado especificidad para sus
huéspedes nematodos Steinernema afines y viceversa. En la naturaleza, solo se ha encontrado
que X. nematophila está asociada con los nematodos S. carpocapsae, aunque una investigación
exhaustiva del rango de Xenorhabdus spp. no se ha informado que pueda colonizar S.
carpocapsae. Los genes nilA, nilB y nilC de X. nematophila se identificaron previamente en una
prueba de mutagénesis marcada con firma que se diseñó para dilucidar los genes bacterianos
necesarios para la colonización del huésped del nematodo S. carpocapsae (17). En este trabajo
inicial, también se reveló que el grupo de genes nilABC está ausente en otras dos especies de
Xenorhabdus, X. poinarii y X. beddingii. En el presente estudio, evaluamos el papel de los genes
nilA, nilB y nilC en la especificidad de especie.

La X. nematophila-S. carpocapsae interacción es especie específica. Para explorar la base de la

especificidad del rango de huéspedes en una interacción de Xenorhabdus Steinernema, nos
enfocamos en el nematodo S. carpocapsae, ya que la relación entre este y su simbionte
bacteriano, X. nematophila, está bien estudiada a nivel molecular (13). Debido a que los
factores no biológicos, como el aislamiento geográfico de los huéspedes y/o los microbios,
pueden dar la apariencia de una especificidad microbio-huésped donde no existe, buscamos
establecer experimentalmente que esta interacción es, de hecho, específica de la especie.
Mezclamos nematodos S. carpocapsae con ocho especies diferentes de Xenorhabdus [X.
nematophila, X. beddingii, X. bovienii (ATCC 49109), X. bovienii (Jollieti), X. budapestensis, X.
ehlersii, X. innexi, X. poinarii y X. szentirmaii], incluidos dos aislamientos de X. bovienii de
distintas especies de nematodos (4, 11, 20, 33). A excepción de X. szentirmaii y X. bovienii
(Jollieti), que no apoyaron el desarrollo y la reproducción de nematodos, todas las especies
analizadas apoyaron el desarrollo de S. carpocapsae en adultos que produjeron descendencia.
Se evaluó la presencia de bacterias en el sitio de colonización de los nematodos de la progenie
derivados de cada cepa mediante sonicación y placas de dilución (consulte Materiales y
métodos; límite de detección 0,0002 CFU/nematodo). Solo el simbionte nativo, X. nematophila,
colonizó los nematodos S. carpocapsae; los nematodos de progenie que se desarrollaron a
partir de céspedes de otras especies no tenían ninguna bacteria asociada con ellos. Por lo tanto,
la interacción X. nematophila-S.ncarpocapsae es específica de la especie y es probable que se
mantenga en la naturaleza por la capacidad exclusiva de X. nematophila para colonizar los
nematodos S. carpocapsae.
Los genes de colonización nilABC de X. nematophila están ausentes en otras especies de
Xenorhabdus. Anteriormente identificamos una región de 3,5 kb del cromosoma X.
nematophila que codifica cuatro genes: nilA, nilB, nilC y tn2 (denominados colectivamente
como el locus nil) (Fig. 1) (17). La eliminación del locus nil del cromosoma X. nematophila da
como resultado la incapacidad de la bacteria para colonizar los nematodos S. carpocapsae, pero
no produce otros cambios fenotípicos conocidos (7). Se predice o se sabe que los genes nilA,
nilB y nilC codifican proteínas de membrana que pueden funcionar en la adherencia (7, 17). A
través del análisis de transferencia Southern utilizando el locus nil como sonda, encontramos
que de todas las especies de Xenorhabdus analizadas, solo X. nematophila alberga el locus nil
(datos no mostrados). Esta observación está respaldada por la falta de secuencias similares al
locus nil en la secuencia del genoma completo de X. bovienii.}
El locus nil de X. nematophila permite la colonización de S. carpocapsae por especies de
Xenorhabdus. El papel crítico del locus nulo en la colonización de nematodos S. carpocapsae
por X. nematophila (7, 8, 17), junto con su ausencia en otras especies de Xenorhabdus, sugiere
que puede codificar proteínas que funcionan como determinantes de la especificidad del rango
de huéspedes de S. carpocapsae . Para probar esto, introdujimos el locus nulo en los
cromosomas de la cepa ATCC 49109 de X. bovienii, la cepa ATCC 49121 de X. poinarii y
DSM16338 de X. szentirmaii (que representan tres clados distintos de Xenorhabdus [35]) para
crear X. bovienii Tn7-nil , X. poinarii Tn7- nil, y X. szentirmaii Tn7-nil, respectivamente (ver
Materiales y Métodos). X. szentirmaii Tn7-nil no apoyó el desarrollo de nematodos, lo que
indica que el locus nil no está involucrado en este aspecto de la especificidad del rango de
hospedantes (datos no mostrados). Sin embargo, X. bovienii Tn7-nil y X. poinarii Tn7-nil
colonizaron nematodos de S. carpocapsae, mientras que las cepas de control correspondientes
que carecían del locus nulo no lo hicieron (Fig. 2 y Tabla 4). Por lo tanto, el locus nulo es
necesario y suficiente para la colonización bacteriana del nematodo S. carpocapsae por parte
de Xenorhabdus, lo que indica que contribuye a definir la especificidad del hospedador de X.
nematophila.
…Los nematodos emergentes fueron colonizados por X. bovienii y X. poinarii solo en ensayos en
los que estaba presente el locus nulo (Fig. 4), lo que confirma que la capacidad de colonizar S.
carpocapsae es específica de la especie en un entorno natural y que el locus nulo confiere esta
especificidad.
El locus nil codifica proteínas implicadas en el inicio de la colonización y en el crecimiento
bacteriano o en el mantenimiento de la colonización. Se cree que el proceso de colonización de
X. nematophila tiene etapas tanto de iniciación como de desarrollo. Los nematodos recién
formados tienen pocas bacterias que crecen para llenar el sitio de colonización, y la población
final de bacterias en un nematodo maduro y completamente colonizado (Fig. 5) representa de 1
a 2 clones individuales (23). Estos hallazgos han llevado al modelo de trabajo de colonización en
el que muy pocas células individuales inician la colonización (aunque no se comprende el
proceso de iniciación) y luego se dividen para llenar el sitio de colonización. Nuestros datos
demuestran que el locus nil permite la colonización de nematodos S. carpocapsae por la
bacteria Xenorhabdus, pero no revela si NilA, NilB y NilC funcionan en las etapas de iniciación
y/o crecimiento de la colonización de nematodos, cualquiera de los cuales o ambos podrían
contribuir a la especificidad de la interacción natural.
Para determinar si los productos del gen nil locus funcionan en el inicio de la colonización y/o el
crecimiento dentro de los huéspedes nematodos, examinamos la distribución de nematodos S.
carpocapsae colonizados por un mutante X. nematophila nilA que expresa GFP. Los mutantes
nilA están atenuados pero no completamente deficientes en la colonización y, por lo tanto,
permiten determinar estos aspectos de la colonización. De 500 nematodos examinados (24), el
65 % estaban vacíos y el 35 % estaban visiblemente colonizados, en contraste con la
distribución de X. nematophila de tipo salvaje que expresa GFP, donde se observó que el 3,8 %
de los nematodos estaban vacíos y el 96 % estaban visiblemente colonizados . El hallazgo de
que un mutante nilA coloniza un porcentaje menor de nematodos que el tipo salvaje indica que
nilA funciona en el inicio de la colonización o en las primeras etapas de la colonización,
representando los nematodos no colonizados aquellos en los que falló la iniciación. Comparado
con los niveles brutos de colonización para mutantes nulos (Fig. 2 y arriba), este resultado
también sugiere que el mutante nilA es defectuoso en el crecimiento, ya que la proporción de
nematodos colonizados por el mutante nilA es más de 10 veces mayor (35). % colonizado) que
el que se esperaría de sus niveles de colonización general (2,5% de los niveles de tipo salvaje).
En otras palabras, si el mutante nilA fuera defectuoso solo en la iniciación, se esperaría que solo
el 2,4% de todos los nematodos estuvieran colonizados. En cambio, cada uno de los 35 % de
nematodos colonizados con nilA debe contener menos bacterias (debido a un crecimiento
defectuoso) que los nematodos colonizados de tipo salvaje para explicar el promedio
relativamente bajo de nilA CFU/nematodo.

En el mutualismo entre X. nematophila y S. carpocapsae, una asociación exitosa parece requerir

contribuciones tanto del huésped como del microbio. Hemos demostrado aquí que X.
nematophila requiere factores específicos para colonizar a su huésped nematodo, mientras que
el nematodo puede controlar los niveles de bacterias colonizadoras (23). De manera similar, el
inicio y mantenimiento del mutualismo Euprymna scolopes-Vibrio fischeri se caracteriza por los
factores bacterianos necesarios para el inicio (40) y los mecanismos del huésped para controlar
el tamaño de la población bacteriana (26). Esto sugiere que los mutualismos entre animales y
microbios en general pueden caracterizarse por restricciones impuestas por el huésped que
seleccionan bacterias específicas y controles impuestos por el huésped que impiden el
crecimiento descontrolado del mutualista colonizador.

(6)NILD CRISPR RNA:

Entomopatógeno Steinernema spp. los nematodos se asocian mutualistamente con bacterias
del género Xenorhabdus (Stock y Goodrich-Blair, 2008). Juntos, estos pares de simbiontes
infectan, matan y se reproducen dentro de los insectos huéspedes. Una etapa juvenil infecciosa
(IJ) especializada del nematodo Steinernema transmite simbiontes bacterianos entre insectos,
asegurando el mantenimiento de la simbiosis a través de generaciones. La asociación entre S.
carpocapsae y su simbionte X. nematophila ha sido bien estudiada con respecto a los aspectos
celulares y moleculares de la simbiosis, particularmente con respecto a los mecanismos por los
cuales se coloniza el IJ (Goodrich-Blair, 2007; Herbert y Goodrich-Blair , 2007; Chaston et al.,
2013). Las bacterias ocupan una región conocida como receptáculo en la porción anterior del
intestino IJ (Poinar, 1966; Wouts, 1980; Bird y Akhurst, 1983; Martens et al., 2003; Flores-Lara
et al., 2007; Snyder et al. al., 2007). Aunque los procesos mediante los cuales se seleccionan las
bacterias X. nematophila y logran ingresar al receptáculo siguen siendo oscuros, solo uno o dos
clones individuales son los fundadores de la población final (∼ 30–200 ufc IJ−1) que finalmente
llena el espacio (Martens et al. al., 2003; Chaston et al., 2013).
Para comprender mejor los factores moleculares bacterianos necesarios durante la colonización
del nematodo IJ, se llevó a cabo una prueba de mutagénesis marcada con firma para identificar
mutantes de X. nematophila defectuosos en este proceso en la cepa X. nematophila HGB081
AN6/1 asociada al nematodo S. carpocapsae (en adelante denominado XnSc 081 (Heungens et
al., 2002). En uno de los mutantes identificados en esta pantalla, nilD6::Tn5, el transposón se
había insertado en una región del genoma que carecía de un potencial de codificación evidente.
Los estudios de complementación luego confirmaron el nilD región era necesaria para la
colonización de nematodos, pero era prescindible para la virulencia en un modelo de infección
de insectos (Heungens et al., 2002).Desde entonces, los análisis bioinformáticos han indicado
que el locus nilD codifica un único elemento CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas
agrupadas regularmente interespaciadas) independiente que comprende un espaciador y dos
repeticiones, que fue interrumpido por la inserción del transposón (Fig. 1).
Los CRISPR son elementos genéticos ampliamente distribuidos entre bacterias y arqueas y
pueden proporcionar resistencia a secuencias de nucleótidos extrañas (Barrangou y Marraffini,
2014). Los CRISPR comprenden una serie de secuencias repetidas cortas que están separadas
por regiones variables, llamadas espaciadores. Muchos espaciadores CRISPR muestran
identidad con las secuencias, denominados protoespaciadores, dentro de los genomas de
bacteriófagos u otros elementos de ADN móviles (Bolotin et al., 2005; Mojica et al., 2005;
Pourcel et al., 2005; Deveau et al., 2008) . Esta observación condujo al descubrimiento de que
los elementos CRISPR codifican un sistema de defensa inmunitario adquirido que evoluciona
rápidamente contra los fagos y plásmidos entrantes (revisado en Sorek et al., 2013; Barrangou y
Marraffini, 2014). Las matrices CRISPR se transcriben como moléculas de ARN individuales que
luego son procesadas por componentes de moléculas individuales de ARN CRISPR (crRNA)
(Barrangou et al., 2007; Brouns et al., 2008; Carte et al., 2008). Hay tres clases principales de
sistemas CRISPR (Tipos I–III). Estos tres tipos se subdividen en varios subtipos, diferenciados por
criterios que incluyen la filogenia de los genes cas y la secuencia de las repeticiones CRISPR
(Makarova et al., 2011a,b). En Escherichia coli, un sistema de tipo I-E, cinco proteínas, Cse1 (Cas
subtipo E. coli), Cse2, Cas7, Cas5 y Cas6e (anteriormente denominadas CasA, B, C, D, y E
respectivamente) están asociados en un complejo denominado 'Cascada' y Cas6e, una supuesta
proteína de unión al ARN, es la subunidad responsable del procesamiento del ARN (Brouns et
al., 2008; Carte et al., 2008; Jore et al., 2011). ).
Los crRNA procesados se dirigen e interactúan con moléculas de ADN o ARN que codifican
protoespaciadores, lo que resulta en el silenciamiento y/o degradación de genes (Gasiunas et
al., 2014). Una secuencia semilla de 6 a 8 nt dentro del crRNA muestra una identidad del 100 %
con el objetivo y se predice que guiará la interacción entre el crRNA y el protoespaciador
(Semenova et al., 2011; Wiedenheft et al., 2011). La focalización y el silenciamiento de CRISPR
también requieren la presencia de un motivo adyacente protoespaciador (PAM) corto dentro
de la secuencia diana exógena, ubicado directamente aguas arriba de la secuencia inicial. El
PAM proporciona un mecanismo por el cual el sistema diferencia entre secuencias diana y no
diana (p. ej., endógenas), evitando así la autoinmunidad potencialmente letal debida a la
selección de secuencias cromosómicas "propias" (Mojica et al., 2009; Westra et al., 2013). La
hibridación de la molécula de crRNA con la secuencia de ADN que codifica PAM da como
resultado la formación de un R-Loop dentro del crRNA que actúa como un sitio de unión para
otro miembro de la familia de proteínas Cas, Cas3. Cas3 contiene actividades de helicasa y
nucleasa que son responsables de la degradación de la molécula objetivo (Sinkunas et al., 2011;
2013; Westra et al., 2012). La evolución de la resistencia a nuevos desafíos ocurre mediante la
adición de espaciadores al extremo proximal del promotor de la matriz de repetición CRISPR, en
un proceso dependiente de Cas1 y Cas2 (Barrangou y Marraffini, 2014).
Además de proporcionar resistencia a las secuencias exógenas, los CRISPR de E. coli tienen
actividad contra la lisogenia y la inducción de bacteriófagos templados (Edgar y Qimron, 2010).
La inducción del sistema CRISPR-Cas da como resultado la muerte de células de E. coli si los
objetivos crRNA están presentes en el cromosoma, pero el sistema también selecciona
poblaciones bacterianas que han perdido profagos. Otras funciones atribuidas a los sistemas
CRISPR-Cas incluyen la modulación de los comportamientos de la comunidad bacteriana, la
expresión génica y la reparación del ADN (Methe et al., 2005; Viswanathan et al., 2007; Zegans
et al., 2009; Aklujkar and Lovley, 2010; Babu et al., 2010). Por último, estudios recientes han
implicado o establecido un papel para los sistemas CRISPR-Cas en la promoción de la virulencia
de varios patógenos, incluidos Legionella pneumophila, Campylobacter jejuni y Francisella
novicida Gunderson y Cianciotto, 2013; Louwen et al., 2013; 2014; Samson et al., 2013). Por lo
tanto, el repertorio de actividades celulares impactadas por CRISPR-Cas parece ser diverso y
queda mucho por aprender sobre estos elementos versátiles, particularmente con respecto a
su influencia en las interacciones del huésped. El trabajo presentado aquí se llevó a cabo para
determinar la relación de nilD con el sistema CRISPR-Cas y su función en la colonización
mutualista de los nematodos hospedadores. Demostramos que el locus nilD expresa una
molécula de ARN CRISPR que contribuye, de manera dependiente de Cas6e, a colonización de
tres especies distintas de nematodos. Nuestros datos son consistentes con un modelo que NilD
funciona para regular las secuencias bacterianas endógenas de una manera que no requiere
Cas3 ni una identidad de secuencia perfecta con el objetivo.
Resultados

El locus nilD está codificado dentro de una región CRISPR-Cas Heungens et al. (2002)
informaron previamente una secuencia de 3185 pb (AY077466) de XnSc 081 que contenía el
locus nilD requerido para la asociación con los nematodos S. carpocapsae. Un análisis de
secuencia adicional reveló que este locus codifica un elemento de repetición CRISPR, que
comprende un espaciador y dos repeticiones, que se interrumpe por la inserción del transposón
en la cepa nilD6::Tn5 deficiente en colonización (Fig. 1) (Heungens et al., 2002). Se observaron
secuencias repetidas de CRISPR adicionales aguas arriba de nilD (región entre paréntesis en la
Fig. 1A). Estos datos indican que X. nematophila codifica múltiples loci CRISPR y que la
interrupción de uno de estos, nilD, puede inhibir la colonización por nematodos.
Para obtener más información sobre el contexto cromosómico de nilD e identificar otros loci
CRISPR, se secuenció el genoma de XnSc 081 y se comparó con el de la secuencia publicada de
la cepa HGB800 de X. nematophila (NC_014228; ATCC 19061, en lo sucesivo denominada XnSc
800 ) (Tabla S1). En ambos genomas hay seis elementos CRISPR (Tabla S2), etiquetados
alfabéticamente en orden de aparición en el cromosoma (A–E y G) además de nilD (CRISPR-F).
En ambos genomas, el locus nilD se encuentra aproximadamente 250 nt aguas abajo de CRISPR-
E. El nilD CRISPR es más similar a los loci C y E: cada uno de estos tres loci (nilD, CRISPR-C y
CRISPR-E) codifica secuencias espaciadoras de 32 nt y repeticiones de 29 nt que son similares
en secuencia a las de E. coli K12 (Heungens et al., 2002) (Fig. 1C). A su vez, las secuencias de
repetición de nilD son similares, pero no idénticas, a las de los loci C y E. En los 29 nt que
comprende cada repetición, se produjeron 6 y 4 diferencias en las repeticiones izquierda y
derecha de nilD respectivamente, en relación con el CRISPR -E se repite (Fig. 1C), lo que indica
que el locus nilD se ha separado de los otros loci CRISPR en el genoma.
Codificado aguas abajo de nilD está el gen gloA previamente secuenciado, así como los genes
cas y el locus G de CRISPR (Fig. 1A). Las secuencias de cada una de estas regiones son idénticas
entre XnSc 081 y XnSc 800. Los loci CRISPR están precedidos por secuencias líder ricas en A/T
que contienen promotores que impulsan la transcripción CRISPR (Pul et al., 2010). Estos líderes
pueden ser necesarios para la función CRISPR (Marraffini y Sontheimer, 2008; Sorek et al.,
2008) y su secuencia tiende a conservarse dentro de las especies, pero no entre especies
(Jansen et al., 1999; Lillestol et al., 2006). ). Tanto en XnSc 800 como en XnSc 081, una
secuencia de 99 nt adyacente a CRISPR-E (Fig. 1A) es idéntica en un 93 % a la que se encuentra
aguas arriba de CRISPR-C, y probablemente sea la secuencia líder. Esta secuencia no se
encuentra adyacente a ningún otro locus CRISPR (A, B, D o G), ni se encuentra adyacente a nilD,
lo que sugiere que estos loci pueden regularse de una manera distinta a CRISPR-C y -E.
Los genes cas de X. nematophila son del subconjunto Tipo I-E e incluyen los genes cas1, cas2 y
cas3 ampliamente conservados, así como cse1 (casA), cse2 (casB), cas7 (casC), cas5 (casD) y
cas6e (casE) (Fig. 1A) (Haft et al., 2005; Makarova et al., 2006; 2011b; Chakraborty et al., 2010).
Con base en comparaciones con E. coli y otros sistemas (Brouns et al., 2008; Sinkunas et al.,
2011; 2013; Westra et al., 2012), predecimos que cas3 codifica una proteína con actividad de
nucleasa y helicasa necesaria para mediar la degradación de híbridos crRNA-DNA, mientras que
los otros cinco genes codifican componentes del complejo Cascade de ribonucleoproteína
necesario para el procesamiento de ARN CRISPR y la degradación del ADN objetivo. En otros
sistemas, los genes cas1 y cas2 no son necesarios para el procesamiento o la actividad del ARN
CRISPR, sino que codifican nucleasas que forman un complejo necesario para la adquisición de
nuevos espaciadores (Fineran y Charpentier, 2012; Nuñez et al., 2014). Además, cas1 participa
en la reparación del ADN y la segregación cromosómica (Babu et al., 2010), mientras que cas3
promueve la replicación de plásmidos en E. coli (Ivancic-Bace et al., 2013).
Los análisis genómicos indican que la composición del espaciador del sistema de E. coli Tipo I-E
se diversifica más lentamente de lo que se esperaría si los CRISPR estuvieran principalmente
involucrados en la inmunidad (Touchon et al., 2011). Para abordar si el contenido del
espaciador de X. nematophila se diversifica durante la asociación con hospederos de
nematodos e insectos, aislamos ADN de 10 colonias individuales de X. nematophila de nuestra
población de laboratorio de nematodos S. carpocapsae IJ que se habían mantenido durante ∼
15 años mediante repetidos (∼ mensual) paso a través de larvas de insectos Galleria mellonella.
Estos X. nematophila 'evolucionados' son el resultado de > 1500 rondas del ciclo de vida
natural, que comprenden la persistencia en nematodos IJ que no se alimentan durante el
almacenamiento en agua, la infección y el crecimiento dentro de las larvas de insectos (incluida
la exposición a microbiota asociada a insectos) y la colonización de nematodos IJ (Richards y
Goodrich-Blair, 2009). Por el contrario, los stocks de XnSc 800 y XnSc 081 se almacenaron
durante un período similar congelados en glicerol sin propagación. No hubo diferencias en la
secuencia espaciadora en los loci C, E o nilD de CRISPR en las 10 colonias aisladas entre sí o con
las cepas almacenadas congeladas (datos no mostrados), lo que indica que estos loci no
evolucionan durante el paso de laboratorio a través de nematodos e insectos. Si bien no
examinamos el contenido de espaciadores de los otros cuatro loci CRISPR en la cepa
evolucionada, la ausencia de cambios en el contenido de espaciadores en los loci C y E de
CRISPR después de más de 1500 pases a través de insectos respalda la idea de que la
maquinaria CRISPR-Cas en X. nematophila puede funcionar en un papel fuera de la inmunidad
canónica contra los ácidos nucleicos exógenos (Takeuchi et al., 2012). En general, los análisis
genómicos descritos anteriormente indican que el locus nilD, que es necesario para que X.
nematophila colonice los nematodos S. carpocapsae, codifica un elemento CRISPR no canónico.
La secuencia NILD CRISPR es suficiente para promover
colonización de nematodos

Anteriormente informamos que el defecto de colonización de la mutación nild6 :: tn5 se rescató

parcialmente mediante la introducción de un plásmido (PSR2-312, Tabla 1) que lleva un
fragmento de 312 pb del ADN que contiene nild de tipo salvaje, lo que confirma que esta región
es necesaria para Colonización (Heungens et al., 2002). Del mismo modo, la inserción de un
fragmento de 387 pb que codifica el locus NILD (PEVS107-NILD, Tabla 1) en una copia única en
el sitio de inserción Atttn7 del genoma XNSC 081 NILD6 :: TN5 (referido al en este momento
como NILD6 :: TN5 + NILD) fue suficiente para restaurar la colonización de nematodos, en este
caso a niveles de tipo salvaje (Fig. 2B).
Estos datos respaldan la hipótesis de que dentro del locus nilD, las secuencias similares a
CRISPR, no las regiones codificantes cortas, son necesarias para la colonización. nilD codifica
una pequeña transcripción de ARN expresada durante el crecimiento en cultivo de laboratorio y
la colonización de nematodos. Las repeticiones CRISPR de Escherichia coli se transcriben y
procesan en pequeños ARN de ~ 57 nt (Brouns et al., 2008). Intentamos determinar si el locus
nilD expresa de manera similar un ARN pequeño. Las transferencias Northern no fueron
suficientemente sensibles para detectar un transcrito de ARN de la región nilD (datos no
mostrados). Por lo tanto, realizamos un ensayo de protección de RNasa (RPA) utilizando sondas
que contenían una secuencia nilD específica para ARN sentido o antisentido [en relación con la
orientación de la transcripción del elemento similar a CRISPR predicho en comparación con E.
coli (Brouns et al., 2008 )]. No se observó señal protegida en ninguna reacción específica para
ARN antisentido (datos no mostrados). Por el contrario, el ARN obtenido de cultivos de tipo
salvaje, pero no del mutante nilD6::Tn5, protegió un fragmento de aproximadamente 58 nt
cuando se usaron sondas específicas para la cadena con sentido (Fig. 3A), lo que indica que la
región nilD codifica un 58 nt ARN que se expresa en condiciones de crecimiento in vitro. Se
observaron resultados similares cuando se extrajo ARN de bacterias de tipo salvaje recolectadas
de nematodos S. carpocapsae en etapa IJ (Fig. 3B), lo que demuestra que el ARN NilD también
se expresa durante interacciones mutualistas con su huésped nematodo. Además, el análisis
RPA de ARN aislado de células de tipo salvaje de X. nematophila cultivadas en diversas
condiciones in vitro indica que los niveles de ARN de NilD están elevados en células envejecidas
o limitadas en nutrientes (Fig. S2A). Se detectaron niveles más altos de ARN NilD después del
crecimiento en LB suplementado con 2, 2-dipiridil (un quelante de Fe (II)) en relación con LB
solo o con suplementos adicionales con Fe2SO3 exógeno, lo que indica que los niveles de ARN
NilD pueden aumentar después de la limitación de hierro (Fig. S2B ).
Discusión

El objetivo de este estudio fue dilucidar el papel mecánico del locus nilD de X. nematophila
durante la colonización de nematodos huéspedes de S. carpocapsae. Nuestro trabajo
demuestra que nilD codifica un pequeño ARN y que la expresión de esta molécula es suficiente
para rescatar el defecto de colonización de la cepa nilD6::Tn5. Las predicciones bioinformáticas
indicaron que NilD RNA es miembro de la familia CRISPR RNA. De acuerdo con esto,
presentamos evidencia experimental de que la función de colonización y procesamiento de
ARN NilD requiere cas6e, que codifica un homólogo de la endonucleasa compleja en cascada de
procesamiento de ARN CRISPR de E. coli (Cas6e) (Westra et al., 2012). Sin embargo, a diferencia
de los sistemas CRISPR-Cas de otras bacterias, la función de ARN NilD no parece requerir la
helicasa-nucleasa Cas3 (Sinkunas et al., 2011), ya que un mutante cas3 no muestra un defecto
de colonización (Fig. 5). Esto puede indicar que la función de NilD RNA diverge de la de otros
crRNA, y que su requisito en la colonización no incluye la degradación del objetivo mediada por
Cas3.
Varias líneas de evidencia argumentan en contra de la idea de que la función de colonización
del ARN NilD es restringir la entrada de ADN exógeno (plásmidos y bacteriófagos líticos), la
función primaria inicial atribuida a los ARNcr (Brouns et al., 2008; Marraffini y Sontheimer,
2008) . En cambio, nuestros datos respaldan el modelo de que el ARN NilD regula las secuencias
endógenas, como se ha observado o sugerido en otros sistemas CRISPR-Cas (Zegans et al.,
2009; Aklujkar y Lovley, 2010; Cady y O'Toole, 2011; Sampson et al. al., 2013). En primer lugar,
el defecto de colonización nilD6::Tn5 es evidente en un sistema cerrado que consta únicamente
de una población clonal bacteriana y el huésped nematodo. Por lo tanto, la única fuente de
ADN extraño potencialmente tóxico es el nematodo. Sin embargo, los lisados de nematodos no
inhiben el crecimiento de las cepas de Xenorhabdus en cultivo líquido y no forman placas en los
céspedes bacterianos (datos no mostrados). Además, los análisis BLASTn (Altschul et al., 1997)
contra la base de datos de secuencias NCBI GenBank y otros 13 genomas bacterianos de
Xenorhabdus (H. Goodrich-Blair, sin publicar) no pudieron identificar protoespaciadores
putativos con identidad con NilD (datos no mostrados). Si bien no es concluyente, este hecho es
contrario a la idea de que el ARN de NilD se dirige a un elemento genético móvil presente en
otras especies de Xenorhabdus. En segundo lugar, las diferencias en el cromosoma endógeno
pueden pasar por alto o causar la necesidad de ARN NilD. El defecto de colonización de
nilD6::Tn5 solo es evidente en un fondo genómico específico (Fig. 5) en el que pueden surgir
alelos supresores (p. ej., sup-1) que pueden colonizar a pesar de la ausencia de expresión de
nilD (Fig. 3). Nuestro análisis genómico indica que el antecedente de la cepa asociado con el
requerimiento de nilD en la colonización tiene un único SNV distintivo, un cambio de T a C en el
nt 3271541 en la región intergénica entre una primasa del fago P4 y una región predicha para
codificar Rhslike y elementos asociados (Fig. . S3), mientras que la secuenciación de la cepa sup-
1 no logró identificar ninguna alteración genética que pudiera explicar el fenotipo de supresión
(datos no mostrados). Estos hallazgos sugieren que un solo cambio de nucleótido en el genoma
bacteriano puede conferir dependencia de nilD para la colonización, mientras que la supresión
puede resultar de la variabilidad epigenética o de fase.
Una explicación alternativa para el papel de NilD RNA en la colonización es que se requiere para
controlar la expresión de un elemento genético endógeno que es perjudicial para las
interacciones del huésped, con la región espaciadora NilD RNA32 nt que confiere especificidad
para este elemento. Al igual que el sistema CRISPR de E. coli, NilD puede controlar la expresión
de sus objetivos (Edgar y Qimron, 2010). Dos modelos de regulación génica mediada por
CRISPR-Cas son que el complejo Cascade, incluido el ARNcr, se une al ARNm objetivo para
bloquear la traducción o promover la escisión mediada por Cas-3, o el complejo Cascade se une
al objetivo de ADN y evita la transcripción. Dado que un mutante cas-3 no muestra los mismos
defectos de colonización que el mutante nilD6::Tn5 (Fig. 5), nuestros datos son más
consistentes con la idea de que el complejo NilD RNA-Cascade bloquea la transcripción o la
traducción, en lugar de desencadenar degradación del objetivo. Más información sobre el
mecanismo de la función del ARN de NilD espera la identificación de su(s) objetivo(s). No se
observa ningún protoespaciador con una identidad del 100 % en los genomas de XnSc 800 o
XnSc 081, lo que sugiere que los bajos niveles de similitud pueden ser suficientes para la
orientación de NilD. Por el contrario, los experimentos de complementación que utilizan nilD
XnSc 081 mutagenizado y los loci nilD divergentes de XnSa 1418 y XnSw 1419 no lograron
restaurar el defecto de colonización de nilD6::Tn5 (Tabla 3), lo que revela que cierta integridad
de secuencia es esencial. Además, estos datos pueden indicar que los objetivos de ARN NilD en
las cepas XnSa 1418 y XnSw 1419 han divergido en la secuencia, y que los loci nilD en esas cepas
han coevolucionado para mantener la identidad de secuencia. Si es cierto, un análisis de
secuencia comparativo adicional de estas cepas podría producir objetivos putativos.
Este informe amplía el número limitado de estudios que demuestran el impacto de los sistemas
CRISPR-Cas en las interacciones huésped-microbio. El gen cas2 de L. pneumophila es necesario
para el crecimiento intracelular dentro de las amebas huésped (Gunderson y Cianciotto, 2013).
De manera similar a nuestro trabajo, estos experimentos se realizaron en ausencia de ADN
exógeno o fago, lo que sugiere que el requerimiento de cas2 en L. pneumophila era
independiente de cualquier función relacionada con la interferencia. Del mismo modo, un
mutante cas2 no fue más sensible a la exposición a la luz ultravioleta o al tratamiento con
mitomicina C o ácido nalidíxico, lo que indica que el defecto de virulencia no se debió al papel
potencial de Cas2 en la reparación del ADN (datos no mostrados). Un estudio reciente
demostró la regulación negativa mediada por F. novicida Cas9 de un gen endógeno que codifica
una lipoproteína. En ausencia de cas9, la expresión aberrante de la lipoproteína desencadenó la
inmunidad del huésped y redujo la virulencia del patógeno (Sampson et al., 2013). Juntos, estos
y otros estudios han establecido un papel para la maquinaria CRISPR-Cas en la facilitación de la
virulencia de patógenos (Louwen et al., 2014). El trabajo presentado aquí demuestra que estos
sistemas también pueden funcionar en asociaciones mutualistas. Aunque sigue siendo
enigmático, el papel de NilD RNA y su alelo sintético en la colonización por nematodos debe
aclararse mediante la identificación de su objetivo molecular y, a su vez, la función de este
objetivo en la promoción o inhibición del proceso de colonización.

(7)Bacteria entomopatogena

Xenorhabdus spp. son enterobacterias gramnegativas móviles que forman asociaciones

mutualistas con nematodos del suelo entomopatógenos del género Steinernema y son
patógenas para una variedad de insectos [14]–[19]. En el nematodo, Xenorhabdus spp. se
transportan en una región especializada del intestino, denominada receptáculo [20], del juvenil
infectivo (IJ) de tercera etapa [21]. Los IJ viven en el suelo hasta que invaden el hemocele de los
insectos huéspedes susceptibles. Las bacterias se liberan en el hemocele del insecto, donde
superan los sistemas de defensa del insecto y producen numerosos factores de virulencia que
participan en la supresión de la inmunidad del insecto y en la muerte del huésped [22] [32]. Las
bacterias proliferan en niveles elevados en el cadáver del insecto y producen diversos
compuestos antimicrobianos que suprimen el crecimiento de microorganismos antagónicos
[33]–[36]. Xenorhabdus spp. también secretan una serie de exoenzimas que estimulan la
degradación macromolecular, cuyos productos, junto con las propias bacterias, se cree que
proporcionan una base de nutrientes para el crecimiento y la reproducción de los nematodos
[37]–[41]. Cuando el número de nematodos aumenta y los nutrientes se vuelven limitantes en
el cadáver del insecto, la progenie de nematodos se vuelve a asociar con bacterias y se
diferencia en IJ colonizados que no se alimentan y emergen al suelo para buscar nuevos
huéspedes [20], [42], [43 ]. Por lo tanto, la interacción tripartita Xenorhabdus-nematodo-
insecto representa un sistema modelo en el que tanto los procesos mutualistas como los
patogénicos pueden estudiarse en una sola especie bacteriana [44].
Para comprender mejor la biología de Xenorhabdus, secuenciamos los genomas completos de
X. nematophila ATCC 19061 [17] y X. bovienii SS-2004 [56], [57]. Comparación de estos
genomas de Xenorhabdus con los genomas secuenciados de Photorhabdus luminescens subsp.
laumondii TT01 [58] y P. asymbiotica ATCC 43949 [59] proporciona evidencia de la divergencia
genómica entre estos dos géneros a pesar de que comparten estilos de vida similares. Nuestro
análisis de estos dos genomas de Xenorhabdus proporciona información sobre el estilo de vida
complejo de estos simbiontes de nematodos, es de interés para comprender las infecciones de
insectos mediadas por bacterias y es un recurso para usar estos entomopatógenos como
agentes de control biológico de plagas de insectos relevantes para la agricultura.
Discusión

La compleja asociación de Xenorhabdus y Photorhabdus con nematodos es un hermoso

ejemplo de simbiosis huésped-microbio. En este artículo, informamos la secuenciación
completa de los genomas X. nematophila ATCC 19061 y X. bovienii SS-2004. Nuestro análisis
revela que la bacteria Xenorhabdus puede producir un gran arsenal de toxinas insecticidas,
acorde con su estilo de vida entomopatógeno conocido. Nuestro análisis comparativo del
genoma de Xenorhabdus y Photorhabdus proporciona información sobre cómo sus relaciones
con diferentes nematodos han dado forma a su historia evolutiva. Xenorhabdus y
Photorhabdus son filogenéticamente más similares entre sí que sus huéspedes nematodos
(Figura 2), lo que sugiere que tanto Xenorhabdus como Photorhabdus divergieron más
recientemente de un ancestro común. Este progenitor bacteriano puede haber sido capaz de
colonizar tanto Steinernema como Heterorhabditis, y la asociación a largo plazo con su huésped
puede haber dado lugar de forma independiente a Xenorhabdus y Photorhabdus. La
delimitación de estos dos géneros está marcada por el hecho de que cada género solo puede
colonizar huéspedes nematodos específicos. Es importante destacar que Xenorhabdus y
Photorhabdus no son las únicas bacterias que se sabe que participan en simbiosis patogénicas
con nematodos. Por ejemplo, la c-proteobacterium Moraxella osloensis puede asociarse con el
nematodo Phasmarhabditis hermaphrodita y parasitar babosas [84]. M. osloensis (familia
Pseudomonadaceae) es filogenéticamente distinta de Xenorhabdus o Photorhabdus (familia
Enterobacteriaceae). Dado que P. hemaphrodita pertenece al mismo orden que Steinernema y
Heterorhabditis (Rhabditida), esto sugiere que las c-proteobacterias tienen una larga asociación
como simbiontes de nematodos.
La divergencia de Xenorhabdus y Photorhabdus plantea dos preguntas: ¿qué genes se
conservan y qué genes han divergido? Nuestro análisis de mapeo filogenómico reveló que
muchas vías fisiológicas centrales están altamente conservadas en las cuatro bacterias (Tabla 2
y Tablas S1, S2, S3, S4, S5, S6). Estos incluyen genes que codifican toxinas y proteasas,
transportadores relacionados con el hierro y biosíntesis de LPS. Algunos de estos genes, como
las toxinas, son bien conocidos por sus interacciones con los insectos, y es probable que estas
toxinas se hayan conservado a lo largo de la historia evolutiva de estos dos géneros para ayudar
a mantener la relación mutualista que tienen con sus respectivos nematodos huéspedes (Texto
S5) . Otros genes como el grupo de biosíntesis de LPS también son conocidos tanto por el
mutualismo de nematodos como por la patogénesis en P. luminescens [52], y nuestro hallazgo
de homólogos en P. asymbiotica y las dos bacterias Xenorhabdus puede indicar su papel similar
en estas tres bacterias.

(8) CprX_ (BUSCAR MAS SOBRE

ESTE PAPER)
Otros tres miembros del regulón CpxR de X. nematophila, nilA, nilB y nilC (21), son necesarios
para la colonización de nematodos y se cree que están involucrados en el inicio de la
colonización, tal vez a través de la señalización o la unión a la superficie de un nematodo (4–6) .
nilA, nilB y nilC están codificados en el mismo locus, denominado región de simbiosis 1 (23).
nilA y nilB se cotranscriben, mientras que nilC se transcribe de forma divergente (23). NilC es
una lipoproteína de membrana externa orientada periplásmicamente (4), NilB es una proteína
de membrana externa de función desconocida (A. Bhasin y H. Goodrich-Blair, datos no
publicados), mientras que se prevé que NilA sea una proteína de membrana interna (23).