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GUÍA DEL USUARIO

trizol™Reactivo
Números de catálogo15596026 y 15596018
Doc. número de parte15596026.PPSPub. No.HOMBRE0001271 Rdo.A.0

¡ADVERTENCIA!Lea las Hojas de Datos de Seguridad (SDS) y siga las Materiales necesarios no suministrados
instrucciones de manejo. Use gafas protectoras, ropa y guantes A menos que se indique lo contrario, todos los materiales están disponibles a través de
adecuados. Las hojas de datos de seguridad (SDS) están disponibles en termopescador.com. MLS: Fisher Scientific (fisherscientific.com) u otro proveedor de
thermofisher.com/support. laboratorio importante.

tabla 1 Materiales necesarios para el aislamiento de ARN, ADN y proteínas

Información del Producto
Artículo Fuente
Invitrogen™trizol™Reagent es un reactivo listo para usar, diseñado para aislar ARN
total de alta calidad (así como ADN y proteínas) de muestras de células y tejidos Equipo
de origen humano, animal, vegetal, de levadura o bacteriano, en una hora. trizol Centrífuga y rotor capaz de alcanzar
MLS
™El reactivo es una solución monofásica de fenol, isotiocianato de guanidina y
12.000 ×gramoy 4°C
otros componentes patentados que facilitan el aislamiento de una variedad de tubos
especies de ARN de tamaño molecular grande o pequeño. trizol™El reactivo Tubos de microcentrífuga de polipropileno MLS
mantiene la integridad del ARN debido a la inhibición altamente efectiva de la reactivos
actividad de la RNasa al tiempo que interrumpe las células y disuelve los
Cloroformo MLS
componentes celulares durante la homogeneización de la muestra. trizol™El
reactivo permite el procesamiento simultáneo de una gran cantidad de muestras Tabla 2 Materiales necesarios para el aislamiento de ARN

y es una mejora del método de aislamiento de ARN de un solo paso desarrollado

Artículo Fuente
por Chomcynski y Sacchi (Chomczynski y Sacchi, 1987).
Equipo
Baño de agua o bloque térmico a 55–60 °C MLS
trizol™El reactivo permite realizar la precipitación secuencial de ARN, ADN y
reactivos
proteínas a partir de una sola muestra (Chomczynski, 1993). Después de
homogeneizar la muestra con TRIzol™Se añade el reactivo, cloroformo y se isopropanol MLS
permite que el homogeneizado se separe en una capa acuosa superior Etanol, 75% MLS
transparente (que contiene ARN), una interfase y una capa orgánica inferior roja Agua libre de ARNasa al 0,5% SDS MLS
(que contiene el ADN y las proteínas). El ARN se precipita de la capa acuosa con (Opcional)Glucógeno libre de ARNasa MLS
isopropanol. El ADN se precipita de la interfase/capa orgánica con etanol. La
proteína se precipita del sobrenadante de fenol-etanol mediante precipitación Tabla 3 Materiales necesarios para el aislamiento de ADN

con isopropanol. El ARN, el ADN o la proteína precipitados se lavan para eliminar Artículo Fuente
las impurezas y luego se resuspenden para su uso en aplicaciones posteriores.
reactivos
Etanol, 100% MLS
• El ARN aislado se puede utilizar en RT-PCR, análisis Northern Blot,
Etanol, 75% MLS
hibridación Dot Blot, selección poli(A)+, traducción in vitro, ensayo de
protección de RNasa y clonación molecular. Citrato de sodio 0,1 M en etanol al 10 % MLS
• El ADN aislado se puede utilizar en PCR, digestión con enzimas de restricción y NaOH 8 mM MLS
transferencias Southern. HEPES MLS
• La proteína aislada se puede utilizar para transferencias Western, recuperación Tabla 4 Materiales necesarios para el aislamiento de proteínas.
de cierta actividad enzimática y cierta inmunoprecipitación.
Artículo Fuente
trizol™El reactivo también se puede utilizar con Phasemaker™Tubos para aislar ARN.
Equipo
Referirse atrizol™Reactivo y Phasemaker™Guía del usuario del sistema Tubes
Complete(MAN0016163) para el protocolo completo. (Opcional)Membranas de diálisis MLS
reactivos
Contenido y almacenamiento isopropanol MLS
Etanol, 100% MLS
Gato. Nº 15596026 Gato. Nº 15596018
Contenido
(100 reacciones) (200 reacciones)
Almacenamiento
Clorhidrato de guanidina 0,3 M en etanol al 95 % MLS
trizol™Reactivo 100ml 200ml 15–30°C 1% MSDS MLS

Solo para uso de investigación. No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico.

 b. Agregue 0.3–0.4 mL de TRIzol™Reactivo por 1 × 105—107células
Requisitos de muestra de entrada directamente a la placa de cultivo para lisar las células.
¡IMPORTANTE!Realice el aislamiento del ARN inmediatamente después de la recolección de C. Pipetee el lisado hacia arriba y hacia abajo varias veces para homogeneizar.
muestras o congele rápidamente las muestras inmediatamente después de la recolección y • Células cultivadas en suspensión:
guárdelas a –80 °C o en nitrógeno líquido hasta el aislamiento del ARN.
a. Pellet las células por centrifugación y desechar el
sobrenadante.
Material de partida por 1 ml de
Tipo de ejemplo b. Añadir 0,75 mL de TRIzol™Reactivo por 0,25 mL de muestra (5– 10 ×
trizol™Reactivo
106células de origen animal, vegetal o de levadura o 1 × 107
Tejidos[1] 50–100 mg de tejido
células de origen bacteriano) al sedimento.
1 × 105–1 × 107células cultivadas en
Células cultivadas en monocapa monocapa en una placa de cultivo de 3,5 cm Nota:No lave las células antes de agregar TRIzol™Reactivo para
(10 cm2) evitar la degradación del ARNm.
5–10 × 106células de origen animal, C. Pipetee el lisado hacia arriba y hacia abajo varias veces para homogeneizar.
Células cultivadas en suspensión vegetal o de levadura o 1 × 107células de
Nota:El volumen de la muestra no debe exceder el 10% del volumen de
origen bacteriano
TRIzol™Reactivo utilizado para la lisis.
frescos o tejidos almacenados en ARNmás tarde™Solución de estabilización (Cat.
[1]Tejidos
No. AM7020). PUNTO DE PARADALas muestras se pueden almacenar a 4 °C durante la noche o a -20
°C hasta por un año.
Directrices de procedimiento 2.(Opcional)Si las muestras tienen un alto contenido de grasa, centrifugue el lisado durante
• Realice todos los pasos a temperatura ambiente (20–25 °C) a menos que se indique lo 5 minutos a 12 000 ×gramoa 4–10 °C, luego transfiera el sobrenadante transparente a
contrario. un tubo nuevo.
• Use TRIzol frío™Reactivo si el material de partida contiene altos 3.Incubar durante 5 minutos para permitir la disociación completa del
niveles de RNasa, como muestras de bazo o páncreas. complejo de nucleoproteínas.
• Utilice recipientes de plástico estériles, desechables y envueltos individualmente y 4.Añadir 0,2 mL de cloroformo por 1 mL de TRIzol™Reactivo utilizado para la lisis,
pipetas, puntas de pipeta y tubos estériles y desechables sin ARNasa. luego tape el tubo de forma segura.
• Utilice guantes desechables cuando manipule reactivos y muestras de ARN para 5.Incubar durante 2–3 minutos.
evitar la contaminación por ARNasa de la superficie de la piel; cambie los 6.Centrifugar la muestra durante 15 minutos a 12.000 ×gramoa 4°C.
guantes con frecuencia, particularmente a medida que el protocolo avanza de
La mezcla se separa en una fase inferior roja de fenol-cloroformo e
extractos crudos a materiales más purificados.
interfase y una fase acuosa superior incolora.
• Utilice siempre técnicas asépticas microbiológicas adecuadas cuando
7.Transfiera la fase acuosa que contiene el ARN a un tubo nuevo.
trabaje con ARN.
8.Transfiera la fase acuosa que contiene el ARN a un tubo nuevo
• Usar RNasaBorrar™Solución de descontaminación de ARNasa (n.º de cat.
inclinando el tubo a 45° y pipeteando la solución.
No. AM9780) para eliminar la contaminación por ARNasa de las superficies de
trabajo y elementos no desechables como centrífugas y pipetas utilizadas ¡IMPORTANTE!Evite transferir la interfase o la capa orgánica a la
durante la purificación. pipeta cuando retire la fase acuosa.
Vaya directamente a "Aislar ARN" en la página 2.
Lyse muestras y fases separadas
Guarde la interfase y la fase orgánica si desea aislar ADN o proteína. Consulte "Aislamiento
1.Lise y homogeneice muestras en TRIzol™Reactivo según su
de ADN" en la página 3 o "Aislamiento de proteínas" en la página 4 para conocer los
material de partida.
procedimientos detallados. La fase orgánica se puede almacenar a 4°C durante la noche.
• Tejidos:
Añadir 1 mL de TRIzol™Reactivo por 50–100 mg de tejido a la
muestra y homogeneizar con un homogeneizador.
• Célula cultivada en monocapa:

a. Retire los medios de crecimiento.

ARN aislado

1 Precipitar el ARN
a.(Opcional)Si la muestra inicial es pequeña (<106células o <10 mg de tejido), agregue 5–10 µg de glucógeno libre de
ARNasa como vehículo a la fase acuosa.
Nota:El glucógeno se coprecipita con el ARN, pero no interfiere con las aplicaciones
posteriores.
b.Agregar 0,5 mL de isopropanol a la fase acuosa, por 1 mL de TRIzol™Reactivo utilizado para la lisis.
C.Incubar durante 10 minutos.
d.Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 ×gramoa 4°C.

El precipitado de ARN total forma un gránulo blanco similar a un gel en el fondo del tubo.
mi.Desechar el sobrenadante con una micropipeta.

2 Lavar el ARN a.Resuspender el precipitado en 1 mL de etanol al 75% por 1 mL de TRIzol™Reactivo utilizado para la lisis.

Nota:El ARN se puede almacenar en etanol al 75 % durante al menos 1 año a –20 °C, o al menos 1 semana a 4 °C.
b.Vórtice la muestra brevemente, luego centrifugue durante 5 minutos a 7500 ×gramoa 4°C.
C.Desechar el sobrenadante con una micropipeta.
d.Aspire o seque al aire el sedimento de ARN durante 5 a 10 minutos.

¡IMPORTANTE!No seque el sedimento con una centrífuga al vacío. No deje que el sedimento de ARN se seque para garantizar la
solubilización total del ARN. Las muestras de ARN parcialmente disueltas tienen una A230/280relación <1,6.

2 trizol™Guía del usuario de reactivos

 3 Solubilizar el ARN
4 Determinar el rendimiento de ARN
aislar ADN
Aísle el ADN de la interfase y la fase inferior de fenol-cloroformo guardada en "Muestras Lyse y fases separadas" en la página 2.
1 Precipitar el ADN
2 lavar el ADN
trizol™Guía del usuario de reactivos
a.Vuelva a suspender el precipitado en 20–50 μL de agua libre de ARNasa, EDTA 0,1 mM o solución de SDS al 0,5 % pipeteando hacia arriba y
hacia abajo.
¡IMPORTANTE!No disuelva el ARN en SDS al 0,5 % si el ARN se va a utilizar en reacciones enzimáticas
posteriores.
b.Incube en un baño de agua o en un bloque térmico a 55–60 °C durante 10–15 minutos.
Continúe con las aplicaciones posteriores o almacene el ARN a –70 °C.
Determinar el rendimiento de ARN utilizando uno de los siguientes métodos.
Método Procedimiento
Absorbancia 1. Diluya la muestra en agua libre de ARNasa, luego mida la absorbancia
a 260 nm y 280 nm.
La absorbancia a 260 nm proporciona el contenido
total de ácido nucleico, mientras que la absorbancia a 2. Calcule la concentración de ARN utilizando la fórmula A260 ×
280 nm determina la pureza de la muestra. Dado que dilución × 40 = µg de ARN/mL.
los nucleótidos libres, el ARN, el ssDNA y el dsDNS se 3. Calcular la relación A260/A280. Una
absorben a 260 nm, todos contribuyen a la proporción de ~2 se considera pura.
absorbancia total de la muestra.
Las muestras de ARN se pueden cuantificar por absorbancia sin dilución previa
con NanoDrop™espectrofotómetro. Consulte las instrucciones del instrumento
para obtener más información.
Fluorescencia • Cuantificar el rendimiento de ARN usando el Qubit apropiado™o Quant-it™Kit de
ensayo de ARN (n.º de catálogo Q32852, Q10210, Q33140 o Q10213).
La fluorescencia mide selectivamente el ARN
intacto, pero no mide la proteína u otro Consulte las instrucciones del kit para obtener más información.
contaminante presente en la muestra
Tabla 5ARN típico (A260/280de >1.8) rendimientos de varios materiales de partida
Material de partida Cantidad rendimiento de ARN
Células epiteliales 1 × 106células 8–15 µg
Nueva hoja de tabaco — 73 µg
fibroblastos 1 × 106células 5–7 µg
Músculos esqueléticos y cerebro 1 mg 1–1,5 µg
Placenta 1 mg 1–4 µg
Hígado 1 mg 6–10 µg
Riñón 1 mg 3–4 µg
a.Retire cualquier fase acuosa restante que recubra la interfase.
Esto es fundamental para la calidad del ADN aislado.
b.Añadir 0,3 mL de etanol al 100% por 1 mL de TRIzol™Reactivo utilizado para la lisis.
C.Tape el tubo, mezcle invirtiendo el tubo varias veces.
d.Incubar durante 2–3 minutos.
mi.Centrifugar durante 5 minutos a 2000 ×gramoa 4°C para sedimentar el ADN.
F.Transferir el sobrenadante de fenol-etanol a un tubo nuevo.
El sobrenadante se utiliza para el aislamiento de proteínas (consulte “Aislamiento de proteínas” en la página 40, si es necesario, y se puede
almacenar a –70 °C durante varios meses).
a.Resuspender el sedimento en 1 mL de citrato de sodio 0,1 M en etanol al 10 %, pH 8,5, por 1 mL de TRIzol™
Reactivo utilizado para la lisis.
b.Incubar durante 30 minutos, mezclando ocasionalmente por inversión suave.
Nota:El ADN se puede almacenar en citrato de sodio/etanol durante al menos 2 horas.
C.Centrifugar durante 5 minutos a 2000 ×gramoa 4°C.
d.Desechar el sobrenadante con una micropipeta.
mi.Repita el paso 2a al paso 2d una vez.
Nota:Repita el paso 2a al paso 2d dos veces para gránulos de ADN grandes (>200 µg).
F.Resuspender el precipitado en 1,5–2 ml de etanol al 75 % por 1 ml de TRIzol™Reactivo utilizado para la lisis.
gramo.Incube durante 10 a 20 minutos, mezclando ocasionalmente por inversión suave.
Nota:El ADN se puede almacenar en etanol al 75% durante varios meses a 4°C.
H.Centrifugar durante 5 minutos a 2000 ×gramoa 4°C.
i.Desechar el sobrenadante con una micropipeta.
j.Aspire o seque al aire el sedimento de ADN durante 5 a 10 minutos.
¡IMPORTANTE!No seque el sedimento con una centrífuga al vacío.
3
 3 Solubilizar el ADN
4 Determinar el rendimiento de ADN
Proteínas aisladas
Aísle las proteínas del sobrenadante de fenol-etanol guardado en "Precipitar el ADN" en la página 3 usando "Precipitar las proteínas" en la página 4 o
"Dializar las proteínas" en la página 5.
1 Precipitar las proteínas
2 Lavar las proteínas
3 Solubilizar las proteínas
4 trizol™Guía del usuario de reactivos
a.Vuelva a suspender el sedimento en 0,3 a 0,6 ml de NaOH 8 mM pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Nota:Recomendamos resuspender el ADN en una base suave porque el ADN aislado no se resuspende bien
en agua o tampón Tris.
b.Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 ×gramoa 4°C para eliminar los materiales insolubles.
C.Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo, luego ajuste el pH según sea necesario con HEPES.
Continúe con las aplicaciones posteriores o almacene el ADN a 4 °C durante la noche. Para un almacenamiento a largo plazo a –20
°C, ajuste el pH a 7–8 con HEPES y agregue EDTA 1 mM.
Determinar el rendimiento de ADN usando uno de los siguientes métodos.
Método Procedimiento
Absorbancia 1. Diluya la muestra en agua o tampón (pH >7,5), luego mida la
absorbancia a 260 nm y 280 nm.
La absorbancia a 260 nm proporciona el contenido
total de ácido nucleico, mientras que la absorbancia 2. Calcule la concentración de ADN usando la fórmula A260 ×
a 280 nm determina la pureza de la muestra. Dado dilución × 50 = µg ADN/mL.
que los nucleótidos libres, el ARN, el ssDNA y el 3. Calcular la relación A260/A280. Una
dsDNS se absorben a 260 nm, todos contribuyen a la relación de ~1,8 se considera pura.
absorbancia total de la muestra.
Las muestras de ADN se pueden cuantificar por absorbancia sin dilución previa
utilizando NanoDrop™espectrofotómetro. Consulte las instrucciones del instrumento
para obtener más información.
Fluorescencia • Cuantificar el rendimiento de dsDNA usando el Qubit apropiado™o Quant-it™Kit de
ensayo de ADN ds (n.º de catálogo Q32850, Q32851, Q33120 o Q33130).
La fluorescencia mide selectivamente el ADN
intacto, pero no mide la proteína u otro Consulte las instrucciones del kit para obtener más información.
contaminante presente en la muestra
Tabla 6ADN típico (A260/280de 1.6–1.8) rendimientos de varios materiales de partida
Material de partida Cantidad rendimiento de ADN
fibroblastos 1 × 106células 5–7 µg
Células cultivadas, mamífero 1 × 106células 5–7 µg
Músculos esqueléticos y cerebro 1 mg 2–3 µg
Placenta 1 mg 2–3 µg
Hígado 1 mg 3–4 µg
Riñón 1 mg 3–4 µg
a.Añadir 1,5 mL de isopropanol al sobrenadante de fenol-etanol por 1 mL de TRIzol™Reactivo utilizado para la
lisis.
b.Incubar durante 10 minutos.
C.Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 ×gramoa 4°C para sedimentar las proteínas.
d.Desechar el sobrenadante con una micropipeta.
a.Prepare una solución de lavado que consta de clorhidrato de guanidina 0,3 M en etanol al 95%.
b.Resuspender el precipitado en 2 mL de solución de lavado por 1 mL de TRIzol™Reactivo utilizado para la lisis.
C.Incubar durante 20 minutos.
Nota:Las proteínas se pueden almacenar en solución de lavado durante al menos 1 mes a 4 °C o durante al menos 1 año a -20 °C.
d.Centrifugar durante 5 minutos a 7500 ×gramoa 4°C.
mi.Desechar el sobrenadante con una micropipeta.
F.Repita el paso 2b–paso 2e dos veces.
gramo.Agregue 2 ml de etanol al 100 % y mezcle en un vórtex brevemente.
H.Incubar durante 20 minutos.
i.Centrifugar durante 5 minutos a 7500 ×gramoa 4°C.
j.Desechar el sobrenadante con una micropipeta.
k.Seque al aire el gránulo de proteína durante 5 a 10 minutos.
¡IMPORTANTE!No seque el sedimento con una centrífuga al vacío.
a.Resuspender el precipitado en 200 μl de SDS al 1 % pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
Nota:Para garantizar la resuspensión completa del sedimento, le recomendamos que incube la muestra a 50 °C en
un baño de agua o bloque térmico.
b.Centrifugar durante 10 minutos a 10.000 ×gramoa 4°C para eliminar los materiales insolubles.
C.Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
Proceda directamente a las aplicaciones posteriores o almacene la muestra a –20 °C.
 4 Determinar el rendimiento de proteína• Mida la concentración de proteína mediante el ensayo de

Bradford. Nota:La concentración de SDS debe ser <0,1%.

Dializar las proteínas 3.Centrifugar el dializado durante 10 minutos a 10.000 ×gramoa 4°C.

1.Cargue el sobrenadante de fenol-etanol en la membrana de diálisis.
Nota:La solución de fenol-etanol puede disolver algunos tipos de membranas de
diálisis (éster de celulosa, por ejemplo). Pruebe el tubo de diálisis con la
membrana para evaluar la compatibilidad antes de comenzar.
4.Transfiera el sobrenadante que contiene las proteínas a un tubo nuevo.
5.(Opcional)Solubilice el sedimento agregando 100 μl de SDS al 1 % y
100 μl de urea 8 M.
Proceda directamente a las aplicaciones posteriores o almacene la muestra a – 20 °C.

2.Dializar la muestra frente a 3 cambios de SDS al 0,1 % a 4 °C. Realice el

primer cambio de solución después de 16 horas, el segundo cambio 4
horas después (a las 20 horas) y el último cambio 2 horas después (a las
22 horas).
Nota:Se requiere una concentración de SDS de al menos 0,1 % para volver a
solubilizar las proteínas del sedimento. Si lo desea, el SDS se puede diluir después
de la solubilización.

Solución de problemas

Observación Causa posible Acción sugerida

Se observa un rendimiento inferior al Las muestras se homogeneizaron o Disminuya la cantidad de material de partida.
esperado lisaron de forma incompleta.
Corte las muestras de tejido en trozos más pequeños y asegúrese de que el tejido esté
completamente sumergido en TRIzol™Reactivo para lograr la lisis total.

El sedimento se solubilizó de Aumente la tasa de solubilización pipeteando la muestra

forma incompleta. repetidamente y caliéntela a 50–60 °C.
La muestra se degrada Las muestras no se procesaron ni congelaron La muestra debe procesarse o congelarse inmediatamente después de la recolección.
inmediatamente después de su recolección.

Las preparaciones de muestra se Almacene las muestras de ARN entre –60 y –70 °C. Almacene las muestras de ADN y proteínas a –
almacenaron a la temperatura incorrecta. 20 °C.

El ARN o ADN está contaminado. La interfase/fase orgánica se No intente extraer toda la capa acuosa después de la separación de
pipetea con la fase acuosa. fases.
La fase acuosa se elimina de forma Retire los restos de la fase acuosa antes de la precipitación del ADN.
incompleta.

El sedimento de ADN no se lava lo Asegúrese de que el sedimento se lave con citrato de sodio 0,1 M en etanol al 10 %.
suficiente con citrato de sodio 0,1 M en
etanol al 10 %.

El ARN A260/280la proporción es baja
El ADN A260/280la proporción es baja
La muestra fue homogeneizada en un
volumen insuficiente de TRIzol™
Reactivo.
La fase orgánica se elimina de forma
incompleta.
El fenol no se eliminó suficientemente
de la preparación de ADN.
Añadir la cantidad adecuada de TRIzol™Reactivo para su tipo de muestra.
No intente extraer toda la capa acuosa después de la separación de
fases.
Lavar el sedimento de ADN una vez más en citrato de sodio 0,1 M en etanol
al 10%.

Chomczynski, P. y Sacchi, N. 1987Método de un solo paso de aislamiento de ARN

Garantía limitada del producto
mediante extracción ácida de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. Anal.
Life Technologies Corporation y/o sus afiliados garantizan sus productos
Bioquímica162, 156-159
según lo establecido en los Términos y condiciones generales de venta de
Life Technologies que se encuentran en el sitio web de Life Technologies Hummon, AB, Lim SR, Difilippantonio, MJ y Ried, T. 2007 Aislamiento y
en www.thermofisher.com/us/en/home/global/terms- solubilización de proteínas tras TRIzol®extracción de ARN y ADN del material del
andconditions.html. Si tiene alguna pregunta, comuníquese con Life paciente después de un almacenamiento prolongado.biotécnicas42, 467-472
Technologies alwww.thermofisher.com/support.

Referencias
Chomczynski, P. 1993.Reactivo para el aislamiento simultáneo en un solo paso de ARN,
ADN y proteínas a partir de muestras de células y tejidos.biotécnicas15, 532-537

trizol™Guía del usuario de reactivos 5

La información de esta guía está sujeta a cambios sin previo aviso.

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Revisión histórica:Pub. N.º MAN00001271

Revisión Fecha Descripción
A.0 09 noviembre 2016 Se agregaron referencias a Phasemaker.™tubos
— 13 diciembre 2012 Línea de base para la revisión.

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9 noviembre 2016