Técnicas

inmunohistoquímicas 1
!"#$%"&"'"(()#*!"(%""(()+,/#"#0#)(

 
    
 
  

    
  -
      

1. BASES CONCEPTUALES EN INMUNOHISTOQUÍMICA

2323 
Inmunohistoquímica es toda técnica que permite > La principal ventaja sobre otras técnicas que tam-
detectar in situ componentes celulares y extracelula- bién emplean anticuerpos como herramienta de
 #'  !

  # trabajo (RIA, Western blot, ELISA, etc.) es que en

 # ;![ !
   !
 la inmunohistoquímica se conservan las relacio-

 !   ;#![) nes entre los distintos componentes en estudio y,
 
  !  
 )

La inmunohistoquímica tiene su antecedente en el > Pero no es hasta la década de los años seten-


  !5^]. ta cuando se publican los trabajos pioneros de

  $ "189,200.

/ !#!   ' $ >  $ ?]] 
   =^ &
  !
  `'#  &  0'# &  $   !#! -
sin duda la técnica con mayor impacto en la práctica     
' 

  +!# ' !
)  “ &   '$  
5% de casos161)   
 $ !-

   

 
 
!#! 
'  


mucho mayor, hasta el punto de que hoy sería
!  
  0'#  
empleo de las técnicas inmunohistoquímicas33.

/ '#  (!
  '
 > Las técnicas inmunocitoquímicas permiten pre-
en los últimos años y se ha convertido en una herra-  
' '   Œ‰“
 
!
'
 ! 
 
 casos=Œ.

'
$ & 10.

:   

 ' $
 > Este desarrollo de la inmunohistoquímica hizo
la inmunohistoquímica en las dos últimas décadas36:   
  ;$ ![ 

3
4 Atlas de inmunohistoquímica

 !
 
!
 ! !-
'110 
  ;$ [  !
 "     
  
#'  
  -
 $'
^Š.
1. 


 ' <!
  > Hasta la década de los ochenta la mayor parte de
      !


   
 ')
que ello implica.
2. 
 "
  '"- > La sensibilidad hace referencia a la cantidad
  !  
 
 !#!
 #'   " !-
  
 %
 %
 & 
 toquímica es capaz de detectar. Una técnica con

 ! !&
) /  - alta sensibilidad es capaz de detectar cantidades
'" ! 



  !& *
 #')
   !  -


& &
  
  ")
3. +
 !

 !& - > 4  <! *   '
 !
  ! 
 !  - la sensibilidad más de 100 veces respecto a los
#'     

 !#!) !"


 
)

2363  
En inmunohistoquímica denominamos antígeno > Generalmente se trata de proteínas, que son los
    !
    !' ! ) 8
  !"
tisular o frotis celular. polisacáridos, lípidos o incluso ciertos tipos de
ácidos nucleicos.

! #'  < ! - > En el tejido que analizamos no representa por
cia extraña cuando es inyectado a un animal de expe-   #'   !"  
)
!  
   !-
 

  #)
Un epitopo o determinante antigénico es la parte > / 
     #'-

 #'  
   ! &   no se denomina paratopo.
por tanto, reconocida por el anticuerpo.



  !* ! 
 #'- > En el caso de las proteínas los epitopos son pe-
no presenta un número mayor o menor de epitopos. queñas secuencias lineales de 3 a 8 aminoáci-
dos, pero pueden incluir elementos de la estruc-
tura 2aria o 3aria de la proteína.
/
! '"  
 > /
! '"
 
ser continuos o discontinuos9. los más frecuentes.

/
! '" continuos están
compuestos por una secuencia lineal de 3 a 8 ami-

 ' !   discontinuos o
conformacionales están constituidos por secuencias
aminoacídicas distantes puestas en contacto por el
'! !
   -
ca.

Figura 1.1. Esquema que representa en rojo la secuen-


 
! '"   &

uno discontinuo (abajo).
 Técnicas inmunohistoquímicas 5

Las moléculas de pequeño tamaño (menos de 10 > Como molécula transportadora puede emplear-
kDa) son incapaces de inducir una respuesta inmune  <! " $ '  -
y se denominan haptenos. Para adquirir carácter in- mocianina.
!'"     !
  # 
 '
)
4  
 ! ' ! #
transportadora, este hecho debe tenerse en cuenta si
se estudian muestras de tiroides, pues el anticuerpo va

 
!
  #' # !"
')

Figura 1.2. Tiroides marcado con un anticuerpo anti-

!  !  #
 -

 
 
  ! ' !
# 
 ^]()

2383 

Los anticuerpos o inmunoglobulinas 7'  '-
coproteínas en forma de Y sintetizadas por las células
!) : ! '"  -
 ` 


 '  " !-
cas formadoras de anticuerpos.

/ 7'  

 
 
 

polipeptídicas idénticas: un par de cadenas ligeras (N,
O) y un par de cadenas pesadas (D, J, G, H, P) que de-
!  
 7' 7'+ 7'€ 7' 7'4  7'_) /
  
 
   !


) / 
 '    Figura 1.3. _"
 7' !
  
 

 ??] !
 &  
 ^^]) & 
 ' 
  #  
)


 
   '  (!
(! &  ' $ (!
amino-terminal).

Figura 1.4. _"

 7'      
extremos carboxilo- y amino-terminal.
6 Atlas de inmunohistoquímica

/
'
  7'   ! #
papaína
 ' 
 '! #

  #' Fab (antigen binding &  '-
mento cristalizable o Fc. 4 '! 
es común a todos los individuos de la misma especie,

 ' !  !#!
 

  !  !

de anticuerpos secundarios antiespecie.

Figura 1.5. _"

 7'
'
  # 

'   '!  '! Fc }'!
cristalizable) y dos Fab }'! antigen binding).

/
' !
 pepsina ' 

'! }  '! $
   -
#'  F(ab’)2. 4 <! '!  ! 
'
  ! 
   $
 
 '! }   


-
)

Figura 1.6. _"

 7'
'
   

' 
 '! } & }–2.

Los anticuerpos empleados en inmunohistoquími-

  '!
   7'€ =Z] … & !
! 7'_ ]] …) / 
 7'€ ! -
! 
  7'€=  7'€?)
/ 7' 
 !! ! !"

$
 (  7'+  !
#! &
 7'_  
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  ! !&
'
 ]] … 
    '-
 
 

   „ (Joining) al que se
 Z !"
 7')

Figura 1.7. !%

 7'_ !
  Z !

 7' 
   }    ' )
 Técnicas inmunohistoquímicas 7

/ !"
 7' 
   # !!
! #' !
  '! }) 8-

  !
! '"  
que pueden unirse anticuerpos secundarios, que per-
!  !
 


 !
veremos más adelante.

Figura 1.8. El anticuerpo primario se une por medio de

 '! }  #' 
 
 
'! }    
)

/    paratopo de un anticuerpo y el

epitopo
  #'    !

 -
  $) / 
   $-
  !   '
 $    & '$
  #'  !" 
 
'-
  
 & 
 $

Waals.

Figura 1.9. :

    
 -
 &  
 #' !


 8
2006)=^@.

/     $ 



- > La   
  '

 !!-
ciarse durante los lavados. Se trata de una reacción de dad estereoquímica entre paratopo y epitopo, y
equilibrio expresada por:    
    
&  #') / 
  —
+' ™ + œ +'+ suele tener un valor comprendido entre 109 y
1012 M-1.
El punto de equilibrio depende de las concentra- > La avidez es una propiedad relacionada que hace

 #' &  &
  

 referencia a la fuerza conjunta con la que un an-
ambos. tisuero, formado por varios anticuerpos, se une
8 Atlas de inmunohistoquímica

  #' !$ !%) +



  

 
$

 

uno de los anticuerpos por su epitopo, su valor
 ! !&   !

 
-
des.
Existen dos tipos de anticuerpos: policlonales y
monoclonales.

238323<=$>)#?!?(@$(<"()!
Los anticuerpos policlonales, antisueros o simple- > /
!    & 
!      ( 
# '  '

 ; 
del suero de un animal previamente inmunizado con  [ &  

 "!  
 #'   
 
) a un suero que contiene anticuerpos.

4 #'  &  !   

-
 7' 
 
 !!) 4 
(#
 
    !
 7'


 

 
 

clones de células plasmáticas (de ahí, policlonal). El
animal más frecuentemente empleado para la obten-

     % 
se utilizan también cabras, ovejas, cobayas, cerdos,
caballos, y otros.

Figura 1.10. Obtención de un anticuerpo policlonal.

/ &
  # (* +' 
-
 
 '   #
 7' # 
los mismos por parte de las células plasmáticas. El con-
%
  7' &   )
Ventajas

/ !
 $ !'   
anticuerpo policlonal presente:

š \ ' avidez   #' &   -

'
   !!  !<)

Figura 1.11. Anticuerpo policlonal con diversos epito-

pos que son reconocidos por las correspondientes mo-
"
 7')
 Técnicas inmunohistoquímicas 9

š Una alta sensibilidad. + '

 

 #' 
&
 
procesamiento tisular es raro obtener falsos
'$ &  
   
serán reconocidos. Esto es muy importante en
inmunocitoquímica ultraestructural donde es
   %
& )

Figura 1.12. Reconocimiento de epitopos de un antígeno

por parte de un anticuerpo policlonal. Aunque uno de
      #'  

Inconvenientes   7'
'
    $
)

š Al estar constituidos por una mezcla de distin- > Las reacciones cruzadas pueden deberse a la
 7'     
 7'
'
   #'
 ! '
 





 !    '
   -
'  reacciones cruzadas con otras molé- nocidos por el anticuerpo sea común a sustan-
) 4     (  7' 
  #' &
)

   
 !
 -
   #' 
)
š 4 !"

   (
 - > Diferentes animales responderán de distinta
ro del animal implica variaciones entre dife- !  !! !' 
 
    ' !
 ! 
  $ !'" 
reproducibilidad. ' )
š 4 !"

  !" !   > Las cantidades de suero que se pueden extraer
disponibilidad del anticuerpo sea limitada.
  !  * $ '<
la especie que se emplee) y hay que tener en
cuenta también la supervivencia del animal.

238363<=$>)#?!<$(<"()!
Los inconvenientes que presentan los anticuerpos > Se trataba sobre todo de evitar los problemas
policlonales llevaron al desarrollo de la técnica de 

 

& % 
-
 
! & '!    dad, así como las limitaciones en la cantidad de
de los anticuerpos monoclonales. anticuerpo disponible.

La técnica de los hibridomas fue desarrollada

 —› & _103. El objetivo era obtener un

 



  


ilimitada. César Milstein y su discípulo alemán Geor-
' —› $     8!

 _
 & }'#  =Š^)

Figura 1.13. César Milstein el día de su nombramiento

como Doctor honoris causa   \$


 {'
(1999).
10 Atlas de inmunohistoquímica

Para ello fusionaron (hibridaron) células plasmá-

 
 7' 

 
 
!
   #'    

con células tumorales procedentes de mielomas no
secretores. La célula plasmática normal da al híbrido
 


   7' # &  "-
la tumoral aporta al mismo la inmortalidad necesaria
   $  

!) -
mente, por razones de economía, se emplearon rato-
   
  !)
En la actualidad se está extendiendo el uso de conejos
(véase más adelante).

Figura 1.14. Obtención de anticuerpos monoclonales

mediante la técnica de los hibridomas. Tras inmunizar
al animal, se fusionan células plasmáticas procedentes

   " !   
  "-
 #
   7' # &  
inmortales.

Una vez aislada la célula hibridada se procederá al > / 

 
 
$
  !! !
  

& empleando la técnica en la que se vaya a usar,



  ''
    -    
  immunoblotting
rrespondiente. no siempre funcionará bien en inmunohistoquí-
mica, y uno que funcione bien en cortes de con-
'   !  
'  
 )
El cultivo puede llevarse a cabo:

In vitro, obteniendo el anticuerpo a partir del
sobrenadante.

In vivo, trasplantando el cultivo a la cavidad > Los cultivos que crecen en la cavidad peritoneal

   '" & (&
 proporcionan mayores cantidades de anticuer-
el anticuerpo a partir del líquido ascítico. po (103 veces más) que los que crecen in vitro,
  ! # &  

7' ! !  
  -
minadas.
 Técnicas inmunohistoquímicas 11

El cultivo estará constituido por un único clon de > 8   & ''  7' -
células idénticas. # !     -
po.
Ventajas


   al reconocer el anticuerpo mo- > La 

hace referencia a la propiedad
noclonal un único epitopo. de un anticuerpo de unirse selectivamente a un

Reproducibilidad, &   !'

< 
  #'  
intrínseca impide que haya diferencias entre cruzadas con otras moléculas.
lotes.

Disponibilidad, puesto que la cantidad que
puede obtenerse de un anticuerpo monoclonal
es prácticamente ilimitada.

Reconocimiento de epitopos lineales, por lo >
Ocurre lo contrario con los anticuerpos policlo-
  
  ! - nales, que reconocen determinantes conforma-

  #  !
  
 - cionales=Z@ =Z^.
ticuerpo183.

Los anticuerpos monoclonales de conejo, obte- > Además, con los anticuerpos monoclonales de

 !
 '# '"  ' % 
    ! 
$%   $
  


  '" & 

š _& $
 & 

) !  
 Z=] $ !&90,162.
š _& 

 ' )
š 8


   %

 62,90,155,162.

Inconvenientes


Menor sensibilidad que los anticuerpos poli- > En la práctica esto no representa un inconve-
clonales, ya que éstos reconocen varios epito-    !   ' -
pos y los monoclonales solo uno.


  "

  !

"
 ! &  
 !"


  '"203.

Posibilidad de obtención de falsos negativos, > 4 ( 


 !
 -
ya que si el epitopo reconocido se altera, po- cuerpos monoclonales en inmunocitoquími-

!    '$) ca ultraestructural, por las alteraciones de los

Menor estabilidad al pH y concentraciones sa- 
  
 %)
linas que los anticuerpos policlonales.

Imposibilidad de eliminación de reactividad > En los anticuerpos policlonales puede eliminarse
cruzada en caso de epitopos compartidos por !
 
 !'#
 

)

  ! #')

Valorados conjuntamente, la principal ventaja (es- > En la práctica solo emplearemos anticuerpos



   !     
  
'!
con creces los inconvenientes señalados. de monoclonales equivalentes.
Los prospectos (data sheets) que acompañan a los
 !
#   '-
 !  '  


 -
cuerpo151:
š 8
  ! $) > # !  
    -
* & ' !)
12 Atlas de inmunohistoquímica

š :
  
 
 !* - > Si aparecen bandas con diferentes masas mo-
perado en Western blot. leculares deben incluirse referencias a estudios
š 
     explicando el resultado.

     
)
š +
   %

  '"- > 
  <! 
 '   

!

  #) knocked out en ratones mutantes el uso de este
 &     .
š 8
  
"   > Muchos suministradores ofertan diferentes an-
desarrollados contra diferentes epitopos de la tisueros contra distintos epitopos de la misma
misma proteína en secciones seriadas. proteína (que detectan las porciones amino- y
(! 
 ' -
les de la proteína).
š 
   
   > Criterio alternativo a los dos anteriores (d y e)
!#!  
 in situ en en caso de que no puedan cumplirse.
secciones seriadas.

238383@(>$@^<
/  !   - > /  
 
  $& 

   ! #
 '! =]] PL o 1 mL). 
   '

)
/   ! #
 '!  > 4 !    $ '-


  !  0 (!  - ! 
 
 3) 15 mM, que evita
' Π]Π?)  ! ! !
  !  & 
' ) %)

  ! : 0 =]] !_) :œ ?]    
 -
 &
!&  $

#)
> Se le añade también albúmina sérica bovina
(BSA) al 1%. La albúmina se une a componen-
   $"
   =
 !-
! $
 $

 #)
Además inhibe los anticuerpos anti-albúmina
producidos en caso de que ésta se haya emplea-
do como proteína transportadora de haptenos.

A no ser que lo recomiende expresamente el fabri- >  !'  8`  <  !5-

 $  !
 8` ! -  
!  5)
  ! !

  !
  #)
4   #'  ! -
!       
 !
elementos.
El título, o  
  - > Será necesario, por tanto, comenzar por deter-
po monoclonal, se expresa en P'  !'  !/) 8 ! 
 

   -
   
 '!  tras condiciones particulares de trabajo.
los P'
 #' 
  !/
 ) > ! ' '    !-
#!  !   
de proteína en torno a 1 P'!/??Œ.
La dilución óptima de un anticuerpo será aquélla > \
 ==]] ' '! 
   !(!  *
  mezclamos 1 parte de anticuerpo y 99 partes de

  !(! 


  # &  !

)
!#!  #)