INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Centro de Desarrollo de Productos Bióticos

Estructura y función de almidón de cuatro

variedades de garbanzo

TESIS

Que para obtener el Grado de

Maestría en Ciencias en Desarrollo de Productos Bióticos
PRESENTA

Lucero Marlen Yniestra Marure

Directores de tesis

Dr. Luis Arturo Bello Pérez

Dra. María del Carmen Núñez Santiago

Yautepec de Zaragoza, Morelos; Junio del 2018.

Este trabajo se realizó en Laboratorio de Control de Calidad
del Departamento de Desarrollo Tecnológico del Centro de
Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico
Nacional bajo la dirección del Dr. Luis Arturo Bello Pérez y la
Dra. María del Carmen Núñez Santiago.

Se agradece al consejo Nacional de Ciencia y Tecnología

(CONACYT), así como a la secretaria de investigación y
posgrado (SIP-IPN) por las becas otorgadas para la
realización de estos estudios.
 Resumen

El garbanzo es una leguminosa de gran importancia para los sistemas agrícolas

de países en desarrollo por su aporte nutricional en la dieta humana y de ganado.
En México, la producción de garbanzo es de 217 mil toneladas anuales, con lo que
se posiciona entre los países con mayor producción a nivel mundial. Las
características físicas del garbanzo (tamaño y color) varían según la especie y el
lugar donde es cultivado. El garbanzo ha generado un gran interés dentro de la
investigación debido a su alto contenido proteico y de carbohidratos, siendo el
almidón el más abundante. Sin embrago, existe una deficiencia en la información
sobre almidón de garbanzo, el estudio de su estructura y su relación con las
propiedades fisicoquímicas. El objetivo de este proyecto es estudiar las
propiedades moleculares, fisicoquímicas y de digestibilidad del almidón de cuatro
variedades de garbanzo para relacionarlas entre sí. Los estudios moleculares
consistieron en la determinación de la masa molecular promedio (MM), radio de
giro (RZ), longitud de cadena promedio (GPn) y difracción de Rayos x de la
amilopectina; y en los fisicoquímicos se determino temperaturas de gelatinización
y formación de pastas. El almidón de garbanzo tiene una forma ovoide de
superficie lisa con diámetro promedio de 20 μm. El MM de la amilosa y
amilopectina fue de 2.15 - 2.80 x 105 g.mol-1 y 1.03-2.94 x 108 g.mol-1
respectivamente. El Rz vario de 118 a 165 y 181 a 260 nm respectivamente. El
GPn =16. El patrón de difracción de Rayos X es tipo C, con una mayor proporción
de cadenas cortas tipo A y B1 que representan el 85 %. Las temperaturas de inicio
de gelatinización (Tini) oscilaron entre 63.3 y 65.3 °C y temperatura máxima (Tmax)
entre 67.8 y 69.6 °C las cuales están relacionadas con el alto contenido de
longitudes de cadena corta. El ∆H indica la existencia de un bajo ordenamiento en
las cadenas de amilopectina. El alto contenido de amilosa produce pastas con
valores de viscosidad altos. El almidón de garbanzo presenta un alto contenido de
almidon resistente (AR = 73 %), probablemente como efecto del alto contenido de
cadenas cortas y poco acceso a los puntos de ramificación de la amilopectina.

II
 Abstract

The chickpea is a legume of great importance for the agricultural systems of

developing countries for their nutritional contribution in the human diet and
livestock. In Mexico, the production of chickpeas is 217 thousand tons per year,
which places it among the countries with the highest production worldwide. The
physical characteristics of the chickpea (size and color) vary according to the
species and the place where it is grown. The chickpea has generated great interest
in research due to its high protein and carbohydrate content, with starch being the
most abundant. However, there is a deficiency in the information on chickpea
starch, the study of its structure and its relationship with physicochemical
properties. The objective of this project is to study the molecular, physicochemical
and digestibility properties of the starch of four varieties of chickpea to relate them
to each other. The molecular studies consisted in the determination of the average
molecular mass (Mw), radius of gyration (Rz), average chain length (GPn) and x-
ray diffraction of amylopectin; and in the physicochemicals, temperatures of
gelatinization and formation of pastes were determined. Chickpea starch has a
smooth surface ovoid shape with an average diameter of 20 μm. The Mw of
amylose and amylopectin was 2.15 - 2.80 x 105 g.mol-1 and 1.03-2.94 x 108 g.mol-
1
respectively. The Rz varied from 118 to 165 and 181 to 260 nm respectively. The
GPn = 16. The X-ray diffraction pattern is type C, with a higher proportion of short
chains type A and B1 representing 85%. The gelatinization start temperatures (To)
ranged between 63.3 and 65.3 ° C and maximum temperature (Tp) between 67.8
and 69.6 ° C which are related to the high content of short chain lengths. The ΔH
indicates the existence of a low order in the amylopectin chains. The high amylose
content produces pastes with high viscosity values. Chickpea starch has a high
content of resistant starch (RS = 73%), probably as an effect of the high content of
short chains and little access to branching points of amylopectin.

III
 CONTENIDO
Resumen……………………………………………………………………………………………II

Contenido……………………………………………………………………………………….....III

Índice de Tablas…………………………………………………………………………………..V

Índice de Cuadros……………………………………………………………………..…………VI

Introducción ....................................................................................................................................... 1
I Antecedentes .................................................................................................................................. 2
1.1 Garbanzo................................................................................................................................. 2
Morfología del garbanzo ......................................................................................................... 3
Importancia económica............................................................................................................ 4
Usos actuales ............................................................................................................................ 5
1.2 Almidón.................................................................................................................................... 5
Composición química ............................................................................................................... 5
Forma, tamaño y morfología del granulo .............................................................................. 6
1.3 Estructura molecular del almidón ................................................................................... 7
Niveles de Organización.......................................................................................................... 7
Arreglo cristalino ..................................................................................................................... 10
Métodos empelados para estudiar la estructura de los almidones .................................... 12
1.4 Propiedades fisicoquímicas................................................................................................ 12
Gelatinización .......................................................................................................................... 12
1.5 Digestibilidad ............................................................................................................................ 14
1.6 Relación estructura- función en el almidón.......................................................................... 15
II. Justificación................................................................................................................................. 18
III Hipótesis ...................................................................................................................................... 18
IV. Objetivos .................................................................................................................................... 19
4.1 Objetivo General .................................................................................................................. 19
4.2 Objetivos Específicos .......................................................................................................... 19
V. Metodología ................................................................................................................................ 20
5.1 Diagrama de flujo metodológico ........................................................................................ 20
5.2 Materiales .............................................................................................................................. 21

IV
 5.3 Métodos ................................................................................................................................ 21
5.3.1 Aislamiento del almidón................................................................................................... 21
5.3.2 Purificación de los almidones. ........................................................................................ 21
5.3.3 Composición Química ...................................................................................................... 22
Humedad ................................................................................................................................. 22
Cenizas .................................................................................................................................... 22
Proteínas .................................................................................................................................. 22
Almidón Total (Pureza) .......................................................................................................... 23
Amilosa (%) ............................................................................................................................ 24
5.3.4 Estructura........................................................................................................................... 25
Difracción de rayos X ............................................................................................................. 25
5.3.5 Propiedades fisicoquímicas ............................................................................................ 28
Morfología ................................................................................................................................ 28
Distribución de tamaño de partícula ........................................................................................ 29
Temperatura y entalpía de gelatinización ............................................................................... 29
Formación de pastas ................................................................................................................. 29
5.3.6 Digestibilidad in vitro ........................................................................................................ 30
VI. Resultados y discusión ............................................................................................................ 31
6.1 Composición química .......................................................................................................... 31
6.2 Análisis estructural............................................................................................................... 32
6.2.1 Difracción de Rayos X ..................................................................................................... 32
6.2.2 Masa molecular promedio (MM) y radio de giro (RZ) ................................................... 33
6.2.3 Distribución de tamaño de longitud de cadena de amilopectina............................... 36
6.3 Propiedades fisicoquímicas.................................................................................................... 38
6.3.1 Morfología y tamaño de partícula .................................................................................. 38
6.3.2 Calorimetría Diferencial de Barrido ............................................................................... 41
6.3.3 Formación de pastas ....................................................................................................... 43
6.4 Digestibilidad in vitro ........................................................................................................... 45
VII. Conclusiones ............................................................................................................................ 48
VIII. Perspectivas ............................................................................................................................ 49
VIII Bibliografía ................................................................................................................................ 50

V
 Índice de figuras
Página
Figura
1 Estructura interna de la semilla de garbanzo 4
2 Estructura del granulo a diferentes niveles de organización 7

3 Estructura de amilosa 8

4 Estructura de amilopectina 8
5 Estructura de cristales de almilopectina 11

6 Esquema de granulo de almidón de guisante liso en donde se 11

muestran la zona central rica en cristales tipo B y la periferia es rica en
cristales tipo A
7 Representación esquemática de los cambios en el almidón durante la 14
gelatinización
8 Diagrama experimental de trabajo 20

9 Patrones de difracción de Rayos X del almidón de las cuatro 33

variedades de garbanzo

10 Fractograma de las cuatro variedades de almidón de garbanzo 35

11 Distribución de longitud de cadenas de amilopectina de almidón de 37

garbanzo variedad Blanco

12 Micrografías obtenidas por microscopía electrónica de barrido de 39

almidones de garbanzo de diferentes variedades

13 Micrografías de almidón de garbanzo por (a) luz transmitida y (b) luz 40

polarizada

14 Distribución de tamaño de gránulo en almidón de garbanzo “suprema” 41

15 Perfil de viscosidad del almidón de las cuatro variedades de garbanzo. 44

16 Perfil de viscosidad de tres almidones: Garbanzo (Blanco), maíz 45

normal y waxy

VI
 Índice de cuadros
Cuadro Pagina

1 Formas y dimensiones de gránulos de almidón de diferentes 6

leguminosas.

2 Composición química del almidón de garbanzo 32

3 Masa molecular promedio y radio de giro de amilosa y amilopectina de 35

almidones de garbanzo
4 Distribución de longitud de cadena de amilopectina en almidones 37
nativos de garbanzo
5 Temperaturas y entalpía de gelatinización de almidones de garbanzo 42

6 Fracciones de almidón de garbanzo (ADR, ADL, AR) 47

VII
 Introducción

El garbanzo (Cicer arietenium L.) es una leguminosa de gran importancia

económica debido a su alta producción a nivel mundial, ocupando el tercer lugar
en consumo entre las leguminosas. Su distribución se encuentra principalmente en
países con climas cálidos como la India, Pakistán, Irán, Etiopia, México y el área
del mediterráneo. En 2014 se produjeron 171,665 toneladas en el Noroeste de
México lo cual representa el 1.20 % del garbanzo en el mundo (FAO, 2014). Esta
leguminosa es un alimento básico en países tropicales y subtropicales (Williams et
al, 1987). Actualmente el garbanzo es utilizado por su alto contenido proteico sin
embargo no existe un enfoque basado a su componente mayoritario que es el
almidón (Guerrero et al., 1998). Esta leguminosa se agrupa generalmente por el
color, tamaño y distribución geográfica dando lugar a dos tipos: Desi y Kabuli, de
las cuales, este último se emplea principalmente para consumo humano. El
garbanzo está constituido principalmente por proteínas y carbohidrato. La mayor
parte de carbohidratos está constituida por el almidón (Chavan et al., 1986). El
garbanzo es comúnmente consumido en forma entera, en pastas como plato
principal o como bocadillo. Sin embargo, en los últimos años se han realizado
diversos estudios para potencializar el uso del garbanzo en el área de alimentos
ya que puede utilizarse como sustituto de harina de trigo en alimentos sin gluten
(Flores-Silva et al., 2014). A través del tiempo se han realizado diversos estudios
con respecto al almidón de garbanzo, los cuales se han orientado al estudio de
sus propiedades fisicoquímicas y funcionales para obtener información de la
funcionalidad del garbanzo en productos elaborados con leguminosa (Botham et
al., 1995). Existe escasez de información sobre la relación estructura función en
variedades de garbanzo, lo cual es una parte fundamental para la base de futuras
investigaciones que permitiría encontrar y mejorar diversas funcionalidades de
este almidón. Es por esta razón que el objetivo de esta investigación se baso en el
estudio de la estructura del almidón de cuatro variedades de garbanzo (Blanco,
Suprema, Jumbo y Blanoro) a diferentes niveles de organización y relacionarlo con
sus propiedades fisicoquímicas y funcionales.

1
 I Antecedentes

1.1 Garbanzo

El garbanzo (Cicer arietenium L.) es una planta herbácea cuyo fruto es una vaina
con una o dos semillas. Dichas semillas son leguminosas las cuales tienen un
papel importante dentro de los recursos alimentarios debido a su alto contenido
proteico, fibra y minerales (Guerrero, 1998). Su distribución se encuentra
principalmente en países con climas cálidos como la India, Pakistán, Irán, Etiopia,
México, Argentina y el área del mediterráneo. El color, tamaño y forma del
garbanzo varía según el tipo de variedad. Esta leguminosa se agrupa
generalmente en dos tipos: Desi y Kabuli. El tipo Desi es una semilla pequeña de
color oscuro y una superficie rugosa mientras que la semilla Kabuli es grande, de
color beige y superficie lisa (Saini, 1984).

En México, el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y

Pecuarias (INIFAP) ha creado nuevas variedades de garbanzo para mejorar sus
niveles de producción, así como su resistencia al ataque de plagas. Entre estas
variedades se encuentran las denominadas Blanco, Blanoro, Jumbo y Suprema.

La variedad Blanco proviene de la cruza de garbanzo Santo Domingo y Blanco

lechosos. Su color es blanco cremoso con corrugaciones marcadas. Posee
resistencia a F. Oxysporum y F. Solani. Tiene una gran aceptación en el Noreste
de México debido a su alta capacidad de rendimiento y características de grano
blanco cremoso (Salinas-Pérez et al., 2008).

Blanoro es una variedad que se derivó de una cruza triple de los garbanzos L-
4924x, Blanco lechoso y Blanco de Sinaloa. Esta variedad presenta un color
ligeramente claro, con forma y rugosidad aceptada en el mercado internacional.
Su principal característica es presentar una alta tolerancia a la “rabia” causada por
el hongo Fusarium Oxysporum, F. sp. Ciceris (Ortega-Murrieta et al., 2016).

2
La variedad Jumbo 2010 se originó de la cruza simple Dwelley y Blanco Sinaloa-
92. Esta variedad tiene una alta tolerancia a “rabia” similar a la variedad Blanco
Sinaloa-92. Todo el proceso de formación de la línea experimental se efectuó en el
Campo Experimental Costa de Hermosillo del INIFAP (Valenzuela–Herrera et al.,
2010).

El garbanzo de la variedad Suprema proviene de la cruza de dos líneas de Blanco

y fue liberada por el INIFAP en el año 2003. Tiene una coloración de grano blanco
lechoso y tiene una marcada rugosidad (Salinas-Pérez et al., 2008).

Dado que son variedades nuevas, el presente trabajo aborda un estudio

sistemático del almidón de dichas variedades, haciendo énfasis en la importancia
del estudio estructural y su relación con las propiedades funcionales del mismo.

La composición química promedio del garbanzo es: 22% de proteína, 4.5% de

grasa, 8% de fibra cruda, 2.7% de cenizas y 63% de carbohidratos. La mayor
parte de carbohidratos está constituida por el almidón el cual se encuentra en un
porcentaje de entre 37.5 y 50.8% (Chavan et al., 1986).

Morfología del garbanzo

El garbanzo (Cicer arietinum) es una planta anual diploide. Sus raíces tienen las
características de profundizar en el suelo de manera considerable teniendo como
resultado una resistencia a suelos áridos o secos. El tallo principal es redondeado,
el cual puede alcanzar una altura de hasta 60 cm (Hernández et al., 2011).

El fruto es una vaina en donde se encuentran de dos a tres semillas en su interior.

El tamaño de las semillas varía entre 8 a 11 mm de largo y 6 a 8 mm de ancho,
son asimétricas con el lóbulo radial prominente. La destacada exposición del
lóbulo radical les da un aspecto de “picudas”, siendo la zona más sensible de la
semilla.

3
La semilla es exendospermada por el gran desarrollo de los cotiledones, los
cuales presentan un endosperma laminar que recubre todo el embrión. En la figura
1 se observa la estructura interna de la semilla. En donde se observa el eje
embrionario constituido por la radícula, hipocotilo y plúmula, el cual puede tener
una aspecto recto o con una ligera torsión. La radícula es lineal con ápice
ligeramente curvado (Carreras et al., 2016).

Figura 1. Estructura interna de la semilla de garbanzo. Fuente: Carreras et al.,2016.

Importancia económica

El garbanzo es la tercera leguminosa más consumida alrededor del mundo y

México es uno de los principales países productores. En el 2014 se produjeron
171,665 toneladas en el Noroeste de México, lo cual representó el 1.20 % del
garbanzo comercializado a nivel mundial con un precio de 681.7 USD por
tonelada. México también destaca por la alta exportación de dicha leguminosa, ya
que, de la producción nacional se exportó un 21.6 %, lo cual representan 37,000
toneladas (FAO, 2014). El resto se empleó en el consumo nacional en la
elaboración de alimentos para ganado, consumo humano y en la industria
alimentaria.

4
Usos actuales

Tradicionalmente, el garbanzo se ha empleado para consumo humano como

complemento en la dieta de los mexicanos, o bien como suplemento en la
elaboración de alimentos para ganado debido a su alto contenido proteico. Sin
embargo se han realizado diversos estudios para diversificar su uso en el área de
alimentos, tales como la combinación de las proteínas de granos y de leguminosas
que proporcionen un mayor equilibrio de aminoácidos esenciales (Livingstone et
al., 1993). El uso del garbanzo en pastas permite el aumento del contenido de
minerales y disminuye la respuesta glucémica (Goñi y Valentín-Gamazo, 2003).
También se han realizado bocadillos con alto valor nutricional para niños con
desnutrición (Chavez-Jauregui et al., 2003).

La utilización de harinas de garbanzo ha tenido un gran impacto en la industria

alimentaria debido a sus características funcionales: tiene una buena capacidad
de absorción de agua y retención de aceites, capacidad emulsificante y capacidad
de formación de espuma (Abou et al., 2010). Finalmente, el garbanzo se puede
utilizar como ingrediente principal en la panificación haciendo sustitución de la
harina de trigo, ya que se ha demostrado que es una fuente principal de proteínas
de calidad sin gluten (Flores-Silva et al., 2014). Sin embargo, no hay muchos
trabajos que aborden el estudio estructural de los almidones de esta leguminosa
para relacionarlo con sus propiedades funcionales.

1.2 Almidón

Composición química

El almidón es un polisacárido de almacenamiento energético el cual se localiza

principalmente en plantas superiores. Se encuentra como gránulos en los
cloroplastos de las hojas verdes, amiloplastos de semillas y tubérculos (Ellis et
al.,1998). El almidón se encuentra almacenado en partículas semi-cristalinas,

5
donde el porcentaje de cristalinidad oscila entre 15 a 45 %, dependiendo de la
fuente botánica, distribución de los gránulos y la composición del almidón. Los
gránulos están compuestos por dos tipos de α-glucanos: amilosa y amilopectina,
ambos están compuestos por monómeros de glucosa.

Forma, tamaño y morfología del granulo

La forma de los gránulos de almidón tiene una gran diversidad, la cual depende
del origen botánico. Algunos de ellos son redondos, esféricos, ovalados o
irregulares. La longitud y anchura de los gránulos son de tamaños variables que
pueden estar en un intervalo de 6 a 60 µm. (Cuadro 1) (Wani et al., 2016). Cabe
destacar que los gránulos son semi-cristalinos, lo que indica que dentro de su
estructura cuenta con partes cristalinas y amorfas distribuidas en forma de anillos
radiales alternados. La estructura de los anillos amorfos es poco conocida y se
cree que la mayor parte está constituida por amilosa, sin embargo, es probable
que la amilopectina también sea parte de estos anillos (Vamadeva et al., 2014)

Cuadro 1. Formas y dimensiones de gránulos de almidón de diferentes

leguminosas.

Fuente de Longitud Anchura Forma

almidón (μm) (μm)
Garbanzo 14 – 30 9 – 30 Ovalado, esférica

Lenteja 6 – 37 6 – 32 Ovalado, esférico,

elíptico

Frijol 10 – 42 6 – 32 Ovalado, redondo,

irregular

Chícharo 10 – 49 7 – 30 Ovalado, irregular

Fuente: Wani et al. (2016).

6
1.3 Estructura molecular del almidón

Niveles de Organización

La arquitectura interna del gránulo de almidón está constituida por anillos

concéntricos cristalinos y amorfos, los cuales se encuentran en capas alternas. Es
importante saber la relación entre la amilosa y la amilopectina ya que es uno de
los principales factores que determinan las propiedades funcionales del almidón.
Los anillos amorfos están constituidos por amilosa y los inicios de las
ramificaciones de la amilopectina. Las láminas cristalinas tienen principalmente
cadenas de amilopectina que forman dobles hélices, las cuales se encuentran
empaquetadas, lo que les permite generar una red cristalina (Maaran et al., 2014).

Existen diferentes opiniones con respecto a los niveles de organización sin

embargo coinciden en los cuatro principales (Figura 2):

Nivel 4

Gránulo de almidón

Figura. 2 Estructura del granulo a diferentes niveles de organización.

7
Nivel 1. Este nivel se encuentra constituido por cadenas individuales de amilosa y
amilopectina en donde se define la distribución de las longitudes de cadena.

La amilosa es una molécula esencialmente lineal con enlaces α-(1-4) (Figura 3),
con una baja proporción de enlaces α-(1-6) (Buleón et al., 1998). Su tamaño es
dependiente de la fuente botánica. Su MM oscila entre 1 × 10 5 a 1 × 10 6 Da. Su
grado de polimerización (GP) varía en un intervalo de 324 a 4,920.

Figura 3. Estructura de amilosa. Fuente: Tester et al., 2004.

La amilopectina es una molécula con una estructura fundamentalmente

ramificada, tiene enlaces α-(1-4) y α-(1-6) (Figura 4) (Buléon, et al., 1998). Su MM
varía entre 1 × 107 y 1 × 109 Da. El GP de 9,600 a 15,900 (Tester et al., 2004).

Figura 4. Estructura de amilopectina. Fuente: Tester et al., 2004.

8
Nivel 2. Este nivel está constituido principalmente por la amilopectina que es una
molécula altamente ramificada, por lo que resulta complicada su caracterización
teórica y experimental. Las cadenas de amilopectina se pueden clasificar en tres
grupos. Peat et al.,(1952) hicieron una división básica de las cadenas y definieron
a las cadenas A como insustituibles las cuales no tienen ramas consecutivas y se
encuentran unidas a las cadenas B o C a través de enlaces α-(1-6) en su extremo
reductor. Las cadenas B poseen ramas posteriores que están conectadas a través
de enlace α-(1-6) en el extremo reductor de las ramas y finalmente numerosas
ramas están unidas a una cadena C. Dicha cadena es única en cada
macromolécula y lleva el único grupo reductor, siendo así la base de la
complejidad en la estructura de la amilopectina. Hanashiro et al. (1996) sugirieron
que las cadenas tipo A tienen cadenas con una longitud entre 6 y 12, las tipo B1
una longitud de 13 a 24, las tipo B2 una longitud de 25 a 36 y las cadenas B3
tienen longitudes de cadena ≥37. Con respecto a las cadenas tipo C, éstas
cubren un intervalo de 10 a 130 GP.

La organización de las cadenas de amilopectina es de gran importancia para la

comprensión de la estructura y arquitectura de toda la macromolécula.
Actualmente la organización no es totalmente clara, sin embargo existen dos
hipótesis, el modelo de “cluster” y el modelo de bloques de construcción (building
block). El modelo del cluster sugiere que las cadenas de unidades cortas están
organizadas en grupos y las cadenas largas son las que interconectan. Por otro
lado el modelo de “building block” sugiere que los conglomerados se forman a
partir de unidades estructurales aun más pequeñas llamadas bloques de
construcción. Estas unidades consisten en aproximadamente 10 cadenas de
segmentos “inter-cluster”. Se sugiere que los bloques de construcción se
extienden a lo largo de una columna vertebral. (Varatharajan et al.,2015).

Nivel 3. En la estructura laminar del almidón nativo, las cadenas de los glucanos
de amilopectina forman dobles hélices de manera ordenada conformando
empaquetamiento entre las dobles hélices, lo cual permite la creación de regiones

9
cristalinas. En el caso de la amilosa se cree que se encuentra en las partes
amorfas.

Nivel 4. El gránulo es la forma nativa en la que se encuentra el almidón. Está

compuesto por un hilum que se forma parte de la zona concéntrica del gránulo. A
partir del hilum, se encuentran los anillos concéntricos de crecimiento amorfos y
cristalinos, los cuales se van alternando alrededor del hilum del granulo formando
laminillas. Las zonas amorfas están constituidas principalmente por puntos de
ramificación de las moléculas de amilopectina y por amilosa la cual, se piensa que
está entrelazada entre las dobles hélices de la amilopectina. La zona cristalina
está constituida por las moléculas de amilopectina que están organizadas por
dobles hélices (Dona, et al., 2010).

Arreglo cristalino

El arreglo de las dobles hélices de la amilopectina va a dar origen a diferentes

tipos de patrones de cristalinidad, el cual se obtiene por medio de difracción de
Rayos X. Existen tres tipos de patrón: A, B y C (Figura 5). La estructura del
almidón tipo A tiene amilopectina con longitudes de cadena promedio de 23 a 29
unidades de glucosa. Generalmente se encuentra en almidones de cereales. El
patrón tipo B tiene longitudes de cadenas de amilopectina de 30 a 44 moléculas
de glucosa. Este patrón se encuentra principalmente en tubérculos. Por último, se
encuentra el tipo C el cual es una combinación del A y B, tiene longitudes de
cadena de 26 a 29 monómeros de glucosa (Sajilata, et al., 2006). Las cadenas de
amilopectina se empaquetan de manera diferente en cada uno de los tipos de
almidón, en donde el tipo A es relativamente compacto con una baja proporción de
agua estructural, mientras que en el tipo B, el embalaje es menos compacto, con
una estructura un poco más abierta conteniendo un núcleo hidratado (Figura 5) (
Maaran et al., 2014).

10
Figura. 5 Estructura de cristales de almilopectina. Fuente: Gallant et al.,1997.

En cuanto al patrón de cristalinidad tipo C, la ubicación exacta de los patrones de

difracción tipo A y B ha sido tema de debate a lo largo de los años, por esta razón
Buleon (1998) realizó un estudio con chícharo liso utilizando como técnica un
mapeo de microfocos y concluyó que en esta leguminosa, el centro de los
gránulos de almidón es rico en un patrón de cristal tipo B, mientras que la periferia
es rica en patrón de difracción tipo A como se encuentra en la Figura 6.

Cristal tipo A

Cristal tipo B

Granulo de almidón

Figura. 6 Esquema de granulo de almidón de guisante liso en donde se

muestran la zona central rica en cristales tipo B y la periferia es rica en
cristales tipo A. Fuente: Buleon et al., (1998).

11
Métodos empelados para estudiar la estructura de los almidones

El análisis estructural de las molécula de almidón, como MM, RZ y distribución de

longitud de cadenas de la amilopectina es importante porque nos permite la
comprensión de la relación entre la estructura, la biosíntesis, las propiedades
funcionales, fisicoquímicas y de digestibilidad (Cave et al.,2009). Las pequeñas
diferencias en la estructura interna del almidón puede explicar grandes diferencias
en las propiedades funcionales (Bertoft et al.,2016).

Existen diversos métodos de separación y estudio de la amilosa y la amilopectina.

Entre las más empleadas se encuentra la cromatografía de exclusión por tamaño,
el fraccionamiento por flujo cruzado, la ultracentrifugación analítica, la detección
por dispersión de luz multiangulo, y el índice de refracción (RI), entre otras. Sin
embargo éstas técnicas presentan algunos inconvenientes, como problemas para
la disolución de la muestra (Bello-Pérez et al.,2017). En este trabajo se utiliza el
método del fraccionamiento de flujo en campo asimétrico (AF4) junto con la
dispersión de luz laser multiangular (MALLS) con detector de índice de refacción
(RID). AF4 se utiliza en la cuantificación de la MM y el RZ de las cadenas
poliméricas de la amilosa y la amilopectina. Mientras que, la estructura fina de la
amilopectina se determina mediante el estudio de distribución de longitud de
cadena apoyada en la desramificación enzimática de enlaces α-1,6. Una vez
desramificada, se cuantifican las cadenas poliméricas a través de cromatografíca
de intercambio aniónico de alto rendimiento (HPAEC) (Hoyo-Leyva et al., 2017).

1.4 Propiedades fisicoquímicas

Gelatinización

La gelatinización es un proceso en donde los gránulos de almidón se someten a

altas temperaturas en un exceso de agua, dando lugar a un fenómeno de
transición de fase orden-desorden. En la Figura 7 se representa el proceso de
gelatinización: partiendo de un almidón nativo que se encuentra en contacto con

12
una gran cantidad de agua (a en la fig. 7), los gránulos de almidón comienzan a
hidratarse por efecto de la temperatura (b en la fig. 7). Posteriormente, los
puentes de hidrógeno de la región amorfa del granulo se rompen permitiendo que
el agua se asocie con los grupos hidroxilos libres. Al ocurrir este fenómeno, el
granulo se hincha y comienza la lixiviación de amilosa al solubilizarse para pasar
a formar parte de la fase acuosa (c en la fig. 7). Una vez concluido el proceso de
gelatinización, la amilosa formará parte de la fase acuosa mientras que la
amilopectina permanecerá en forma de gránulos hinchados en la fase dispersa (d
en la fig. 7). Normalmente, los almidones nativos se fracturan durante este
proceso y sus componentes moleculares pasan a la fase continua, quedando los
remanentes como “cáscaras vacías” o “fantasmas” (Atkin et al., 1998). Finalmente
ocurre un fenómeno llamado retrogradación, en donde las moléculas de amilosa
que se encuentran en la fase acuosa comienzan alinearse y re-asociarse en una
estructura ordenada (e en la fig. 7) (Sandoval-Aldana et al., 2005). Las
temperaturas de transición de gelatinización (Tini, Tmax y Tfinal) y la entalpia de
gelatinización (H) son influenciadas por la arquitectura molecular de las regiones
cristalinas del granulo de almidón. La técnica más empleada para medir estas
temperaturas es la calorimetría diferencial de barrido (DSC por sus siglas en
inglés) (Wani et al., 2016).

13
 (a) (b) (c)

(e) (d)

Figura. 7 Representación esquemática de los cambios en el almidón durante

la gelatinización. Fuente: Sandoval-Aldana et al., (2005).

1.5 Digestibilidad

La digestibilidad del almidón ocurre dentro tracto gastrointestinal, donde las

enzimas α-amilasas salivales y pancreáticas rompen la molécula de almidón en
oligosacaridos, como la maltosa y las α-dextrinas limites (moléculas ramificadas).
La digestibilidad se ha relacionado con el índice glucémico (IG) lo cual ayuda a
evaluar la calidad nutricional de los alimentos.

Englyst et al., (1992) desarrollaron un método in vitro para la clasificación del

almidón en función de su tasa de digestión en el intestino delgado por medio de
enzimas digestivas Dichas fracciones son: almidón de rápida digestibilidad (ADR)
la cual es la fracción digerida durante los primeros 20 minutos; almidón de
digestión lenta (ADL) que corresponde a la fracción digerida entre los 20 minutos y

14
120 minutos; almidón resistente (AR) que es la fracción de almidón que
permanece sin hidrolizar después de los 120 minutos.

Las propiedades de digestión del almidón están fuertemente relacionadas con el

patrón de difracción de Rayos X, la longitud de cadena y puntos de ramificación,
así como la morfología y fuente botánica del almidón (Ao et al., 2007). En el caso
de almidones de cereales crudos, éstos tienen un alto contenido de ADR los
cuales tienen unas estructura semicristalina tipo A y un alto porcentaje de
cadenas cortas (Zhang et al., 2006). La disposición de los componentes del
almidón (amilosa y amilopectina) en los anillos concéntricos (zonas amorfas y
cristalinas) y sus patrones de ramificación determinan las características del ADL
(Magallanes et al., 2017).

1.6 Relación estructura- función en el almidón

El desarrollo de nuevas tecnologías ha permitido el avance en el estudio de los

polisacáridos de almidón, sin embargo, no es muy frecuente encontrar
investigaciones que relacionen la estructura molecular con la función de los
mismos. De ahí la importancia de incorporar estudios estructurales de estos
polisacáridos con las propiedades fisicoquímicas, de digestibilidad y relacionarlos
entre sí, buscando establecer de qué forma interaccionan sus componentes,
amilosa y amilopectina. En este contexto, el fenómeno de la gelatinización es un
fenómeno resultante de la pérdida del orden molecular de los gránalos de almidón,
y está directamente relacionada al hinchamiento de los gránulos y a la medición
de la consistencia de las pastas resultantes. Sin embargo, asumir una relación
directa entre el orden molecular y su impacto a una escala macromolecular puede
ser confuso, especialmente porque el hinchamiento de los gránulos de almidón
puede derivar en su ruptura y dar pasó a otro tipo de desorganización.

Por otro lado, las pastas resultantes de la cocción de almidones en exceso de

agua pueden ser descritas como dos fases: una fase continua que es rica en
amilosa solubilizada y una fase dispersa rica en amilopectina. Dependiendo de la

15
concentración de estos componentes en la pasta se observarán fenómenos
diferentes. En concentraciones bajas (< 2%), los gránulos de almidón cocido
(compuestos de amilopectina principalmente) precipitan y darán origen a una
separación de fases. En concentraciones altas (> 5%) la gran cantidad de
gránulos hinchados permitirá que éstos no precipiten, y que la presencia de la
amilosa en la fase continua de origen a la formación de un gel (Núñez-Santiago, et
al., 2004) y a la retrogradación paulatina del sistema. Finalmente, la capacidad de
la amilosa para formar una red tridimensional que derive en la formación de geles
dependerá esencialmente de su GP y de su concentración en la fase continua
(Gidley y Bulpin,1989).

Por otra parte, la disposición de los componentes del almidón (amilosa y

amilopectina) en los anillos concéntricos (zonas amorfas y cristalinas) y sus
patrones de ramificación determinan las características de digestión lenta
(Magallanes et al., 2017). Esta proporción está fuertemente relacionada con el
patrón de difracción de Rayos X, la longitud de cadena y el número de puntos de
ramificación de la amilopectina, así como la morfología y fuente botánica del
almidón (Ao et al.,2007). Así, los almidones de cereales crudos tienen un alto
contenido de ADL, los cuales tienen unas estructura semicristalina tipo A y un alto
nivel de cadenas cortas (Zhang et al.,2006).

Así, para la comprensión de estos fenómenos es importante conocer la estructura

a nivel micro de los componentes de los almidones y relacionarlos con sus
propiedades funcionales y de digestibilidad para aportar un avance en el
conocimiento de estos polisacáridos, que permita proponer su uso en sistemas
que permitan aprovechar sus propiedades fisicoquímicas conservando su valor
alimenticio.

1.7 Estudios realizados de almidón de garbanzo

Realizando un revisión de la literatura sobre trabajos reportados en almidones de

garbanzo, encontramos el estudio de seis variedades con origen en la India (Singh

16
et al., 2004). Estas seis variedades estudiadas, mostraron diferencias entres sus
propiedades morfológicas, fisicoquímicas y funcionales, siendo lo más
sobresaliente la diferencia en las propiedades térmicas y su resistencia al
hinchamiento, que es similar a leguminas. A partir de estas propiedades, estos
almidones se recomendaron en industrias que requieren de materia prima
termoestable. Por otra parte Miao et al., (2009) estudiaron la estructura de
almidones obtenidos de garbanzos tipo Desi y Kabulim, mediante MM, RZ y sus
propiedades fisicoquómicas, sin embargo no realizaron una relación entre sus
observaciones a nivel macro y micro. Dentro de los estudios más actuales se
encuentra el de Milan-Noris et al., (2016), quienes determinaron las características
estructurales, fisicoquímicas y digestibilidad de diez almidones de garbanzos
pigmentados (negro, marrón, verde, rojo y crema). Como resultados encontraron
una correlación entre las características de viscosidad y las fracciones de
digestibilidad. Demostraron que la pigmentación de garbanzo no afectaba a las
propiedades del almidón, determinan que estos almidones pueden ser empelados
para la elaboración de alimentos funcionales por su alto contenido de almidón
resistente.

En el presente trabajo se estudio la composición estructural y algunas propiedades

fisicoquimicas del almidón de cuatro diferentes variedades de garbanzo (Blanco,
Blanoro, Jumbo y Suprema). Dichas variedades son el resultado de una cruza de
otros tipos de garbanzos. Como aporte de esta investigación será un avance en el
conocimiento de estas variedades que actualmente se comercializan en México.

17
 II. Justificación

El garbanzo es un cultivo de importancia alimentaria. Gracias a su alto contenido

de proteínas, minerales, fibra dietética y almidón es considerado una fuente
alimentaria rica en nutrientes. Adicionalmente, ha cobrado importancia dado el
desarrollo de alimentos sin gluten adicionados con esta leguminosa, abriendo un
mundo de posibilidades en su uso. En México se han desarrollado nuevas
variedades de esta leguminosa buscando mejorar los niveles de producción y con
una mayor resistencia al ataque plagas, entre las que se encuentran cuatro
variedades que se estudiaron sistemáticamente en este trabajo. Una manera de
enriquecer y potencializar el uso de dicha leguminosa es conociendo su
componente mayoritario el cual es el almidón. Por esta razón se realizó el estudio
de características estructurales como, MM, RZ, distribución de cadenas de
amilopectina, las cuales se relacionaron con algunas propiedades fisicoquímicas
como la formación de pastas, gelatinización y digestibilidad.

III Hipótesis

El almidón de cuatro variedades de garbanzo (Cicer arietinum) obtenidas mediante

cruza de diversas especies podría tener propiedades estructurales y funcionales
distintas.

18
 IV. Objetivos

4.1 Objetivo General

Caracterizar el almidón de cuatro variedades de garbanzo mediante el

conocimiento de su estructura molecular, propiedades funcionales y de
digestibilidad buscando establecer una relación estructura - función de éstos.

4.2 Objetivos Específicos

1. Determinar las características estructurales de la amilosa y la amilopectina

de almidón de cuatro variedades de garbanzo utilizando técnicas
cromatográficas y difracción de Rayos X para determinar diferencias entre
ellas.
2. Evaluar las propiedades físicas y fisicoquímicas de los almidones mediante
microscopía, difracción láser, calorimetría diferencial de barrido y formación
de pastas para establecer las particularidades de cada una.
3. Determinar las propiedades de digestibilidad del almidón de cuatro
variedades de garbanzo mediante técnicas enzimáticas para relacionar las
características estructurales con las propiedades fisicoquímicas y de
digestibilidad del almidón de garbanzo.

19
 V. Metodología

5.1 Diagrama de flujo metodológico

Figura 8.Diagrama experimental de trabajo.

20
5.2 Materiales

Los almidones de garbanzo de las cuatro variedades (Blanco, Blanoro, Jumbo y

Suprema) estudiadas fueron proporcionados por la Universidad Autónoma de
Sinaloa. Todos los reactivos utilizados en este trabajo fueron grado analítico y
HPLC.

5.3 Métodos

5.3.1 Aislamiento del almidón

Los almidones se obtuvieron siguiendo el proceso de molienda humedad con

bisulfito de sodio. Las semillas se remojaron en bisulfito de sodio (0.2 %) y acido
láctico (0.47 %) durante 48 horas a 50°C. Posteriormente las semillas empapadas
se mezclaron con agua destilada y se llevó a cabo la molienda en un mezclador
comercial (modelo 450-10, Oster) durante un minuto a máxima velocidad. La
suspensión se filtro a través de un tamiz de malla 100, se centrifugó a 3000 g
durante 10 minutos. Se realizaron lavados del sedimento de almidón hasta que
quedó libre de color. Finalmente el sedimento se liofilizó y se secó (Milan-Noris et
al., 2017).

5.3.2 Purificación de los almidones.

Se realizo la purificación de almidones de garbanzo para disminuir el contenido de

proteínas. Se pesaron 3 g de almidón de garbanzo y se agregó Hidróxido de
Sodio (25 mL al 0.2 %), se mantuvo en agitación por un periodo de 2 horas.
Posteriormente se centrifugo a 5000 rpm por 15 minutos y se desechó el
sobrenadante. El sedimento se lavó 2 veces con agua destilada (25 mL) y se
volvió a centrifugar con las mismas condiciones. Los lavados del precipitado se
realizaron alcanzar un pH neutro (Hoover & Sosulsky, 1985).

21
5.3.3 Composición Química

Humedad

Se utilizó el método 44-19 (AACC, 2000). Se pesaron 2 g de muestra en charolas

de aluminio. Posteriormente, la muestra se expuso en una estufa a 130 °C durante
24 h. La cantidad de humedad se determinó por diferencias de pesos empleando
la siguiente fórmula:

Cenizas

El contenido de cenizas se determinó utilizando el método 08-01 (AACC, 2000), el

cual consistió en pesar 1 g de muestra en un crisol previamente estabilizado a
peso constante. Posteriormente, la muestra se carbonizó sobre la flama de un
mechero y se colocó en la mufla a 550 °C durante 5 horas. Cuando las cenizas
presentaron un color blanquecino, se colocaron en un desecador hasta alcanzar la
temperatura ambiente. Finalmente se pesaron y se calculó el porcentaje de
cenizas con la siguiente fórmula:

x 100

Proteínas

La determinación del porcentaje de proteína se realizó mediante el método 46-13

(AACC, 2000). Se pesó 1 g de cada muestra y se colocó en un tubo Kjeldahl. En el
mismo tubo, se adicionaron 1 g de sulfato de cobre, 10 g de sulfato de potasio
anhidro y 15 mL de ácido sulfúrico concentrado. El tubo se colocó en un digestor
y se calentó gradualmente a 400 °C hasta que las muestras presentaron un color
verde claro. Posteriormente los tubos se dejaron enfriar a temperatura ambiente.
Una vez enfriados, se adicionó 50 mL de hidróxido de sodio al 40%. Por otro lado,
en un matraz Erlenmeyer se agregaron 50 mL de ácido bórico al 4% y 10 gotas de

22
indicador Wesslow. A esta mezcla se adicionó el material digerido y se realizó la
destilación hasta obtener un volumen de 100 mL de la muestra en el matraz
preparado anteriormente. La muestra obtenida se tituló con ácido clorhídrico 0.1 N.
Se calculó el porcentaje de proteína con la siguiente ecuación:

%Proteínas = x F x 100

En donde:
N= Normalidad del ácido de valoración
F= Factor de conversión a proteína, 6.25
14= Peso atómico del nitrógeno

Almidón Total (Pureza)

La pureza del almidón se midió como el porcentaje de almidón total. El

procedimiento incluye la hidrólisis enzimática con -amilasa termoestable y
amiloglucosidasa usando el Kit de medición del almidón total (TSTA-100A,
Megazyme, International Ireland Ltd.) de acuerdo con el apartado “C” que
considera muestras que contienen AR. Se pesaron 100 mg de almidón, los cuales
fueron depositados en un tubo de vidrio (16 x 120 mm) asegurando que la muestra
no se pegara en las paredes. Se agregaron 0.2 mL de etanol (80 %) y se agitó
con la ayuda de un agitador vórtex para humedecer y dispersar la muestra.
Posteriormente se colocaron agitadores magnéticos en los tubos y 2 mL de KOH
(2 M) para volver a suspender los gránulos. La mezcla se agitó durante 20 minutos
en un baño de agua con hielo. Se agregaron 8 mL de regulador de acetato de
sodio (1.2 M pH 3.8) bajo agitación magnética. Se adicionó inmediatamente 0.1
mL de α-amilasa termoestable y 0.1 de amiloglucosidasa. La mezcla se incubó a
50 °C durante 30 minutos con agitación en vórtex cada 5 minutos. Después, los
tubos se lavaron con agua destilada y el contenido se transfirió a un matraz
aforado de 100 mL. A continuación se tomó una alícuota de 10 mL en un tubo

23
eppendorf y se centrífugó a 1800 g por 10 minutos. De cada tubo se tomó una
alícuota de 30 µL y se añadió 1 mL de GOD-POD. Las muestras se incubaron a 50
°C durante 20 minutos. Finalmente se leyeron los valores de absorbancia a 510
nm. Se utilizó un estándar de glucosa y un blanco de agua. El contenido de
almidón total fue calculado mediante la siguiente ecuación:

En donde:
A = Absorbancia del blanco
F = [100 (g de D-glucosa) / absorbancia de los 100 g de glucosa]
W = peso en g de muestra analizada
FV = volumen final

Amilosa (%)

El contenido de amilosa se determinó empelando un Kit para amylosa /

amilopectina (K-AMYL, Megazime International, Ireland LTD). Esta técnica
emplea concavalin A (ConA) que forma complejos con amilopectina permitiendo
su separación por centrifugación.

Se pesaron de 20 a 25 mg de muestra en tubos con tapa de 10 mL . Se adicionó

1 mL de DMSO a los tubos mientras se agitaban a una velocidad baja en un
vortex. Los tubos se colocaron en un baño de agua hirviendo durante 1 minuto.
Esto se realizó para dispersar la muestra por completo y eliminar grumos o
conglomerados de almidón. Se adicionó 2 mL de DMSO al pelet de almidón y se
llevó a baño maría durante 1 h con agitación suave. Posteriormente se realizaron
lavados con 4 mL de solvente ConA (el solvente de ConA se preparó con 30 mL
de ConA concentrado y 70 mL de agua). Se mezcló y se transfirió el contenido a
un matraz aforado de 25 mL para llevar a aforo con el solvente ConA. A partir de
dicha solución, se transfirió 1 mL en un tubo eppendorf de 2 mL y se agregó 0.5
24
mL de la solución ConA. Se cerró el tubo y se mezcló suavemente evitando la
formación de espuma. Se dejó reposar el tubo durante 1 h a temperatura
ambiente, se centrifugó a 14,000 g por 10 minutos. Se tomó una alícuota de 1 mL
del sobrenadante y se colocó en un tubo de centrifuga de 15 mL. También se
adicionaron 3 mL de regulador de acetato de sodio (100 mM, pH:4.5). Se mezcló
el contenido, se cerró el tubo y se calentó en un baño de agua durante 5 minutos
lo cual ayudó a desnaturalizar la ConA. Se colocó el tubo en un baño de agua a 40
°C, se agregó 0.1 mL de la mezcla de enzimas amiloglucosidasa / α-amilasa y se
incubó a 40 °C por 30 minutos. Posteriormente se centrifugó la muestra a 2,000 g
por 5 minutos. Posterior a la centrifugación, se tomó una alícuota de 1.0 mL y se
adicionaron 4 mL de GODPOD. Esta solución se incubó a 40 °C por 20 minutos al
igual que el blanco y el control D-Glucosa. Finalmente se leyó la absorbancia a
510 nm de cada muestra y el control D-glucosa contra el blanco. El blanco se
preparó con 1 mL de regulador de acetato de sodio (1.0 mM) y 4 mL de GODPOD
y se incubó a 40 °C por 20 minutos. Para el control D-glucosa se utilizó 0.1 mL de
solución estándar D-Glucosa (1 mg mL-1), 0.9 mL de regulador de acetato de
sodio y 4.0 mL de GODPOD. Se utilizaron los valores de almidón total para el
cálculo del porcentaje de amilosa en donde se utilizó la siguiente fórmula:

5.3.4 Estructura

Difracción de rayos X

Se obtuvo el patrón de difracción de Rayos X en un difractómetro D8 Advance

(Bruker AXZ Inc., Madison, WI, USA) con un detector D / tex ultra, operando a 35
kV y 15 mA, equipado con una fuente de radiación Cu y K a una longitud de
onda de 0.15406 nm. La intensidad de medición fue en un intervalo de 2 a 40 ° en

25
una escala de 2Ɵ con pasos de 0.02 °. Las muestras fueron equilibradas dentro
de una cámara con humedad relativa del 100% con solución sobresaturada de
sulfato de potasio. El porcentaje de cristalinidad (%C) se determinó a partir del
difractograma calculando el área correspondiente a los picos cristalinos, el área
total y el ruido instrumental, acorde a la siguiente ecuación:

% C = Ap

At – N

Ap = área bajo la curva de los picos de cristalinidad

At = área total bajo la curva

N = Ruido del equipo

Masa molecular promedio (MM) y Radio de giro (Rz)

Las muestras se trataron con DMSO de acuerdo al procedimiento de Bello-Pérez

et al., (1998) con algunas modificaciones: se pesaron 500 mg de almidón y se
resuspendió en 20 mL de DMSO (95%). La mezcla se agitó por un periodo de 2
días a una temperatura de 4 °C. En un matraz volumétrico se agregó 180 mL de
etanol al 95 % (previamente enfriado a 4 °C) en agitación, al formarse el torbellino
que se genera en la agitación se agregó lentamente la solución de almidón.
Posteriormente se adicionaron 20 mL de etanol al 95%. Esta solución se agitó por
5 minutos y se almacenó toda la noche a temperatura ambiente, posteriormente se
centrifugo a 13000 rpm por 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se re-
suspendió el almidón en 60 mL de etanol y se volvió a centrifugar (este último
procedimiento se realizó 3 veces). Después del lavado, la solución se lavó con
ayuda de un filtro de vidrio empleando 200 mL de etanol, 20 mL de acetona por
duplicado y por una vez 20 mL de éter etílico. Por último el almidón se seco a
temperatura ambiente y se almacenó en un recipiente hermético. Una vez que las

26
muestras fueron tratadas, previo a la creomatografía, se llevó a cabo otro
tratamiento térmico utilizando microondas en donde se pesó 25 mg y se disolvió
en 10 mL de solución con azida de sodio a 0.2%. Dicha solución se colocó en una
copa de teflón y en una cámara de presión, la cual se puso en el microondas a
una máxima potencia por 50 s. Posteriormente, la solución de almidón se enfrío
por 30 minutos y se pasó la muestra por un filtro de 5 mm. Se inyectaron 50 µL de
la muestra en un sistema AF4. Este sistema consiste en un canal de flujo cruzado
(Wyatt Technology Corporation, Santa Bárbara, USA) con una membrana de 10
kDa, acoplado a un sistema de dispersión de láser multiángulo (MALLS, por sus
siglas en ingles) (Dawn Heleos 8, Wyatt Technology Corporation, Santa Bárbara,
USA) acoplado a un detector de índice de refracción (RID) (1100 Genérico RI,
Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Las condiciones de flujo fueron 1
mL min -1 al detector, flujo de enfoque y flujo cruzado, 1 min de tiempo de
inyección y 32 min de elución. El eluyente fue agua Milli-Q con azida sódica al
0,02%. Se calcularon la MM y el Rz utilizando el software ASTRA ® Versión 5.3.1.5
(Wyatt Technology Corporation, Santa Bárbara, USA) a través del método de
Berry y el polinomio de segundo orden (Bello-Pérez et al., 2017).

Distribución de longitud de cadena en amilopectina.

La preparación de la muestra se realizó utilizando el procedimiento de Chavez-

Murillo (2008), en donde se pesaron 10 mg de almidón desgrasado y se le añadió
3.2 mL de agua desionizada. Está mezcla se calentó en un baño de agua
hirviendo con agitación durante 1 h. Se enfrío a temperatura ambiente y se
añadieron 0.4 mL de regulador de acetato (0.1 M, pH 3.5) y 5 µL de isoamilasa
(EC 3.2.1.68) (59,000 U mg-1 Hayashibara Biochemical Laboratories, Okayama,
Japan). Esta solución se incubo a 40 °C por 4 horas con agitación constante. La
actividad enzimática fue detenida por neutralización con 0.21 mL de NaOH acuoso
a una concentración 0.2 M en un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. La
muestra se enfrió durante 5 minutos y se filtró a través de una jeringa de 0.45 mm.
Se transfirieron 0.6 mL de la muestra filtrada a un vial auto-muestreador para ser
inyectado en el equipo. En este análisis se utilizo un equipo Dionex ICS 5000 con

27
un automuestreador Dionex AS-AP (Thermo Scientific, Wakth, Massachusetts,
USA) (CLARIA-DPA). Las columnas empeladas fueron Carbopac PA200 con
medidas de 3 x 250 mm y 3 x 50 mm. El potencial y los periodos de tiempo del
detector de pulsos amperométricos fueron los siguientes: E1, +0.10V por 0.4 s;E2,
-2.0V por 0.02 s; E3, +0.60V por 0.01 s; E4,-0.10V por 0.07 s. Se utilizaron dos
fases móviles (eluente A y eluente B). El eluente A fue hidróxido de sodio 150 mM
y eluente B acetato de sodio 500 mM. El flujo fue de 0.5 mL min -1 utilizando un
gradiente de concentración de 95% de eluente A durante 5 minutos, 60% por 18
minutos, 15% por 55 minutos y 95% por 75 minutos. Los datos fueron procesados
con el software Chromeleon v.6.80 SR11 (Thermo Scientific, Waltham,
Massachusetts, USA). Se utilizó como referencia maltosa y maltopentosa. Para la
distribución total de las cadenas se calculó con la siguiente ecuación (Koch et al.,
1998):

Donde:
n = número de picos
Ai = área del pico
Ni es el grado de polimerización del pico.

5.3.5 Propiedades fisicoquímicas

Morfología

De manera individual, las muestras de almidón se colocaron en un portaobjetos,

se colocó una gota de agua destilada y se cubrió con un cubreobjetos. Los
gránulos de almidón se observaron bajo campo de luz transmitida y luz polarizada
empleando un microscopio binocular (Olympus BX45, Olympus Optical Co.,
Tokyo, Japan).

La forma de los gránulos se analizó mediante un microscopio electrónico de

barrido (JEOL JMS 7600F, Akishima, Japan). Las muestras se fijaron a una cinta
28
conductora de cobre con doble pegamento, la cual se cubrió con una capa de
carbón. Dicha cinta fue cubierta con una capa de oro usando un ionizador de
metal JEOL. Después del tratamiento, la muestra fue colocada sobre un soporte
de carbón y se observaron en el microscopio.

Distribución de tamaño de partícula

La distribución del tamaño de partícula se determinó mediante análisis de

difracción de rayo laser (Mastersizer 3000, Malvern Instruments Ltd. UK). Las
mediciones se llevaron a cabo por triplicado a temperatura ambiente. El almidón
se dispersó en agua destilada hasta obtener una concentración final de 0.001%. El
índice de refracción del agua y del almidón fue de 1.330 y 1.335 con una
adsorción de 0.1. El tamaño de partícula se expresa como el diámetro mediano D
(v, 0.5) y distribución de volumen (Malvern Instruments LTD, 2012).

Temperatura y entalpía de gelatinización

Las propiedades térmicas durante la gelatinización de los almidones de garbanzo

se determinaron usando un calorímetro diferencial de barrido (Q20, TA
Instruments, New Castle, NJ. USA) previamente calibrado con Indio. Para llevar a
cabo este procedimiento se pesaron 2.2 mg de muestra en una charola de
aluminio a temperatura ambiente y se hidrato con 7 µL (7 mg) de agua
desionizada para obtener un contenido de humedad aproximado del 70%. Las
charolas se sellaron hemáticamente y se sometieron a un proceso de térmico a
una tasa de calentamiento de 10 °C min-1 de 30 a 120 °C. Se utilizó una charola
vacía como referencia. Los resultados se reportan como Temperatura de inicio
(Tini), Temperatura máxima (Tmax), Temperatura de conclusión (Tfinal) y entalpía de
gelatinización (∆H). Los datos se analizaron con el software Universal V4.5A (TA
Instruments, New Castle, NJ. USA).

Formación de pastas

Se obtuvieron los perfiles de formación de pastas durante la cocción de los

almidones en un Reómetro de esfuerzo controlado (AR-1500ex, TA Instruments,

29
Dallas, TX, USA) empleando una celda de cocción de pastas a 500 s -1. La
secuencia de cocción fue la siguiente: calentamiento (5 °C min -1) de 50 a 95 °C,
sostenimiento a 95 °C durante 10 minutos; enfriamiento (-5 °C min-1) a 60 °C. La
concentración de almidón fue 7 g 100 g-1 en peso seco.

5.3.6 Digestibilidad in vitro

Se cuantificó las fracciones de digestibilidad de los almidones de garbanzo crudos

y gelatinizados empelando el método de Englysts (Englyst et al., 1992) con
modificaciones (Hoyo-Leyva et al.,2015): se pesaron 200 mg (en base seca y
pureza) de almidón de garbanzo en tubos de ensayo de vidrio de 15 mL. Se
añadieron 2 mL de agua destilada. Los tubos de sellaron y posteriormente el
contenido se mezcló con la ayuda de un vórtex. Los tubos de calentaron en un
baño maría con agitación magnética a velocidad máxima durante 20 minutos.
Después de la gelatinización, se equilibró la temperatura de los tubos
colocándolos en un baño de agua a 37 °C por 10 minutos. Durante el proceso de
gelatinización, se dispersó la α-amilasa pancreático porcina (4 g) en agua
destilada (26.6 mL) y se centrifugó a 4000 g por 10 minutos. Se transfirió una
alícuota de 18.9 mL de sobrenadante a un vaso de precipitado y se mezcló con
una solución de amiloglucosidasa (0.98 mL de enzima y 2.52 mL de agua
destilada). Esta solución enzimática se empleó para diez tubos y se preparó en el
momento para realizar la digestión de las respectivas muestras. Posteriormente se
agregó 4 mL de agua a cada uno de los geles que se formaron anteriormente
para su respectiva dispersión. Una vez que los geles se homogenizaron, se añadió
1 mL de regulador de acetato de sodio (0.5 M, pH 5.2), seis perlas de vidrio y 2 mL
de solución de enzima a cada tubo. La mezcla resultante se incubó en un baño de
agua con agitación (37 °C, 160 golpes min-1) (Lab-Line Instruments, Modelo 545,
Melrose, IL, USA). Se tomaron alícuotas (0.05 mL) en intervalos de 1 minuto y se
mezclaron con etanol (0.95 mL al 80%). Se utilizó el reactivo glucosa oxidasa -
peroxidasa para medir el contenido de glucosa hidrolizada. La tasa de hidrolisis de
los almidones se clasificó de la siguiente manera: ADR (almidón digerido en los

30
primeros 20 min), ADL (almidón digerido entre los 20 y 120 min) y AR (almidón sin
digerir después de 120 min). Para los almidones crudos se siguió el mismo
procedimiento de digestión enzimática excepto por los pasos de gelatinización.
Los volúmenes de agua agregados fueron iguales en almidones crudos y
gelatinizados.

VI. Resultados y discusión

6.1 Composición química

La composición química del almidón de las cuatro variedades de garbanzo se

encuentra en el Cuadro 2. Los almidones presentaron diferencias estadisticas
significativas (α = 0.05) en almidón total (pureza) y en el contenido de amilosa.
Esto da un indicio de que las variedades de garbanzo son distintas entre sí, por lo
menos hasta cierto grado. Se observa que la variedad suprema es la más alta en
almidón total y la menor en contenido de amilosa. Esta diferencia podría repercutir
en alguna propiedad fisicoquímica. En cuanto al contenido de proteínas y cenizas
no hubo diferencias estadísticas significativas. El contenido de proteínas y cenizas
es bajo al igual que lo reportado por Milan-Noris et al., (2016). Esto nos indica que
se obtuvieron almidones con una alta pureza consecuencia del proceso de
purificación que se llevo a cabo. El alto contenido de amilosa encontrado en estos
almidones son similares a los niveles encontrados en leguminosas cultivadas en
Canadá, las cuales contienen entre un 36 y 41 % de este polisacárido (Hoover y
Ratnayake, 2002).

31
Cuadro 2. Composición química de almidones de cuatro variedades de
garbanzo (%).

Variedad Almidón total Amilosa Proteína Cenizas

Blanco 83.35 ± 0.2b 36.25 ± 0.3c 1.81 ± 0.8a 0.29 ± 0.02a
Blanoro 82.30 ± 0.1c 38.25 ± 0.2b 2.03 ± 0.4a 0.28 ± 0.02a
Jumbo 81.75 ± 0.4c 41.00 ± 0.5a 2.01 ± 0.5a 0.28 ± 0.02a
Suprema 87.00 ± 0.3a 35.90 ± 0.3c 2.19 ± 0.1a 0.28 ± 0.03a
Los valores reportados representan el promedio ± desviación estándar. Columnas con la misma no representa diferencias
estadísticas significativas (= 0.05).

6.2 Análisis estructural

6.2.1 Difracción de Rayos X

Los patrones de difracción de Rayos X del almidón de las cuatro variedades de

garbanzo se muestran en la Figura 9. De acuerdo con la figura, se observa un
patrón de difracción Tipo C característico del almidón de leguminosas (Hoover et
al.,2002). Este tipo de patrón es una combinación del tipo A y B. Los
difractogramas mostraron un pico dual en 2θ = 17 y un pico sencillo en 2θ = 25
(típicos de los picos de difracción de tipo A) y dos picos sencillos en 2θ = 5, 15
(típicos de los picos de difracción de tipo B) (Liu et al.,2015). De manera general,
el patrón de difracción tipo C se caracteriza porque las moléculas de amilopectina
tienen una longitud de cadena entre 26 y 29 moléculas de glucosa (Sajilata, 2006).
Las muestras presentaron porcentajes similares de cristalinidad, entre 31 – 34%.
Los almidones que presentan este tipo de patrón se caracteriza porque la
amiloéctina tiene un GPn de 26 a 29 moléculas de glucosa (Sajilata, 2006). La
importancia de conocer el tipo y porcentaje de cristalinidad es fundamental debido
a que tiene relación en cuanto a la organización de la amilopectina que se
encuentra en el interior del granulo de almidón. Yoo y Jane (2002) proponen que
el patrón de cristalinidad y el porcentaje son el resultado del ordenamiento de las
dobles hélices de la amilopectina.

32
 Blanco (31.56 %)

Blanoro (33.97%)

Suprema (33.15%)

Jumbo (32.77 %)

0 5 10 15 20 25 30 35 40

2
Figura 9. Patrones de difracción de Rayos X del almidón de las cuatro variedades de
garbanzo.

6.2.2 Masa molecular promedio (MM) y radio de giro (RZ)

En la Figura 10 se muestran los fractogramas que se obtuvieron mediante el

sistema AF4-MALLS-RID en donde se observa una señal doble en los minutos
10 al 20. La fracción de amilosa eluyó entre el minutos 10 y 16. En los minutos
posteriores se observa un pico más pronunciado y definido el cual corresponde a
la fracción de amilopectina. Las cuatro variedades de almidón de garbanzo tienen
un perfil similar. En este tipo de cromatografía las moléculas con alta masa
molecular fluyen con una menor velocidad por el canal AF4 como es el caso de la
2
amilopectina. Los datos obtenidos se ajustaron con una precisión de R > 0,99
utilizando el modelo Berry de segundo orden (Hoyo-Leyva et al., 2017). En el
Cuadro 3 se muestran la MM y Rz de las diferentes variedades de garbanzo. Las
fracciones de amilosa y amilopectina en la variedad de Blanoro mostraron una
33
mayor MM (3.28 x 105 y 1.87 x 105 g mol-1 respectivamente) y un RZ (160 ± 2.5 y
224 ± 1.3 nm respectivamente) en comparación con las tres variedades
restantes. El alto valor de la MM de Blanoro sugiere que la molécula de almidón
está compuesta por amilopectina altamente polimerizada (Zeng et al., 2016).

Miao et al. (2009) realizaron la caracterización de dos tipos de garbanzo Kabuli y

Desi en donde reportaron una MM de 5.38 x 107 g mol-1 y 3.54 × 107 g mol-1
respectivamente. Contrastando con nuestros resultados, se observa una diferencia
probablemente como consecuencia de la diversidad de las variedades de
garbanzo, adicionalmente, las estudiadas en el presente trabajo, son el resultado
de una cruza de variedades y por lo tanto sufrieron una modificación genética
indirecta. Por otra parte, el método de dispersión del almidón, la solubilización y el
modelo que se utilizó para realizar el ajuste de los datos pueden tener un impacto
importante que genere diferencias entre diversos estudios. Los valores de
dispersión masa-molar (ÐM = MM / Mn) que se encuentran en el Cuadro 3 son
utilizados para la determinación de la uniformidad de la dispersión del tamaño de
las moléculas de polímeros. De acuerdo con la literatura, un valor de ÐM ≈ 1, los
polímeros tendrán una mayor uniformidad, mientras que los valores de ÐM ≈ 2 son
polímeros lineales con una gran polidispersidad (Stepto, 2009). Con respecto a las
cuatro variedades de garbanzo, la fracción de amilosa tienen una ÐM ≈ 2,
indicativo de una gran dispersión en la masa molecular de los polímeros de esta
macromolécula. Por el contrario, la polidispersidad en la amilopectina de los cuatro
variedades ÐM ≈ 1, lo que indica una gran homogeneidad en la masa molecular
de la amilopectina.

Finalmente, la relación amilosa/amilopectina puede contrastarse con los

resultados previos del porcentaje de amilosa calculado previamente por un método
enzimático (Cuadro 2). Desde nuestro punto de vista, el método de separación por
canal de flujo cruzado (AF4-MALLS-RID) nos arrojó valores menores de la
proporción de amilosa que los obtenidos por el método enzimático.

34
 Figura 10. Fractograma de las cuatro variedades de almidón de garbanzo.

Cuadro 3. Masa molecular promedio y radio de giro de amilosa y

amilopectina de almidones de cuatro variedades de garbanzo.
Amilosa Amilopectina

MM RZ MM RZ

5 -1 8 -1
Muestra AM / AP (x 10 g∙mol ) (nm) ÐM (x 10 g∙mol ) (nm) ÐM

Blanco 31.9:68.1 2.15(± 1.3%) 118(± 1.0) 1.7(± 0.03) 1.03(± 3.7%) 197(± 1.5) 2.3(± 0.14)

Blanoro 33.6:66.4 3.28(± 4.0%) 160(± 2.5) 1.9(± 0.04) 1.87(± 0.9%) 224(± 1.3) 1.2(± 0.03)

Jumbo 38.3:61.7 2.54(± 4.7%) 120(± 1.5) 1.9(± 0.02) 1.02(± 1.4%) 181(± 2.7) 1.6(± 0.11)

Suprema 23.3:76.7 2.80(± 2.5%) 165(± 0.6) 1.9(± 0.04) 2.94(± 0.9%) 260(± 1.8) 1.1(± 0.01)

MM: Masa molecular promedio; Rz: radio de giro; AM / AP: amilosa / amilopectina; ÐM: dispersión masa-molar (MM / Mn).

De acuerdo con el método de separación de canal de flujo cruzado, los

porcentajes de amilosa y amilopectina son el resultado de la integración de los

35
picos que se generan en la señal de índice de refracción, lo cual es un método no
reproducible debido a que la integración de los picos se realiza manualmente y el
software hace los cálculos, y no existe una técnica estandarizada para realizar la
integración. Sin embargo, el orden de la proporción de amilosa cuantificada es la
misma: Jumbo>Blanoro>Blanco>Suprema.

Por otra parte la disolución de los almidones es un factor crítico para la separación
adecuada de los polisacáridos. Tanto la solubilidad del almidón como
características de la secuencia de elución de la muestra en el canal son factores
que determinan la efectividad de este método (Bello-Pérez et al., 2017). Así, existe
un gran campo de estudio en esta área para mejorar los parámetros analíticos de
separación.

6.2.3 Distribución de tamaño de longitud de cadena de amilopectina

La distribución de la longitud de cadena de la amilopectina des- ramificada de los

almidones nativos de garbanzo obtenida por CLARIA-DPA se presenta en el
Cuadro 4, mientras que la Figura 11 muestra un ejemplo del perfil cromatográfico
de distribución de longitud de cadena. Las fracciones de la amilopectina se
agrupan en cuatro tipos de cadenas: A, B1, B2, B3 las cuales tienen diferente
grado de polimerización. De acuerdo con el cuadro, todos los almidones
presentaron mayor proporción en las cadenas tipo A y B1 con un GPn = 16. La
longitud de cadena de la amilopectina está estrechamente relacionada con el
patrón de difracción de Rayos X. Zhang et al., (2006) concluyeron que la
estructura semicristalina tipo A tiene un alto contenido de cadenas cortas y la del
tipo B tiene mayor porcentaje de cadenas largas. Sin embargo en el caso del tipo
C la proporción de longitud de cadena dependerá en gran parte a la fuente
botánica, por ejemplo, en el caso de guisantes y frijoles, un patrón de difracción
tipo C presenta longitudes de cadena entre 26 y 29 moléculas de glucosa (Sajilata
et al., 2006). En nuestro caso, de acuerdo con la fig. 11, las longitudes de cadena
con un porcentaje de área más grande fueron entre 12 y 15. Esto pudiera ser

36
indicativo de que, a pesar de tener un patrón de difracción tipo C, probablemente
las proporciones de arreglo cristalino A / B cambien entre las diversas fuentes de
almidón, o inclusive, cambien los puntos de ramificación en la amilopectina.

Cuadro 4. Distribución de longitud de cadena de amilopectina en almidones

nativos de garbanzo.

A B1 B2 B3
Variedad GPn
GP 6-12 GP 13-24 GP 25-36 GP ≥37
b ab
Blanco 16.6 ± 0.5ª 38.4 ± 0.3 47.6 ± 0.3ª 8.8 ± 0.6ª 5.2 ± 0.5
b b
Blanoro 16.1 ± 0.2ª 40.8 ± 0.4ª 46.1 ± 0.2 8.5 ± 0.3ª 4.2 ± 0.3
b b
Jumbo 16.1 ± 0.5ª 40.3 ± 0.2ª 46.5 ± 0.2 8.7 ± 0.6ª 4.4 ± 0.2
a b b a a
Suprema 16.9 ±0.5 38.1 ± 0.6 46.0 ± 0.6 7.7 ± 0.5 6.5 ± 0.8

GP = Grado de polimerización. Los valores son la medida de tres repeticiones ± desviación.

**Misma letra en la columna significa que no hay diferencia estadística significativa.

8,000
7,000
6,000
Área (%)

5,000
4,000
3,000
2,000
1,000
0,000
4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67

DP

Figura 11. Distribución de longitud de cadenas de amilopectina de almidón

de garbanzo variedad Blanco.

37
6.3 Propiedades fisicoquímicas

6.3.1 Morfología y tamaño de partícula

La forma granular de las cuatro variedades de garbanzo muestra una gran

similitud entre las muestras, con una forma ovoide y superficie lisa sin presentar
residuos de proteínas en la superficie (Figura 12). Estos resultados son similares a
los reportadas por Milan-Noris et al., 2017, quienes trabajaron con diferentes
variedades de garbanzo pigmentado. En las micrografías de los gránulos de
almidón obtenidas mediante microscopia de luz transmitida (Figura 13 a), se
observó que tienen una depresión central, a lo que se le conoce como hilum y está
relacionado con la arquitectura del gránulo desarrollada durante la biosíntesis
(Milan-Noris et al., 2017). A partir del hilum, los gránulos de almidón se organizan
en capas concéntricas semicristalinas y amorfas en forma de anillos, en un arreglo
alterno. De manera complementaria, las imágenes de luz polarizada (Figura 13 b),
nos permitieron observar la “cruz de malta”, indicando la birrefringencia en los
gránulos. Este efecto es consecuencia del cambio de dirección del índice de
refracción de la luz al pasar a través de los gránulos y nos indica la presencia de
zonas amorfas y cristalinas en su interior. Estas observaciones, así como el bajo
contenido de proteínas reportado en el Cuadro 2, nos indican que el método de
purificación de los almidones fue lo suficientemente eficaz, de tal manera que nos
permitió obtener gránulos sin alterar su superficie ni estructura interna,
manteniendo su conformación molecular original.

De forma representativa de las cuatro variedades, la Figura 14 muestra la

distribución de tamaño de gránulo de los almidones de la variedad “Suprema”. De
acuerdo con la figura, la distribución fue esencialmente bimodal. El primer tamaño
oscila entre 1 y 6 m y corresponde a los gránulos más pequeños observados por
microscopia. La segunda es la población corresponde a gránulos más grandes,
con un diámetro entre 9 y 70 m y un D[v, 0.5] = 20 m. La distribución del
tamaño de partícula es importante en las propiedades de gelatinización debido a
que la heterogeneidad puede producir un intervalo amplio de temperaturas de

38
gelatinización, un aspecto importante a considerar durante el proceso de cocción
del garbanzo.

10μm 10μm

10μm 10μm

Figura 12. Micrografías obtenidas por microscopía electrónica de barrido de

almidones de garbanzo de diferentes variedades.

39
 Luz transmitida Luz polarizada

Figura 13. Micrografías de almidón de garbanzo por (a) luz transmitida y

(b) luz polarizada.

40
 14

12

10
% Volumen

0
1 10 100

Diámetro (m)

Figura 14. Distribución de tamaño de gránulo en almidón de garbanzo

“Suprema”.

6.3.2 Calorimetría Diferencial de Barrido

El Cuadro 5 resume las temperaturas (Tini, Tmax y Tfinal) y entalpia de gelatinización

de las cuatro variedades de garbanzo obtenidos mediante análisis de calorimetría
diferencial de barrido (DSC por sus siglas en inglés). De acuerdo con el cuadro,
Tini, Tmax y Tfin mostraron diferencias estadísticas significativas (α=0.05), así como
la entalpia. Se ha demostrado que los parámetros de calorimetría están
directamente relacionados con la arquitectura molecular de las zonas cristalinas
del granulo y con la relación amilosa/amilopectina. Noda et al., (1996) demostraron
que bajas temperaturas de gelatinización son consecuencia de una mayor
población de cadenas cortas de amilopectina ya que la longitud de cadena

41
promedio está fuertemente relacionada con las temperaturas de gelatinización
(Xiangli et al., 2008). Así, en el presente trabajo, los cambios asociados a las
temperaturas de gelatinización se atribuyen a las diferencias en las longitudes de
cadena de la amilopecitna.

Por otro lado, se ha relacionado la entalpia con la conformación molecular y la

disposición estructural de la amilopectina (Milán-Noris et al., 2017) ya que refleja la
pérdida del orden de sus dobles hélices. Los valores mayores de entalpia nos
indican mayor orden a nivel estructural como es el caso de Blanoro y Jumbo.
Hughes et al. (2009) reportaron Tini, Tmax y Tfinal para dos tipos de garbanzo Kabuli
y Desi en donde obtuvieron los siguientes valores: 59 °C, 63 – 65 °C y 77 - 79 °C
respectivamente con un intervalo de ∆H de 11 a 13.3 J g-1. Los resultados de
temperaturas de transición son similares a los obtenidos Hughes et al., (2019), sin
embargo, los resultados de entalpia obtenidos en este trabajo son más bajos, lo
cual permite discutir que posiblemente en las variedades de garbanzo que
utilizaron tienen menor orden molecular.

Cuadro 5. Temperaturas y entalpía de gelatinización de almidones de

garbanzo.

Tini Tmax Tfinal H

Variedad (°C) (°C) (°C) (J g-1almidón)

Blanco 63.28 ± 0.5c 67.80 ± 0.1c 79.50 ± 0.3b 9.42 ± 0.3b

Blanoro 64.12 ± 0.1b 69.12 ± 0.6ª,b 79.55 ± 0.2b 12.21 ± 0.8a

Jumbo 63.26 ± 0.9c 68.29 ± 0.6b 78.65 ± 0.1c 10.30 ± 0.9a,b

Suprema 65.30 ± 0.1a 69.56 ± 0.2ª 82.40 ± 0.1ª 8.07 ± 0.4c

Los valores son la medida de tres repeticiones ± desviación estándar. **Misma letra en la columna significa que no hay
diferencia estadística significativa

42
6.3.3 Formación de pastas

La Figura 15 muestra los perfiles de viscosidad de los almidones de las cuatro

variedades de garbanzo durante la cocción de los mismos. A partir de la figura se
observa que los cuatro almidones mostraron un perfil de formación de pastas
similar. La temperatura a la cual se observa el inicio de la gelatinización es 69 °C,
6 °C por arriba de la temperatura reportada por calorimetría (T ini), por lo que no
hay que olvidar que las condiciones de gelatinización varían con el método de
medición. En la celda de cocción de pastas, al entrar en contacto el almidón con el
agua y a altas temperaturas, los grupos OH- de los gránulos de almidón
interactúan con las moléculas de agua a través de puentes de hidrógeno
produciendo que los gránulos se hidraten. Este efecto deriva en que las moléculas
de agua se introduzcan en las regiones amorfas y cristalinas, reflejándose en un
hinchamiento de molécula de amilopectina, lo que permite la liberación de las
cadenas de amilosa que pasan a la fase continua (Varatharajan et al., 2014).

La viscosidad máxima se obtuvo a un valor de 0.09 Pa*s. Posterior al punto

máximo, se observó una disminución de la viscosidad, reflejo de la ruptura de los
gránulos durante la etapa de sostenimiento de temperatura a 95 °C, siendo un
valor de 0.02 Pa*s en los cuatro almidones. Una vez pasada esta etapa, se
observa un claro incremento en la viscosidad de la pasta como efecto de la
disminución de la temperatura en las mismas. Durante el proceso de formación de
pastas se llevan acabo modificaciones morfológicas en los gránulos de almidón,
los cuales son hinchamiento y ruptura, generando la lixiviación de los
componentes moleculares, como es el caso de la amilosa. Dichos componentes
se incorporan al medio continuo (Gallant et al., 1997).

Con fines comparativos, se incluyó la formación de pastas de dos almidones con

diferente contenido de amilosa: almidón de maíz normal con 25 %, maíz waxy con
2% y se comparó con almidón de garbanzo Blanoro (Figura 16). De acuerdo con la
figura, se observó que el granulo de almidón de garbanzo tuvo una viscosidad pico
y un valor de rompimiento menores con respecto a los almidones de maíz. El
almidón de maíz waxy mostró que la resistencia de los gránulos de almidón al

43
tratamiento térmico mecánico fue prácticamente nula. Por su parte, el almidón de
maíz normal mostró una mayor resistencia al tratamiento térmico-mecánico.

Durante la etapa final, al disminuir la temperatura de la pastas, se puede observar

un incremento de la viscosidad en el almidón de garbanzo y maíz normal. Esto se
debe a la concentración de amilosa que se encuentra en la fase continua. Así, en
el almidón waxy no hay un cambio evidente de la viscosidad en la última etapa de
enfriamiento de 95 a 60 °C debido a que en esta etapa final, el contenido de
amilosa es quien determina el incremento de la viscosidad. Así, en la etapa final
de la formación de pastas, una mayor cantidad de amilosa en la fase continua de
ésta produce una mayor viscosidad. Estos resultados se empatan con los altos
contenidos de amilosa en los almidones de garbanzo (Cuadro 2).

Figura 15. Perfil de viscosidad del almidón de las cuatro variedades de

garbanzo.

44
Figura 16. Perfil de viscosidad de tres almidones: Garbanzo (Blanco), maíz
normal y waxy.

6.4 Digestibilidad in vitro

Las propiedades de digestibilidad de los almidones crudos y cocidos de las

diferentes variedades de garbanzo se muestran en el Cuadro 6. De acuerdo con
los resultados, se observa que en el caso de los almidones crudos existen
diferencias significativas entre las tres fracciones de almidón, en cuanto al AR las
variedades Jumbo y Blanoro son las que obtuvieron mayor porcentaje (73 y 72 %
respectivamente). Esta última fracción es la forma más deseable de la dieta del
almidón porque no se degrada completamente en el intestino delgado y su
ingestión podría promover beneficios a la salud, especialmente en términos de
índice glucémico. Los valores de AR fueron comparados con los de Milan-Noris et

45
al., (2016), quienes evaluaron la digestibilidad del almidón de diferentes
variedades de garbanzo pigmentado utilizando la técnica de Englyst. Estos
investigadores obtuvieron valores de AR entre 42 y 52%.

Sin embargo, el consumo de estos almidones es en alimentos cocinados. Así, en

cuanto a los almidones cocidos también hay diferencias estadísticas significativas
entre las diferentes fracciones. Se observa un decremento en el almidón resistente
como efecto del proceso de cocción del almidón y en donde la estructura del
almidón cambia como consecuencia de la gelatinización. Se sabe que durante
este fenómeno, el almidón se hincha liberando de esta manera cadenas de
amilosa y quedando las moléculas con mayor exposición a las enzimas que se
utilizan para este procedimiento. Los resultados obtenidos en el almidón
gelatinizado son diferentes en comparación con los de Milan-Noris et al. (2016) en
donde obtuvieron los siguientes resultados: ADR 58 – 59 %, ADL 33 – 35 % y AR
5 – 9 %.

Las propiedades de digestión del almidón están fuertemente relacionadas con el

patrón de difracción de Rayos X, la longitud de cadena y puntos de ramificación,
así como la morfología y fuente botánica del almidón (Ao et al., 2007); así como La
disposición de los componentes del almidón (amilosa y amilopectina) en los anillos
concéntricos (zonas amorfas y cristalinas) y sus patrones de ramificación (Hoover
et al.,2010; Magallanes et al., 2017). En el caso particular de los almidones de las
cuatro variedades de garbanzo no se observa una tendencia clara en este sentido,
se considera que probablemente existen otros factores como las dextrinas límite y
el estudio de los puntos de ramificación de la amilopectina y la densidad de las
dobles hélices.

Hasta el momento los almidones de leguminosas tienen pocas aplicaciones

comerciales, es por esta razón que uno de los objetivos de caracterizar los
almidones de las cuatro variedades de garbanzo fue proponer como se podrían
utilizar. En general, los resultados que se obtuvieron sugieren que los almidones
de garbanzos pueden tener potencial en el desarrollo de alimentos funcionales por
su alto contenido de ADL y AR. Actualmente las agencias de salud recomiendan el

46
consumo de AR y ADL para la prevención de enfermedades como: la obesidad, la
diabetes y enfermedades cardiovasculares. Promoviendo un mayor consumo de
carbohidratos no digeribles para la prevención de las enfermedades antes
mencionadas.

Cuadro 6. Fracciones de almidón de garbanzo (ADR, ADL, AR).

Condición Muestra ADR ADL AR

Crudo Control 18.4 ± 0.1e 33.2 ± 0.2b 48.5 ± 0.1c

Blanco 17.2 ± 0.4f 35.5 ± 0.1a 47.3 ± 0.4d

Blanoro 16.7 ± 0.7f 24.8 ± 0.2d 58.5 ± 0.8b

Jumbo 12.7 ± 0.6g 14.2 ± 0.1e 73.1 ± 0.4a

Suprema 12.1 ± 0.7g 15.1 ± 0.7e 72.8 ± 0.2a

Cocido 20 min Control 82.3 ± 0.7a 6.6 ± 0.8h 11.1 ± 0.3h

Blanco 45.2 ± 0.2d 26.2 ± 0.2c 28.6 ± 0.1f

Blanoro 63.8 ± 0.1b 11.1 ± 0.1f 25.1 ± 0.2g

Jumbo 59.8 ± 0.1c 4.0 ± 0.3i 36.2 ± 0.6e

Suprema 61.1 ± 0.1c 7.7 ± 2.5g 29.2 ± 0.1f

Los valores son la media de tres mediciones repeticiones ± desviación estándar. **Misma letra en la columna significa que
no hay diferencia estadística significativa

47
VII. Conclusiones

 Los almidones de las cuatro variedades de garbanzo estudiadas

presentaron diferencias estadísticas significativas en el contenido de
almidón total y amilosa. El alto contenido de este último polisacárido (> 30
%) es un aspecto relevante que vale la pena destacar en esta leguminosa,
dado que, el alto contenido de amilosa se refleja en la formación de pastas
con valores altos de viscosidad y muy probablemente con la formación de
geles rígidos.


El aspecto físico ovoide y de superficie lisa no indicó diferencias a simple
vista entre las cuatro variedades ni tampoco el tamaño de los gránulos,
considerando estos como grandes (20 m) con un patrón de difracción de
Rayos X tipo C. Sin embargo, los cambios más sobresalientes se dieron
MM y RZ, tanto en la amilosa como en la amilopectina.


El patrón de difracción de Rayos X tipo C se relacionó con un alto contenido
de cadenas cortas A y B1 en la amilopectina que representan el 85%,
teniendo un DPn = 16.

 Las temperaturas de gelatinización y la ∆H están relacionadas con la

longitud y el ordenamiento de las cadenas de amilopectina.

 El almidón de garbanzo presento un alto contenido de AR, lo cual puede

estar relacionado con el alto contenido de cadenas cortas que se
encuentran en un solo cluster, generando un espacio muy compacto y
exista poco acceso a los puntos de ramificación de la amilopetina.

48
 VIII. Perspectivas

Los resultados obtenidos en este trabajo contribuyeron a conocer una parte de la

estructura y propiedades fisicoquímicas de almidones de garbanzo, sin embargo
falta caracterizar las longitudes de cadenas de las dextrinas límite, aportando así
información con respecto a la estructura interior de la amilopectina como la
localización de puntos de ramificación, lo cual está estrechamente relacionado
con la digestibilidad del almidón y con la estabilidad del almidón.

Por otra parte resulta interesante conocer la distribución y la interacción que

existe ente los patrones de cristalinidad en los gránulos con patrón tipo C
(combianacion del tipo A y B), como es el caso del almidón de garbanzo. Debido a
que esto podría estar asociado con la digestibilidad y las propiedades
fisicoquímicas, además de que existe información limitada con respecto al estudio
de este patrón de cristalinidad.

Dado a los resultados que se obtuvieron en formación de pastas es importante

realizar pruebas realogicas a los geles que se obtienen de los almidones de
garbanzo, debido a que se observo que posiblemente sean geles fuertes, lo que
ayudaría a esclarecer posibles aplicaciones de los almidones de garbanzo.

49
 VIII Bibliografía

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