Saldarriaga Céspedes, Angie Eliana CMI

Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
N
IÓ
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
“Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria y
RM
Concentración Mínima Bactericida del aceite esencial de Citrus

FO
sinensis (Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento de

IN
Staphylococcus aureus y de Escherichia coli.”

DE
AS
EM
TESIS
ST
PARA OPTAR EL TÍTULO DE

SI
BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO
DE
N
IO
CC
Autora: Br. Angie Eliana Saldarriaga Céspedes

RE
Asesor: Dr. Pedro Mercado Martínez

DI
TRUJILLO – PERU
2016
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE
N
IÓ
BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO
AC
IC
UN
M
CO
RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Y
A
IC
Dr. Orlando Gonzales Nieves
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
VICE-RECTOR ACADÉMICO
EM
Dr. Rubén Vera Veliz

ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

DI
Dr. Esteban Ilich Zerpa
ii
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
N
IÓ
Dr. Marco Salazar Castillo
AC
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
RM
FO
Dr. Enrique Padilla Santos

IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

N
IO
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
CC
Dra. Eva Villanueva Tarazona

RE
DI
iii
ASESOR
N
IÓ
El que suscribe, profesor asesor de la presente tesis declara que ésta ha sido
AC
ejecutada de conformidad con su correspondiente proyecto y con las debidas
IC
UN
orientaciones al tesista. En cuanto al informe, este ha sido revisado y acoge las
M
observaciones y sugerencias correspondientes.
CO
Y
Por lo tanto, autorizo a la Br. ANGIE ELIANA SALDARRIAGA CESPEDES,
A
IC
continuar con el trámite de reglamento correspondiente. ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
________________________
SI
DE
Dr. Pedro Mercado Martínez

N
IO
ASESOR
CC
RE
DI
iv
PRESENTACIÓN
N
IÓ
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:
AC
IC
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de
UN
Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra
M
CO
consideración y criterio, el informe de tesis titulado: “Determinación de la
Y
Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración Mínima Bactericida del aceite
A
IC
esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento de
ÁT
Staphylococcus aureus y de Escherichia coli.”con el propósito de obtener el
RM
Título Profesional de Biólogo – Microbiólogo.

FO
IN
DE
AS
EM
Trujillo, Abril del 2016

ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
Br. Angie Eliana Saldarriaga Céspedes
MIEMBROS DEL JURADO
N
IÓ
AC
IC
UN
Dra. Manuela Lujan Velásquez
M
CO
PRESIDENTE
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN

DE
AS
SECRETARIO
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

RE
DI
VOCAL
vi
APROBACIÓN
N
IÓ
Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran
AC
que el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y
IC
UN
fundamentales, siendo aprobado por unanimidad.
M
CO
Y
A
IC
ÁT
Dra. Manuela Lujan Velásquez
RM
FO
PRESIDENTE
IN
DE
AS
EM
ST

SI
DE
SECRETARIO
N
IO
CC
RE
DI
Dr. Luis Alberto Llenque Díaz
VOCAL
vii
DEDICATORIA
A ti Dios que me diste la oportunidad de vivir y regalarme una familia
N
IÓ
maravillosa.
AC
IC
UN
M
CO
Con mucho cariño a mi hija Jimena Calderón Saldarriaga, mi motivación, mi
Y
alegría y mi impulso en todo momento.
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
.
IO
CC
RE
DI
viii
AGRADECIMIENTO
Mi profundo agradecimiento a mi asesor Dr. Pedro Mercado Martinez,
N
profesor del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad
IÓ
Nacional de Trujillo, por su apoyo, confianza y asesoramiento en la realización
AC
IC
de la presente Tesis.
UN
M
CO
A mis Padres Beatriz y Belisario por apoyarme a lo largo de toda mi
Y
A
carrera universitaria.
IC
ÁT
RM
FO
A mis Hermanos Liset y Kevin por su apoyo constante.

IN
DE
AS
A Denis por su apoyo, amor y compañía.

EM
ST
SI
A Don carlos, por su apoyo, confianza y por estar siempre ahí, cuando
DE
más lo necesite.
N
IO
CC
RE
DI
ix
RESUMEN
El presente trabajo tuvo por objetivo la Determinación de la Concentración Mínima
N
Inhibitoria y Concentración Mínima Bactericida del aceite esencial de Citrus sinensis
IÓ
AC
(Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento de Staphylococcus aureus y de
IC
Escherichia coli. El aceite se obtuvo por destilación de arrastre con vapor de agua a
UN
partir del flavedo de la naranja. Los cultivos empleados para determinar la Concentración
M
CO
Mínima Inhibitoria(CMI) y la Concentración Mínima Bactericida(CMB) fueron:
Staphylococcus aureus y de Escherichia coli. La CMI se determinó con el método de
Y
A
Macrodilución en caldo utilizando 8 concentraciones; dando como promedio el 3.8%
IC
ÁT
frente Staphylococcus aureus y un promedio el 8.7 % del aceite esencial frente
RM
Escherichia coli. La CMB se obtuvo por el método de siembra en superficie en agar

FO
nutritivo; los promedios fueron 7.2% para Staphylococcus aureus y 12.3% del aceite
IN
esencial para Escherichia coli. El aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad
DE
Tangelo resultó tener un mayor efecto antibacteriano en los cultivos de Staphylococcus

AS
aureus que en los cultivos de Escherichia coli

EM
ST
Palabras clave: Concentración Mínima Inhibitoria, Concentración Mínima Bactericida,

SI
Citrus sinensis, Staphylococcus aureus , Escherichia coli.

DE
N
IO
CC
RE
DI
CONTENIDO
Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo……………………..………... ii
Asesor……………………………………………………………………………… iv
Presentación……………………………………………………………………….. v
N
IÓ
Miembros del Jurado………………….…………………………………………… vi
AC
Aprobación……………………………….………………………………………….……. vii
IC
UN
Dedicatoria………………………………………………………………………… viii
M
Agradecimiento……………………………………………………………………. ix
CO
Resumen…………………………………………………………………………… x
Y
Contenido………………………………………………………………………….. xi
A
IC
ÁT
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….. 1
RM
MATERIAL Y METODO
FO
MATERIAL BIOLOGICO ....................................................................…………. 9

IN
DE
PROCEDIMIENTO……………………..……………………………………….. 9
AS
1. Obtención del aceite esencial de la naranja………………………………… 9

EM
1.1 Preparación de los frutos de la naranja. ………………………………….. 9

ST
9
SI
1.1.1 Recolección de la muestra………………………………….........

9
DE
1.1.2 Selección ………………………………………………..……....

N
1.1.3 Lavado ………………………………………………………….. 10

IO
1.1.4 Extracción del flavedo …...……………………………………... 10

CC
10
RE
1.1.5 Corte……………………………………………………………..
DI
1.2 Extracción del aceite esencial de Citrus
sinensis…………………………………………………..……………….. 10
1.2.1 MÉTODO: Destilación por arrastre con vapor de agua
xi
………………………………………………………………….. 10
2. Evaluación del efecto antibacteriano del aceite esencial de C.
sinensis(Naranja) in vitro……………………………..…………………………........... 11
2.1. Evaluación del efecto antibacteriano del aceite esencial de C.
N
sinensis(Naranja) en el crecimiento de S. aureus………………. 11
IÓ
AC
2.1.1. Estandarización del inóculo de S.
IC
aureus………………………………………………….. 11
UN
2.1.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria
M
CO
del aceite esencial de Citrus sinensis(Naranja)
11
Y
variedad Tangelo en el crecimiento de S. aureus. ..........
A
2.1.2.1. Método: Macrodilución en caldo ……...............
IC
ÁT 11
2.1.3. Determinación de la Concentración Mínima

RM
Bactericida del aceite esencial de Citrus

FO
sinensis(Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento de

IN
S. aureus………………………...…………………………….. 11
DE
2.2. Evaluación del efecto antibacteriano del aceite esencial de C.

AS
sinensis en el crecimiento de E. coli…………………….…………. 12

EM
2.2.1. Estandarización del inóculo de E. coli …………..…….. 12

ST
2.2.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria

SI
DE
(CMI) del aceite esencial de C. sinensis(Naranja) en el
crecimiento de E. coli……………………………………
N
12
IO
2.2.2.1 Método: Macrodilución en caldo…………………..….. 12

CC
RE
13
DI
2.2.3. Determinación de la Concentración Mínima
Bactericida del aceite esencial de Citrus sinensis
(Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento de E.
xii
coli……………………………………………………….…….. 13
2.2.3.1 Método: Macrodilución en caldo………………. 13
2.2.3.2 Concentración Mínima Bactericida del aceite
esencial de Citrus sinensis var. Tangelo en el
N
IÓ
crecimiento de E. coli……………………………… 13
AC
IC
3. Análisis Estadístico …………………………………………………… 13
UN
M
CO
RESULTADOS…………………………………………......……………………… 14
Y
Tabla 1. Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración Mínima
A
IC
Bactericida del aceite de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo
ÁT
frente a los cultivos de Staphylococcus
RM
aureus………………………..…………………………………………………..….. 15
FO

IN

DE
frente a los cultivos de Escherichia

AS
coli………………………………………..……………………………………….…. 16
EM
.
ST
SI

DE
Bactericida del aceite de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo en

N
especies de Escherichia coli y Staphylococcus aureus……………………… 17

IO
CC
DISCUSION……………………………………………………………………..
RE
18
DI
CONCLUSIONES………………………………………………………………... 21
RECOMENDACIONES………………………………………………………….. 22
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………….. 23
xiii
ANEXOS………………………………………………………………………….. 31
ANEXO 1: El equipo de destilación por arrastre con vapor de agua
utilizado en la extracción del aceite de citrus sinensis variedad (Naranja).
Tangelo .
N
IÓ
AC
ANEXO 2: Set de tubos de ensayo donde se determinó la Concentración
IC
Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja)
UN
variedad Tangelo, evaluando el crecimiento de S. aureus.
M
CO
ANEXO 3: Placa con agar nutritivo donde no se observó crecimiento de
Y
Staphylococcus aureus en una concentración del 7% del aceite esencial de
A
IC
Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo. ÁT
RM
ANEXO 4:Tubos de ensayo donde se observa el crecimiento de

FO
Escherichia coli hasta la concentración de 9% del aceite esencial de Citrus

IN
sinensis (Naranja) variedad Tangelo, se determinó la presente como

DE
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI).

AS
ANEXO 5: Placas Petri con agar nutritivo donde no se presentó

EM
crecimiento Escherichia coli en la concentración de 12% comparado con

ST
SI
otra de Concentración 10% del aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja)

DE
variedad Tangelo.
N
IO
ANEXO 6: Análisis estadístico realizados a la Concentración Mínima

CC
Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite

RE
de Citrus sinensis(Naranja) variedad Tangelo, frente a los cultivos de

DI
Staphylococcus aureus.
ANEXO 7: Análisis estadístico realizados a la Concentración Mínima
xiv
Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite
de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo frente Escherichia coli.
ANEXO 8: Análisis estadístico realizado a los valores de la Concentración
Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del
N
IÓ
aceite de Citrus sinensis(Naranja) variedad Tangelo frente Staphylococcus
AC
aureus y Escherichia coli, para saber si existe diferencia significativa.
IC
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
xv
INTRODUCCIÓN
En los últimos años el mundo ha optado por el consumo de agentes antimicrobianos de
N
origen natural (derivados de vegetales), esto debido a que se ha asociado al consumo
Ó
CI
excesivo de conservadores químicos con intoxicaciones, esto sumado al uso irracional
CA
de antibacterianos que ha traído como consecuencia la resistencia de microorganismos
I
UN
a diversos antibióticos.1
M
CO
Y
A
IC
Las propiedades antimicrobianas de hierbas y especias han sido reconocidas y usadas
ÁT
desde tiempos antiguos en la preservación de los alimentos y en la medicina, pero
RM
científicamente confirmado hace pocos años2. Los aceites esenciales poseen actividad
FO
antimicrobiana por lo cual los convierte en una opción atractiva para la sustitución de
IN
conservantes sintéticos, aunque añadido va a cambiar o mejorar el sabor de los

DE
alimentos. La industria alimentaria principalmente utiliza a los aceites esenciales como

AS
saborizantes, pero estos representan una interesante fuente de antimicrobianos

EM
naturales para la conservación de alimentos3. Sin embargo, la aplicación de aceites

ST
SI
esenciales como conservantes de alimentos requiere un conocimiento detallado de sus

DE
propiedades, es decir, la concentración mínima inhibitoria (CMI), el modo de acción y

N
el efecto de los componentes en la matriz de los alimentos4.

IO
CC
RE
DI
Los cítricos se originaron hace unos 20 millones de años en el sudeste asiático. Desde
entonces hasta ahora han sufrido numerosas modificaciones debidas a la selección
natural y a hibridaciones tanto naturales como producidas por el hombre. El género
1
Citrus, pertenece a la gran familia de las Rutáceas, presenta las siguientes especies:
Citrus sinensis (Naranja dulce), Citrus aurantium (naranja agria), Citrus reticulata
(Mandarina), Citrus aurantifolia (Limón), etc5.
N
Ó
CI
CA
Citrus sinensis (Naranja) es el que tiene mayor demanda a nivel mundial y una de las más
I
UN
utilizadas en el país, entre las que destaca la variedad Tangelo que da frutos de tamaño
M
mediano, corteza un tanto gruesa, dura y coriácea. Se han reportado estudios que
CO
demuestran que poseen características antifúngicas, antimicrobianas y fitoterapéuticas, las
Y
A
cuales le hacen una especie promisoria para su uso en actividades farmacéuticas, control
IC
ÁT
de plagas en el sector agrícola y la preservación de los alimentos para evitar la
RM
proliferación de microorganismos causantes de enfermedades6.

FO
IN
DE
Todo cítrico contiene aceite esencial y principios amargos (flavonoides), las hojas
AS
maduras pueden contener alcaloides, taninos y monoterpenos. Las flores contienen

EM
además glucósidos y cumarinas. El flavedo (cáscara) del fruto contiene α-pineno, β-

ST
pineno, mirceno, limoneno, p-cimeno, γ-terpineno, linanol, acetato de linalilo, α-

SI
terpineol, citronelol, acetato de geranilo, N-metilantranilato de metilo, entre otros

DE
componentes7.
N
IO
CC
Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva, anaerobio facultativo; se

RE
DI
encuentra en la piel, la nariz y en la piel de animales de sangre caliente. Hasta 30-50%
de la población humana son portadores. S. aureus puede crecer en un amplio rango de
temperatura, comprendido entre 7-48.5ºC con un óptimo de 30-37ºC, pH de 4.2 a 9.3,
2
con un óptimo de 7 a 7.5 y concentración de cloruro de sodio hasta 15%, puede crecer
y sobrevivir a baja actividad de agua (AW=0.86)8. Estas características permiten que
S. aureus crezca en una amplia variedad de alimentos. Esto, más su nicho ecológico,
N
pueden fácilmente explicar su incidencia en todos los alimentos que requieren
Ó
CI
manipulación procesamiento, incluyendo productos alimenticios fermentados tales
CA
como el queso. S. aureus es un importante patógeno debido a una combinación de
I
UN
virulencia mediada por las toxinas, invasividad y resistencia a antibióticos. Algunas
M
cepas de S. aureus son capaces de producir enterotoxina estafilococócica y son los
CO
agentes causantes de intoxicación alimentaria estafilocócica9.
Y
A
IC
ÁT
La contaminación con S. aureus puede ser evitado por el tratamiento de calor en los
RM
alimentos, sin embargo esta se mantiene como mayor causa de enfermedades

FO
transmitidas por alimentos porque puede contaminar los productos alimentarios

IN
10
DE
durante la preparación y procesamiento . Los alimentos que han sido frecuentemente

AS
incriminados en la intoxicación por estafilococos son la carne, aves de corral, de

EM
huevos, leche y derivados, ensaladas, productos de panadería, en particular rellenos de

ST
crema pasteles y tortas y sándwiches rellenos11.

SI
DE
N
E. coli también está implicado en las enfermedades alimentarias. Es un bacilo Gram

IO
negativo, anaerobio facultativo, móvil por flagelos perítricos, esporógeno, tiene

CC
RE
requerimientos nutricionales sencillos: fermentan la glucosa, reducen los nitratos y son

DI
catalasa positivos y oxidasa negativos. E. coli puede crecer en un amplio rango de
temperatura, comprendido entre 7-46 ºC con un óptimo de 37 ºC, pH de 4.4 a 9, con
un óptimo de 6 a 7, su actividad de agua (AW) mínima es 0.95 y su AW óptimo es
3
0.99512. Las cepas de E. coli poseen antígenos flagelares (H), capsulares (K) y
somáticos (O)13.
Los aceites esenciales poseen compuestos que presentan distintos niveles de actividad
N
antibacteriana, son extraídos de diferentes frutos cítricos y plantas aromáticas, su
Ó
CI
volatilidad a temperatura ambiente, a diferencia de otros agentes antimicrobianos; los
CA
hace atractivos para su estudio y aplicación como una alternativa adecuada y natural
I
UN
de aditivos alimentarios14.
M
CO
Y
Los aceites esenciales son utilizados como saborizantes en la industria alimenticia,
A
IC
esta característica unida a su potencial saborizante, antimicrobiano y antioxidante,
ÁT
15
tiene un gran beneficio, por ser un producto natural y sin riesgo a la salud humana .
RM
Bajo esta concepción se han realizado diversos estudios con aceites esenciales,
FO
15
evaluando su efecto antimicrobiano, fungicida e insecticida , con la finalidad de
IN
utilizarlos como alternativas terapeúticas contra las infecciones producidas por

DE
microorganismos resistentes a los antibióticos 16.

AS
EM
Los aceites esenciales del flavedo de los cítricos contienen de 85 a 99% de

ST
componentes volátiles y de 1 a 55% de componentes no volátiles. La actividad

SI
DE
antimicrobiana del aceite esencial de los cítricos depende de diversos factores, entre
N
los que destacan la estructura química de los componentes del aceite y su

IO
CC
concentración. Es extremadamente difícil correlacionar la actividad antimicrobiana a

RE
un único compuesto o clase de compuestos, ya que los diversos componentes de

DI
cualquier aceite pueden actuar sinérgicamente. 17
4
La hidrofobicidad de los constituyentes de los aceites esenciales les permite integrar a
los lípidos de la membrana celular bacteriana y de la mitocondria, alterando las
estructuras y haciéndolas más permeables. Una gran pérdida del contenido celular
puede conducir a la muerte celular18. Los aceites esenciales son más efectivos en
N
Ó
bacterias Gram positivas que en Gram negativa in vitro, aceites esenciales obtenidos
CI
de Ocimum basilicum L. y otras especies de Ocimum fueron más efectivas contra
I CA
bacterias Gram positivas (Bacillus sp., Staphylococcus sp., Micrococcus sp., Sarcina
UN
sp., Lactobacillus sp.) que en bacterias Gram negativas (Enterobacter sp.,
M
CO
Pseudomonas sp., Escherichia coli, Salmonella sp.)19. Estudios con aceites esenciales
Y
demuestran que los aceites esenciales interactúan con membranas celulares de las
A
IC
+ +
bacterias cambiando su permeabilidad a cationes como H y K ; la salida de potasio
ÁT
RM
intracelular ocasiona alteraciones estructurales y pérdida de la viabilidad celular, así lo

FO
demuestra el estudio del aceite esencial de Origanum compactum frente a S. aureus y

IN
P. aeruginosa20.
DE
AS
Se han realizado estudios sobre la actividad antibacteriana y la concentración mínima

EM
ST
inhibitoria (CMI) del aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata Blanco) variedad
SI
Dancy, en donde las cortezas de las frutas fueron prensadas al frío para la obtención
DE
del aceite. Las cepas bacterianas que se utilizaron para determinar la actividad
N
IO
antibacteriana fueron: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus ATCC 259923,

CC
RE
DI
Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomona
aeruginosa ATCC 27853, y Escherichia coli ATCC 2592221,22. La actividad
antibacteriana se determinó por el método de difusión en agar utilizando las siguientes
5
concentraciones de aceite: 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100%. La CMI se
determinó por el método de dilución en caldo utilizando 6 concentraciones. El aceite
esencial presentó actividad antibacteriana del tipo bactericida contra B. subtilis, S.
aureus y L. monocytogenes a todas la concentraciones excepto al 1%. La CMI del
N
Ó
aceite esencial de mandarina variedad Dancy para B. subtilis fue de 9%, para S. aureus
CI
y L. monocytogenes fue de 7%22.
I CA
UN
M
CO
El principal constituyente volátil del aceite esencial de Citrus sinensis variedad
Y
Valencia encontrado según investigaciones ha sido el monoterpeno con una
A
IC
concentración de 99.93%, y su potencial aplicación, para ser aprovechado como más
ÁT
que un abono.23
RM
FO
IN
La actividad antibacteriana del aceite esencial de Pseudognaphalium caeruleocanum

DE
obtenido por el método de difusión en agar con discos frente a Staphylococcus aureus
AS
(ATCC 25923), Enterococcus faecalis (ATCC 29212), Escherichia coli (ATCC

EM
ST
25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Klebsiella pneumoniae (ATCC

SI
23357) mostraron que el aceite inhibió el desarrollo de S. aureus y E. faecalis, a una

DE
concentración mínima inhibitoria (CMI) de 80 y 120 μg/mL, respectivamente24.

N
IO
CC
Diversos autores evaluaron la actividad bactericida y determinaron la concentración

RE
mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico y del aceite esencial de hojas de
DI
Rosmarinus officinalis sobre microorganismos de interés alimentario: Escherichia
coli, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Listeria
monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus y Lactobacillus plantarum
6
en el 2010. El aceite esencial exhibió un amplio espectro de acción antimicrobiana
tanto para bacterias gram positivas como gram negativas con CMI entre 512 – 4096
ppm. El extracto etanólico mostró actividad antimicrobiana contra las bacterias S.
sonnei, S. typhimurium y L. monocytogenes con CMI de 1024 ppm23.
N
Ó
CI
CA
Se han realizado estudios sobre la actividad antibacteriana del aceite esencial de
I
UN
mandarina, reportándose que dicho aceite presentó actividad del tipo bactericida contra B.
M
subtilis, S. aureus y Listeria monocytogenes22.
CO
Y
A
La gran capacidad de adaptación y de sobrevivencia que presenta E. coli y S. aureus
IC
ÁT
hace particularmente compleja su eliminación en los alimentos, es por eso que la
RM
industria alimentaria a lo largo de los años ha hecho uso de productos químicos para
FO
inhibir el crecimiento de microorganismos causantes de alteraciones de alimentos,

IN
infecciones e intoxicaciones; una alternativa natural es el uso de aceites esenciales, ya

DE
que son eficaces para la seguridad y conservación de alimentos debido a la presencia

AS
25
EM
de una amplia gama de componentes volátiles .Es por esta razón que se propuso la
ST
realización de la presente tesis con el propósito de la determinación de la

SI
Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración Mínima Bactericida del aceite

DE
esencial de Citrus sinensis (Naranja), variedad Tangelo en el crecimiento de

N
IO
Staphylococcus aureus y de Escherichia coli.

CC
RE
DI
Por lo citado anteriormente, en el presente informe se plantearon los siguientes
objetivos:
7
Objetivo General:
- Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración
Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial Citrus sinensis(Naranja)
N
Ó
variedad Tangelo en el crecimiento de Staphylococcus aureus y Escherichia
CI
CA
coli de (Pruebas in vitro).
I
UN
M
Objetivos Específicos:
CO
Y
A
- Determinar si existe o no diferencia significativa entre la Concentración
IC
ÁT
Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del
RM
aceite de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo con cultivos de

FO
Staphylococcus aureus.
IN
- Determinar si existe o no diferencia significativa entre la Concentración

DE
Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del

AS
aceite de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo con cultivos de

EM
ST
Escherichia coli.
SI
- Establecer si existe o no diferencia significativa de las Concentraciones

DE
Mínima Inhibitoria y de las Concentraciones Mínima Bactericida promedio del

N
IO
aceite de Citrus sinensis(Naranja) variedad Tangelo con los cultivos de

CC
Staphylococcus aureus y Escherichia coli.

RE
DI
8
MATERIAL Y MÉTODO
N
Ó
MATERIAL BIOLÓGICO
CI
CA
-Cultivos de Staphylococcus aureus (FGB-001, FGB-002, FGB-003, FGB-004,
I
UN
FGB-005 y FGB-006), proporcionados por el Laboratorio de Fisiología y
M
CO
Genética Bacteriana.
Y
A
IC
-Cultivos de Escherichia coli (EC-001, EC-002, EC-003, EC-004, EC-005 y EC-
ÁT
006), proporcionados por el Laboratorio de Referencia Regional “La Libertad” de
RM
la ciudad de Trujillo.
FO
IN
-Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo.

DE
AS
PROCEDIMIENTO
EM
ST
1. Obtención del aceite esencial de la naranja

SI
DE
1.1 Preparación de los frutos de la naranja.

N
1.1.1 Recolección de la muestra:

IO
CC
Las frutos de Citrus sinensis(Naranja) variedad Tangelo fueron obtenidos

RE
del supermercado “TOTTUS” de Trujillo.

DI
1.1.2 Selección
9
Sólo fueron utilizadas aquellas naranjas que no presentaron magulladuras,
cortes o demás lesiones en su flavedo.
1.1.3 Lavado
N
Ó
Se realizó el lavado de los frutos, eliminando partículas extrañas, suciedad,
CI
CA
restos de tierra que estuvieron adheridos a la materia prima.
I
UN
1.1.4 Extracción del flavedo
M
Se extrajo la parte blanca de la cascara, para la obtención del flavedo.
CO
1.1.5 Corte
Y
A
En esta etapa se cortó el flavedo en pedazos.
IC
ÁT
1.2 Extracción del aceite esencial de Citrus sinensis
RM
1.2.1 MÉTODO: Destilación por arrastre con vapor de agua26, 27

FO
Se realizó un proceso de destilación por arrastre con vapor de agua (Anexo

IN
1), en donde se colocaron 150g del flavedo en una pera de decantación, el

DE
cual estuvo conectado a un balón de 1000ml que contenía agua, éste último
AS
fue calentado en una cocina hasta alcanzar la temperatura de ebullición del

EM
agua, lo cual generó la salida de los aceites esenciales del flavedo de la

ST
SI
naranja que estaba en la pera de decantación. El aceite esencial fue arrastrado

DE
por el vapor de agua, que al condensarse, formó una mezcla de aceite y agua
N
en una segunda pera de decantación. La mezcla obtenida, se centrifugó a

IO
CC
6000 rpm durante 15 min, con el fin de separar la fase acuosa de la oleosa, la
RE
separación de la menor porción de agua se hizo con la ayuda de una jeringa.

DI
El tiempo de extracción fue de 80 min, contándose desde el instante en el que
cayó la primera gota en la segunda pera de decantación.
10
El aceite fue envasado en frascos ámbar de 12 ml de capacidad y se conservó
en refrigeración a 4 ºC para los análisis posteriores.
N
2. Evaluación del efecto antibacteriano del aceite esencial de Citrus sinensis in
Ó
CI
vitro.
CA
2.1 Evaluación del efecto antibacteriano del aceite esencial de Citrus sinensis en
I
UN
el crecimiento de S. aureus
M
CO
2.1.1 Estandarización del inóculo de S. aureus28,29
Y
Se sembró en agar nutritivo e incubó a 37 ºC por 10 horas. Posteriormente, se
A
IC
realizó una suspensión en solución salina fisiológica a una turbidez equivalente
ÁT
al estándar 0,5 del Nefelometro de Mc Farland.
RM
FO
2.1.2 Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria(CMI) del

IN
aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento

DE
30, 31
de S. aureus.
AS
EM
2.1.2.1 Método: Macrodilución en caldo (Anexo. 2)

ST
Se usaron 9 tubos de ensayo que contenían caldo nutritivo, tween 80 al

SI
0.5%(v/v) y aceite esencial en concentraciones de 0(control), 2, 3, 4, 5, 6,

DE
30
7, 8, 9% de un volumen final de 2ml.
N
IO
A cada uno de los tubos se le adicionó 0.02 ml del inóculo de S.aureus, se

CC
homogenizó y se llevó a incubar a 37 ºC por 24 horas.

RE
La lectura se hizo en relación a la definición de CMI que es la menor

DI
concentración del aceite que inhibe el crecimiento bacteriano visible.
El ensayo se realizó por triplicado.
11
2.1.3. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida(CMB) del aceite
esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento de
S. aureus.32.33 (Anexo 3)
N
Ó
De la lectura de la Concentración mínima inhibitoria, a partir del tubo que
CI
CA
no se observó crecimiento bacteriano (Inhibición del crecimiento), se
I
UN
contaron 4 tubos que no presentaron turbidez. De cada tubo seleccionado
M
se extrajo 0.1 ml para realizar la técnica de siembra por superficie en
CO
placas con agar nutritivo.
Y
A
IC
También se utilizó una placa control para cada una de las bacterias: un
ÁT
control en agar nutritivo con 0.1ml de inóculo
RM
FO
Se incubó durante 24 horas a 37 °C.

IN
DE
Luego se procedió con la lectura; se consideró la CMB, a la placa que no

AS
presento crecimiento bacteriano, teniendo la menor concentración de

EM
aceite de Citrus sinensis variedad Tangelo.

ST
SI
2.2 Evaluación del efecto antibacteriano del aceite esencial de Citrus sinensis en
DE
N
34, 35
el crecimiento de E. coli
IO
.
CC
2.2.1 Estandarización del inóculo de E. coli

RE
DI
Se sembró E. coli en agar nutritivo e incubó a 37 ºC por 6 horas. Se realizó una
suspensión en solución salina fisiológica a una turbidez equivalente al estándar
del tubo 0,5 de Nefelometro de Mc Farland.
12
2.2.2 Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite
esencial de Citrus sinensis en el crecimiento de E. coli.
N
2.2.2.1 Método: Macrodilución en caldo(Anexo 4).
Ó
CI
Se usaron 9 tubos de ensayo que contenían caldo nutritivo, tween 80 al
CA
0.5%(v/v) y aceite esencial en concentraciones de 0(control), 6, 7, 8, 9, 10,
I
UN
11, 12, 13% de un volumen final de 2ml.
M
CO
A cada uno de los tubos se le adicionó 0.02 ml del inóculo de E. coli, se
Y
homogenizó y se llevó a incubar a 37 ºC por 24 horas.
A
IC
La lectura se hizo en relación a la definición de CMI que es la menor
ÁT
concentración del aceite que inhibe el crecimiento bacteriano visible.
RM
El ensayo se realizó por triplicado.

FO
2.2.3. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida(CMB) del aceite

IN
esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento

DE
de Escherichia coli.
AS
Se realizó el mismo procedimiento realizado en CMB del aceite esencial de

EM
C. sinensis sobre S. aureus(Anexo 5).

ST
SI
DE
3. Análisis Estadístico
N
IO
El análisis de los resultados obtenidos para la determinación CMI y CMB del

CC
aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento

RE
Escherichia coli y Staphylococcus aureus se efectuó mediante el programa SPSS

DI
versión 18.0. Se realizó el análisis de varianza(Anexo 6, 7 y 8), específicamente
un ANAVA unifactorial, a los datos obtenidos para determinar si hay diferencias

34
significativa. La significancia se reportó con un nivel de confianza del 95%.
13
RESULTADOS
N
Ó
CI
CA
La tabla 1 muestra la Concentración Mínima Inhibitoria y la Concentración Mínima
I
UN
Bactericida del aceite esencial Citrus sinensis(Naranja) variedad Tangelo, con los
M
cultivos de S. aureus, donde los promedios de la CMI y la CMB fueron 3.8 y 7.2%
CO
respectivamente.(Anexo 6).
Y
A
IC
ÁT
RM
La tabla 2 muestra la Concentración Mínima Inhibitoria y la Concentración Mínima

FO
Bactericida del aceite esencial Citrus sinensis(Naranja) variedad Tangelo, frente a los
IN
cultivos de E. coli, donde los promedios de la CMI y la CMB fueron 8.7 y 12.3%
DE
respectivamente. (Anexo 7).

AS
EM
ST
SI
La tabla 3 muestra que no existe diferencia significativa entre las Concentraciones

DE
Mínima Inhibitoria promedio del aceite esencial Citrus sinensis (Naranja) variedad
N
IO
Tangelo con especies de S. aureus y E. coli, en cambio sí existe diferencia

CC
significativa entre las Concentraciones Mínima Bactericida promedio del aceite

RE
esencial Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo con especies de S. aureus y E.

DI
coli, (Anexo 8).
14
N
Ó
CI
con los cultivos de Staphylococcus aureus.
I CA
UN
M
CO
Cultivos de Concentración Mínima Concentración Mínima
Y
Staphylococcus Inhibitoria (%) Bactericida (%)
A
aureus
ST-001 4
IC 9
ÁT
RM
ST-002 3 7
FO
IN
ST-003 2 6
DE
ST-004 4 7
AS
EM
ST -005 4 7
ST
SI
ST -006 4 7
DE
N
Promedio ( ̅ ): 3.8 7.2

IO
CC
(p<0.05)
RE
DI
15
Tabla 2. Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración Mínima Bactericida
N
Ó
del aceite de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo frente a los
CI
CA
cultivos de Escherichia coli.
I
UN
M
CO
Y
Cultivos de Concentración Mínima Concentración Mínima
A
IC
Escherichia coli Bactericida (%)
Inhibitoria (%)
ÁT
RM
EC-001 8 12
FO
IN
EC-002 9 13
DE
EC-003 11 12
AS
EM
EC-004 7 14
ST
EC-005 9 12
SI
DE
EC-006 8 11
N
IO
Promedio ( ̅ ): 8.7 12.3

CC
RE
(p>0.05)
DI
16
Tabla 3. Comparación del promedio de la Concentración Mínima Inhibitoria y del
N
Ó
promedio de la Concentración Mínima Bactericida del aceite de Citrus
CI
CA
sinensis (Naranja) variedad Tangelo en especies de Staphylococcus
I
UN
aureus y Escherichia coli.
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
Prueba
FO
Concentración Mínima Concentración Mínima

Cultiv Inhibitoria (%) Bactericida (%)
IN
os
DE
S. aureus 3.8 7.2

AS
E. coli 8.7 12.3

EM
ST
SI
p>0.05 p<0.05
DE
N
IO
CC
RE
DI
17
DISCUSIÓN
N
Ó
Se han reportado estudios de aceite esenciales que poseen actividad
CI
CA
antimicrobiana, donde se indica que las especie vegetales cítricas, poseen
I
UN
características antifúngicas, antimicrobianas y fitoterapéuticas, las que las hacen una
M
especie promisoria para evitar la proliferación de microorganismos causantes de
CO
enfermedades35,36, los aceites de naranja y toronja mostraron tener actividad
Y
antibacteriana contra cepas bacterianas de: Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
A
IC
Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa y Salmonella entre otras37,38.
ÁT
RM
FO
En la tabla 1 se demuestra que, el aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja)

IN
variedad Tangelo tiene efecto inhibitorio y bactericida frente a Staphylococcus aureus

DE
presentando como promedio una CMI del 3.8% y un promedio de una CMB de 7.2%,
AS
así mismo se muestra que el efecto bactericida del aceite esencial es significativamente
EM
mayor en la CMB comparado con la CMI de cultivos de Staphylococcus aureus con

ST
p<0.05. (Anexo 06).

SI
DE
N
En la tabla 2 los resultados demuestran que, el aceite esencial de Citrus

IO
CC
sinensis variedad Tangelo tiene efecto inhibitorio y bactericida frente a Escherichia

RE
coli presentando como promedio una CMI del 8.7% y un promedio de una CMB de
DI
12.3%, por esto se muestra que el aceite esencial estadísticamente actúa
significativamente por igual en ambas concentraciones con los cultivos de Escherichia
coli con p>0.05. (Anexo 06).
18
En la tabla 3 se observa que el promedio CMI del aceite esencial Citrus sinensis
variedad Tangelo entre especies de S. aureus y E. coli, los valores son cercanos, por lo
N
que no actúa significativamente, siendo lo opuesto si se compara con el promedio del
Ó
CI
CMB entre las dos especies, donde si se observa diferencia significativa.
I CA
En los resultados obtenidos en la tabla 1 y tabla 2, el aceite esencial de Citrus
UN
M
sinensis(Naranja) variedad Tangelo tiene un mayor efecto inhibitorio y bactericida en
CO
Staphylococcus aureus que en Escherichia coli debido a su diferencia de estructuras
Y
morfológicas, como lo es en su membrana y su pared celular.39,40 La interacción en la
A
IC
membrana con las bacterias, generalmente es producida por su carga positiva y su
ÁT
RM
atracción electrostática hacia las superficies polianionicas, ya sea en los ácidos

FO
teicoicos en Gram positivos o lipoolisacáridos en Gramnegativos.41

IN
La diferencia que existe en el efecto de este aceite esencial de naranja frente a

DE
Staphylococcus aureus y Escherichia coli también se debería a la estructura y

AS
constitución de su pared celular, Escherichia coli es una bacteria Gram negativa

EM
presenta una pared celular y una membrana más compleja; la pared celular es similar
ST
SI
en constitución (más delgada) a la de las bacterias Gram positivas como

DE
Staphylococcus aureus, está constituida por péptidoglicanos, tiene una membrana

N
externa y una membrana interna, está constituida por fosfolípidos con ácidos grasos
IO
CC
42
saturados y entre las dos capas se halla un espacio periplásmico rico en enzimas.
RE
DI
La acción antibacteriana de los aceites esenciales se debe a su composición. El
aceite esencial de C. sinensis tiene un alto contenido de monoterpeno, este terpeno
19
actúa acumulándose en la membrana plasmática microbiana y por lo tanto causa una
pérdida de la integridad de la membrana y disipación de la fuerza motriz44, 45. En los
Gram negativos como Esherichia coli su membrana externa actúa como una barrera
que limita la entrada de varios tipos de agentes antimicrobianos, entre estos los aceites
N
esenciales46 . Lo último respaldaría al efecto bactericida en la tabla 3 muestra la CMI
Ó
CI
y CMB promedio en microorganismos como Staphylococcus aureus y Escherichia
I CA
coli. Para Staphylococcus aureus se utilizó una cantidad menor del aceite esencial
UN
Citrus sinensis(Naranja) variedad Tangelo, mientras que para Escherichia coli la
M
CO
concentración bactericida será mayor estadísticamente.
Y
A
Estudio realizado muestra similares resultados con esta investigación, en el
IC
ÁT
que se utilizó el aceite esencial Citrus sinensis L. (naranja dulce) inhibe mejor a cepas
RM
de microorganismos Gram positivos, como: Staphylococcus aureus ATCC 25933 y

FO
Staphylococcus epidermidis, demostrando actividad antibacteriana significativa a

IN
concentraciones de 100 y 50%, respectivamente, que con los microorganismos Gram

DE
negativos: Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 47.

AS
EM
ST
En otros estudios se utilizaron el aceite esencial de zingiber officinale,

SI
(jengibre) el cual mostró ser más eficaz contra cepas Staphylococcus aureus que,
DE
contra cepas Pseudomonas aeruginosa48 y el aceite esencial de Origanum vulgare L.

N
IO
ante bacterias aisladas en leche de bovino, tuvo un buen efecto contra bacterias Gram
CC
positivas, para Staphylococcus coagulasa negativa49. Comparado con los resultados

RE
promedio de la tabla 3, los microorganismos Gram positivos como Saphylococcus

DI
aureus resultan ser más sensibles ante agentes antimicrobianos, que los Gram
negativos como Escherichia coli.
20
CONCLUSIONES
1. La Concentración Mínima Bactericida del aceite esencial de Citrus sinensis
N
(Naranja) variedad Tangelo frente a Staphylococcus aureus es significativamente
Ó
CI
mayor que la Concentración Mínima Inhibitoria de la misma especie.
I CA
UN
M
CO
2. No hubo diferencia significativa entre la Concentración Mínima Inhibitoria y la
Y
Concentración Mínima Bactericida del aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja)
A
IC
variedad Tangelo frente a Escherichia coli. ÁT
RM
FO
3. No hubo diferencia significativa entre las Concentraciones Mínima Inhibitoria

IN
promedio del aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo con
DE
especies de Staphylococcus aureus y Escherichia coli; en cambio la Concentración

AS
EM
Mínima Bactericida promedio para E. coli fue significativamente mayor que para
ST
S. aureus.
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
21
RECOMENDACIONES
N
Ó
- Se sugiere evaluar, en posteriores trabajos, la actividad antimicrobiana con los
CI
CA
componentes mayoritarios aislados del aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja)
I
UN
variedad Tangelo sobre los microorganismos evaluados y desarrollar estudios
M
sobre matrices alimentarías específicas que permitan valorar el comportamiento in
CO
situ del aceite esencial del flavedo de Citrus sinensis (Naranja), evaluando el
Y
efecto sensorial sobre el producto que se desea conservar y el efecto de los
A
IC
procesos de elaboración y de otros aditivos sobre la actividad antimicrobiana.
ÁT
RM
FO
IN
- Se sugiere también realizar estudios de extracción de aceite esencial en otras

DE
especies, principalmente en la región La Libertad, que puedan contribuir al

AS
desarrollo agroindustrial.
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
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RE
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DI
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actividad antibacteriana del aceite esencial de Citrus sinensis L.(naranja dulce) y
N
Ó
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CI
I CA
UN
47. Vásquez Ribeiro Oscar. Extracción y caracterización del aceite esencial de
M
CO
jengibre (zingiber officinale). Rev Amaz Inv Alim 2001; 1 (1): 38 – 40.
Y
A
IC
ÁT
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RM
aceite esencial de Origanum vulgare L. ante bacterias aisladas en leche de bovino.

FO
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IN
DE
AS
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EM
antisépticos y desinfectantes. Colomb Med 2007; 38(2): 5-7.

ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
30
N
Ó
CI
I CA
UN
M
CO
Y
A
ANEXOS IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
31
N
ANEXO 1
IÓ
AC
Equipo de destilación por arrastre con vapor de agua utilizado en la extracción del aceite de citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo
IC
UN
M
CO
Y
I CA
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
E M
ST
SI
DE
N
O
C CI
RE
DI
2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/
32 . No olvide citar esta tesis.
ANEXO 2
N
- Set de tubos de ensayo donde se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria
Ó
CI
(CMI) del aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo,
CA
evaluando el crecimiento de S. aureus
I
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
- Set de Tubos de ensayo donde se observa el crecimiento de Staphylococcus

EM
aureus, por la que se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del

ST
aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo; comparado con un

SI
tubo control donde se observó crecimiento.

DE
N
IO
CC
RE
DI
33
ANEXO 3
Placa con agar nutritivo donde no se observó crecimiento de Staphylococcus aureus
N
en una concentración del 7% del aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad
Ó
CI
Tangelo.
I CA
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
34
ANEXO 4
-Tubos de ensayo donde se observa el crecimiento de Escherichia coli hasta
la concentración de 9% del aceite esencial de Citrus sinensis (Naranja)
N
Ó
variedad Tangelo, se determinó la presente como Concentración Mínima
CI
Inhibitoria (CMI).
I CA
UN
M
CO
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
-Comparación de tubos de ensayo con caldo nutritivo en los que se presentó

AS
crecimiento de Escherichia coli(Tubo control) y el no crecimiento en una

EM
concentración del 9% de aceite esencial Citrus sinensis (Naranja) variedad

ST
Tangelo.
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
35
ANEXO 5
N
Ó
CI
CA
Placas Petri con agar nutritivo donde no se presentó crecimiento Escherichia coli en
I
UN
la concentración de 12% comparado con otra de Concentración 10% del aceite
M
CO
esencial de Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo.
Y
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
IO
CC
RE
DI
36
ANEXO 6
N
IÓ
AC
Análisis estadístico realizados a la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite de
IC
Citrus sinensis(Naranja) variedad Tangelo, frente a los cultivos de Staphylococcus aureus.
UN
M
CO
Estadísticas de la regresión
Coeficiente de
Y
correlación
A
IC
múltiple 0.85571696
Coeficiente de
ÁT
determinación
RM
R^2 0.73225152
R^2 ajustado 0.6653144
FO
Error típico 0.43549417
IN
Observaciones 6
DE
ANÁLISIS DE
AS
VARIANZA EM
Grados
De Promedio
ST
liberta Suma de de los

SI
D cuadrados cuadrados F P
DE
Regresión 1 2.07471264 2.07471264 10.9393939 0.029724579

Residuos 4 0.75862069 0.18965517
N
Total 5 2.83333333
I O
CC
Estadístico Superior Inferior Superior

RE
Coeficientes Error típico T Probabilidad Inferior 95% 95% 95.0% 95.0%

DI
37
- -
N
Intercepción -0.86206897 1.43072286 0.60254085 0.57930621 -4.83439244 3.11025451 4.83439244 3.11025451
IÓ
Concentración
AC
Mínima
IC
Bactericida (%) 0.65517241 0.19808837 3.30747546 0.02972458 0.105190937 1.20515389 0.10519094 1.20515389
UN
M
CO
P - valor: 0.0297245
Y
La prueba muestra que hay diferencia significativa entre los grupos (p<0.05).
A
IC
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
I O
CC
RE
DI
38
N
ANEXO 7
IÓ
AC
IC
Análisis estadístico realizados a la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite de
UN
Citrus sinensis (Naranja) variedad Tangelo frente Escherichia coli.
M
CO
Y
A
Coeficiente de
IC
correlación
ÁT
múltiple 0.64959835
Coeficiente de
RM
determinación
R^2 0.42197802
FO
R^2 ajustado 0.27747253
IN
DE
Observaciones 6
AS
ANÁLISIS DE VARIANZA EM
Grados de Suma de Promedio de
ST
libertad cuadrados los cuadrados F P

Regresión 1 5.90769231 5.90769231 2.92015209 0.16266058
SI
Residuos 4 8.09230769 2.02307692

DE
Total 5 14
N
O
Inferior Superior Inferior Superior

I
CC
Coeficientes Error típico Estadístico t Probabilidad 95% 95% 95.0% 95.0%

RE
Intercepción 17.9846154 5.28967958 3.3999442 0.02727873 3.29811041 32.6711204 3.29811041 32.6711204

DI
39
N
Concentración - 0.43214067 -1.70884525 0.16266058 -1.9382764 0.46135332 -1.9382764 0.46135332
IÓ
AC
IC
Mínima 0.73846154
UN
Bactericida (%)
M
CO
p-valor: 0.16266058
Y
A
IC
La prueba muestra que no hay diferencia significativa entre los grupos (p>0.05).
ÁT
RM
FO
IN
DE
AS
EM
ST
SI
DE
N
I O
CC
RE
DI
40
ANEXO 8
N
IÓ
Análisis estadístico realizado a los valores de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima Bactericida (CMB) del
AC
aceite de Citrus sinensis(Naranja) variedad Tangelo frente Staphylococcus aureus y Escherichia coli, para saber si existe diferencia
IC
UN
significativa.
M
Resumen
CO
Y
A
Coeficiente de correlación múltiple 0.47633051
IC
CMI
ÁT
Coeficiente de determinación R^2 0.22689076
R^2 ajustado 0.03361345
RM
FO
Observaciones 6
IN
ANÁLISIS DE VARIANZA
DE
Grados de Suma de Promedio de los
AS
Libertad Cuadrados Cuadrados F P
Regresión 1
EM
3.17647059 3.17647059 1.17391304 0.33954173
Residuos 4 10.8235294 2.70588235
ST
Total 5 14
SI
DE
Superior Inferior Supe

Coeficientes Error típico Estadístico t Probabilidad Inferior 95% 95% 95.0% 95.
N
O
Intercepción 13.0588235 3.80584144 3.43125791 0.02650507 2.49211369 23.6255334 2.49211369 23.62

I
CMI
CC
(%) -1.05882353 0.97724987 -1.08347268 0.33954173 -3.77210414 1.65445708 -3.77210414 1.654

RE
DI
41
N
IÓ
Resumen
AC
IC
UN
Coeficiente de correlación múltiple 0.11516336
Coeficiente de determinación R^2 0.0132626
M
CO
R^2 ajustado -0.23342175
Y
Observaciones 6
A
IC
ÁT
ANÁLISIS DE VARIANZA
RM
CM
FO
Grados de Suma de Promedio de los
IN
Libertad Cuadrados Cuadrados F P
DE
Regresión 1 0.14367816 0.14367816 0.81301864 0.04976344
AS
Residuos 4 10.6896552
EM 2.67241379
Total 5 10.8333333
ST
SI
Superior Inferior Sup

DE
Coeficientes Error típico Estadístico t Probabilidad Inferior 95% 95% 95.0% 95

Intercepción 10.9310345 5.37062739 2.0253366 0.11153347 -3.98021764 25.8422866 -3.98021764 25.8
N
O
Concentración M
I
CC
Mínima Bactericida (%) 0.17241379 0.74358133 0.23186945 0.81301864 -1.89209896 2.23692655 -1.89209896 2.23
RE
DI
42

Saldarriaga Céspedes, Angie Eliana CMI

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Concentración Mínima Bactericida del aceite esencial de Citrus

sinensis (Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento de

Staphylococcus aureus y de Escherichia coli.”

PARA OPTAR EL TÍTULO DE

Autora: Br. Angie Eliana Saldarriaga Céspedes

Asesor: Dr. Pedro Mercado Martínez

AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE

TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE

Dr. Rubén Vera Veliz

SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Dr. Esteban Ilich Zerpa

DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

Dr. Enrique Padilla Santos

DIRECTORA DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE

Dra. Eva Villanueva Tarazona

Dr. Pedro Mercado Martínez

Título Profesional de Biólogo – Microbiólogo.

Trujillo, Abril del 2016

Br. Angie Eliana Saldarriaga Céspedes

MIEMBROS DEL JURADO

Dr. Pedro Mercado Martínez

Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

Dr. Pedro Mercado Martínez

Dr. Luis Alberto Llenque Díaz

A ti Dios que me diste la oportunidad de vivir y regalarme una familia

Mi profundo agradecimiento a mi asesor Dr. Pedro Mercado Martinez,

A mis Hermanos Liset y Kevin por su apoyo constante.

A Denis por su apoyo, amor y compañía.

El presente trabajo tuvo por objetivo la Determinación de la Concentración Mínima

Staphylococcus aureus y de Escherichia coli. La CMI se determinó con el método de

Escherichia coli. La CMB se obtuvo por el método de siembra en superficie en agar

Tangelo resultó tener un mayor efecto antibacteriano en los cultivos de Staphylococcus

aureus que en los cultivos de Escherichia coli

Palabras clave: Concentración Mínima Inhibitoria, Concentración Mínima Bactericida,

Citrus sinensis, Staphylococcus aureus , Escherichia coli.

Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo……………………..………... ii

MATERIAL BIOLOGICO ....................................................................…………. 9

1. Obtención del aceite esencial de la naranja………………………………… 9

1.1 Preparación de los frutos de la naranja. ………………………………….. 9

1.1.1 Recolección de la muestra………………………………….........

1.1.2 Selección ………………………………………………..……....

1.1.3 Lavado ………………………………………………………….. 10

1.1.4 Extracción del flavedo …...……………………………………... 10

1.2 Extracción del aceite esencial de Citrus

1.2.1 MÉTODO: Destilación por arrastre con vapor de agua

2. Evaluación del efecto antibacteriano del aceite esencial de C.

2.1. Evaluación del efecto antibacteriano del aceite esencial de C.

2.1.3. Determinación de la Concentración Mínima

Bactericida del aceite esencial de Citrus

sinensis(Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento de

2.2. Evaluación del efecto antibacteriano del aceite esencial de C.

sinensis en el crecimiento de E. coli…………………….…………. 12

2.2.1. Estandarización del inóculo de E. coli …………..…….. 12

2.2.2. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria

(CMI) del aceite esencial de C. sinensis(Naranja) en el

2.2.2.1 Método: Macrodilución en caldo…………………..….. 12

2.2.3. Determinación de la Concentración Mínima

Bactericida del aceite esencial de Citrus sinensis

(Naranja) variedad Tangelo en el crecimiento de E.

2.2.3.1 Método: Macrodilución en caldo………………. 13

2.2.3.2 Concentración Mínima Bactericida del aceite

esencial de Citrus sinensis var. Tangelo en el