Maciel González Daniela Zugey

Genética molecular
METODOLOGIA
Para extracción de ADN en lagarto

Por punción de la vena caudal, se puede obtener muestras de sangre. 

 -Se almacenan diluidas en proporción 1:10 en un buffer de lisis (100 mM Tris-HCl pH 8;
100 mM EDTA pH 8; 10 mM NaCl; 1% SDS (p/v)) que permite su conservación a
temperatura ambiente.  
Para la extracción de ADN:   
- Colocar en un tubo de 1,5 ml tipo eppendorf, 100 μl de la solución de sangre conservada a
temperatura ambiente en buffer de lisis. 
 -Agregar 600 μl de una solución de digestión (2 % (p/-v) CTAB; 1,4 M de NaCl; 0,2 %
(p/-v) 2-Mercaptoetanol; 20 mM EDTA; 200 mM Tris-HCl pH 7,5).  
-Homogeneizar e incubar en baño termostatizado a 60oC durante 4 horas.  
-Cada 30 minutos homogeneizar la muestra para una mejor digestión. 
 
- A la muestra digerida se le agregan 700 μl de cloroformo, se homogeniza y se centrifuga a
10000 rpm durante 10 minutos. 
- El sobrenadante se trasvasa a un tubo nuevo estéril. 
-Se agrega igual volumen de cloroformo.  
-Se homogeniza y se centrifuga a 10000 rpm durante 10 minutos. 
- Se repite el paso anterior una vez más. 
- En un nuevo tubo estéril, al sobrenadante del paso anterior se le agregan 500 μl de alcohol
isopropílico. Se homogeniza y se lleva a -20oC por 15 minutos (pueden ser 2 horas para
recuperar mayor cantidad de ADN).  
-Luego se centrifuga a 13000 rpm durante 15 minutos. 
- Posteriormente se descarta el alcohol y se llevan los tubos a estufa de secado durante unos
20 minutos para eliminar el exceso de alcohol. 
- El pellet resultante es resuspendido en 200 μl de agua bidestilada estéril. 
- Se deja reposar dos horas a temperatura ambiente para que el ADN se rehidrate. 
-Se almacena a -20oC hasta su utilización.