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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE
FACULTAD DE AGRONOMIA E INGENIERIA FORESTAL

DIRECCION DE INVESTIGACION Y POSTGRADO
MAGÍSTER EN FISIOLOGÍA Y PRODUCCIÓN VEGETAL.
SELECCIÓN DE LEVADURAS CON CAPACIDAD DE SÍNTESIS DE ÁCIDO

INDOL ACÉTICO Y/O ACTIVIDAD ACC DESAMINASA Y SU APLICACIÓN
PARA PROMOVER EL CRECIMIENTO VEGETAL
Tesis presentada como requisito para optar al grado de
Magíster en Fisiología y Producción Vegetal
por:
Mariajosé Carvajal Contardo
Comité de Tesis
Profesor Guía: Liliana Godoy
Profesores Informantes:
Francisco Albornoz
Claudia Bonomelli
Septiembre 2022
Santiago-Chile
1
Agradecimientos
Agradezco a la Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal de la Pontificia

Universidad Católica de Chile y al proyecto FONDECYT Nº 1210422 que permitió
financiar este trabajo.
Mi completa gratitud al Laboratorio de Microbiología y Genética de levaduras del

Departamento de Fruticultura y Enología, y a su preciosa y maravillosa equipa.
Agradezco también al Laboratorio de Hidroponía y Nutrición de Cultivos del
Departamento de Ciencias Vegetales.
Agradezco a mis profesores, por siempre estar ahí para resolver mis dudas, por
darme desafíos y oportunidades increíbles, por ser parte de mi formación profesional.
Profesor Francisco Albornoz, gracias por dejarme ser su ayudante, fue una
experiencia muy linda y aprendí mucho junto a usted. Profesora Claudia Bonomelli,
gracias por ser parte de mi comisión y darme motivación. Profesora Liliana Godoy, la
máster de las levaduras, gracias por confiar en mí, enseñarme tanto y dejarme ser
parte de su laboratorio. Fue un honor trabajar con ustedes, sacaron lo mejor de mi.
Agradezco a Daniela Catrileo, la mejor Lab Manager e Ingeniera en Biotecnología

que podrán conocer en el mundo. Todo mi aprendizaje en laboratorio se lo debo a
ella, a su paciencia y cariño al enseñarme cada cosa. Eres la más seca y un
verdadero ejemplo a seguir.
Gracias a las levaduras y los tomatitos por llevarme tan lejos, por hacer experimentos
realmente hermosos, por sorprenderme y emocionarme con cada resultado.
Agradezco a mi familia, amigas y amigos, en especial a mi amiga de toda la vida

Sofía Muñoz que escucho todos mis dramas, amiwa te quiero y amo mucho. A mi
papá, mamá, hermana y chances, por su apoyo incondicional, por ser el pilar
fundamental en mi formación personal y por compartir mis alegrías en cada pequeño
logro. Gracias por todo, ustedes lo saben. Los quiero y amo mucho.
Mención especial a Agustín Yon, que me ayudo en todo el proceso de mi tesis.

Gracias infinitas por acompañarme, por escuchar mis ideas, por darme ánimos y por
hacerme ver todo lo que he logrado. Tu sabes todo ¡te mega amo!
A mi hermana, ¡ fighting !
A mis padres, que guiaron a la persona que soy ahora
soy una científica dramática y ustedes lo saben mejor que nadie.
A veces las cosas no resultan.

Si no te resulta algo significa que estas a un paso más cerca de lograr tu objetivo ☺
No soy buena para las frases cliché pero les quiero decir que tarde o temprano,
en algún momento, se termina la tesis.
Índice
Abstract 3
1. Introducción 4
1. 1. Ácido indol-3-acético. 5
1. 2. Actividad ACC desaminasa. 6
1. 3. Levaduras como microorganismo promotor de crecimiento vegetal. 8
2. Hipótesis y Objetivos 10
2. 1. Hipótesis de trabajo: 10
2. 2. Objetivo General: 10
2. 3. Objetivos específicos 10
2. 4. Palabras Claves 10
3. Materiales y métodos 11
3. 1. Microorganismos 11
3. 2. Cuantificación de síntesis de AIA 12
3. 3. Determinación cualitativa de la actividad ACC desaminasa. 12
3. 4. Cuantificación de la actividad ACC desaminasa. 12
3. 5. Evaluación del efecto de la síntesis de AIA y actividad ACC desaminasa en
el desarrollo del sistema radicular en plántulas de tomate. 13
3. 6. Evaluación de la producción de etileno en plantas de tomate hidropónico. 14
3. 6. 1. Solución nutritiva y microorganismos 14
3. 6. 2. Cuantificación producción de etileno 15
3. 6. 2. Medición del crecimiento vegetativo en plantas de tomate hidropónico15
3. 7. Análisis estadístico 15
4. Resultados 16
4. 1. Cuantificación de AIA 16
4. 2. Determinación cualitativa de la actividad ACC desaminasa 17
4. 3. Cuantificación de la actividad ACC desaminasa. 18
4. 4. Evaluación del efecto de la síntesis de AIA y actividad ACC desaminasa en
el desarrollo del sistema radicular en plántulas de tomate. 18
4. 5. Evaluación del crecimiento de microorganismos en la solución nutritiva 25
4. 6. Relación entre el origen de las cepas y su producción de AIA y actividad
ACCD. 26
1
4. 7. Evaluación de la producción de etileno en plantas de tomate hidropónico 27
4. 7. 1. Clorofila 28
4. 7. 2. Tasa fotosintética 29
4. 7 . 3. Peso fresco y peso seco 30
5. Discusión 35
5.1. Producción de AIA 35
5. 2. Actividad ACC desaminasa 35
5. 3. Efecto de la síntesis de AIA y actividad ACC desaminasa en el desarrollo del
sistema radicular en plántulas de tomate. 37
5. 4. Evaluación del crecimiento de microorganismos en la solución nutritiva 40
5. 5. Evaluación de la producción de etileno en plantas de tomate hidropónico 41
6. Conclusión 44
7. Resumen 45
8. Bibliografía 46
SELECCIÓN DE LEVADURAS CON CAPACIDAD DE SÍNTESIS DE ÁCIDO

INDOL ACÉTICO Y/O ACTIVIDAD ACC DESAMINASA Y SU APLICACIÓN
PARA PROMOVER EL CRECIMIENTO VEGETAL
Mariajose Carvajal Contardo
2
Abstract
Yeast, as plant growth-promoting agents can increase nutrient uptake by

increasing root growth. The main objective was to evaluate plant growth in tomato
seedlings inoculated with yeast strains selected for their synthesis of IAA or ACCD
activity. To quantify IAA twenty-three strains were cultured in YPD w/wo L-Trp. The
same strains were cultured in YNB w/wo ACC to determine ACCD activity. Root
growth, evaluated as number of lateral roots and root length, was assessed in tomato
plants obtained from seeds placed in plates with the yeast inoculum. Finally, ethylene
synthesis was directly measured in roots of tomato plants exposed to four different
treatments: control (no inoculation), inoculation with the strain producing the highest
amount of IAA, inoculation with the strain that showed ACCD activity, and a mixture
of both selected yeast strains. All the strains were capable of producing IAA with and
without Trp. Two strains of Soliococozyma aeria were positive to ACCD activity. Most
of the strains increase the number of lateral roots and root volume. Most of the strains
decrease the length of the main root, except for Rhodotorula babjevae. In conclusion,
Rb-42 and Sa-79, arise as promising root growth promoting microorganisms thanks
to their synthesis of IAA or ACCD activity.
Key words: Plant growth promoting microorganisms, tomato, ethylene, indole-3-acetic

acid, beneficial yeasts.
3
1. Introducción
Actualmente existe una creciente búsqueda de herramientas para mejorar el

desarrollo y crecimiento de los cultivos. Esto debido a que las prácticas tradicionales
existentes ya no son suficientes para tener una producción sostenible en el tiempo.
Es por ello que se han propuesto numerosas soluciones que buscan suplir las
necesidades ambientales que se exigen a nivel mundial y producir alimentos de forma
consciente (Kahiluoto, et al., 2014).
Dentro de los problemas que se intenta resolver con este tipo de

herramientas, está el hacer más eficientes procesos como absorción de agua y
nutrientes. Dado esto, se han desarrollado biofertilizantes a partir de
microorganismos capaces de aumentar la disponibilidad de nutrientes en el suelo,
haciendo más fácil la absorción de ellos por la planta, de forma tal, que exista una
asociación benéfica (Sharma, et al., 2021). Esta mayor disponibilidad se puede dar
de forma directa, mediante la solubilización de nutrientes, o de forma indirecta,
aumentando el volumen radicular produciendo hormonas vegetales que lo
promuevan (Hernández-Fernández, et al., 2021)
Dentro de los biofertilizantes formulados a partir de microorganismos, existe

la categoría de los bioestimulantes que, siguiendo la misma línea del caso anterior,
se trata de microorganismos benéficos que gracias a su actividad metabólica mejoran
la eficiencia nutricional de la planta, pudiendo tener otros efectos positivos en
términos de disminuir estrés abiótico, mejorar la respuesta de defensa contra
patógenos, entre otros (Du Jardin, 2015). Ambos son productos que han tenido una
creciente demanda y se espera que entre los años 2022 y 2027 haya un aumento en
la tasa de crecimiento cercano al 15% en el mercado de estos compuestos
(Research&Markets, 2022).
Conocidos son los casos de Trichoderma sp., Rhizobium sp. y hongos

micorrízicos, que se caracterizan en el primer caso por actuar contra numerosos
patógenos, en el segundo por fijar nitrógeno atmosférico y el tercero tiene efectos
significativos en el aumento de exploración del perfil de suelo de las raíces, tanto
secundarias como primarias, e incluso aumento de la eficiencia en la absorción de
nutrientes, obteniendo de esta forma una rizosfera mucho más enriquecida para una
mayor generación de biomasa (Backer, et al., 2018). Como estos, podemos encontrar
4
una larga lista de microorganismos que no han sido estudiados completamente y
dentro de ellos se encuentran las levaduras, que son microorganismos unicelulares
pertenecientes al reino fungi (Aguilar, 2017).
Se ha descrito que las levaduras son capaces de promover el crecimiento

vegetal. Existen distintos mecanismos directos, como la producción o degradación
de fitohormonas, aumento de la absorción de nutrientes, o indirectas como
producción de enzimas o compuestos orgánicos volátiles que actúan como
biocontrolador (Freimoser, et al., 2020; Fu, et al., 2016).
1. 1. Ácido indol-3-acético.
Las auxinas son uno de los reguladores de crecimiento más importantes tanto
a nivel endógeno, producido como ácido indol-3-acético (AIA) por la misma planta,
como a nivel exógeno aplicado por los seres humanos como ácido indol-3-butírico
(IBA), entre otros. Cumple con distintas funciones, destacando su participación en la
morfogénesis mediante división y elongación celular formando nuevos tejidos y la
modulación sobre la arquitectura radicular. Además, favorece la dominancia apical,
promoviendo el crecimiento inicial de la plántula e induce la formación de raíces
adventicias (Taiz & Zeiger, 2006).
Se ha reportado la producción de ácido indol acético (AIA) por parte de

levaduras encontradas en el suelo de algunos cultivos de interés comercial. Las
levaduras presentes en la rizosfera, mediante la producción de auxinas, inducen una
mayor formación de raíces laterales y pelos radiculares, promoviendo así un mayor
acceso a los nutrientes del suelo debido al mayor radio de exploración (Luo, et al.,
2018). Al respecto, Fernandez San- Millan et al. (2020) realizaron un ensayo con
plántulas de tabaco inoculadas con diferentes cepas de levaduras que, si bien no
reportó un aumento en la tasa o tiempo de germinación ni en el porcentaje de
germinación, si afectó el vigor de las plántulas, observándose un aumento del
contenido de la clorofila en cotiledones y primeras hojas, y aumento de la densidad
de pelos radiculares. Por otro lado, en el mismo estudio se realizaron pruebas para
comprobar que el efecto no dependía de la relación entre especie y cepa. Para ello
se escogieron dos especies de levaduras, Pichia dianae y Meyerozyma guilliermondii,
las que destacaron por tener los mayores valores en los parámetros explicados.
5
Adicionalmente, se replicó el mismo experimento usando semillas de lechuga, en las
que se obtuvieron resultados similares.
Existen 5 vías de producción de ácido indol-3-acético, de las cuales 3 de ellas

son triptófano dependiente (Trp-d) siendo la vía del ácido indol-3-pirúvico es la más
utilizada. Las otras 2 vías son independientes de su precursor (Trp-i), es decir no
necesitan de su presencia, lo que supone una ventaja al momento de querer producir
AIA (Luo, et al., 2018; Spaepen, et al., 2007). Según los últimos estudios, la
producción de AIA por parte de las levaduras es posible en ambos casos (Rao, et al.
2010). Fu, et al. (2016) realizaron un ensayo con levaduras cultivadas en medio con
y sin Trp, reportaron valores de producción de AIA para levaduras crecidas en el
medio suplementado con Trp entre 8,57 y 600 𝜇g/mL, mientras que, en ausencia de
este compuesto, éstos oscilan entre 1,6 a 247 𝜇g/mL, resultados que sugieren que
existe una brecha en la cantidad producida de esta hormona. Esto fue también
descrito por Fernandez-San Millan et al. (2020), quienes señalan que, de las 70 cepas
de levaduras utilizadas en el experimento, cerca del 90% de ellas fue capaz de
producir AIA en ausencia del triptófano, a pesar de que en promedio producen 2/3
menos que en presencia de este precursor. Un caso similar fue reportado en
bacterias de la especie Bacillus sp., las que fueron capaces de producir hasta 350
𝜇g/mL de AIA en presencia de Trp y 200 𝜇g/mL en ausencia (Wagi & Ahmed, 2019).
1. 2. Actividad ACC desaminasa.
Algunas levaduras son capaces de transformar el 1-aminociclopropano-1-

carboxílato (ACC), precursor del etileno, en amoniaco y α-cetobutirato mediante la
enzima 1-aminociclopropano-1-carboxílato desaminasa (ACCD) (Figura 1). Esta
actividad se relaciona con el etileno que produce la planta, ya que es capaz de
interrumpir la biosíntesis de esta hormona que en concentraciones óptimas (en
promedio 10 mg/L, puede variar según la especie) es indispensable en funciones
relacionadas al crecimiento normal de las plantas, como la formación de raíces
adventicias y pelos radicales, acelera la germinación, rompe dormancia en semillas
y es conocida como la hormona de la senescencia (Glick, et al. 2007). En hortalizas
como tomate, se han reportado valores entre 0,1 a 1,5 nmol/g/hr aproximadamente,
desde su primer estadío de desarrollo como plántula hasta la etapa previa a la
senescencia (Chen, et al. 2020; Gouws, et al. 2012).
6
Además, participa en el desencadenamiento de la transcripción de genes que
codifican para proteínas de defensa debido a algún estrés, en este caso se consume
el pool existente de ACC en la planta (Glick, et al. 2007). Sin embargo, cuando el
estrés externo se convierte en una amenaza para la planta y comienza a causar daño,
se produce etileno en altas concentraciones (más de 25 mg/L) proceso que puede
llegar a durar entre 1 a 3 días. Esta gran cantidad de etileno genera síntomas como
clorosis, senescencia temprana tanto de hojas como raíces, abscisión de hojas, etc
(Singh, et al., 2015). En este último caso el pool de ACC ya se agotó, y se inicia la
transcripción de genes de la enzima ACC sintasa, sumado a las señales de estrés y
desarrollo es que el segundo peak es de mayor duración. En casos de estrés abiótico,
se ha reportado que bacterias del género Pseudomonas y Rhizobium con actividad
ACCD, son capaces de amortiguar el deterioro de las plantas de trigo por estrés
salino, esto a través de la mayor producción de clorofila y disminución de síntesis de
etileno generando una mayor tolerancia a la excesiva presencia de sales en el medio
(Zahir, et al. 2012). También hay estudios donde el uso de levaduras con esta
actividad disminuye el efecto del estrés por sequía en trigo (Hussein, et al. 2022).
Como consecuencia a los diferentes tipos de estrés, los cultivos no estarían

creciendo al máximo potencial que pueden tener. La planta no es capaz de crecer en
el tiempo en que se ve afectada por el estrés, hasta que logra ajustar su metabolismo
o que el estrés sea removido (Glick, et al. 2007). Debido a esto es que se hace crucial
controlar las respuestas frente a los estímulos detrimentales causados por los
desafíos climáticos como la sequía y el aumento de temperaturas, para lograr un
desarrollo con menos interrupciones obteniendo rendimientos favorables para la
población en crecimiento.
La biosíntesis de esta hormona comienza con la enzima ACC sintasa que

convierte S-adenosilmetionina (SAM) a ACC y 5′-metiltioadenosina (MTA), este
último reciclado a L-metionina. Luego el ACC se convierte en etileno mediante la
enzima ACC oxidasa (Figura 2). La ACCD actúa degradando el ACC, dejando sin
sustrato para generar más etileno (Honma & Shimomura, 1978). Lo que para la planta
significa tener una mayor tolerancia al estrés y evitar estas reacciones extremas de
defoliación o senescencia.
En cuanto a la enzima ACC desaminasa, esta tiene una afinidad por el ACC
(Km) que va desde 1,5 a 6,0 mM, es decir requiere de una alta concentración de su
7
sustrato para alcanzar la velocidad máxima de reacción. En otras palabras, no
representa una alta afinidad por el sustrato, por lo tanto la velocidad máxima de la
reacción se verá comprometida (Gamalero & Glick, 2015; Honma & Shimomura,
1978). Además, los niveles de ACC en la planta están en el rango de los µM, por lo
que la concentración de este sustrato en los tejidos es muy bajo comparado con el
Km ya mencionado de la enzima ACCD. Esto quiere decir que si hay un pequeño
aumento en la concentración de ACC aumentaría la tasa de la reacción de unión
entre el complejo enzima - sustrato (Glick, et al. 2007).
Figura 1. Interacción levadura - célula vegetal del tejido radicular de una planta.
(Modificado de Gamalero & Glick, 2015)
1. 3. Levaduras como microorganismo promotor de crecimiento vegetal.
Ambas formas de promover el crecimiento vegetal, síntesis de AIA y actividad

ACCD, se complementan entre sí. Por un lado, el AIA está involucrado en la
promoción de la transcripción de genes que codifican para la enzima ACC sintasa
(Figura 1), y por el otro el ACC puede inhibir el funcionamiento del AIA (Gamalero &
Glick, 2015; Ribaudo, et al. 2006). Por lo que, si existiera la presencia de un
microorganismo con actividad ACCD, los niveles de etileno disminuirían y el AIA
podría continuar con sus funciones, promoviendo el crecimiento de la planta de forma
indirecta (Glick, et al. 2006). Esto ha sido comprobado en especies como arroz,
donde el inóculo de una levadura en las raíces generó un incremento de un 25% en
8
el peso seco de esta zona en promedio (Amprayn, et al. 2012). Además, mientras el
AIA genera mayor cantidad de raíces laterales, la actividad ACCD permite la
producción de bajas concentraciones de etileno, generando una mayor cantidad de
pelos radiculares y mejorando y aumentando la absorción de nutrientes. Además, la
disminución del ACC permite darles una vida útil mayor a las raíces mientras se van
generando nuevas. Por otro lado, el producto de la reacción generado por la enzima
ACCD que es alfa-cetobutirato, contribuye en el crecimiento y desarrollo de las
levaduras ya que es el precursor de aminoácidos como la metionina que forma parte
importante de la estructura celular (Pirkov, et al., 2008). Además, otro de los
productos de la reacción es amonio, aumentando la disponibilidad de éste en la
rizosfera (Gamalero & Glick, 2015).
Entender cómo influyen las levaduras en el desarrollo y desempeño general

de las plantas es clave para su posible implementación en la producción de cultivos.
Existen varios reportes científicos que hablan sobre la capacidad de las levaduras de
producir AIA, pero hay poca información disponible sobre levadura con actividad
ACCD y los posibles efectos de estas cualidades en levaduras aplicadas en ensayos
in vivo. Además, es desconocido el potencial que pueden tener las levaduras nativas
de Chile como microorganismos promotores del crecimiento vegetal. Es por ello que
el presente estudio, tiene como principal objetivo promover el crecimiento vegetal en
plantas de tomate hidropónico a través de la aplicación de levaduras con capacidad
de síntesis de AIA y actividad ACC desaminasa.
9
2. Hipótesis y Objetivos
2. 1. Hipótesis de trabajo:
La aplicación de levaduras con capacidad de síntesis de AIA y/o actividad

ACC desaminasa en plantas de tomate promueve el crecimiento vegetal
2. 2. Objetivo General:
Promover el crecimiento vegetal en plantas de tomate a través de la aplicación

de levaduras con capacidad de síntesis de AIA y actividad ACC desaminasa.
2. 3. Objetivos específicos
1. Identificar levaduras con capacidad de sintetizar de ácido indol acético y/o actividad
ACC desaminasa.
2. Evaluar el efecto de la inoculación de levaduras en la producción de raíces laterales
y pelos radiculares en plántulas de tomate.
3. Cuantificar la producción de etileno y su efecto en el crecimiento vegetativo de
plantas de tomate inoculadas con levaduras que presentan actividad ACC y/o síntesis
de ácido indol acético.
2. 4. Palabras Claves
Promotor de crecimiento vegetal, Etileno, Auxinas, Tomate hidropónico, levaduras

benéficas.
10
3. Materiales y métodos
3. 1. Microorganismos
En total se evaluaron 23 cepas obtenidas desde de la colección de

microorganismos del Laboratorio de Genética y Microbiología de Levaduras de la
Pontificia Universidad Católica de Chile (Tabla 1). Previo a la identificación de estas
levaduras se realizó la extracción de ADN con el Kit Wizard Genomic DNA Purification
(Promega USA), luego fueron almacenados a -20ºC hasta ser enviadas a
secuenciación (Macrogen, Corea del Sur).
Tabla 1. Cepas de levaduras utilizadas en este estudio.

Nombre
Código Cepa Origen (ciudad, región) Región
abreviado
YCPUC10 Torulaspora delbrueckii Td-10 Talca – El Maule VII
YCPUC32 Hyphopichia pseudoburtonii Hp-32 Santa Fe, Los Ángeles - Bío bío VIII
YCPUC35 Rhodotorula dairenensis Rd-35 Santa Fe, Los Ángeles - Bío bío VIII
YCPUC42 Rhodotorula babjevae Rb-42 Rivera - Bío bío VIII
YCPUC53 Rhodotorula sp Rs-53 Rivera - Bío bío VIII
YCPUC66 Pichia membranifaciens Pm-66 Villarrica - La Araucanía IX
YCPUC75 Solicoccozyma aeria Sa-75 Hijuelas - Valparaíso V
YCPUC79 Solicoccozyma aeria Sa-79 Lumaco - La Araucanía IX
YCPUC83 Pichia kluyveri Pk-83 Los Ángeles - Bío bío VIII
YCPUC85 Wickerhamonyces onychis Wo-85 Lumaco - La Araucanía IX
YCPUC87 Wickerhamonyces onychis Wo-87 Lumaco - La Araucanía IX
YCPUC89 Metschinikowia sp Ms-89 Lumaco - La Araucanía IX
YCPUC101 Suhomyces kilbournensis Sk-101 Los Ángeles - Bío bío VIII
YCPUC113 Suhomyces kilbournensis Sk-113 Los Ángeles - Bío bío VIII
YCPUC136 Debaryomyces hansenii Dh-136 Requinoa - Libertador Bernardo O'Higgins VI
YCPUC144 Pichia membranifaciens Pm-144 Linares - Maule VII
YCPUC146 Cryptococcus sp Cs-146 Linares - Maule VII
YCPUC166 Saccharomyces bayanus Sb-166 Comercial C
YCPUC174 Torulaspora delbrueckii Td-174 Comercial C
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3. 2. Cuantificación de síntesis de AIA
La producción de AIA se evaluó en las 23 cepas de levaduras, las que fueron

cultivadas, independientemente en medio YPD líquido (1% extracto de levadura, 2%
peptona, 2% glucosa) con y sin L-Triptófano (L-Trp) al 0,1% (p/v). Se incubaron
durante una semana bajo agitación, a temperatura constante de 28 ºC y oscuridad.
Para cuantificar la producción de AIA, se utilizó la técnica colorimétrica

siguiendo el método de Salkowski (Ehmann, 1977). Para ello se tomaron 100 µL del
sobrenadante del cultivo de levadura y se mezcló con 100 µL del reactivo de
Salkowski (2 mL de Fe2Cl3 + 98 mL de 35% HClO4) en una microplaca de 96 pocillos
(Falcon) por triplicado. Luego la placa se incubó por 30 minutos en oscuridad a
temperatura ambiente. El desarrollo de coloración se cuantificó usando un
espectrofotómetro a 530 nm. Finalmente, la concentración de AIA se determinó con
una curva estándar de AIA puro (Sigma–Aldrich) en un rango de 0 a 100 µg mL-1.
3. 3. Determinación cualitativa de la actividad ACC desaminasa.
Las levaduras seleccionadas fueron cultivadas en medio YPD líquido durante

2 días. Se lavaron 3 veces con agua destilada, y se tomaron 50 µL los que se
depositaron en tubos de ensayo con 5 mL de medio YNB sin ninguna fuente de
nitrógeno (aminoácidos o sulfato de amonio) (Difco), e YNB suplementado con 3 mM
de ACC. Para ello se realizó la solución stock de ACC 0,5 M, esterilizada con un filtro
de pirinola de 0,2 µm, que luego fue almacenado a -20ºC hasta su uso. Se dejaron
crecer durante 2 semanas en una incubadora con agitación a 150 rpm con
temperatura a 28 ºC. La turbidez en el medio de cultivo fue utilizada como indicador
de la capacidad de las levaduras para crecer utilizando el ACC como sustrato,
sustituyendo al N. El crecimiento se cuantificó mediante densidad óptica a 630 nm.
3. 4. Cuantificación de la actividad ACC desaminasa.
Una vez identificadas las cepas con actividad ACC desaminasa de forma
cualitativa, se cuantificó la concentración de α-cetobutirato producida por las cepas.
Se siguió el protocolo propuesto por Torbaghan et al. (2017) con modificaciones. Se
tomó 1 mL del cultivo y se centrifugó por 5 minutos a 3000 x g. El pellet fue
12
resuspendido en 1 mL de Tris-HCl 0,1 M a pH 7,6, y luego se centrifugó a 16000 x g
por 5 minutos. Posteriormente, se resuspendió el pellet en 200 µL de Tris-HCl 0,1 M
a pH 8,5 y se añadieron 30 µL de tolueno y se agitó por 30 segundos. De las células
toluenizadas se tomaron 200 µL y se mezcló con 20 µL de ACC 0,5 M, esto se incubó
durante 15 minutos a 30ºC. Luego, se mezcló con 1 mL de HCl 0,56 M y se centrifugó
por 5 minutos a 16000 x g. Se tomó 1 mL del sobrenadante y se agregaron 800 µL
de HCl 0,56 M y se llevó a vortex. Luego se añadieron 300 L de 2,4
dinitrofenilhidrazina (0,2% 2,4 dinitrofenilhidrazina en 2 M HCl), se homogeneizó y se
incubó por 30 minutos a 30ºC. Finalmente, se añadieron 2 mL de NaOH 2 M y se
cuantificó la absorbancia por triplicado mediante espectrofotómetro a 540 nm. Para
determinar la concentración de α-cetobutirato producida por las levaduras se realizó
una curva estándar a partir de una solución stock 10 mM de α-cetobutirato en Tris-
HCl 0,1M a pH 8,5.
3. 5. Evaluación del efecto de la síntesis de AIA y actividad ACC desaminasa en el

desarrollo del sistema radicular en plántulas de tomate.
Se seleccionaron las cepas que demuestren tener actividad ACC desaminasa

y/o producción de AIA, para evaluar su efecto sobre el crecimiento de raíces laterales
y pelos radiculares en plantas de tomate. Para esto, se germinaron in vitro 5 semillas
de la variedad “Attiya” (Rijk Zwaan) en placas petri de 15 cm de diámetro, con medio
sólido Murashige - Skoog (MS) suplementado con sacarosa 1%, agar 1,5% y MES
0,05%. Las semillas fueron desinfectadas previamente en una solución de cloro al
1% v/v, sumergiéndolas durante 15 minutos, luego se realizaron 5 lavados con agua
destilada estéril. Las semillas se posicionaron de forma horizontal y equidistantes
entre ellas en la parte superior de la placa. Los tratamientos evaluados fueron 24, un
tratamiento para cada cepa más el control sin inóculo de levadura, para lo cual se
utilizaron 4 repeticiones. Las placas se colocaron de forma vertical en una cámara en
oscuridad a 28 ºC durante 2 días. Pasado ese tiempo, se inocularon 50 µL de las
cepas de levaduras de un cultivo saturado. Se utilizó un rastrillo de vidrio esterilizado
para rayar la levadura en forma horizontal en el extremo opuesto al que germinaron
las semillas. Las placas se incubaron en una cámara de crecimiento a 25 °C de
temperatura ambiente y un fotoperiodo de 16 hr durante 5 días.
13
Una vez crecidas las plántulas y sus raíces, se midió el largo de la raíz, el
número de raíces laterales y el volumen radicular utilizando los softwares WinRhizo
e Image J.
3. 6. Evaluación de la producción de etileno en plantas de tomate hidropónico.
Para el ensayo in vivo, se implementó un sistema hidropónico de tipo raíz flotante

para poder evaluar el efecto que producen las levaduras sobre el crecimiento y
desarrollo de las plantas de tomate. Se aplicaron 4 tratamientos: control (CT), la cepa
con mayor actividad ACC, S. aeria YCPUC79 (ACC), la cepa con mayor producción
de AIA Metschinikowia sp YCPUC89 (AIA) y la mezcla de estas dos cepas (ACC/AIA).
Cada tratamiento contó con 4 contenedores plásticos de 3L distribuidos de forma
aleatoria, cada uno con 2 plantines de tomate variedad “Attiya” (Rijk Zwaan)
previamente germinados en sustrato mezcla 3:1 turba:perlita y trasplantados con 3
hojas verdaderas. Los tratamientos con levaduras fueron inoculados con las cepas
correspondientes a una concentración de 1x106 células mL-1. El ensayo se llevó a
cabo en una cámara de crecimiento ubicada en la Facultad de Agronomía e
Ingeniería Forestal de la Pontificia Universidad Católica de Chile, a 25 ºC y
fotoperiodo de luz 16:8 h, durante 3 semanas.
3. 6. 1. Solución nutritiva y microorganismos
Una solución nutritiva fue elaborada en base al requerimiento nutricional de

los plantines de tomate, según Albornoz et al, (2018) (Tabla 2), preparando una
solución stock de micronutrientes 1000X. Para esto se usaron las siguientes sales;
Nitrato de potasio (KNO3), Fosfato monopotásico (KH2PO4), Sulfato de magnesio
heptahidratado (MgSO4 + 7H2O) y Nitrato de Calcio tetrahidratado (Ca(NO3)2).
Tabla 2. Requerimiento nutricional de plantines de tomate.

Nutriente Requerimiento nutricional (mM)
N-NO3 7
K 3
P 0,5
Ca 2
Mg 1
S 1
14
Previo a la inoculación de las levaduras en la solución nutritiva se realizó un
experimento para evaluar su sobrevivencia y crecimiento en ella. Una solución stock
de 50 mL con cada sal a 1 M fueron aplicados en un volumen de 50 µL en 5 mL de
agua destilada estéril en tubos de ensayo. A estos se agregó un inóculo equivalente
a 1x106 células mL-1. Los tubos fueron incubados con agitación durante 48 horas a
25 ºC. Se realizó conteo de colonias a los 2, 4 y 6 días.
3. 6. 2. Cuantificación producción de etileno
Para cuantificar la producción de etileno de las raíces, se utilizó un medidor

de etileno con una tasa de flujo del aire de 10 m s -1(modelo F-900, Felix Instruments).
Se realizó 1 medición diaria.
3. 6. 2. Medición del crecimiento vegetativo en plantas de tomate hidropónico
Se cuantificó la tasa de fotosíntesis y contenido de clorofila a todas las plantas

1 vez por semana. Por otra parte, al finalizar el experimento se pesaron las raíces y
parte aérea por separado para obtener masa fresca y seca total. Posterior a esto la
zona aérea cosechada se envió a hacer el análisis del contenido total de Nitrogeno
(N) al laboratorio de Agroanálisis UC.
3. 7. Análisis estadístico
Diferencias entre los tratamientos fueron evaluadas mediante ANOVA y

cuando existieron diferencias significativas al 5% se realizó una separación de
medias por el LSD de Fisher. Todos los análisis fueron realizados utilizando el
programa Statgraphics Centurion XVI.I (StartPointTechnologies, Warreton, USA).
15
4. Resultados
4. 1. Cuantificación de AIA
La mayor producción de AIA fue observada en la cepa R. babjevae YCPUC42

la cual presentó un valor de 0,61 µg x106 ± 0,0063 células de levadura en el medio
suplementado con Trp. Su valor se redujo a 0,42 µg x106 en el medio sin Trp (Figura
2).
Figura 2. Producción de ácido indol acético en las levaduras evaluadas. Los valores
se expresan en µg de AIA x106 células de levadura. Las barras representan la
media ± error estándar de 3 repeticiones.
Por otro lado, la cepa con menor producción fue D. hansenii YCPUC137 con
0,15 ± 0,019 µg x106 células en medio sin Trp. Las 23 levaduras presentaron
diferentes rangos de síntesis, donde 4 cepas produjeron sobre 0,4 unidades, 9 cepas
sintetizaron entre 0,2 y 0,4 unidades y 10 bajo 0,2.
16
4. 2. Determinación cualitativa de la actividad ACC desaminasa
De las 23 cepas crecidas en medio YNB sólo dos se desarrollaron con éxito
en el medio mínimo suplementado con ACC, correspondientes a S.aeria YCPUC75
e YCPUC79, lo que se ve demostrado como turbidez en el medio (Figura 3).
Figura 3. Turbidez generada por A: S. aeria YCPUC75 y B: S. aeria YCPUC79 en

medio YNB sin ACC e YNB con ACC.
En ambos casos, no hubo crecimiento en el medio sin ACC, mientras que en

el medio con ACC si hubo crecimiento con una diferencia estadísticamente
significativa (Figura 4).
Figura 4. Densidad óptica para análisis de actividad ACC desaminasa de S. aeria

YCPUC75 e YCPUC79.
17
4. 3. Cuantificación de la actividad ACC desaminasa.
La cepa S. aeria YCPUC79 tuvo la mayor actividad ACC desaminasa,

produciendo 0,44 ± 0,0072 mM de α–cetobutirato, mientras que la cepa S. aeria
YCPUC75 produjo 0,39 ± 0,0065 mM de α–cetobutirato (Figura 5).
Figura 5. Actividad ACC desaminasa expresada como la producción de α–

cetobutirato por S. aeria YCPUC75 e YCPUC79). Las barras representan las medias
± error estándar de 3 repeticiones. Letras distintas denotan diferencias significativas
(p < 0,05).
4. 4. Evaluación del efecto de la síntesis de AIA y actividad ACC desaminasa en el

desarrollo del sistema radicular en plántulas de tomate.
El experimento fue llevado a cabo en una cámara de crecimiento con

fotoperiodo y temperatura controlados. El completo registro de mínimas y máximas
en cada mes que se hizo el experimento se presenta en la Tabla 3.
Tabla 3. Registro de temperaturas de la cámara de crecimiento.

Fecha Temperatura (Cº)
ensayo Mínima Máxima
19/01 23,32 26,38
14/02 23,86 25,54
17/05 21,66 29,36
31/05 19,58 27,40
Al evaluar el largo de la raíz principal, el tratamiento control y R. babjevae

YCPUC42 obtuvieron un promedio de 13,2 ± 2,5 cm, valor estadísticamente mayor a
18
todos los demás tratamientos. Las cepas S. bayanus YCPUC166, W. onychis
YCPUC85, T. delbrueckii YCPUC10 e YCPUC174 tuvieron el menor largo de todos
los tratamientos, siendo cerca de 3 veces menor comparado con el control,
promediando 3,1 ± 0,73 cm (Figura 6).
Figura 6. Largo de la raíz principal (cm) de plántulas de tomate luego de su co-cultivo

con levaduras. Las barras representan la media ± error estándar de 4 repeticiones.
El siguiente parámetro evaluado fue el número de raíces laterales o

secundarias. La mayoría de los tratamientos obtuvo un mayor número de raíces
laterales que el control, siendo las cepas S. aeria YCPUC77 y R. babjevae YCPUC42
las que obtuvieron el mayor número con un promedio de 22,3 ± 5,1 raíces laterales
por planta de tomate. Las cepas W. onychis YCPUC87, S. kilbournensis YCPUC101,
P. kluyveri YCPUC83, D. hansenii, YCPUC136 YCPUC137 e YCPUC138 no tuvieron
diferencias significativas en contraste con el control, es decir tuvieron el mismo
número de raíces laterales. Por otro lado, las cepas S. bayanus YCPUC166, W.
onychis YCPUC85, T. delbrueckii YCPUC10 e YCPUC174 obtuvieron el menor
número de raíces laterales, en algunos casos promediando solo 1 raíz lateral por
planta en cada tratamiento (Figura 7).
19
Figura 7. Número de raíces laterales de plántulas de tomate luego de su co-cultivo
con levaduras. Las barras representan la media ± error estándar de 4 repeticiones.
Por último, se cuantificó el volúmen radicular en cm 3 con el software WinRhizo

Basic 2009. La cepa R. darienensis YCPUC35 fue la que obtuvo el mayor volumen
radicular con 0,061 ± 0,016 cm3. Mientras que las cepas S. bayanus YCPUC166, W.
onychis YCPUC85, T. delbrueckii YCPUC10 e YCPUC174 obtuvieron el menor
volúmen radicular con cerca de 0,008 ± 0,002 cm 3 promedio, esto representa una
clara prueba de la baja tasa de crecimiento de las plántulas de estos tratamientos
con las respectivas cepas mencionadas (Figura 8).
20
Figura 8. Volúmen radicular (cm3) de plántulas de tomate luego de su co-cultivo con
levaduras. Las barras representan la media ± error estándar de 4 repeticiones.
Se pueden observar diferentes respuestas fenotípicas por parte de las

plántulas de tomate, dependiendo de la especie de levadura inoculada en tratamiento
(Figura 9). A pesar de que estas diferencias fueron cuantificadas y comparadas
estadísticamente, visualmente tenemos variables como el crecimiento de la levadura
en el medio MS, en que en algunas especies no fue muy favorable (Figura 9. D, I, N,
P)
21
Figura 9. Plántulas de tomate en placas con co-cultivo de levaduras. A: Control. B:
Wo-87. C: Ms-89. D: Sa-78. E: Dh-137. F: Dh-136. G: Pm-144. H: Pk-83. I: Sk-113.
J: Sk-101. K: Rd-35. L: Pm-66. M: Sa-79. N: Rb-42. O: Sa-77. P: Rb-42. Q: Sa-75.
Algunas cepas, como S. bayanus YCPUC166, W. onychis YCPUC85, T.

delbrueckii YCPUC10 e YCPUC174, tuvieron un efecto negativo en el crecimiento de
las plántulas, dado el casi nulo desarrollo del sistema radicular con apenas 3 raíces
laterales promedio por planta, lo que debilita el desarrollo de la zona aérea, en donde
los cotiledones no lo logran desplegarse (Figura 10).
Figura 10. Plántulas de tomate de bajo crecimiento y desarrollo, en placas con co-
cultivo de levaduras. A: Td-10. B: Wo-85. C:Td-174. D:Sb-166.
22
A pesar de ello, la cepa S. bayanus YCPUC166 tuvo diferentes respuestas
fenotípicas según la fecha en que se realizó el ensayo. El ensayo realizado en el mes
de mayo, con temperaturas que van desde los 19 a 27 ºC, resultó en plantas con bajo
desarrollo y escaso crecimiento comparado con el control (Figura 12. A). Mientras
que el ensayo realizado en enero y febrero, con temperaturas que oscilaron entre 23
a 25 ºC, las plántulas tuvieron un desarrollo normal, al igual que el resto de los
tratamientos con levaduras (Figura 11. B).
Figura 11. A: Co-cultivo plántulas de tomate y la cepa Sb-166 entre 19 y 27 ºC. B:

Co-cultivo plántulas de tomate y la cepa Sb-166 entre 23 y 25 ºC
Otro ejemplo de la expresión radicular de las plántulas se puede apreciar al

comparar el control versus los tratamientos con mayor producción de AIA, R.
babjevae YCPUC42, donde se ve un mayor número de raíces laterales pero no
disminuye el largo de la raíz principal, y el tratamiento con actividad ACCD, S.aeria
YCPUC79, donde también hay un aumento de raíces laterales, pero estas se ven
mucho más elongadas en forma horizontal y hay una disminución en el largo de la
raíz principal (Figura 12).
Figura 12. A: control sin inóculo de levadura. B: R. babjevae YCPUC42. C: S. aeria

YCPUC79
Luego de analizar los tratamientos de forma individual, se replicó este

experimento para analizar el comportamiento en conjunto de la cepa con mayor
23
producción de AIA, R. babjevae YCPUC42 y la cepa con mayor actividad ACC
desaminasa, S.aeria YCPUC79. Para ello se hizo un co-cultivo segmentado de
ambas cepas, es decir, están sembradas en la misma placa sin ser mezcladas una
al lado de la otra, además se hizo un co-cultivo en mezcla (Figura 13).
Figura 13. A: Control. B: Sa-79. C: Rb-42. D: Co-cultivo segmentado, a la izquierda

Sa-79, a la derecha Rb-42. E: Co-cultivo en mezcla Sa-79 y Rb-42.
Dado el bajo crecimiento de la cepa R. babjevae YCPUC42 en las placas petri

y el bajo efecto producido por la mezcla de ambas cepas, se comprobó que en este
caso el efecto estimulante sobre la zona radicular fue debido en mayor medida por la
acción de la cepa S.aeria YCPUC79, por lo que esta combinación de cepas no tendría
resultados significativamente estadísticos en cuanto a los parámetros ya evaluados.
Es por ello que se decidió continuar el ensayo utilizando otra cepa que haya estado
dentro del grupo de las más productoras de AIA. Para eso se escogió a
Metschinikowia sp YCPUC89 (Figura 14).
Figura 14. A: Control. B: Sa-79. C: Ms-89. D: Co-cultivo segmentado, a la izquierda

Sa-79, a la derecha Ms-89. E: Co-cultivo en mezcla Sa-79 y Ms-89.
En este caso se obtuvo un buen desarrollo de ambas cepas en conjunto, ya

sea en co-cultivo segmentado o en co-cultivo en mezcla (Figura 14. D, E.). En ambos
casos visualmente hay una mayor masa radicular, comparado con el caso del co-
cultivo con la cepa S.aeria YCPUC79 por sí sola con las plántulas de tomate (Figura
14.B).
24
Para tener un análisis más detallado se realizaron las mismas mediciones de
los parámetros ya mencionados (largo de raíz principal, número de raíces laterales,
volumen radicular). El control tuvo el mayor largo de raíz principal, mientras que los
plantines con los tratamientos de levaduras tuvieron cerca de la mitad de largo
comparado con el control, por lo que se puede decir que hay una influencia, a pesar
de que entre tratamientos con levaduras son bastante similares (Figura 15.A).
Figura 15. A: Largo de la raíz principal (cm) de plántulas de tomate en co-cultivo con
levaduras. B: Número de raíces laterales en plántulas de tomate en co-cultivo con
levaduras. C: Volumen radicular (cm3). Las barras representan la media ± error
estándar de 4 repeticiones.
El número de raíces laterales aumentó en todos los tratamientos con
levaduras comparado con el control, mientras que no se encontraron diferencias
entre tratamientos con estos microorganismos en mezcla o separados (Figura 15. B).
Por otro lado, el volumen radicular fue altamente promovido su aumento por el
tratamiento con la cepa Metschinikowia sp YCPUC89, mientras que entre los otros
tratamientos no hubo diferencia significativa a pesar de que si tienen un mayor
volumen comparado con el control (Figura 15.C)
4. 5. Evaluación del crecimiento de microorganismos en la solución nutritiva
En primer lugar, se analizó la viabilidad de las levaduras en la solución

nutritiva para las plantas de tomate en el ensayo in vivo. Se escogió la cepa con
mayor producción de AIA, R. babjevae YCPUC42, y la cepa con mayor actividad ACC
desaminasa, S. aeria YCPUC79, para ser sometidas al experimento durante 6 días.
25
La cepa S. aeria YCPUC79 aumentó su crecimiento pasando de 1,80 x 107 a 2,86 x
107 células/mL. Por otro lado, la cepa R. babjevae YCPUC42 disminuyó su
crecimiento y persistencia en el medio (Tabla 4).
Tabla 4. Conteo de colonias de levaduras crecidas en la solución nutritiva para

tomates en células mL-1.
Tiempo (días) 2 4 6
Sa-79 1,80 x 107 2,48 x 107 2,86 x 107
Rb-42 1 x 105 3,4 x 104 4 x 103
Por esta razón la cepa R. babjevae YCPUC42 no fue utilizada para el

tratamiento AIA. En su reemplazo se escogió la cepa Metschinikowia sp YCPUC89,
ya que demostró tener un buen desarrollo en las placas petri con medio MS (Figura
9). Esta cepa y una mezcla con S. aeria YCPUC79, fueron puestas a prueba en el
mismo experimento para evaluar su comportamiento en el tiempo (Tabla 5).
Metschinikowia sp YCPUC89 tuvo una mejor respuesta, observándose crecimiento
en el tiempo. Por otro lado, la mezcla de ambas cepas arrojó resultados positivos,
con un crecimiento de hasta 1 orden de magnitud, pasando 107 a 108 en 4 días.
Tabla 5. Conteo de colonias de levaduras crecidas en la solución nutritiva para

tomates células mL-1.
Tiempo (días) 2 4 6
Rb-42 1 x 105 3,4 x 104 4 x 103 (b)
Sa-79 1,80 x 107 2,48 x 107 2,86 x 107 (ab)
Ms-89 1,6 x 107 4,6 x 107 2,9 x 107 (ab)
Co-cultivo Sa-79 y Ms-89 5,6 x 107 1,1 x 108 6,6 x 107 (a)
4. 6. Relación entre el origen de las cepas y su producción de AIA y actividad

ACCD.
Las 23 cepas vínicas, aisladas desde diferentes ubicaciones en la zona

central del país, fueron capaces de producir AIA (Figura 2). Sin embargo, no fue
26
posible correlacionar su origen geográfico y la producción de AIA, siendo variables
independientes entre sí (Figura 15).
Figura 15. Producción de AIA y actividad ACC según el lugar de origen de la cepa.
La actividad ACC tampoco revela alguna relación con el origen de las

levaduras (Figura 15).
4. 7. Evaluación de la producción de etileno en plantas de tomate hidropónico
A lo largo de todo el experimento el tratamiento ACC/AIA obtuvo la menor

producción de etileno en la zona radicular de tomates hidropónicos. Mientras que el
tratamiento ACC fue el segundo con menor producción de etileno. Por otro lado, el
control y AIA tuvieron grandes variaciones, sin embargo, se mantuvieron siempre con
los valores más altos (Figura 16). Se puede ver como en los primeros días los niveles
de etileno llegan casi a las 200 ppm, y con el primer cambio de la solución nutritiva a
los 4 días hay una disminución en la prevalencia de esta hormona vegetal (Figura
16).
27
Figura 16. Producción de etileno en raíces de tomate hidropónico. Las barras
representan la media ± error estándar de 4 repeticiones.
Para el análisis estadístico en este caso se optó por hacer el impacto

acumulado de todo en toda la extensión de tiempo del experimento, obteniendo el
tratamiento AIA/ACC con una media de 447,30 ppm (a), ACC con una media 695,90
ppm (b), AIA con 1101,49 ppm (c) y el control con 1133,29 ppm (c).
4. 7. 1. Clorofila
En cuanto al contenido de clorofila (SPAD) este fue mayor durante las 3

mediciones consecutivas en todos los tratamientos inoculados con levadura
comparado con el control. A los 7 días el control obtuvo un contenido de clorofila de
43,8 ± 4,1 SPAD, mientras que los tratamientos con levadura obtuvieron en promedio
53,1 ± 6,2 SPAD. A los 14 días, el contenido de clorofila aumentó, sin embargo, las
diferencias entre tratamientos fueron las mismas comparado con la primera semana.
28
Figura 17. Contenido de clorofila (SPAD). Las barras representan la media ± error
estándar de 4 repeticiones.
A los 21 días de iniciado el experimento el tratamiento AIA/ACC obtuvo el

mayor contenido de clorofila con sobre los 72,3 ± 4,5 SPAD comparado con los
demás tratamientos (Figura 17).
4. 7. 2. Tasa fotosintética
La tasa fotosintética fue evaluada a los 16 y 21 días, donde en la primera

medición todos los tratamientos tuvieron resultados similares, en promedio 12,8 ±
2,1 µmol m-2 s-1, sin diferencias estadísticas.
Figura 18. Tasa fotosintética. Las barras representan la media ± error estándar de 4
repeticiones.
Mientras que en la última medición hubo una sutil variación donde el control
obtuvo el menor valor de todos los tratamientos con 17,5 ± 4,6 µmol m-2 s-1, mientras
29
que los tratamientos con levaduras registraron una tasa fotosintética de 22,3 ± 2,4
µmol m-2 s-1 siendo estadísticamente iguales (Figura 18).
4. 7. 3. Peso fresco y peso seco
El peso final fresco fue mayor en los tratamientos Control y ACC con 242 ±
17,5 gr en promedio, mientras que AIA/ACC y AIA tuvieron como promedio 65 ± 21,5
gr (Figura 19. A). El peso fresco de las raíces fue mayor en ACC con 78 ± 4,3 gr
estadísticamente significativo, mientras que los demás tratamientos se mantuvieron
en promedio 48 ± 9,3 gr (Figura 19. B).
Figura 19. Peso final (gr), A: Peso fresco aéreo. B: Peso fresco raíz. C: Peso seco
aéreo. D: Peso seco raíz. Las barras representan la media ± error estándar de 4
repeticiones.
En cuanto al peso seco aéreo, este fue significativamente mayor en el

tratamiento ACC con 28 ± 5,8 gr, a este le sigue el control con 22 ± 1,6 gr, y los
tratamientos AIA/ACC y AIA tuvieron los pesos más bajos con 6,4 ± 3,5 gr en
30
promedio (Figura 19. C). El peso seco de las raíces fue mayor en ACC y Control con
4,5 ± 0,5 gr en promedio, mientras que AIA y AIA/ACC tuvieron los menores valores
estadísticamente con 2,3 ± 0,8 gr en promedio (Figura 19. D).
Se estandarizaron los valores de la producción de etileno del último día del

experimento, junto con los pesos finales de las plantas. La mayor producción de
etileno la tuvo el tratamiento AIA con 62,31 ± 36,6 ppm gr -1 por otro lado los demás
tratamientos no tuvieron diferencias significativas entre sí, promediando 19,9 ± 3,3
ppm gr-1 (Figura 20).
Figura 20. Estandarización de la producción de etileno en ppm por peso seco de las
raíces (ppm gr-1). Las barras representan la media ± error estándar de 4 repeticiones.
El crecimiento final de las plantas de tomate en cada tratamiento puede ser

comparado visualmente gracias al registro fotográfico (Figura 21).
Figura 21. Crecimiento aéreo de plantas de tomate luego de 21 días de duración del
experimento. A: Control. B: AIA. C: ACC. D: AIA/ACC.
31
Los tratamientos Control y ACC tuvieron la mayor biomasa aérea, visualmente
se puede comprobar (Figura 21. A y C) con el respaldo del análisis estadístico de los
pesos finales (Figura 20). Sin embargo, el Control deja entrever los entrenudos
(Figura 21. A), mientras que ACC se ve más frondoso (Figura 21. C).
Por otro lado, el sistema radicular exhibió dramáticas diferencias visuales

entre tratamientos. Un sistema radicular normal es el que presentó el control y ACC
(Figura 22. A y C), denotando raíces de color blanco sin perturbaciones en ella (Figura
23. A).
Figura 22. Crecimiento radicular de plantas de tomate luego de 21 días de duración

del experimento. A: Control. B: AIA. C: ACC. D: AIA/ACC.
En cambio, el sistema radicular del tratamiento AIA se vio completamente

colonizado por Metschinikowia sp YCPUC89, obstruyendo a las raíces en su función
de absorción de agua y nutrientes, lo que terminó en la desintegración de éstas
(Figura 22. B; Figura 23. B).
32
Figura 23. Acercamiento de raíces. A: Control. B: AIA, formación de biofilm. C:
AIA/ACC, formación de biofilm y emergencia de nuevas raíces laterales y adventicias.
A pesar de ello se logra ver el desarrollo de raíces adventicias por sobre el

sistema radicular descompuesto (Figura 23. B). Otro caso particular es el del
tratamiento con la mezcla de ambas levaduras, AIA/ACC, donde en un inicio existió
el mismo problema de formación de biofilm sobre las primeras raíces, luego hubo un
gran desarrollo de nuevas raíces laterales y adventicias que de alguna forma
amortigua el efecto negativo producido por las levaduras (Figura 22. D).
Finalmente se determinó el contenido de nitrógeno (N) total en hojas de las

plantas de tomate. (Figura 24).
8
a
6 a
N total (%)
b
b
4
0
C IA C ol
C A C tr
/A A o n
IA C
A
Figura 24. Contenido de N total. Las barras representan la media ± error estándar de
4 repeticiones.
33
Los tratamientos AIA/ACC y AIA tuvieron el mayor contenido de N total comparado
con el control, sin embargo, no presentaron diferencias estadísticas entre sí. Por otro
lado, los tratamientos ACC y control tuvieron el menor contenido de N total en hojas,
sin diferencias estadísticamente significativas entre sí.
34
5. Discusión
5.1. Producción de AIA
Dentro de los estudios sobre producción de AIA se han reportado diferencias

entre especies de levaduras. El género Saccharomyces puede producir entre 0,24 y
6,91 μg mL-1 (Fernandez San Millan et al, 2020; Fu, et al. 2016), mientras que dentro
del género Rhodotorula se han reportado entre 0,58 - 15,64 μg mL-1(Fernandez-San
Millan, et al. 2020; Tapia-Vesquez, et al. 2020). También se han reportado otros
géneros analizados en este estudio como, Torulaspora, Hypopichia, Debaryomyces,
Metschinikowia (Fernandez San Millan et al, 2020; Fu, et al. 2016). Nuestros
resultados indican que R. babjevae YCPUC42 produce 3,3 ± 0,051 μg mL-1 de AIA lo
que está dentro de los rangos ya informados.
Asimismo, todas las cepas fueron capaces de producir AIA en presencia y

ausencia de Trp. Un resultado similar fue descrito por Fernandez-San Millan et al.
(2020), donde 70 cepas aisladas desde viñas de España fueron sometidas en un
experimento para cuantificar la producción de esta hormona vegetal, donde cerca de
tres cuartas partes de las cepas produjeron AIA sin ser suplementado el precursor en
el medio a evaluar. Sin embargo, señalan que es más eficiente la vía de producción
dependiente del Trp. La producción de AIA en menores concentraciones puede ser
una ventaja ya que de esta forma no se concentra esta hormona en altas cantidades
en la zona radicular, evitando generar desórdenes fisiológicos en las raíces (Taiz &
Zeiger, 2006).
5. 2. Actividad ACC desaminasa
La actividad ACCD es un mecanismo que pueden poseer algunos

microorganismos, y que consiste en utilizar el ACC, precursor del etileno, para
convertirlo en amoniaco y ɑ-cetobutirato a través de la enzima ACCD, lo que puede
reducir la síntesis de etileno en la planta. En concentraciones normales, el etileno
cumple roles fundamentales en el desarrollo de las plantas, ya que participa en la
modulación del sistema radicular y formación de pelos radiculares, los que están en
íntimo contacto con los nutrientes presentes en la rizosfera (Glick, et al. 2007). Sin
embargo, la concentración puede aumentar rápidamente por efecto de algún estrés
35
externo, aquí el etileno deja de funcionar en sus tareas normales y comienza su tarea
como elicitor de señales de defensa y gatilla procesos de senescencia que disminuye
la vida útil de tejidos vegetales tanto aéreos como radiculares (Gamalero & Glick,
2015; Hussein, et al 2015). En este caso, tener levaduras con actividad ACCD que
puedan ser aplicadas en plantas significaría disminuir los eventos donde el etileno
llegue a su peak máximo de producción, que ralentizan el crecimiento vegetal,
obteniendo una mayor biomasa acumulada en el tiempo e incluso el desarrollo de la
planta en un tiempo más acotado.
Para comprobar si un microorganismo posee actividad ACCD en primer lugar

se hace un estudio previo donde se analiza cualitativamente si son capaces de utilizar
el ACC como fuente de N (Amprayn, et al. 2012; Zahir, et al; 2008). Amprayn, et al.
(2012) realizaron un experimento similar donde cuatro cepas fueron crecidas en un
medio mínimo con y sin ACC, reportando que la cepa de levadura Candida tropicalis
fue positiva a la actividad ACC desaminasa, con un valor de DO a 600 nm de 0,4. Por
su parte, nuestros resultados indican que S. aeria YCPUC79 tuvo un valor de DO de
0,1, que esta dentro del rango reportado. Otras especies de levaduras han sido
reportadas que poseen actividad ACCD como Hansenula saturnus donde utilizan sus
genes para analizar esta enzima (Minami, et al. 1997), sin embargo no hay fuentes
que indiquen su potencial efecto en plantas.
Dentro de los registros de actividad ACC reportado en microorganismos como

bacterias y hongos, se encuentran rangos que van desde 0,0007 a 12970 nM α –
cetobutirato mg-1 h-1 (Singh, et al. 2015). Al transformar las unidades de medida de la
actividad ACCD de la cepa S. aeria YCPUC79 obtenidos en este experimento esta
es capaz de producir 18000 nm α – cetobutirato mg-1 h-1, lo que sugiere que este
microorganismo se clasificaría como uno con alta actividad ACC desaminasa. A su
vez, en otros estudios donde se cuantificó esta actividad, utilizan en su mayoría el
análisis del α – cetobutirato producido por el microorganismo. En este caso, los
autores Gupta y Pandey, (2019) evaluaron la actividad ACCD en rizobacterias
obteniendo como resultado 900–1800 nmol α-cetobutirato mg-1 h-1. En su defecto, en
otros estudios se analiza solo el crecimiento con OD a 600 nm, esto luego de hacer
crecer al microorganismo en cuestión en un medio mínimo (Nutaratat, et al. 2014;
Hussein, et al. 2022).
36
5. 3. Efecto de la síntesis de AIA y actividad ACC desaminasa en el desarrollo del
sistema radicular en plántulas de tomate.
La disminución del largo de la raíz principal es un fenómeno que se produce

debido al suministro de AIA exógeno, y se rompe la dominancia apical (producida por
la gran concentración de auxinas presente en la punta de esta raíz). De esta forma
se redistribuye la concentración de AIA a lo largo de toda la raíz activando los
meristemas que darán paso a nuevas raíces laterales (Taiz y Zeiger, 2006). El mismo
fenómeno descrito se reportó en otros estudios donde hacen co-cultivo de levaduras
con especies vegetales como arroz, tomate, tabaco, lechuga, demostrando que
existen diferentes respuestas morfológicas a nivel radicular según la cepa con la que
se esté trabajando (Amprayn, et al. 2012; Verma, et al. 2019; Fernandez San Millan,
et al. 2020; Tapia, et al. 2020). Esto se traduce en respuestas expresadas en cambios
morfológicos como mayor número de raíces laterales, mayor volumen radicular,
mayor densidad de pelos radiculares, acortamiento del sistema en sí, entre otras
variaciones (Fu, et al. 2016).
Dada las diferentes respuestas de la arquitectura radicular según la especie

y cepa inoculadas en las placas, como es el caso del ejemplo de Rb-42, Sa-75 y el
Control (Figura 12), es necesario implementar diferentes herramientas. Se vuelve
crucial hacer esta medición, ya que no se trata solo de tener un mayor número de
raíces laterales, sino de tener sistema radicular que abarque una mayor cantidad de
suelo, de esta forma llegaría a más lugares donde encontraríamos los nutrientes para
su desarrollo (Hernandez-Fernandez, et al. 2021; Lonhienne, et al. 2014)
Las cepas Rhodotorula sp. YCPUC53 y H. pseudoburtonii YCPUC32 no

fueron incluidas en estos resultados ya que no crecieron en las placas con medio MS.
Esto puede ser debido a que no se encuentran en su medio óptimo de crecimiento,
siendo el medio MS un medio para el desarrollo de plantas y no para
microorganismos (Amprayn, et al. 2012). Sin embargo, ambas cepas han sido
utilizadas en experimentos similares obteniendo resultados favorables, donde la cepa
se inocula en la placa petri con medio de cultivo MS y produce un efecto positivo en
el desarrollo de la zona radicular de cultivos como tabaco, arabidopsis y lechuga
(Fernandez San Millan, et al. 2020; Sarabia, et al. 2018; Fu, et al. 2016). En el caso
específico de la cepa Rs-53, su bajo crecimiento puede ser analizado desde el
contenido de azúcar presente en el medio, el que no fue suficiente para suplir los
37
requerimientos nutricionales de la especie en cuestión (Zhao, et al. 2019; Sandberg.
2019). Por otro lado, la cepa Hp-32 tampoco tuvo un buen desarrollo en placas, lo
que puede ser explicado en base a la temperatura del ambiente, la que no era la
óptima para el crecimiento de esta especie (cerca de los 30°C) (Lee, et al. 2021).
Un caso particular es el de la cepa R. babjevae YCPUC42, ésta es la que

tiene una mayor producción de AIA y fue el tratamiento que produjo mayor número
de raíces laterales. Se tiende a pensar que al tener mayor cantidad de auxinas
existiría una disrupción en la dominancia apical en la punta de la raíz principal. Sin
embargo, la formación de raíces laterales se promueve en concentraciones de
auxinas que van desde 0,1 a 1,5 𝜇g/mL. Una concentración mayor a estos valores
comienza a promover el crecimiento aéreo, mientras que la zona radicular no recibe
efectos de crecimiento por esta hormona vegetal, debido a que se mantiene la
dominancia en el meristema apical radicular (Taiz y Zeiger, 2006). Esto se ve
representado en la curva de crecimiento en respuesta a la concentración de auxinas
(Figura 24).
Figura 24. Curva de crecimiento en respuesta a la concentración de auxinas

(Adaptado de Taiz y Zeiger, 2006).
Dentro de los tratamientos que tuvieron un efecto negativo en el crecimiento

de las plántulas de tomate, la especie T. delbrueckii ha sido reportada por tener este
mismo efecto sobre las plántulas de Arabidopsis en un ensayo en placas Petri
utilizando medio MS (Fernandez San Millan et al, 2020). En el caso de W. onychis,no
ha sido reportado su efecto en el crecimiento de alguna especie vegetal, sin embargo,
se cree que puede producir toxinas killer, que tienen efecto antifúngico sobre otras
especies de levadura (Walker, 2011). Fernandez San Millan, et al. (2020), reportaron
38
que solo 12 de las 69 cepas probadas en co-cultivo con plántulas de Arabidopsis
demostraron tener un mejoramiento significativo en el volumen radicular y en tallos y
cotiledones, 42 no tuvieron ningún efecto y 15 empeoraron la situación de las
plántulas.
En el caso de la cepa que tuvo crecimiento diferente según la temperatura, S.

bayanus, se caracteriza por tener un crecimiento óptimo en temperaturas que van
desde los 23 a los 26ºC y estas se deben mantener constantes en el tiempo para
asegurar un buen desarrollo (Salvado, et al. 2011). En este caso se puede visualizar
los efectos que puede producir la levadura sobre la plántula, esta primera a pesar de
desarrollarse de igual manera en un rango de temperatura, puede ser la causante de
la disminución en el crecimiento de la planta. Se ha reportado el estrés que significa
para las levaduras estar bajo este tipo de condiciones, afecta su metabolismo y se
desencadena la transcripción de genes que codifican para proteínas y compuestos
que podrían causar algún efecto sobre las plantas en este caso (Bleoanca y Bahrim,
2013).
El experimento en que se usaron inóculos de dos levaduras diferentes en una

misma placa, la cepa R. babjevae YCPUC42 tuvo un bajo desarrollo en el medio MS
por lo que fue descartada de este experimento y se utilizó Metschinikowia sp
YCPUC89. La especie R. babjevae se caracteriza por tener requerimientos de
azúcares mayor que otras levaduras, lo que podría explicar su falta de desarrollo en
este medio hecho para especies vegetales (Zhao, et al. 2019; Sandberg. 2019). A
pesar de ello, esta cepa se debe considerar para futuros estudios ya que, a pesar de
su escaso desarrollo en el medio MS, fue la cepa con mayor producción de las 23
cepas analizadas y ha sido reportada como una especie con alta síntesis de AIA en
otros estudios (Fernandez- San Millan, et al. 2020; Tapia-Vasquez, et al. 2020)
En el caso de las cepas Metschinikowia sp YCPUC89 y S. aeria YCPUC79 el

experimento sugiere que ambas cepas pueden convivir juntas sin mayor problema y
tienen un efecto en la promoción del crecimiento y mayor desarrollo de la zona
radicular de los tomates (Figura 14; Figura 15). Sin embargo, no demuestran tener
un efecto mayor al ser mezcladas, tanto en volumen o en número de raíces laterales.
A pesar de ello, se cree que cepas de una misma especie pueden coexistir y generar
mayores efectos positivos sobre el crecimiento de las plantas, es así como en un
estudio realizado por Romero, et al. (2017) hablan sobre el potencial que tienen las
39
mezclas de bacterias benéficas en mejorar aún más el desarrollo de algunas
especies vegetales. Ellos a partir de una mezcla de bacterias compuestas por P.
putida, A. brasilense, Acinetobacter sp. y Sphingomonas sp. inocularon semillas de
maíz y lograron comprobar una mejora sustancial en el crecimiento de plantas de
maíz.
5. 4. Evaluación del crecimiento de microorganismos en la solución nutritiva
Se evaluó el crecimiento de la cepa Rb-42 en medio solución nutritiva. Como

resultado, esta no tuvo un crecimiento constante en el tiempo, sino que la baja
cantidad que logró crecer fue disminuyendo. R. babjevae distingue por producir
carotenoides y productos oleaginosos. Esto actúa como protección contra los rayos
UV, requiere de una mayor concentración de azúcares en su medio ambiente para
poder generar este tipo de compuestos (Zhao, et al. 2019; Sandberg. 2019). De la
misma forma, en el experimento de evaluación del efecto de las levaduras sobre el
desarrollo del sistema radicular en tomates, esta misma cepa tuvo un bajo desarrollo
en el medio MS, este medio no tiene la cantidad suficiente de sacarosa requerido por
este tipo de especies.
Dentro de las cepas seleccionadas para este experimento, S.aeria es una

especie reportada como productora de lípidos, pero en menor proporción comparado
con R. babjevae (Mokhtarnejad, et al. 2016). Se han encontrado muestras de esta
cepa en ambientes hipersalinos, caracterizados por tener una salinidad sobre el 3,5%
y pueden tener hasta un 27% de Cloruro de Sodio (Rich and Meier, 2015). Según
Joshi, et al. (2021) S. aeria es una especie dominante en este tipo de ambientes,
pudiendo crecer en medios con un 10-15% de NaCl, con temperaturas que oscilan
entre 4-40 °C. Esta especie se caracteriza por su gran actividad enzimática
extracelular, lo que va totalmente ligado con el uso que puede tener por su actividad
ACC desaminasa, adicionalmente se encuentran los antecedentes de esta especie
en que se reporta que puede sobrevivir en ambientes altamente estresantes,
características que están ligadas al comportamiento del ambiente en Chile, sujeto a
cada vez más altas temperaturas y ambientes salinos en lugares donde antes no se
presentaba esta condición.
Metschnikowia sp es la segunda cepa escogida dada su producción de AIA.

Esta ha sido reportada por Fernández San Millán et al, (2020) por su efecto en la
40
promoción del crecimiento vegetal en plántulas de Arabidopsis, donde produce un
mayor volumen radicular no así en longitud de raíz principal (comparado con los
demás tratamientos con otras cepas de levaduras), además de una mayor expresión
y desarrollo en la zona aérea, aumentando el peso seco de esta. Además, numerosos
estudios destacan su capacidad biocontroladora de enfermedades producidas tanto
a nivel de campo como en poscosecha, tales como Alternaria, Botrytis, Fusarium,
entre otras (Pawlikowska, et al. 2019)
5. 5. Evaluación de la producción de etileno en plantas de tomate hidropónico
La actividad ACCD en levaduras puede disminuir los niveles de etileno en plantas

(Gamalero & Glick, 2015). En este estudio se llevó a cabo un experimento con el
objetivo de evaluar la producción de etileno las raíces de tomate, donde el tratamiento
ACC aplicado con la levadura S. aeria YCPUC75 obtuvo una de las menores
cantidades de etileno con un valor acumulado de 695,90 ppm. En otros estudios, se
han utilizado bacterias del género Pseudomona en raíces las que disminuyen la
cantidad de etileno (Amprayn, et al. 2012; Yim, et al. 2010, Glick, et al. 2007). Nuevos
estudios deben poner a prueba el desempeño de las levaduras u otros
microorganismos como potenciales estabilizadores de los niveles de etileno, con el
objetivo de amortiguar los efectos de estreses abióticos como sequía, salinidad.
Estudios sobre ello se han realizado en trigo y arroz, donde microorganismos con
actividad ACCD pueden aumentar la masa y el largo radicular (Hussein, et al. 2022;
Yim, et al. 2010).
En cuanto al contenido de clorofila, éste fue mayor en todos los tratamientos

con levaduras en las 3 mediciones realizadas. A pesar de que no se ha reportado
una relación entre el mecanismo que hace a una levadura promotora del crecimiento
vegetal y el contenido de clorofila, hay resultados donde cepas con producción de
AIA tienen más clorofila en las hojas de plantas de tabaco, que el tratamiento control
(Fernandez-San Millan, et al 2020; Fu, et al. 2016; Sun, et al. 2014).
Un resultado llamativo fue el del peso final, tanto fresco como seco, de las
plantas de tomate. El tratamiento con ACC logró obtener el mayor peso fresco
radicular y el mayor peso seco aéreo, lo que podría estar relacionado a dos factores.
En primer lugar la cepa utilizada, S. aeria YCPUC79 además de tener actividad
41
ACCD produce AIA sobre los 0,2 μg x106 células de levadura, es decir existe una
promoción del desarrollo de raíces laterales debido a la presencia de este AIA extra
(Taiz & Zeiger, 2006; Ribaudo, 2006). En segundo lugar, al haber menos etileno en
el medio, las raíces que llevan mayor tiempo en la planta pueden permanecer activas
por más tiempo mientras van emergiendo nuevas raíces desde los meristemas,
sumando masa a la zona radicular (Glick, el al. 2015). A su vez, esto se puede traducir
en una mayor masa aérea, debido a un mayor consumo de nutrientes al tener más
raíces que los absorban.
Por otro lado, el caso de los tratamientos con AIA y AIA/ACC tuvieron pesos
tanto aéreos como radiculares, dramáticamente menores comparando con el control
y ACC (Figura 19). El tratamiento con AIA fue inoculado con Metschinikowia sp
YCPUC89, y esta cepa tuvo un buen desarrollo en la solución nutritiva del tomate, y
además generó una gran masa del cultivo lo que trajo como consecuencia la
generación de un grueso biofilm en las paredes de los recipientes que contenían a la
solución y en las raíces de las plantas. Como consecuencia de aquello las raíces se
vieron afectadas negativamente siendo prácticamente destruidas por la gran
colonización del cultivo de levaduras sobre ellas, teniendo que desarrollar un nuevo
sistema radicular a partir de raíces adventicias (Figura 22. B y D; Figura 23. B y C).
Esto generó un menor crecimiento en la zona aérea (FIgura 21. B y D).
Adicionalmente, hay que considerar la gran cantidad de etileno generada por el
tratamiento AIA (Figura 16).
Para estandarizar la cantidad de etileno producida por las plantas de cada

tratamiento, se hizo una relación entre el peso seco final de las raíces y la medición
de etileno del último día del experimento en ppm gr -1 (Figura 20). En el gráfico se
evidencia que el tratamiento AIA produce la mayor cantidad de etileno por gramo de
raíz, lo que podría ser explicado por el gran estrés causado por el biofilm formado por
Metschinikowia sp YCPUC89, la cual ya ha sido reportada por su capacidad de
formar biofilm como mecanismo de biocontrol contra algunos patógenos
(Pawlikowska, et al. 2019; Steglinska, et al. 2022). El biofilm se puede generar por
diferentes motivos, como un mecanismo de supervivencia o adaptación en respuesta
a algún agente externo, como competencia por nutrientes con otros
microorganismos, baja disponibilidad de nutrientes en el medio, adherencia a
superficies, entre otros (Chi et al., 2015). A pesar de su gran colonización en raíces
se debe analizar su potencial como bioestimulante de especies vegetales, ya que
42
tiene un buen desarrollo en medios que no son los óptimos para su crecimiento, lo
que puede significar sobrevivencia sin dejar de producir AIA (Pawlikowska, et al.
2019).
En cuanto al análisis de N total, los dos tratamientos con mayor contenido de

N en hojas fueron AIA y AIA/ACC. En éstos, la presencia de la cepa Metschinikowia
sp YCPUC89 causó la formación de un biofilm alrededor de las raíces. Esta condición
de estrés para la planta pudo desencadenar respuestas con el fin de disminuir el
estado de alerta (Glick, el al. 2015). Se ha descrito que una de estas respuestas se
asocia con un aumento en la expresión de genes relacionados con transportadores
de N (Niu, et al. 2018). Esto permite aumentar la disponiblidad de este nutriente
dentro de la planta, permitiendo la formación de nuevos componentes estructurales,
ya sea aminoácidos y/o proteínas (Loomis, 1997; Marschner, 2012).
Este fenómeno puede explicar en parte el mayor contenido de clorofila en los

tratamientos con inóculo de levadura. En el caso de los tratamientos AIA y AIA/ACC
al estar bajo un estrés, las plantas pudieron absorber más N, y este pudo quedar en
el citoplasma o vacuola de las hojas debido a su exceso, además de formar mayor
cantidad de clorofila dado que el N forma parte del anillo central de esta (Taíz &
Zeiger, 2006; Marschner, 2012)
43
6. Conclusión
Los resultados obtenidos demuestran que todas las cepas de levaduras,

evaluadas en este estudio, son capaces de producir AIA con y sin su precursor
presente en el medio. Por otro lado, solo las cepas S.aeria YCPUC79 e YCPUC76
fueron positivas para la actividad ACC desaminasa, produciendo 0,44 y 0,39 mM de
α – cetobutirato respectivamente. En cuanto al co-cultivo de levaduras con plántulas
de tomate, todos los tratamientos tuvieron una disminución en el largo de la raíz
principal, menos el tratamiento con la cepa R.babjevae YCPUC42 que obtuvo el
mismo largo que control. En este mismo experimento, la mayoría de los tratamientos
obtuvieron un mayor número de raíces laterales y volumen radicular, excepto por las
cepas T. delbrueckii YCPUC10 e YCPUC174, S. bayanus YCPUC166 y W.onychis
YCPUC85 que tuvieron un efecto negativo en el crecimiento y desarrollo de las
plántulas. Finalmente, la producción de etileno en las raíces de tomate tuvo los
menores valores en los tratamientos ACC y AIA/ACC. Sin embargo, se
estandarizaron estos valores con el peso seco de las raíces y la última medición de
etileno, y estos resultados sugieren que en ACC con la cepa Metschinikowia sp
YCPUC89, disminuyó los valores de etileno en proporción a la masa radicular.
Futuros estudios deben realizarse para analizar el desempeño de estas levaduras en
otros medios, y evaluar su potencial como bioestimulante que atenúe el efecto de
estreses abióticos.
44
7. Resumen
Las levaduras como promotores de crecimiento vegetal pueden mejorar la

absorción de nutrientes mediante el aumento en el crecimiento radicular. El objetivo
principal es promover el crecimiento vegetal en plántulas de tomate a través de la
aplicación de levaduras con capacidad de síntesis de AIA y actividad ACC
desaminasa. Para cuantificar el AIA, veintitrés cepas fueron cultivadas en medio YPD
con y sin Triptófano, siguiendo el método colorimétrico de Salkowski. Para determinar
la actividad ACCD las mismas cepas fueron cultivadas en el medio mínimo YNB con
y sin ACC, se midió turbidez a los 14 días de incubación mediante DO y luego fue
cuantificado como mM de alfa-cetobutirato. Luego, se evaluó el crecimiento radicular
en tomates bajo el inoculo de las 23 cepas, se midió el número de raíces laterales, el
largo de la raíz principal y el volumen radicular. Finalmente se cuantificó la producción
de etileno en plantas de tomates inoculadas con dos cepas seleccionadas,
obteniendo 4 tratamientos; Control, AIA: inóculo con la cepa con mayor producción
de AIA, ACC: inóculo con cepa que tenga actividad ACCD y AIA/ACC: la mezcla de
ambas cepas. Se midió etileno en la zona radicular. Todas las cepas fueron capaces
de producir AIA con y sin Triptófano. Dos cepas de Soliococozyma aeria poseen
actividad ACCD. El número de raíces laterales aumentó en la mayoría de los
tratamientos con levaduras, mientras que el largo de la raíz principal disminuyó en
todos los casos, excepto en el tratamiento con Rhodotorula babjevae. El tratamiento
ACC disminuyó los niveles de etileno en las raíces, además obtuvo el mayor peso
fresco aéreo y peso seco radicular, En conclusión, las cepas Metschnikowia sp. y S.
aeria surgen como microorganismos promotores de crecimiento vegetal gracias a su
producción de AIA y actividad ACCD.
Palabras clave: Microorganismos promotores del crecimiento vegetal, tomate,

etileno, ácido indol acético, levaduras benéficas.
45
8. Bibliografía
Aguilar, P. (2017). Levaduras, características generales con foco en

Saccharomyces cerevisiae. IIB INTECH.
Albornoz, F., Gebauer, M., Ponce, C. y Cabeza, R. (2018). LeNRT1.1

Improves nitrate uptake in grafted tomato plants under high nitrogen demand.
Molecular Sciences
Backer, R., Rokem, JS., Ilangumaran, G., Lamont, J., Praslickova, D., Ricci,
E., Subramanian, S. & Smith, D. (2018). Plant Growth-Promoting Rhizobacteria:
Context, Mechanisms of Action, and Roadmap to Commercialization of Biostimulants
for Sustainable Agriculture. Front. Plant Sci. 9:1473. doi: 10.3389/fpls.2018.01473.
Bleoanca, L. and Bahrim, G. (2013). Overview on brewing yeast stress factors.

Romanian Biotechnological Letters. Vol. 18(5). Pp. 8559-8572.
Chi, M., Li, G., Liu, Y., Liu, G., Li, M., Zhang, X., Sun, Z., Sui, Y., & Liu, J.
(2015). Increase in antioxidant enzyme activity, stress tolerance and biocontrol
efficacy of Pichia kudriavzevii with the transition from a yeast-like to biofilm
morphology. In Biological Control. Vol. 90. Pp. 113–119.
https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2015.06.006
Chen, Y., Hu, G., Rodriguez, C., Liu, M., Binder, B. & Chervin, C. (2020). Roles
of SlETR7, a newly discovered ethylene receptor, in tomato plant and fruit
development. Hortic Res Vol. 7(17). https://doi.org/10.1038/s41438-020-0239-y
Du Jardin, P. (2015). Plant biostimulants: Definition, concept, main categories

and regulation. Scientia Horticulturae Vol. 196. Pp 3–14.
http://dx.doi.org/10.1016/j.scienta.2015.09.021
Fernandez-San Millan A., Farran, I., Larraya, L., Ancin, M., Arregui, L. &
Veramendi, J. (2020). Plant growth-promoting traits of yeasts isolated from Spanish
vineyards: benefits for seedling development. Microbiological Research. Vol. 237.
https://doi.org/10.1016/j.micres.2020.126480.
46
Gamalero, E. & Glick, B. (2015). Bacterial Modulation of Plant Ethylene Levels.
Plant Physiology. Vol. 169. Pp. 13–22.
www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.15.00284
Glick, B., Cheng, Z., Czarny, J. and Duan, J. (2007). Promotion of plant growth
by ACC deaminase-producing soil bacteria. Eur J Plant Pathol. Vol. 119. Pp. 329–
339. doi:10.1007/s10658-007-9162-4
Glick, B., Todorovic, B., Czarny, J., Cheng, Z., Duan, J. and McConkey, B.
(2006). Promotion of Plant Growth by Bacterial ACC Deaminase. Critical Reviews in
Plant Sciences. Vol. 26 (5-6). Pp. 227-242. doi: 10.1080/07352680701572966
Gouws, L., Botes, E., Wiese, A., Trenkamp, S., Torres, I., Tang, Y., Hills, P.,
Usadel, B., Lloyd, J., Fernie, A., Kossmann, J. & Merwe, M. (2012) The plant growth
promoting substance, lumichrome, mimics starch, and ethylene-associated symbiotic
responses in lotus and tomato roots. Front. Plant Sci. Vol. 3(120). doi:
10.3389/fpls.2012.00120
Gupta, S. & Pandey, S. (2019). ACC Deaminase Producing Bacteria With

Multifarious Plant Growth Promoting Traits Alleviates Salinity Stress in French Bean
(Phaseolus vulgaris) Plants. Front. Microbiol. 10:1506.
https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01506
Freimoser, F., Rueda-Mejia, M.P., Tilocca, B. and Migheli, Q. (2019).

Biocontrol yeasts: mechanisms and applications. World J Microbiol Biotechnol. Vol.
35(154). https://doi.org/10.1007/s11274-019-2728-4
Fu, S.F., Sun, P.F., Lu, H.Y., Wei, J.Y., Xiao, H.S, Fang, W.T., Cheng, B.Y.
and Chou, J.Y. (2016). Plant growth-promoting traits of yeasts isolated from the
phyllosphere and rhizosphere of Drosera spatulata Lab. Fungal Biology. Vol. 120(3).
Pp. 433-448. https://doi.org/10.1016/j.funbio.2015.12.006
Hussein, K., Tohamy, T. and El-Maraghy, S. (2022). Amino-cyclopropane-1-

carboxylate deaminase (ACCD) producing yeasts improved salinity tolerance of
Triticum aestivum L. Rhizosphere. Vol. 23.
https://doi.org/10.1016/j.rhisph.2022.100548
47
Hernández-Fernández, M., Cordero-Bueso, G., Ruiz-Muñoz, M., Cantoral, J.
(2021). Culturable Yeasts as Biofertilizers and Biopesticides for a Sustainable
Agriculture: A Comprehensive Review. Plants, Vol. 10(822). https://doi.org/10.3390/
plants10050822
Honma, M. & Shimomura, T. (1978). Metabolism of 1-Aminocyclopropane-1-

carboxylic Acid. Agric. Biol. Chem. Vol. 42(10). 18251831.
Joshi, S., Bajpai, A. and Johri, B. (2021). Extremophilic fungi at the interface
of climate change. Fungi Bio-Prospects in Sustainable Agriculture, Environment and
Nano-technology. Vol. 2. Pp. 1-22.
Kahiluoto, H., Kuisma, M., Kuokkanen, A., Mikkilä, M. and Linnanen, L. (2014).
Taking planetary nutrient boundaries seriously: Can we feed the people?. Global Food
Security. Vol. 3(1). Pp. 16-21. https://doi.org/10.1016/j.gfs.2013.11.002.
Lee, D.W., Hong, C.P., Thak, E.J., Park, S.-G., Lee, C.H., Lim, J.Y., Seo, J.-
A. and Kang, H.A. (2021). Integrated genomic and transcriptomic analysis reveals
unique mechanisms for high osmotolerance and halotolerance in Hyphopichia yeast.
Environ Microbiol. Vol. 23. Pp. 3499-3522. https://doi.org/10.1111/1462-2920.15464.
Loomis, R. (1997). On the utility of nitrogen in leaves.

https://doi.org/10.1073/pnas.94.25.13378
Lonhienne, T., Mason, M.G., Ragan, M.A., Hugenholtz, P., Schmidt, S. and
Paungfoo‐Lonhienne, C. (2014). Yeast as a Biofertilizer Alters Plant Growth and
Morphology. Crop Science. Vol. 54. Pp. 785 - 790. https://doi-
org.pucdechile.idm.oclc.org/10.2135/cropsci2013.07.0488
Luo, J., Zhou, J.-J., and Zhang, J.-Z. (2018). Aux/IAA Gene Family in Plants:
Molecular Structure, Regulation, and Function. International Journal of Molecular
Sciences. Vol. 19(1), 259. MDPI AG. http://dx.doi.org/10.3390/ijms19010259
Marschner, P (ed). 2012. Marschner’s mineral nutrition of higher plants.

Academic Press.
48
Minami, R., Uchiyama, K., Murakami, T., Kawai, J., Mikami, K., Yamada, T.,
Yokoi, D., Ito, H., Matsui, H. and Honma, M. (1998). Properties, Sequence, and
Synthesis in Escherichia coli of 1-Aminocyclopropane-l-Carboxylate Deaminase from
Hansenula saturnus. The Journal of Biochemistry. Vol. 123(6). Pp. 1112-1118,
Niu, X., Tiantian, H., Zhang, F., Duan, A. & Zhang, J. (2019). The root nitrogen
uptake response to partial nitrogen stress is related to previous nutritional status. Vol.
87. Pp. 55-67. https://doi.org/10.1007/s10725-018-0451-z.
Nutaratat, P., Srisuk, N., Arunrattiyakorn, P. and Limtong, S. (2014). Plant

growth-promoting traits of epiphytic and endophytic yeasts isolated from rice and
sugar cane leaves in Thailand. Fungal Biol. Vol. 118(8).
https://doi.org/10.1016/j.funbio.2014.04.010
Pawlikowska, E., James, S., Breierova, E., Antolak, H. and Kregiel, D. (2019).
Biocontrol capability of local Metschnikowia sp. isolates. Antonie Van Leeuwenhoek.
Vol. 112 (10). Pp. 1425-1445. doi: 10.1007/s10482-019-01272-w.
Pirkov, I., Norbeck, J. Gustafsson, M. & Albers, E. (2008). A complete

inventory of all enzymes in the eukaryotic methionine salvage pathway. The FEBS
Journal. Vol. 275(16). Pp. 4111-4120. https://doi.org/10.1111/j.1742-
4658.2008.06552.
Rao, R., Hunter, A., Kashpur, O. & Normanly, J. (2010). Aberrant Synthesis of
Indole-3-Acetic Acid in Saccharomyces cerevisiae Triggers Morphogenic Transition,
a Virulence Trait of Pathogenic Fungi. DOI: 10.1534/genetics.109.112854
Rich, V. and Maier, R. (2015). Aquatic Environments. Environmental

Microbiology, Third edition. Pp. 111-138
Research&Markets. (2022). Biofertilizer Market: Global Industry Trends,

Share, Size, Growth, Opportunity and Forecast 2022-2027.
49
https://www.researchandmarkets.com/reports/5530496/biofertilizer-market-global-
industry-trends
Romero, D., Baez, A., Quintero, V., Castañeda, M., Fuentes, L., Bustillos, M.,
Rodriguez, O., Morales, Y., Munive, A. and Muñoz, J. (2017). Compatible bacterial
mixture, tolerant to desiccation, improves maize plant growth. PLOS ONE. Vol.
12(11). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0187913
Ribaudo, C., Krumpholz, E., Cassán, F. Bottini, F., Cantore, M. & Curá, J
(2006). Azospirillum sp. Promotes Root Hair Development in Tomato Plants through
a Mechanism that Involves Ethylene. J Plant Growth Regul Vol. 25. Pp. 175–185.
https://doi.org/10.1007/s00344-005-0128-5
Salvadó, Z., Arroyo-López, F., Guillamón. J., Salazar, G., Querol, A. and
Barrio, E. (2011) Temperature adaptation markedly determines evolution within the
genus Saccharomyces. Appl Environ Microbiol. Vol. 77(7). Pp. 2292-302. doi:
10.1128/AEM.01861-10.
Sandberg, C. (2019). Evaluation of the antagonistic activity of Rhodotorula

babjevae and its extracellular compounds towards postharvest pathogens. Swedish
University of Agricultural Sciences.
Sharma, S.B., Sayyed, R.Z., Trivedi, M. & Gobi, T. (2013). Phosphate

solubilizing microbes: sustainable approach for managing phosphorus deficiency in
agricultural soils. SpringerPlus Vol. 2. 587. https://doi.org/10.1186/2193-1801-2-587
Singh, R., Shelke, G., Kumar, A. and Jha, P. (2015). Biochemistry and
genetics of ACC deaminase: a weapon to “stress ethylene” produced in plants.
Frontiers Microbiol. 6:937. doi: 10.3389/fmicb.2015.00937
Spaepen, S., Vanderleyden, J. & Remans, R. (2007). Indole-3-acetic acid in

microbial and microorganism-plant signaling. Federation of European Microbiological
Societies. Vol. 31. Pp. 425 - 448. DOI:10.1111/j.1574-6976.2007.00072.x
Steglinska, A., Kołtuniak, A., Berłowska, J., Czyzowska, A., Szulc, J. Cieciura-
Włoch, W., Okrasa, M., Kr˛egiel, D. and Gutarowska, B. (2022). Metschnikowia
50
pulcherrima as a Biocontrol Agent against Potato (Solanum tuberosum) Pathogens.
Agronomy. Vol. 12(2546). https:// doi.org/10.3390/agronomy12102546
Sun, P., Fang, W., Shin, Y., Wei, J. and Fu, S. (2014) Indole-3-Acetic
AcidProducing Yeasts in the Phyllosphere of the Carnivorous Plant Drosera indica L.
PLoS ONE. Vol. 9(12): e114196. doi:10.1371/journal.pone. 0114196
Taiz, L. y Zeiger, E. (2006). Auxina: la hormona del crecimiento. Fisiología

vegetal. Universitat Jaume.
Tapia, I., Sánchez, R., Arroyo, M., Lira, V., Sánchez, A., Sánchez, M., Padilla,
D., Batista, A. & Folch, L. (2020) Isolation and characterization of psychrophilic and
psychrotolerant plant-growth promoting microorganisms from a high-altitude volcano
crater in Mexico. Microbiological research. Vol. 232.
https://doi.org/10.1016/j.micres.2019.126394
Verma, S., Verma, P.K. and Chakrabarty, D. (2019). Arsenic Bio-volatilization

by Engineered Yeast Promotes Rice Growth and Reduces Arsenic Accumulation in
Grains. Int J Environ Res. Vol 13 Pp. 475–485. https://doi.org/10.1007/s41742-019-
00188-7
Wagi S, Ahmed A. (2019). Bacillus spp.: potent microfactories of bacterial IAA.

PeerJ 7:e7258 DOI 10.7717/peerj.7258
Walker, G.M. (2011). Pichia anomala: cell physiology and biotechnology

relative to other yeasts. Antonie van Leeuwenhoek. Vol. 9. Pp. 25–34.
https://doi.org/10.1007/s10482-010-9491-8
Yim, W., Chauhan, P., Madhaiyan, M., Tipayno, S. and Sa, T. (2010). Plant
growth promontory attributes by 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC)
deaminase producing Methylobacterium oryzae strains isolated from rice. 19th World
Congress of Soil Science, Soil Solutions for a Changing World, Brisbrane, Australia.
Zahir, A., Munir, A., Asghar, N., Shaharoona, B. and Arshad, M. (2008).
Effectiveness of rhizobacteria containing ACC deaminase for growth promotion of
51
peas (Pisum sativum) under drought conditions. J. Microbiol. Biotechnol. Vol. 18. Pp.
958–963.
Zhao, Y., Guo, L., Xia, Y., Zhuang, X. and Chu, W. (2019). Isolation,
Identification of Carotenoid-Producing Rhodotorula sp. from Marine Environment and
Optimization for Carotenoid Production. Mar. Drugs. Vol. 17(161).
doi:10.3390/md17030161
52
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PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATÓLICA DE CHILE

FACULTAD DE AGRONOMIA E INGENIERIA FORESTAL

SELECCIÓN DE LEVADURAS CON CAPACIDAD DE SÍNTESIS DE ÁCIDO

Tesis presentada como requisito para optar al grado de

Magíster en Fisiología y Producción Vegetal

Mariajosé Carvajal Contardo

Agradezco a la Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal de la Pontificia

Mi completa gratitud al Laboratorio de Microbiología y Genética de levaduras del

Agradezco a Daniela Catrileo, la mejor Lab Manager e Ingeniera en Biotecnología

Agradezco a mi familia, amigas y amigos, en especial a mi amiga de toda la vida

Mención especial a Agustín Yon, que me ayudo en todo el proceso de mi tesis.

A mis padres, que guiaron a la persona que soy ahora

soy una científica dramática y ustedes lo saben mejor que nadie.

A veces las cosas no resultan.

SELECCIÓN DE LEVADURAS CON CAPACIDAD DE SÍNTESIS DE ÁCIDO

Mariajose Carvajal Contardo

Yeast, as plant growth-promoting agents can increase nutrient uptake by

Key words: Plant growth promoting microorganisms, tomato, ethylene, indole-3-acetic

Actualmente existe una creciente búsqueda de herramientas para mejorar el

Dentro de los problemas que se intenta resolver con este tipo de

Dentro de los biofertilizantes formulados a partir de microorganismos, existe

Conocidos son los casos de Trichoderma sp., Rhizobium sp. y hongos

Se ha descrito que las levaduras son capaces de promover el crecimiento

Se ha reportado la producción de ácido indol acético (AIA) por parte de

Existen 5 vías de producción de ácido indol-3-acético, de las cuales 3 de ellas

1. 2. Actividad ACC desaminasa.

Algunas levaduras son capaces de transformar el 1-aminociclopropano-1-

Como consecuencia a los diferentes tipos de estrés, los cultivos no estarían

La biosíntesis de esta hormona comienza con la enzima ACC sintasa que

1. 3. Levaduras como microorganismo promotor de crecimiento vegetal.

Ambas formas de promover el crecimiento vegetal, síntesis de AIA y actividad

Entender cómo influyen las levaduras en el desarrollo y desempeño general

La aplicación de levaduras con capacidad de síntesis de AIA y/o actividad

Promover el crecimiento vegetal en plantas de tomate a través de la aplicación

Promotor de crecimiento vegetal, Etileno, Auxinas, Tomate hidropónico, levaduras

En total se evaluaron 23 cepas obtenidas desde de la colección de

Tabla 1. Cepas de levaduras utilizadas en este estudio.

La producción de AIA se evaluó en las 23 cepas de levaduras, las que fueron

Para cuantificar la producción de AIA, se utilizó la técnica colorimétrica

3. 3. Determinación cualitativa de la actividad ACC desaminasa.

Las levaduras seleccionadas fueron cultivadas en medio YPD líquido durante

3. 4. Cuantificación de la actividad ACC desaminasa.

3. 5. Evaluación del efecto de la síntesis de AIA y actividad ACC desaminasa en el

Se seleccionaron las cepas que demuestren tener actividad ACC desaminasa

3. 6. Evaluación de la producción de etileno en plantas de tomate hidropónico.

Para el ensayo in vivo, se implementó un sistema hidropónico de tipo raíz flotante

3. 6. 1. Solución nutritiva y microorganismos

Una solución nutritiva fue elaborada en base al requerimiento nutricional de

Tabla 2. Requerimiento nutricional de plantines de tomate.

3. 6. 2. Cuantificación producción de etileno

Para cuantificar la producción de etileno de las raíces, se utilizó un medidor

3. 6. 2. Medición del crecimiento vegetativo en plantas de tomate hidropónico

Se cuantificó la tasa de fotosíntesis y contenido de clorofila a todas las plantas

Diferencias entre los tratamientos fueron evaluadas mediante ANOVA y

La mayor producción de AIA fue observada en la cepa R. babjevae YCPUC42

Figura 3. Turbidez generada por A: S. aeria YCPUC75 y B: S. aeria YCPUC79 en

En ambos casos, no hubo crecimiento en el medio sin ACC, mientras que en

Figura 4. Densidad óptica para análisis de actividad ACC desaminasa de S. aeria

La cepa S. aeria YCPUC79 tuvo la mayor actividad ACC desaminasa,

Figura 5. Actividad ACC desaminasa expresada como la producción de α–

4. 4. Evaluación del efecto de la síntesis de AIA y actividad ACC desaminasa en el

El experimento fue llevado a cabo en una cámara de crecimiento con

Tabla 3. Registro de temperaturas de la cámara de crecimiento.