Aplicaciones de La Microscopía en La Histología y La Biología Celular

CAMPUS
UNIVERSITARIO SIGLO XXI CIENCIAS DE LA SALUD
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Histología y biología celular, 3e
CAPÍTULO 1: Aplicaciones de la microscopía en la histología y la biología celular
Armando Zepeda Rodríguez
Microscopía fotónica
Introducción
Una gran variedad de actividades humanas son afectadas por tecnología que de alguna forma utiliza energía luminosa. Los fotones forman parte de
nuestras actividades cotidianas, tanto en el hogar como en la industria, en las escuelas de medicina al igual que en los laboratorios clínicos y de
investigación; sin los fotones, gran parte de nuestras comodidades estarían limitadas. Algunos diagnósticos y tratamientos quirúrgicos tendrían poco
éxito sin un microscopio que los module para amplificar la eficiencia del sentido de la vista. El ojo humano es el órgano capaz de percibir la luz del
entorno, es como una cámara oscura que deja pasar la luz a un sistema de lentes que la conducen hasta la retina, cuya función es la fotorrecepción. La
retina está compuesta de conos, bastones y fibras nerviosas que se comunican con el nervio óptico; su sensibilidad depende del color, de la dirección
de la luz incidente y del tiempo que permanezca el estímulo luminoso.
Un poco de historia de la microscopía
La construcción del primer microscopio se atribuye a los hermanos Hans y Zacharias Jansen en 1590, quienes incorporaron lentes convergentes a
tubos de telescopio, con lo que obtuvieron imágenes aumentadas hasta 150 veces, aunque con grandes aberraciones. Los primeros estudios sobre la
historia del microscopio fueron realizados por el filósofo Bacon (15611630), quien le asignó el nombre de microscopium. Bacon perteneció a la
Academia del Lince a la que también pertenecieron Galileo Galilei y otros destacados pensadores.
Según otras fuentes, el término “microscopio” fue acuñado por Anastasius Kircher (16021680) quien en su libro Ars Magna Lucis et Umbrae (El gran
arte de la luz y la oscuridad) realiza la primera clasificación de microscopios conocidos en el siglo xvii. Sin embargo, los primeros microscopios
utilizados para observar el mundo microscópico de manera sistemática fueron fabricados por Anthony van Leeuwenhöek (16321723) (figura 11). La
necesidad de mejorar sus descripciones lo llevó a perfeccionar sus microscopios y a optimizar las lentes que fabricaba, con lo cual logró magnificar
sus objetos de estudio hasta 266 veces. Su precario instrumento cambió la historia de las incipientes ciencias naturales y morfológicas; con él, observó
gran cantidad de células y organismos microscópicos, fibras musculares teñidas con azafrán así como elementos celulares de la circulación sanguínea
de diferentes animales y de personas, lo que le permitió confirmar la teoría de Malpighi sobre la conformación de las redes capilares. Dedicó gran
parte de su tiempo a estudiar espermatozoides de distintas especies, así como la reproducción de aves y anfibios. Estudió también la morfología y
anatomía de insectos, de algas microscópicas, anatomía e histología vegetal. Los protozoarios no escaparon a su curiosidad y sagacidad, los llamó
pequeños Animalcula. Su habilidad, tenacidad, constancia y perseverancia en las observaciones lo llevaron a obtener importantes distinciones en su
época, entre ellas —y quizá la más importante— fue el ser nombrado miembro de la Royal Society of London, así como recibir el nombramiento
histórico de “Padre de la Embriología, Protozoología, Bacteriología” y, por supuesto, “Padre de la Microscopía”.
Figura 11.
Microscopio fabricado por Anthony van Leeuwenhöek, dimensiones reales, referencia a una mano de tamaño regular.
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CAPÍTULO 1: Aplicaciones de la microscopía en la histología y la biología celular, Armando Zepeda Rodríguez Page 1 / 18
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histórico de “Padre de la Embriología, Protozoología, Bacteriología” y, por supuesto, “Padre de la Microscopía”.
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Figura 11.
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Microscopio fabricado por Anthony van Leeuwenhöek, dimensiones reales, referencia a una mano de tamaño regular.
Los descubrimientos realizados con ayuda del microscopio comenzaron en 1665 cuando Robert Hooke acuñó el concepto de “célula”; en 1833 Brown
escribió sus observaciones sobre el núcleo celular; en 1838 Mathias Schleiden y Theodor Schwann propusieron la “Teoría celular”; Kolliker en 1857
observó por primera vez mitocondrias; en 1879 Fleming describió cromosomas en mitosis y 20 años más tarde Camilo Golgi describió lo que hoy se
conoce como “aparato de Golgi”.
La segunda etapa más importante en la historia de la microscopía se inicia en 1872 con Ernst Abbe Jahr, quien estableció las bases de la óptica para
microscopía y la teoría matemática para fabricar de manera científica lentes para los microscopios. Desarrolló la fórmula del límite de resolución, con
la cual estableció que la resolución es dependiente de la longitud de onda de la luz (λ). Gracias a esto se desarrollaron al menos una decena de
sistemas ópticos conocidos también como “métodos de contraste”. Desde entonces la microscopía se convirtió en una herramienta fundamental para
el estudio de células y tejidos.
El microscopio
La óptica de un microscopio está conformada por condensador, objetivos, oculares y una fuente luminosa. Todos estos elementos están soportados
por un estativo, además de una platina y un portacondensador con mecanismos que permiten ajustarlos a las distancias óptimas para enfocar la
preparación y el condensador, respectivamente, a la altura justa para lograr la mejor iluminación en el plano de la preparación. La fuente de
iluminación se localiza en la base del estativo; las lámparas han evolucionado conforme al desarrollo tecnológico de cada época; recientemente se
incorporó a la iluminación el LED (lightemitting diode) diodo emisor de luz, cuya emisión puede generar luz blanca o bien, luz de una λ específica
(figura 12).
Figura 12.
Microscopio fotónico de campo claro. Estructura y componentes más importantes de un microscopio de campo claro: 1) estativo, 2) platina, 3)
portacondensador, 4) fuente luminosa, 5) control de intensidad, 6) condensador, 7) objetivos, 8) revólver, 9) oculares y 10) fototubo.
Figura 12.
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Microscopio fotónico de campo claro. Estructura y componentes más importantes de un microscopio de campo claro: 1) estativo, 2) platina, 3)
portacondensador, 4) fuente luminosa, 5) control de intensidad, 6) condensador, 7) objetivos, 8) revólver, 9) oculares y 10) fototubo.
Condensador
El condensador está ubicado en un portacondensador por abajo de la platina, se mueve con una cremallera, acercándolo al plano de la preparación o
alejándolo, es decir, hacia arriba o hacia abajo; en el mismo portacondensador hay al menos un par de tornillos con los que es posible alinear al eje
óptico. Como su nombre lo indica, el condensador tiene la función de concentrar la luz proveniente de la lámpara, tiene integrado un sistema de
apertura continua (diafragma) que al abrir o cerrar regula la cantidad de luz que pasa por él, generando un efecto de contraste en la preparación
histológica. Este tipo de condensador también recibe el nombre de condensador de Abbe (figura 13). Ese elemento del microscopio puede tener
variantes en su diseño para construir otros métodos de contraste, como se muestra en el esquema de cuatro sistemas ópticos.
Figura 13.
Condensador de campo claro con lente frontal abatible que cambia la AN y diafragma de iris para contraste.
variantes en su diseño para construir otros métodos de contraste, como se muestra en el esquema de cuatro sistemas ópticos.
Figura 13.
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Condensador de campo claro con lente frontal abatible que cambia la AN y diafragma de iris para contraste.
La calidad y proyección del cono de luz que el condensador envía al objetivo es fundamental en la formación de la imagen. La apertura numérica
(AN) es uno de los factores que determinan la calidad y debe correlacionarse directamente con la AN del objetivo. El condensador puede ser de AN fija
si no tiene lente abatible, pero si la tiene, la AN puede modificarse al abatirla. El valor de la AN se inscribe en la cubierta metálica del condensador. El
tema de la AN se aborda a detalle más adelante en este mismo capítulo.
Objetivos
Los fabricantes de microscopios graban en el exterior de los objetivos los datos más importantes que el usuario debe conocer para su mejor uso,
como es el tipo de objetivo. Por ejemplo: planapocromático, el valor la magnificación (10X) luego una línea diagonal el valor de la AN, que es un
número usualmente menor de la unidad y hasta 1.4 como máximo, en la siguiente línea se observa el valor de la distancia de trabajo, usualmente 160
en milímetros o bien un símbolo de infinito (∞) que se refiere a la corrección al infinito; finalmente, separado por una diagonal se especifica el grosor
del cubreobjetos 0.17 mm, o bien, un guión medio (–) que indica que ese objetivo podría trabajar sin cubreobjetos sobre la preparación. Además de
esta serie de datos, se reconoce un anillo de color cercano al revólver asociado a la magnificación y otro anillo de color, casi al borde del objetivo,
presente sólo en aquellos para inmersión, el anillo de color negro indica que debe utilizarse con aceite como medio de inmersión, el color rojo para
inmersión con glicerina y blanco para inmersión en agua (figura 14).
Figura 14.
Revólver. Objetivo planapocromático para contraste de fases (Ph), 100X de magnificación, 1.3 de AN, factor de tubo de 160 mm y de inmersión al aceite.
inmersión con glicerina y blanco para inmersión en agua (figura 14).
Figura 14.
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Revólver. Objetivo planapocromático para contraste de fases (Ph), 100X de magnificación, 1.3 de AN, factor de tubo de 160 mm y de inmersión al aceite.
Oculares
Ambos oculares reciben la imagen desde un prisma que divide al haz luminoso que proviene del objetivo. En cada ocular están grabadas las
características más importantes como el tipo de ocular, el valor de la magnificación seguida por una X, la cifra de campo y la indicación de correcciones
para quienes utilizan lentes personales. La cifra de campo permite conocer el diámetro del campo visual según el objetivo utilizado; por ejemplo, para
calcular el diámetro del campo visual utilizando un ocular con valor de 10X/20 con un objetivo de 40X, se divide el valor de la cifra de campo (20) entre
el valor de amplificación del objetivo (40), es decir, 20/40, el resultado es 0.5 de milímetro, lo que significa que el diámetro del campo visual con esa
combinación es de la mitad de un milímetro; por tanto, el diámetro del campo visual en estas condiciones es de 500 micrómetros (figura 15).
Figura 15.
Ocular Kpl de campo amplio (W), 10X de magnificación, 20 unidades de cifra de campo, corregido para ser utilizado con lentes graduados
personalizados.
La magnificación final de la imagen formada por un microscopio se obtiene multiplicando la magnificación del objetivo por la del ocular. Por ejemplo,
si se utilizó el objetivo de 40X y un ocular de 10X, la magnificación total es de 400X. En algunos microscopios el fabricante incorpora lentes intermedias
entre objetivo y ocular (optovar), usualmente con factores de 1.25X, 1.6X y 2.0X de tal forma que si se considera el (1.25X) con el ejemplo anterior; 400X
Figura 15.
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Ocular Kpl de campo amplio (W), 10X de magnificación, 20 unidades de cifra de campo, corregido para ser utilizado con lentes graduados
personalizados.
La magnificación final de la imagen formada por un microscopio se obtiene multiplicando la magnificación del objetivo por la del ocular. Por ejemplo,
si se utilizó el objetivo de 40X y un ocular de 10X, la magnificación total es de 400X. En algunos microscopios el fabricante incorpora lentes intermedias
entre objetivo y ocular (optovar), usualmente con factores de 1.25X, 1.6X y 2.0X de tal forma que si se considera el (1.25X) con el ejemplo anterior; 400X
debe ser multiplicado por 1.25X, lo que da una magnificación final de 500X.
Resolución y apertura numérica
La resolución de un sistema óptico está definida como la distancia mínima entre dos objetos a la cual estos objetos se pueden apreciar como
individuales y es dependiente de la longitud de onda de la energía utilizada en el sistema óptico. La fórmula para calcular resolución fue desarrollada
por Ernst Abbe Jahr y es conocida como ecuación de Abbe (figura 16).
Figura 16.
Ecuación de Abbe para calcular la resolución en función de la longitud de onda de la luz y de la apertura numérica.
En donde:
δ es la resolución.
λ es la longitud de onda de la luz expresada en nanómetros (nm).
η es el índice de refracción del medio óptico colocado entre la lente frontal del objetivo y el cubreobjetos de una preparación histológica (aire = 1.0;
agua = 1.33; aceite de inmersión = 1.5).
α Unidad angular, es el ángulo entre el eje óptico y los rayos de luz desviados,
Como la δ es dependiente de la λ y ésta se sitúa en el dividendo de la fórmula, el divisor es el producto de dos veces el índice de refracción del medio
óptico situado entre la lente frontal y el cubreobjeto de una preparación histológica y multiplicado por la mitad de la apertura del ángulo del objetivo
utilizado (cuadro 11). En trigonometría, la función seno de un ángulo (sen α) hasta de 90° es igual a 1. El producto que aparece como numerador en la
fórmula expresa en su conjunto lo que en esencia es la NA, que es la medida del ángulo del cono de luz captada por un objetivo. Esta situación se
optimiza cuando se emplean condensador y objetivo de alta apertura numérica y aceite de inmersión entre el objetivo y la laminilla.
Cuadro 11.
Poder de resolución.
α Unidad angular, es el ángulo entre el eje óptico y los rayos de luz desviados,
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Como la δ es dependiente de la λ y ésta se sitúa en el dividendo de la fórmula, el divisor es el producto de dos veces el índice de refracción del medio
óptico situado entre la lente frontal y el cubreobjeto de una preparación histológica y multiplicado por la mitad de la apertura del ángulo del objetivo
utilizado (cuadro 11). En trigonometría, la función seno de un ángulo (sen α) hasta de 90° es igual a 1. El producto que aparece como numerador en la
fórmula expresa en su conjunto lo que en esencia es la NA, que es la medida del ángulo del cono de luz captada por un objetivo. Esta situación se
optimiza cuando se emplean condensador y objetivo de alta apertura numérica y aceite de inmersión entre el objetivo y la laminilla.
Cuadro 11.
Poder de resolución.
Ojo humano Microscopio fotónico Microscopio electrónico
Poder de resolución 2 500 nm 200 nm 1 nm
A fin de calcular la resolución sólo para el objetivo se emplea la ecuación de la apertura numérica:
NA=η sen α
y si se sustituye en la ecuación de Abbe el divisor por NA, entonces la ecuación queda así:
λ
δ=λNA
Calcule la resolución para un objetivo con una NA de 0.9 y otro con 1.4 de NA, recibiendo una longitud de onda de 400 nm. Al sustituir estos valores en
la última ecuación, entonces para los 400 nm divididos entre 0.9, δ es igual a 444 nm y divididos entre 1.4, δ es igual a 282 nm. De modo que estructuras
cuya separación entre sí sea menor a 444 nm y a 282 nm, respectivamente, no pueden ser discriminadas como independientes.
Sistema óptico de campo claro
Este método de contraste utiliza en esencia el diseño del microscopio antes descrito y recibe el nombre de campo claro (CC) debido a que utiliza una
fuente de iluminación de luz blanca al menos de 5 000 K de temperatura de color; un filtro de compensación azul, colocándolo encima del diafragma
de campo y antes del condensador. El condensador de CC enfoca el haz luminoso en el plano de la preparación e incluye un diafragma de contraste.
Después de que el haz luminoso pasa por el condensador y por la preparación, entra al objetivo, que se encarga de formar una imagen real,
aumentada e invertida del objeto, el ocular recibe la imagen formada por el objetivo y la amplifica. La distancia entre el foco posterior al objetivo y el
foco anterior al ocular se llama longitud del tubo, que por lo general es de 160 milímetros (figura 17).
Figura 17.
Imagen de células epiteliales teñidas con Papanicolaou, observadas en sistema óptico de campo claro.
Cuando a nivel de la platina y en la trayectoria del haz luminoso de luz blanca se colocan laminillas con cortes histológicos o con marcadores por
inmunohistoquímica, la estructura histológica que ha incorporado alguno o algunos colorantes y/o marcadores debe saltar a la vista, contrastándose
contra el fondo neutro, que debe ser bien claro.
Sistemas ópticos (métodos de contraste)
Además del CC, se conocen varios métodos de contraste que son alimentados por luz: el campo oscuro (CO), la luz polarizada (LP), el contraste de
fases (CF), el contraste diferencial de interferencia (CDI) o “sistema de Nomarsky”, la fluorescencia, el microscopio de barrido láser confocal (LSCM)
Cuando a nivel de la platina y en la trayectoria del haz luminoso de luz blanca se colocan laminillas con cortes histológicos o con marcadores por
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inmunohistoquímica, la estructura histológica que ha incorporado alguno o algunos colorantes y/o marcadores debe saltar a la vista, contrastándose
contra el fondo neutro, que debe ser bien claro.
Sistemas ópticos (métodos de contraste)
Además del CC, se conocen varios métodos de contraste que son alimentados por luz: el campo oscuro (CO), la luz polarizada (LP), el contraste de
fases (CF), el contraste diferencial de interferencia (CDI) o “sistema de Nomarsky”, la fluorescencia, el microscopio de barrido láser confocal (LSCM)
(cuadro 12). En otro grupo están los microscopios electrónicos, alimentados por partículas de carga negativa (electrones) como el microscopio
electrónico de transmisión (TEM) y microscopio electrónico de barrido (SEM), con un potencial de resolución de orden subnanométrico y
magnificaciones hasta de un millón de aumentos. Ambos grupos de microscopios son utilizados para estudiar la estructura y la ultraestructura de
células y tejidos, aportando información morfológica en la enseñanza como en la investigación en áreas morfológicas de orden microscópicas y
nanoscópicas.
Cuadro 12.
Sistemas ópticos y aplicaciones.
Método de contraste Aplicación
Campo claro Técnica histológica, marcadores inmunohistoquímicos
Campo oscuro Células vivas en medio acuoso
Luz polarizada Pelo, fibras naturales y artificiales, cristales
Contraste de fases Cultivos celulares, especímenes biológicos vivos
Fluorescencia Clorofila, cerumen, variedad de fluorocromos
Campo oscuro (CO)
El sistema óptico de CO está basado en la dispersión de la luz en sistemas coloidales y aprovecha el efecto de Tyndall. El condensador es especial en su
diseño, la luz que recibe desde la fuente luminosa es bloqueada parcialmente en el centro y sólo pasa por la periferia del mismo, sus paredes son
reflejantes, enfoca la luz en forma casi tangencial al salir del mismo; por lo que si en la platina no se coloca la preparación adecuada, el campo
observado será absolutamente oscuro, ya que la luz no alcanza a entrar en el objetivo. Cuando la preparación contiene partículas en suspensión o
células vivas con cilios o flagelos en movimiento, provocarán dispersión de la luz cambiando su trayectoria enviándola al objetivo. Las células brillarán
contrastadas contra un fondo totalmente oscuro. La experiencia de observar este sistema óptico será comparada con observar un cielo estrellado
(figura 18).
Figura 18.
Diagrama simplificado de cuatro sistemas ópticos con atención a condensador y objetivo: a) campo claro, b) campo oscuro, c) luz polarizada y d)
contraste de fases.
Figura 18.
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Diagrama simplificado de cuatro sistemas ópticos con atención a condensador y objetivo: a) campo claro, b) campo oscuro, c) luz polarizada y d)
contraste de fases.
Luz polarizada
Existen cuatro tipos de polarización: absorción, reflexión, dispersión y por birrefringencia (doble refracción). El sistema óptico de LP utiliza como base
al de CC. Cuando en forma consecutiva a lo largo de un mismo eje óptico se colocan dos polarizadores, al primero se le denomina polarizador
mientras que al segundo analizador. Si los ejes de polarización están cruzados (90° entre ambos) la luz no logrará salir del analizador, según la ley de
Malus (Tipler, Mosca). El polarizador se coloca entre la fuente de iluminación y la base del condensador, el analizador se coloca en el eje óptico entre el
objetivo y el ocular. El campo formado entre el polarizador y el analizador se conoce como campo de luz polarizada, de tal modo que el analizador
bloquea las longitudes de onda orientadas conforme al polarizador, por lo que es imposible registrar algún rayo de luz por la salida del ocular.
Cuando en la platina se coloca una preparación con actividad óptica al campo de luz polarizada, ésta cambiará su patrón de vibración por
birrefringencia. Este sistema es ideal para analizar la presencia de cristales como el almidón, oxalatos, urea o polímeros incluidos en tejidos con o sin
tinción y aun en forma aislada. Estos materiales aparecen en el campo de observación con algún patrón de formas y colores característicos,
contrastados contra el resto del campo que es negro por la ausencia de luz. La óptica utilizada en este sistema debe ser destensada para evitar la
inducción de birrefringencia. Los condensadores y objetivos son identificados con la leyenda “Pol” en color rojo (figura 18).
Contraste de fases
Fritz Zernike revolucionó la investigación en biología celular con la innovación del sistema óptico de CF, mediante el cual fue posible observar
especímenes biológicos como células en cultivo y organismos vivos sin teñir; esto le valió el Premio Nobel en Física en 1953. El sistema óptico de CF
revela las diferencias entre los índices de refracción de los diferentes componentes celulares y el citoplasma, contrastándolos y evidenciándolos por
su grosor y densidad como diferencias de intensidad luminosa. Estas pequeñas diferencias de contraste son producidas por la naturaleza de la
muestra y se intensifican por el diseño del sistema óptico. El sistema se construye a partir de un sistema óptico de CC al que se incorporan un par de
anillos de fase (Ph) que trabajan de manera complementaria. El primero es un anillo claro por el cual pasa la luz y está inscrito en una placa que
bloquea el resto de la luz desde el condensador. El segundo anillo es el inverso del primero, es oscuro y sólo él bloquea la luz que ha dejado pasar el
anillo del condensador, es decir, que tanto el centro como la periferia del objetivo dejan pasar la luz.
La combinación de este conjunto de anillos logra desfasar algunas longitudes de onda. Tanto el objetivo como el condensador tienen una leyenda Ph
seguida por un número que va de 1 a 3 (p. ej., Ph2), que al utilizar este sistema deberán ser superpuestos y alineados entre sí (figura 19). La eficiencia
de este sistema óptico se alcanza con luz verde monocromática; observando organismos y células in vivo muy delgados y en solución acuosa, el núcleo
y los organelos aparecen más oscuros que el citoplasma, mientras que los contornos celulares se aprecian como halos brillantes.
Figura 19.
Anillos de contraste de fases. Representación de los anillos de fase (Ph) complementarios de condensador y de objetivo: a la izquierda se encuentran
no alineados; a la derecha se aprecian alineados.
y los organelos aparecen más oscuros que el citoplasma, mientras que los contornos celulares se aprecian como halos brillantes.
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Figura 19.
Anillos de contraste de fases. Representación de los anillos de fase (Ph) complementarios de condensador y de objetivo: a la izquierda se encuentran
no alineados; a la derecha se aprecian alineados.
Sistema óptico de fluorescencia
El británico sir George G. Stokes acuñó el término “fluorescencia” después de observar el mineral fluorspar cuando lo iluminaba con energía
ultravioleta. La microscopía de fluorescencia fue en un inicio estudiada por August Köhler y Carl Reichert, después hubo un largo periodo en que
quedó casi en desuso; en fechas recientes se ha consolidado como una técnica indispensable en la medicina y la biología celular. Muchos
especímenes, como minerales, cristales, resinas, fármacos, mantequilla, clorofila, cerumen y vitaminas muestran autofluorescencia cuando son
radiados con energía ultravioleta. Entre 1930 y 1939, el austriaco Max Haitinger desarrolló la técnica de fluorescencia secundaria empleando
fluorocromos para marcar componentes celulares de bacterias y de otros microorganismos sin autofluorescencia (figura 110). En 1950, Albert Coons
y Nathan Kaplan demostraron la localización de antígenos en tejidos tratados con un anticuerpo marcado con fluoresceína. Dicha técnica ha resuelto
interrogantes sobre la estructura y función de órganos, tejidos y células, además de ser fundamental en estudios de inmunolocalización de proteínas y
macromoléculas participantes en vías de señalización. El fenómeno de la fluorescencia se basa en la luminiscencia, definida como la capacidad de un
cuerpo para emitir energía ultravioleta, infrarrojo o luz visible durante el paso de un estado de excitación a su estado de reposo (estado básico). La
luminiscencia tiene dos fenómenos: la fosforescencia —en la que un cuerpo emite energía continua por tiempo prolongado— y la fluorescencia —
capacidad de algunas sustancias químicas conocidas como fluorocromos para absorber longitudes de onda, almacenarla y liberarla después como luz
visible de mayor longitud de onda—. Se conocen dos tipos del sistema óptico de fluorescencia: el primero por transiluminación y el segundo por
epifluorescencia. La fuente de iluminación es una lámpara a base de vapor de mercurio que emite un espectro en azul y en ultravioleta. Esta energía es
filtrada en forma selectiva por un juego de filtros de excitación antes de llegar al espécimen, que luego de ser radiado emite longitudes de onda de la
luz visible. Después de pasar por el objetivo y antes del ocular pasa por un juego de filtros barrera que bloquean el exceso de energía ultravioleta y
sólo dejan pasar la longitud de onda seccionada, revelando sólo la fluorescencia. El campo visual es un campo oscuro en el que resaltan los colores de
la autofluorescencia o bien de los fluorocromos. El condensador y los objetivos utilizados en este sistema deben ser corregidos y destensados.
Figura 110.
Esquema que representa el principio de fluorescencia. Una sustancia fluorescente recibe energía de longitud de onda no visible, resta energía y la
reemite en longitud de onda visible.
Una de las técnicas más comunes es el DAPI (4´,6diamidino2fenilindol), fluorocromo que marca el ácido desoxirribonucleico (DNA), tiene alta
afinidad por las bases adenosinatimidina (AT), regiones de pares de bases en el DNA, es excitada por ultravioleta con rangos de absorción de 355 nm.
Iluminación de Köhler
Figura 110.
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Esquema que representa el principio de fluorescencia. Una sustancia fluorescente recibe energía de longitud de onda no visible, resta energía y la
reemite en longitud de onda visible.
Una de las técnicas más comunes es el DAPI (4´,6diamidino2fenilindol), fluorocromo que marca el ácido desoxirribonucleico (DNA), tiene alta
afinidad por las bases adenosinatimidina (AT), regiones de pares de bases en el DNA, es excitada por ultravioleta con rangos de absorción de 355 nm.
Iluminación de Köhler
A fin de que todos los componentes de un microscopio rindan de manera eficiente y se optimice la calidad, el eje óptico deberá estar alineado y con la
cantidad y calidad de luz adecuada para iluminar uniformemente el plano de la preparación, para que resalten adecuadamente los colorantes de las
tinciones en el tejido procesado para este fin. Realizar el procedimiento de la iluminación de Köhler brinda beneficios como tener un campo visual
uniformemente iluminado y neutro, apreciar imágenes brillantes y nítidas, además de realizar la observación de manera placentera, el método fue
desarrollado por August Köhler en 1953 (figura 111).
Figura 111.
Iluminación Köhler. A la izquierda se observa el campo visual con imagen de diafragma de campo descentrado, a la derecha la imagen muestra los
bordes del diafragma de campo centrados concéntricamente con el campo de observación.
Después de colocar la preparación histológica en la platina y encender la lámpara de microscopio:
1. Mover el condensador con la lente frontal no abatida a media altura aproximadamente.
2. Enfocar la preparación histológica con el objetivo 10X.
3. Cerrar a dos tercios el diafragma de campo para ubicar la posición del haz luminoso.
4. Mover el condensador en posición vertical hasta obtener la máxima intensidad y observar el contorno geométrico del diafragma.
5. Centrar los bordes del diafragma de campo al campo visual, con los tornillos de centrado del condensador.
6. Abrir gradualmente el diafragma de campo, hasta el borde, y centrarlo nuevamente, abrirlo hasta que desaparezca detrás del borde del campo
visual.
7. Regular el contraste de la imagen con ayuda del diafragma del condensador.
3. Cerrar a dos tercios el diafragma de campo para ubicar la posición del haz luminoso.
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4. Mover el condensador en posición vertical hasta obtener la máxima intensidad y observar el contorno geométrico del diafragma.
5. Centrar los bordes del diafragma de campo al campo visual, con los tornillos de centrado del condensador.
6. Abrir gradualmente el diafragma de campo, hasta el borde, y centrarlo nuevamente, abrirlo hasta que desaparezca detrás del borde del campo
visual.
7. Regular el contraste de la imagen con ayuda del diafragma del condensador.
8. Colocar el filtro azul para compensar la temperatura de color y contrastar la tinción (o tinciones) con el campo claro.
Microscopio de barrido láser confocal (LSCM)
La microscopía fotónica ha sido objeto de muchos cambios en las últimas dos décadas, el mejor ejemplo es la LSCM, que constituye un sistema
especializado, en el que uno o varios rayos láser barren distintos planos focales de un mismo espécimen y forma imágenes seriadas, que son
almacenadas a través de un software como archivo digital. Este sistema ha revolucionado la biología celular, proporciona ventajas extraordinarias,
debido a su magnífica nitidez y capacidad de información en 1.5 veces más que la microscopía fotónica, también constituye una poderosa herramienta
para analizar la estructura de células y tejidos vivos así como fragmentos histológicos sin que éstos sufran daño tanto por transmisión como por
reflexión. La extensión de la magnificación permite hacer reconstrucciones tridimensionales con gran precisión y reduce de manera notable el
blanqueo de la fluorescencia por exposición innecesaria y —quizá lo más importante— elimina el efecto de desenfoque. Estas ventajas han hecho de la
microscopía una disciplina de gran popularidad gracias a su opción de generar imágenes limpias y bien definidas, incluso de especímenes vivos en
tercera dimensión con amplia profundidad de campo. El rayo láser es la piedra angular en este sistema, su nombre es un acrónimo de su nombre en
inglés: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (LASER); se trata de un dispositivo que crea y amplifica un fino haz de luz,
intensificándolo y haciéndolo coherente (figura 112). Fue inventado por Arthur L. Schawlow y Charles H. Towens y su artículo fue publicado en la
revista Physical Review en 1958. La estimulación de la radiación es producida por un cristal de rubí o por la presencia de gases como el argón. Este
láser barre en X,Y mientras que la muestra es movida en eje Z —al final de su trayectoria el detector y su fotomultiplicador con apertura especial—, un
objetivo de alta apertura numérica y un espejo dicroico.
Figura 112.
Esquema de los principales elementos ópticos de un LSCM.
El rayo láser incide sobre la muestra por una pequeña apertura y es enfocado sobre el plano de la imagen del objetivo, así la luz reflejada regresa al
mismo punto pero reenfocada y transmitida por una apertura muy pequeña sin pérdida de señal, de manera que la luz colateral a los ejes principales
objetivo de alta apertura numérica y un espejo dicroico.
Figura 112.
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Esquema de los principales elementos ópticos de un LSCM.
El rayo láser incide sobre la muestra por una pequeña apertura y es enfocado sobre el plano de la imagen del objetivo, así la luz reflejada regresa al
mismo punto pero reenfocada y transmitida por una apertura muy pequeña sin pérdida de señal, de manera que la luz colateral a los ejes principales
dispersa es bloqueada por la apertura principal y la imagen es de gran definición. Tanto la apertura de iluminación como la de retorno tienen un foco
común.
Las aplicaciones del LSCM son muy diversas en la biología celular, se analizan: microtúbulos, mitocondrias, DNA, actina, retículo endoplásmico,
membrana celular, marcadores inmunológicos, cultivos celulares, biopsias, etc. Todas las ventajas que la microscopía confocal ofrece, son
respaldadas por eficientes equipos de cómputo y software capaces de integrar imágenes y presentarlas en tercera dimensión en forma dinámica, así
como almacenarlas y procesarlas con excelente velocidad y resolución. Algunas de las técnicas más utilizadas por los investigadores son: marcaje
múltiple, barrido en línea, cortes aislados, reconstrucción tridimensional (3D) y estéreo de imágenes. Las imágenes obtenidas con este sistema
pueden ser editadas desde la pantalla y almacenadas o impresas. Las unidades de memoria sirven para almacenar muchas imágenes en unidades de
disco extraíbles. Recientemente el sistema de deconvolución digital que capta imágenes desde un microscopio convencional de fluorescencia y de
manera digital elimina el desenfoque.
¿Sabías que…?
Después de la muerte de Carl Zeiss, su entrañable amigo Ernst Abbe estableció en 1889 la fundación Carl Zeiss y dos años más tarde cedió los
derechos que su amigo le había heredado de las industrias Zeiss junto con los talleres de óptica y de vidrio Schott a los trabajadores, dejándolos
como únicos propietarios desde 1891 y hasta la fecha.
Microscopía electrónica
Desde su aparición, el microscopio electrónico ha contribuido de manera sustancial al conocimiento de la ultraestructura celular y tisular, ha
permitido describir la organización celular y los organelos, así como su relación entre ellos, tanto en vegetales como en animales. También ha
contribuido de manera significativa a encontrar respuestas a interrogantes fundamentales relacionadas con la estructura celular normal y patológica.
En 1924, Prince Pierre Raymond LouisVictor de Broglie (18921987) propuso que cuando los electrones eran sometidos a campos magnéticos, éstos
modificaban su trayectoria. En 1926, H. Busch descubrió que los electrones liberados de un átomo pueden describir trayectorias al igual que el
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Microscopía electrónica
Desde su aparición, el microscopio electrónico ha contribuido de manera sustancial al conocimiento de la ultraestructura celular y tisular, ha
permitido describir la organización celular y los organelos, así como su relación entre ellos, tanto en vegetales como en animales. También ha
contribuido de manera significativa a encontrar respuestas a interrogantes fundamentales relacionadas con la estructura celular normal y patológica.
En 1924, Prince Pierre Raymond LouisVictor de Broglie (18921987) propuso que cuando los electrones eran sometidos a campos magnéticos, éstos
modificaban su trayectoria. En 1926, H. Busch descubrió que los electrones liberados de un átomo pueden describir trayectorias al igual que el
comportamiento ondulatorio de la luz, con la condición de hacerlos viajar en un ambiente sometido al vacío; de esta manera alcanzan una longitud de
onda de 0.004 nm, reduciendo en unas 100 000 veces el valor de la longitud de onda de los fotones. En 1931, Ernst Ruska y Max Knoll plasmaron todos
esos conocimientos y construyeron el primer microscopio electrónico de transmisión. Con este desarrollo tecnológico se abrió la puerta a un mundo
inaccesible hasta entonces y, así, se inició una nueva era en el conocimiento.
Los detalles de la naturaleza a nivel de estructuras subcelulares serían vistos y cuestionados por cientos de investigadores en todo el mundo, muchos
biólogos celulares hasta entonces suponían que la célula era una bolsa llena de enzimas con un protoplasma desprovisto de estructura interna. En la
segunda mitad del siglo xx se innovaron y desarrollaron técnicas de preparación de muestras para ser analizadas con el instrumento recién
comercializado. Investigadores de diferentes áreas aplicativas contribuyeron con muchas y diferentes técnicas, entre ellos se cuentan los nombres de
Albert Claude, Don Fawcett, Earnes Fullam, Andrey Glauert, Hugh Huxley, Bob Horne, Charles Leblon, John Luft, George Palade, Daniel Pease y Fritjof
Sjöstrand. En 1974, Palade y Claude recibieron el Premio Nobel de Medicina por sus contribuciones con microscopía electrónica a la biología celular.
En 1986, Ruska recibió el Premio Nobel de Física en reconocimiento a su importante contribución.
Por otra parte, las ciencias que se han visto beneficiadas con las aplicaciones del microscopio electrónico son la anatomía, bioquímica, microbiología,
patología, fisiología, toxicología, virología, biología estructural y la biología celular, entre otras. En particular los anatomistas, los biólogos celulares y
los patólogos son los investigadores más ligados al uso del microscopio electrónico. El constante perfeccionamiento de este instrumento lo ha llevado
a resoluciones subnanométricas, con amplificaciones hasta de un millón de veces. En un inicio se desarrollaron dos tipos básicos de microscopios
electrónicos: microscopio electrónico de transmisión (TEM) y el microscopio electrónico de barrido (SEM), con grandes variantes y múltiples
aplicaciones en un mismo equipo. En cuanto al primer SEM, fue construido por Von Ardenne en Alemania, en tanto que el primero fabricado de
manera comercial fue construido en 1963.
Microscopio electrónico de transmisión
El TEM está conformado por sistemas básicos para su funcionamiento. La columna electrónica es el elemento principal, en ella se aloja el cilindro de
Wehnelt (CW) o cañón de electrones, lentes electromagnéticas, lentes correctoras de astigmatismo, aperturas y una platina, además de un sistema de
enfriamiento de los lentes. En lo más alto de la columna está el CW y en su interior se localiza el filamento (por lo general de tungsteno) que es
alimentado por un voltaje de baja intensidad para calentarlo; de forma independiente, el CW recibe una corriente negativa de alta tensión, lo que
establece una diferencia de potencial eléctrico entre éste y el ánodo, los electrones son proyectados al vacío por el voltaje de aceleración desde el
filamento, alcanzando unos 150 000 km/s a 80 kW.
La conducta de los electrones por efecto del voltaje de aceleración y de su carga hace que este sistema funcione como una lente electrostática,
formándose un primer foco o crossover en las inmediaciones del ánodo. Hay tres tipos de lentes electromagnéticas y, según su función, son
condensadoras, objetivas y proyectoras, además de algunas bobinas correctoras de astigmatismo. Entre la última lente condensadora y la proyectora
está la platina, encargada de dar movimiento a la rejilla en la que se coloca la muestra; otro elemento importante son las aperturas colocadas en
diferentes regiones de la columna y que se encargan de optimizar el haz de electrones y de incrementar el contraste (figura 113).
Figura 113.
Microscopio electrónico de transmisión EM10C, con aceleración de voltaje de 100 keV para cortes de material biológico embebidos en resina.
diferentes regiones de la columna y que se encargan de optimizar el haz de electrones y de incrementar el contraste (figura 113).
Figura 113.
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Microscopio electrónico de transmisión EM10C, con aceleración de voltaje de 100 keV para cortes de material biológico embebidos en resina.
La eficiencia del sistema de vacío determina de manera importante la calidad de las imágenes. La presencia de cualquier molécula de gas en la
trayectoria de los electrones les impediría llegar al espécimen e interaccionar con él, bloqueando la posibilidad de generar imágenes; por lo que la
columna del microscopio electrónico debe estar sometida a presión negativa por un eficiente sistema de vacío. Este sistema se activa en dos etapas: la
primera es el prevacío y la segunda es el alto vacío. En el primer caso, una o dos bombas mecánicas evacuan grandes volúmenes de gas y sirven de
apoyo permanente a las bombas de la segunda etapa, que son bombas de alta eficiencia y actúan evacuando gases a nivel molecular (figura 114).
Figura 114.
Electromicrografía de corte de miocardio observado en un microscopio electrónico de transmisión a 80 keV. Barra = 1 micrómetro.
apoyo permanente a las bombas de la segunda etapa, que son bombas de alta eficiencia y actúan evacuando gases a nivel molecular (figura 114).
Figura 114.
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Electromicrografía de corte de miocardio observado en un microscopio electrónico de transmisión a 80 keV. Barra = 1 micrómetro.
Microscopio electrónico de barrido
El SEM o scanning posee dos grandes ventajas sobre otros sistemas ópticos, su gran profundidad de campo y el efecto de tercera dimensión (figura 1
15). Es ampliamente utilizado en el estudio de la morfología, la topografía, en análisis elemental y en la cristalografía.
Figura 115.
Microscopio electrónico de barrido DSM950 (scanning) con aceleración de voltaje de 30 keV con detectores de electrones secundarios y de
retrodispersos.
El microscopio de barrido cuenta con una columna electrónica más pequeña que la del TEM, el sistema de lentes crea y modula el haz de electrones y,
a diferencia del TEM, carece de lente proyectora. Otra diferencia esencial es la presencia de una cámara para el espécimen que, como su nombre lo
indica, lo aloja además de los detectores. Se trata de un sistema de lentes colimadores que gobiernan la rapidez del barrido y su desplazamiento sobre
la muestra. La superficie es rastreada en forma lineal por el spot del haz desde un sitio en la esquina superior izquierda y hasta el final de esa misma
línea; este ciclo se repite en la línea inmediata inferior y así de manera sucesiva hasta cubrir toda el área observada. El recorrido completo puede durar
desde fracciones de segundo hasta varios segundos, lo cual significa que el haz se desplaza sobre la muestra durante la observación, recorriendo
punto a punto la superficie y recolectando información en un sistema de coordenadas (X, Y) y además en posición Z. Toda la información es integrada
y mostrada en la pantalla del equipo como una imagen.
El voltaje de aceleración en el SEM va desde unos 0.5 keV hasta 30 keV. La naturaleza del espécimen determinará la elección de la diferencia de
potencial utilizada para su análisis. La materia orgánica está compuesta de elementos ligeros, por lo que es muy lábil cuando se expone al haz de
electrones sin el tratamiento adecuado.
Cuando el haz de electrones se impacta en la preparación, causa una zona de múltiples colisiones conocida como “volumen de interacción” y se disipa
la muestra. La superficie es rastreada en forma lineal por el spot del haz desde un sitio en la esquina superior izquierda y hasta el final de esa misma
línea; este ciclo se repite en la línea inmediata inferior y así de manera sucesiva hasta cubrir toda el área observada. El recorrido completo puede durar
desde fracciones de segundo hasta varios segundos, lo cual significa que el haz se desplaza sobre la muestra durante la observación, recorriendo
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punto a punto la superficie y recolectando información en un sistema de coordenadas (X, Y) y además en posición Z. Toda la información es integrada
y mostrada en la pantalla del equipo como una imagen.
El voltaje de aceleración en el SEM va desde unos 0.5 keV hasta 30 keV. La naturaleza del espécimen determinará la elección de la diferencia de
potencial utilizada para su análisis. La materia orgánica está compuesta de elementos ligeros, por lo que es muy lábil cuando se expone al haz de
electrones sin el tratamiento adecuado.
Cuando el haz de electrones se impacta en la preparación, causa una zona de múltiples colisiones conocida como “volumen de interacción” y se disipa
la energía cinética adquirida en su trayectoria, con lo que se producen diferentes señales potencialmente detectables. Los principales son tres tipos de
electrones: Auger, secundarios (SE) y retrodispersos (BSE); además de energía en forma de rayos X. Con estas señales es posible recuperar varios tipos
de información en un SEM: topografía, textura, composición química y estructura cristalina. Los SE generan imágenes de gran definición con un juego
de contraste y brillo en tercera dimensión (figura 116).
Figura 116.
Miocardio fracturado en congelación y observado en un microscopio electrónico de barrido a 15 keV con electrones secundarios. Barra = 2
micrómetros.
¿Sabías que…?
Ernst Ruska y Max Knoll construyeron el primer microscopio electrónico de transmisión en 1931 y que hasta 1986 le otorgaron a Ruska el Premio
Nobel en Física por su invención; el premio fue compartido con los dos inventores del microscopio de tunelaje, Gerd Binnig y Heinrich Rohrer.
Bibliografía
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Publishers. USA. p. 670; 1999.
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CrossRef
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Yount L, Leeuwenhoek AV. First to see Microscopic Life . Enslow Publisher, Inc. 1996.
Actividades prácticas: Aplicaciones de la microscopía en la histología y la biología celular
Puntos clave para recordar
1 . ¿Cuál es el poder de resolución de un microscopio alimentado con longitud de onda?
2 . ¿Cómo se calcula la magnificación total de salida a oculares en un microscopio fotónico?
3 . ¿Cuál es la aplicación fundamental de un microscopio con sistema óptico de campo claro?
4 . En microscopía electrónica se conocen dos plataformas básicas para analizar células y tejidos, ¿cuáles son?
5 . ¿Cuál es el poder de resolución en microscopía electrónica?

Aplicaciones de La Microscopía en La Histología y La Biología Celular

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