Identificación molecular de dos especies
de tlacuache: Didelphis virginiana y
D. marsupialis, utilizando enzimas
de restricción
Molecular identification of two species of opossum:
Didelphis virginiana and D. marsupialis, using RFLP´s
Jésica Arcangeli* y Fernando A. Cervantes
Resumen. En México se distribuyen de forma simpátrica
dos especies de tlacuache del género Didelphis
morfológicamente muy similares. Esta situación oca-
siona errores en la identificación a nivel específico
debido a que los caracteres morfológicos externos no
son fáciles de reconocer. Una alternativa reciente para
identificar especies son los marcadores moleculares,
como el análisis del polimorfismo de la longitud de
los fragmentos de restricción (RFLP). En este método
las enzimas de restricción cortan secuencias de ADN
específicas que están presentes en una especie y no
en otra, produciendo fragmentos de diferente tamaño,
con lo que se puede distinguir fácilmente a las espe-
cies. El objetivo de este trabajo fue, entonces, distin-
guir a Didelphis virginiana de D. marsupialis utilizando
RFLP´s. El análisis de restricción se hizo con amplifi-
caciones del gen citocromo b y dos enzimas de res-
tricción, HaeIII y TaqI. La enzima HaeIII produjo
un patrón de digestión en D. virginiana y dos en
D. marsupialis, mientras que la enzima TaqI produjo
dos patrones en D. virginiana y uno en D. marsupialis.
Todos los patrones obtenidos fueron diferentes y no
se compartieron entre las dos especies. Por lo tanto,
se pudo distinguir exitosamente a D. virginiana de
D. marsupialis utilizando marcadores moleculares.
Palabras clave: enzimas de restricción, citocromo
b, Didelphimorphia, HaeIII, marsupiales, simpatría, TaqI.
Abstract. There are two sympatric and morphologically
similar species of the genus Didelphis in México. This
Departamento de Zoología, Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México. A. P. 70 -153. Coyoacán, C. P. 04510,
México, D. F.
* Correspondencia: jeaa@ibiologia.unam.mx
60 AÑOS DE LA C O L ECCIÓN N ACIONAL DE MAMÍFEROS
condition causes mistakes in their identification at the
specific level because is so difficult discriminate both
species using morphology. A recent alternative for species
identification is molecular markers such as Restriction
Fragment Length Polymorphism (RFLP). This molecular
technique identifies specific DNA sequences with
restriction enzymes that occur in one species and not
in the other one, producing fragments of different size,
therefore it allows to discriminate between species. The
aim of this study then was to distinguish two sympatric
opossum species documenting differences in their
nucleotide sequences using restriction analysis. RFLP´s
utilized cytochrome b PCR products and two restriction
enzymes HaeIII and TaqI. HaeIII produced one pattern
in D. virginiana and two in D. marsupialis, while TaqI
produced two patterns in D. virginiana and one in D.
marsupialis. All patterns obtained were different and
were not shared between these species of opossum.
Therefore, we could successfully discriminate between
D. virginiana and D. marsupialis using molecular
markers.
Key words: restriction enzymes, cytochrome b,
Didelphimorphia, HaeIII, marsupials, sympatric, TaqI.
INTRODUCCIÓN
Los marsupiales americanos son un componente muy
importante en la fauna neotropical, ocupan el tercer lugar
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en riqueza de especies en el Nuevo Mundo después
de los roedores y los quirópteros (Catzeflis et al., 1997).
La familia Didelphidae es la que tiene mayor número
de especies (80) y la que además tiene mayor exten-
sión geográfica, desde el sureste de Canadá hasta la
Patagonia (MacDonald, 1991; Voss y Jansa, 2003). Estos
marsupiales están confinados a los ambientes tropi-
cales y templados donde son muy comunes (Eisenberg,
1989). A pesar de su ubicuidad, existen pocas revisio-
nes taxonómicas que brinden una diagnosis apropia-
da. De hecho, solamente los géneros de talla grande,
Didelphis y Philander, han recibido una atención
sistemática detallada (Patton y Costa, 2003).
Los tlacuaches del género Didelphis son mamíferos que se
caracterizan por tener un marsupio bien desarrollado en las
hembras, cola desnuda y prensil, pelaje denso y pelo de
guarda largo (Fig.1; Gardner, 1973). La distribución actual
del género se extiende desde el sureste de Canadá hasta el
centro de Argentina a elevaciones que van desde el nivel
del mar, tanto en la costa de Atlántico como en la del Pací-
fico, hasta más de 3 000 metros en las montañas de México
y Suramérica (Ventura et al., 2002). Estos marsupiales se
pueden encontrar en una gran variedad de hábitats: mato-
rral xerófilo, bosque tropical perennifolio y caducifolio,
bosque de coníferas, bosque de pino-encino y selva (Cerqueira
Figura 1. Hembra adulta de tlacuache (Didelphis virginiana) en el Campus de Ciudad Universitaria, Universidad Nacional Autónoma de México,
Ciudad de México (Fotografía: J. Arcangeli).
252• 60 AÑOS DE LA C O L ECCIÓN N ACIONAL DE MAMÍFEROS
Jésica Arcangeli y Fernando A. Cervantes
y Lemos, 2000). Actualmente, se reconocen seis especies
nominales: D. albiventris, D. aurita, D. imperfecta,
D. marsupialis, D. pernigra y D. virginiana (Gardner, 2005).
Tanto el registro fósil (Simpson, 1974) como análisis
moleculares (Kirsch et al., 1993; Patton et al., 1996)
indican que el origen de estas especies es reciente, aproxi-
madamente hace 6 millones de años.
En México se distribuyen dos especies, D. marsupialis
y D. virginiana (Gardner, 1973), y el área de simpatría
de estos tlacuaches abarca los estados de Tamaulipas,
Veracruz, Tabasco, Campeche, Oaxaca, Chiapas, Yucatán
y Quintana Roo (Colchero et al., 2005; Zarza y Medellín,
2005) que corresponde a toda la distribución de
D. marsupialis en México (Aranda, 2000; Fig. 2). La
presencia de ambas especies en esta área provoca errores
en la identificación a nivel específico debido a que son
morfológicamente muy similares y exhiben una alta
variabilidad en los caracteres diagnósticos. Este pro-
blema es muy común en de toda la distribución del
género, especialmente en especies simpátricas. Por
ejemplo, Lavergne et al. (1997) reportan que en Guyana
es difícil distinguir entre D. marsupialis y D. albiventris
en los lugares donde su distribución es simpátrica debido
al elevado polimorfismo que presentan los caracteres
externos usados para su identificación.
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 Identificación molecular de dos especies de tlacuache: Didelphis virginiana y D. marsupialis, utilizando enzimas de restricción
Figura 2. Distribución geográfica de las especies de tlacuache Didelphis virginiana y D. marsupialis en México (modificada de Gardner, 1973).
Algunos trabajos han reportado que se puede diferenciar
externamente a D. marsupialis de D. virginiana por el
color de los cachetes, la distribución del pelo de guarda,
la longitud de la cola con respecto a la longitud de la
cabeza y el cuerpo y el porcentaje de color negro en
la cola (Allen, 1901; Davis, 1944; Gardner, 1973; Aranda,
2000). Sin embargo, la identificación de estas especies
basada en la morfología externa es muy incierta por-
que estos caracteres presentan una amplia variación
intraespecífica y geográfica, particularmente dentro del
área de simpatria (Emmons, 1990). Por ejemplo, Ruiz-
Piña y Cruz-Reyes (2002) no pudieron diferenciar en-
tre D. marsupialis y D. virginiana en Yucatán utili-
zando la coloración amarilla de los cachetes en D.
marsupialis y blanca en D. virginiana, porque varios
individuos presentaban estas coloraciones mezcladas.
Por otro lado, es muy importante poder distinguir es-
tas especies de tlacuache debido a que son conside-
radas en México como los reservorios silvestres más
importantes del protozoario Trypanosoma cruzi, agente
causal de la Enfermedad de Chagas (Huante-Magaña
et al., 1990), la cual es considerada un problema de salud
pública en nuestro país (CHAGMEX, 2010). Por lo tanto,
60 AÑOS DE LA C O L ECCIÓN N ACIONAL DE MAMÍFEROS
se necesitan métodos que ayuden a identificar de manera
rápida y sencilla estas dos especies de tlacuache.
Actualmente, una alternativa para distinguir especies es
el uso del análisis del polimorfismo de la longitud de frag-
mentos de restricción (siglas en inglés, RFLP) emplean-
do ADN mitocondrial, como el gen citocromo b (St-Pierre
et al., 2006; Parson et al., 2000) que tiene gran resolu-
ción para revelar diferencias en la secuencia de
nucleótidos en especies cercanas (Ortega, 2006), las
cuales pueden ser fácilmente detectadas con una o
varias enzimas de restricción (Rentería, 2006). Los
RFLP´s utilizan el producto amplificado de una PCR
(Reacción en Cadena de la Polimerasa) para cortar con
enzimas de restricción secuencias de ADN específicas
que están presentes en una especie y no en la otra,
produciendo fragmentos de diferente tamaño con lo que
se puede distinguir fácilmente entre especies (Rentería,
2006). Desafortunadamente, no existen trabajos que
muestren la aplicación de esta técnica para identificar
marsupiales. Sin embargo, si hay estudios donde se han
podido distinguir especies en otros grupos de mamíferos
como: cánidos (Krausman et al., 2006), felinos (Mills et al.,
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 Jésica Arcangeli y Fernando A. Cervantes
2000), mustélidos (Riddle et al., 2003), murciélagos (Machado
et al., 2005), lagomorfos (Litvaitis y Litvaitis, 1996) y roedo-
res (Kuehn et al., 2000; Fagundes y Nogueira, 2007); y
algunos invertebrados (España et al., 2008). Por lo tanto,
el objetivo de este trabajo fue distinguir exitosamente a
D. virginiana de D. marsupialis, utilizando RFLPs.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de muestras y extracción de ADN. Se ob-
tuvieron muestras de hígado de las especies de tlacuache
D. marsupialis y D. virginiana de ejemplares colecta-
dos en el campo (permiso de colector científico FAUT
– 0002 expedido por SEMARNAT) y a través de prés-
tamos de tejidos congelados con colecciones masto-
zoológicas (Apéndice 1).
El ADN se extrajo utilizando un kit comercial (DNeasy
Blood and Tissue Kit, Qiagen Inc.), siguiendo las ins-
trucciones del fabricante. La integridad del ADN ex-
traído se evaluó por medio de electroforesis en geles
del agarosa al 1 % teñidos con bromuro de etidio
(Sanbrook y Rusell, 2001) y su concentración se mi-
dió por espectrofotometría.
Amplificación de ADN. El gen citocromo b com-
pleto (1149 pb) se amplificó por medio de la PCR utili-
zando los iniciadores específicos MVZ05 5´-
CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG - 3’ y
MVZ14 5´- GGTCTTCATCTYHGGYTTACAAGAC - 3´
(Patton et al., 1996). Las concentraciones finales de los
reactivos en un volumen de reacción de 25 µl fueron:
Buffer 1 X, MgCl2 2.5 mM, Taq Polimerasa 1 unidad,
dNTPs 200 µM, cada primer 0.4 µM y ADN 100 ng.
Las condiciones óptimas de amplificación fueron
desnaturalización inicial a 94 ° C por 3 min, 27 ciclos
de 94 ° C por 1 min, 47 ° C por 45 seg, 72 ° C por 1
min, y una extensión final a 72 ° C por 5 min (modifi-
cado de Nunes et al., 2006). Los productos del PCR
fueron visualizados en geles de agarosa al 1.5 % teñi-
dos con bromuro de etidio.
Análisis de restricción. El ADN amplificado se purificó
con el QIAquick PCR purification kit (Qiagen Inc.) y fue
digerido con dos enzimas de restricción HaeIII y TaqI. La
digestión para cada enzima se realizó por separado en
un volumen de 20 µl de reacción con los siguientes
reactivos: 8 µl producto de la PCR, 2 µl del buffer
de la enzima de restricción, 0.2 µl de enzima y 9.8 µl
de H20. Para la digestión la reacción se incubó en baño
María a 37 ° C por una hora para la enzima HaeIII y a
65 ° C para la enzima TaqI. La inactivación de las dos
enzimas se hizo a 80 ° C por 20 minutos. El producto
254• 60 AÑOS DE LA C O L ECCIÓN N ACIONAL DE MAMÍFEROS DEL I NSTITU T O D E
de la digestión fué observado por electroforesis en geles
de agarosa al 1.5 % teñido con bromuro de etidio. Para
confirmar que los patrones de restricción obtenidos en este
análisis fueran los correctos, se compararon con lo predi-
chos por el software NEBcutter V2.0 (Vincze et al., 2003).
Para efectuar esto, a partir de los productos de la PCR
además se generaron secuencias que fueron cortadas vir-
tualmente en el software y cuyos fragmentos resultantes
fueron comparados con los obtenidos en los RFLP´s.
RESULTADOS
El análisis del polimorfismo de la longitud de fragmentos
de restricción se hizo utilizando un total de 41 indivi-
duos del género Didelphis que de acuerdo con crite-
rios morfológicos 16 correspondían a D. marsupialis
y 25 a D. virginiana. Las secuencias del gen citocromo
b obtenidas se depositaron en la base de datos Gen
Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) con los números
de acceso HM589699 y HM589700 para D. virginiana
y HM589701 y HM589702 para D. marsupialis.
De acuerdo con el software NEBcutter V2.0, la enzima
HaeIII debía reconocer la secuencia blanco GGCC y
cortarla simétricamente en las dos hebras de la cade-
na de ADN, entre la guanina y la citosina (GG CC),
mientras que la enzima TaqI debía reconocer la secuencia
TCGA y cortarla asimétricamente, en un hebra entre
la timina y la citosina y en la otra entre la guanina y la
adenina (T CG A). Por lo tanto, la enzima HaeIII
debía cortar la secuencia del gen citocromo b dos veces
en D. virginiana y tres en D. marsupialis, mientras
que la enzima TaqI debía reconocer su secuencia blanco
una vez en cada especie pero en diferentes sitios del
gen (Cuadro 1).
Cuadro 1. Predicción del patrón de digestión del gen citocromo b
con el software NEBcutter V2.0 en un gel de agarosa al 7 % utili-
zando las enzimas HaeIII y TaqI en los tlacuaches Didelphis
virginiana y D. marsupialis. La secuencia blanco de la enzima
HaeIII es GGCC mientras que la de la enzima TaqI es TCGA; pb =
pares de bases.
Enzima Tamaño del fragmento (pb)
Didelphis virginiana Didelphis marsupialis
HaeIII 629 (1 – 629) 629 (1 – 629)
423 (629 – 1052) 63 (630 – 692)
97 (1053 – 1149) 360 (693 – 1052)
97 (1053 – 1149)
TaqI 528 (1 – 528) 951 (1 – 951)
621 (529 – 1149) 198 (952 – 1149)
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Digestión con la enzima HaeIII. En Didelphis
virginiana, la enzima HaeIII produjo un solo patrón
de digestión para todas las muestras. Esta enzima re-
conoció la secuencia GGCC en dos sitios. De modo
que al cortar en dichos sitios produjo tres fragmentos
que en el gen del agarosa se visualizaron como un patrón
de tres bandas de diferente tamaño: 629, 423 y 97 pb.
En contraste, en D. marsupialis se obtuvieron dos
patrones, uno para las muestras de Tabasco y Campeche
(Apéndice 1), donde la enzima HaeIII produjo un
patrón de dos fragmentos (629 y 520 pb); y otro para
Veracruz y Chiapas de cuatro fragmentos (629, 360, 97
y 63 pb; Fig. 3A; Cuadro 2). En este último patrón, el
fragmento más pequeño no se observa en el gel, sin
embargo, la digestión de estas secuencias con el soft-
ware NEBcutter V2.0 confirma su existencia. Por otro
lado, la muestra de Catemaco presenta un fragmento
extra de 520 pb que no forma parte del patrón de di-
gestión de D. marsupialis de acuerdo con el análisis
de esta secuencia con el software. Todos los patro-
nes de digestión obtenidos con la enzima HaeIII fue-
ron verificados con sus secuencias correspondientes
(Apéndice 2). En total 35 de las 41 muestras analizadas
presentaron el patrón esperado, 29 el de D. virginiana
de tres fragmentos (629, 423 y 97 pb) y 6 el de
D. marsupialis con cuatro fragmentos (629, 360, 97 y
63 pb); 6 muestras de D. marsupialis presentaron un
patrón diferente al esperado con dos fragmentos (629
y 520 pb).
Digestión con la enzima TaqI. En Didelphis virginiana,
la enzima TaqI produjo dos patrones diferentes, uno
para la muestra de Oregon, E. U. A. donde la enzima
no reconoció la secuencia TCGA, por lo tanto el gen
citocromo b no es cortado y aparece completo (1149
pb); y otro para todas las muestras de México donde
la enzima reconoció una vez la secuencia blanco pro-
duciendo dos fragmentos (621 y 528 pb), mientras que
en D. marsupialis esta enzima produjo un solo patrón
en todas las muestras; el patrón de digestión fue de
dos fragmentos (951 y 198 pb; Fig.3B; Cuadro 2). To-
dos los patrones de restricción obtenidos resultado de
la digestión con la enzima TaqI fueron verificados con
sus secuencias correspondientes (Apéndice 2). En total,
40 de las 41 muestras analizadas presentaron el patrón
de digestión predicho por el software NEBcutter (Vincze
et al., 2003), 28 el patrón de D. virginiana de dos frag-
mentos (621 y 528 pb) y 12 el patrón de D. marsupialis
con dos fragmentos (951 y 198 pb); sólo la muestra de
Oregon presentó un patrón diferente al esperado con
el gen completo (1149 pb).
Entre las muestras que presentaron los patrones de
digestión de D. virginiana, tanto con la enzima HaeIII
como con la TaqI, se encuentran las dos muestras de
Montecillo Santa Cruz en Oaxaca (ECO-SC-M 1847 y
1862; Apéndice 1), una muestra de Constitución en
Campeche (ASNHC Tejido 2589) y la muestra de Mérida
en Yucatán (FMVZ-UADY, sin número) que habían sido

Figura 3. Gel de agarosa al 1.5 % teñido con bromuro de etidio que muestra la digestión del gen citocromo b. A) Digestión con la enzima
HaeIII en ejemplares de Didelphis virginiana: Tlacotalpan (carril 1) y Constitución (carril 2) que muestran tres bandas (628, 423 y 98 pb);
y de D. marsupialis: Peñuela (carril 3), Huitepec (carril 4) y Catemaco (carril 6) con cuatro bandas (629, 360, 97 y 63 pb) y Constitución
(carril 5) con dos bandas (629, 520 pb). En los carriles 3, 4 y 6 la banda más pequeña no se observa en el gel y Catemaco muestra una banda
extra que no forma parte del patrón de digestión de la especie. M = Marcador de ADN de referencia de tamaño en incrementos de 100 pb;
pb = pares de bases. B) Digestión con la enzima TaqI en ejemplares de Didelphis virginiana: Oregon (carril 1) gen completo sin digerir,
Tlacotalpan (carril 4), REPSA (carril 5) y Constitución (carril 6) con dos fragmentos (621 y 528 pb) y de D. marsupialis: Peñuela (carril
2) y Escárcega (carril 3) con dos bandas (951 y 198 pb). M = Marcador de ADN de referencia de tamaño en incrementos de 100 pb; pb = pares
de bases.

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 Jésica Arcangeli y Fernando A. Cervantes

Cuadro 2. Sitios de colecta (ver Apéndice I) y patrones de digestión parecidos entre ellas (St-Pierre et al., 2006). Este es el
(tamaño de los fragmentos) de 41 muestras del género Didelphis. caso de las dos especies de tlacuache del género
Localidad No. Patrón de Patrón de Didelphis que se distribuyen en México, Didelphis
ejemplares digestión digestión virginiana y D. marsupialis. Ambas son especies
HaeIII TaqI morfológicamente muy similares (Gardner, 1973) y se
distribuyen simpátricamente en Tamaulipas, Veracruz,
Didelphis virginiana Tabasco, Campeche, Oaxaca, Chiapas, Yucatán y Quin-
Oregon 1 629, 423, 97 1149 tana Roo (Colchero et al., 2005; Zarza y Medellín, 2005).
Está situación ocasiona imprecisiones en la identifi-
Escuinapa 3
cación a nivel específico debido a que la amplia varia-
REPSA 5
Tlalpan 1
ción morfológica intraespecífica dificulta distinguir con
Izta-Popo 1 certeza a las dos especies de tlacuache.
Omiltemi 1
Yetla 1
Aunque Gardner (1973) examinó los caracteres
Mixtepec 2 morfológicos de estas dos especies de tlacuache y
629, 423, 97 621, 528 aportó información valiosa para distinguirlas, no fue
Cosoltepec 1
Montecillo Santa Cruz 2 suficiente debido a la gran variación que existe en los
Monterrey 1 caracteres que él uso. De hecho, Ruiz-Piña y Cruz-Reyes
Constitución 3 (2002) después de examinar un gran número de ejem-
Mérida 1 plares afirman que no hay caracteres morfológicos
Cozumel 1 externos que las distingan. Sin embargo, en este estu-
Tlacotalpan 5 dio se logró diferenciarlas con certeza utilizando RFLP´s.
Didelphis marsupialis
Las dos enzimas, HaeIII y TaqI, fueron consideradas
Huitepec 1 informativas ya que produjeron patrones de digestión
Tuxtlas 3 629, 360, 97, 63 951, 198 distintos para cada especie, con lo que se pudo dis-
Peñuela 1
tinguir molecularmente las muestras de D. virginiana
Catemaco 1
de las D. marsupialis. Ambas enzimas produjeron más
Ruinas Acalan 1 de un patrón de digestión por especie (polimorfismos).
Candelaria 2 En las muestras de D. virginiana la enzima HaeIII pro-
629, 520 951, 198 dujo un patrón para todas las muestras (629, 423, 97
Escárcega 2
Constitución 1 pb); mientras que en las muestras de D. marsupialis
produjo dos patrones, uno para las muestras de
Total 41 Catemaco, Peñuela, Tuxtlas y Huitepec (629, 360, 97,
63 pb) y otro para las muestras de Ruinas Acalán,
Candelaria, Escárcega y Constitución (629, 520 pb).
identificadas morfológicamente como D. marsupialis Asimismo, la enzima TaqI produjo dos patrones de
en esas colecciones mastozoológicas. digestión en las muestras de D. virginiana, uno para
la muestra Oregon (1149 pb), y otro para todas las
muestras de México (621, 528 pb); mientras que en
D. marsupialis todas las muestras presentaron el
DISCUSIÓN mismo patrón (951, 198 pb).

La mayor parte de las especies reconocidas actualmente La presencia de varios patrones de digestión en
fueron delimitadas utilizando uno o más caracteres D. virginiana y D. maruspialis se puede explicar como
morfológicos, cualitativos o cuantitativos, que no com- el resultado de la alta tasa de mutación que tiene el
parten con otras especies, asumiendo que esto es ADN mitocondrial (Nabholz et al., 2009). Por lo tanto,
consecuencia de que no existe flujo genético entre éstas estos patrones son el reflejo de la variabilidad
(Wiens, 2007). Sin embargo, la delimitación de espe- intraespecífica presente en las secuencias de gen
cies basada en características morfológicas puede citocromo b de estas dos especies de tlacuache.
ser muy subjetiva ya que existen muchas especies Algunas especies donde se han reportado más de un
similares en tamaño y forma que se distribuyen patrón de digestión son los roedores Akodon cursor
simpátricamente, en donde las características “exclu- y A. montensis en los que se documentaron 16 y 11
sivas” son muy difíciles de distinguir debido a que los patrones diferentes respectivamente (Fagundes y
caracteres pueden estarse sobrelapando o ser muy Nogueira, 2007). Otro ejemplo, es el murciélago

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Platyrrhinus lineatus en el que se encontraron dos
patrones distintos (Machado et al., 2005). Por otra parte,
el hecho de que los patrones de digestión encontra-
dos para D. marsupialis sean diferentes a los de
D. virginiana indica que estas dos especies han
divergido genéticamente aunque el tiempo desde
su especiación no ha sido suficiente para permitir la
acumulación de diferencias notables en su morfología
(Fagundes y Nogueira, 2007).
En este grupo de secuencias la enzima HaeIII recono-
ce dos veces la secuencia blanco en D. virginiana,
mientras que en D. marsupialis lo hace de una a tres
veces. Una ventaja de que existan varios sitios de res-
tricción en estas secuencias es que se reduce la pro-
babilidad de cometer errores en la identificación (Riddle
et al., 2003). Asimismo, el hecho de que compartan un
sitio de corte en la posición 629 puede estar reflejan-
do que existe una gran similitud en las secuencias del
gen citocromo b de estos tlacuaches, lo que implica
que la especiación de estas dos especies es relativa-
mente reciente (Machado et al., 2005). Por otra parte,
D. marsupialis tiene un número mayor de sitios de
restricción que D. virginiana, lo que puede represen-
tar la perdida de un sitio de restricción en
D. virginiana o la ganancia de un nuevo sitio de
restricción para D. marsupialis. Kuehn et al. (2000)
describen un caso similar entre Castor fiber y
C. canadensis donde la substitución de nucleótidos
en dos posiciones originó el reconocimiento de la enzima
RsaI en C. fiber.
La mayoría de las muestras analizadas presentaron el
patrón de digestión que predijo el software NEB cutter
V2.0 (Vincze et al., 2003) para cada especie. En el aná-
lisis con la enzima HaeIII, el 100 % de las muestras de
D. virginiana presentaron el patrón de digestión
esperado para esta especie, mientras que en
D. marsupialis fue el 41.7 %. Asimismo, con la enzima
TaqI en el 96.5% de las muestras de D. virginiana
se obtuvieron los fragmentos esperados para esta
especie, mientras que en D. marsupialis se obtuvo en
el 100 % de las muestras.
Se encontraron cuatro individuos que habían sido iden-
tificados como D. marsupialis, pero en todas las
digestiones se obtuvo el patrón de digestión de
D. virginiana. Estas muestras se obtuvieron de otras
colecciones mastozoológicas donde fueron identifica-
das utilizando los criterios morfológicos, externos y
craneales, que Gardner (1973) propuso para diferenciar
estas especies de tlacuache. Similarmente, Machado
et al. (2005) al trabajar con murciélagos del género
Platyrrhinus encontraron dos individuos que habían
sido identificados originalmente como Platyrrhinus
60 AÑOS DE LA C O L ECCIÓN N ACIONAL DE MAMÍFEROS
lineatus utilizando la clave de Vizotto y Taddei (1973)
basada en el tamaño de los murciélagos, tras el análi-
sis con tres enzimas obtuvieron los patrones de digestión
de P. recifinus. Otro ejemplo lo documentan St-Pierre
et al. (2006) con mustélidos, donde evaluaron los
caracteres propuestos por Hall (1951) para distinguir
individuos de Mustela frenata de M. erminea. La
morfología y el análisis de polimorfismo de fragmen-
tos de restricción mostraron que los caracteres
morfológicos fallaban en distinguir seis ejemplares de
M. erminea como M. frenata, mientras todos los
ejemplares fueron identificados correctamente con los
RFLP´s.
Por otra parte, esta técnica logró discriminar efectiva-
mente a individuos de D. virginiana y D. marsupialis
colectados en la misma localidad, Constitución en
Campeche. En este lugar, el patrón de digestión de D.
virginia fue de tres fragmentos (629, 423, 97 pb); mientras
que en D. marsupialis fue de dos fragmentos (629, 520
pb). Similarmente, Paxinos et al. (1997) lograron dis-
tinguir las zorritas Vulpes macrotis y Vulpes vulpes en
dos localidades de California al obtener patrones de
restricción completamente diferentes en cada especie.
CONCLUSIONES
Estos resultados apoyan la idea de que el análisis de
restricción puede resolver las limitaciones que existen
en la identificación morfológica, permitiendo eliminar
la subjetividad asociada a las claves de identificación
dicotómica. Por otro lado, la técnica de RFLP´s es
relativamente sencilla, rápida y no requiere de gran-
des cantidades de tejido. Además se pueden usar
métodos no invasivos, como muestras de pelo o
excremento para obtener el ADN del animal de interés.
Es importante señalar que los métodos moleculares no
reemplazan a los métodos de identificación tradicionales
basados en la morfología, sino que son herramientas
que complementan la información obtenida por otros
métodos. Particularmente, el análisis del polimorfismo
de la longitud de fragmentos de restricción es una
herramienta concluyente para distinguir especies
simpátricas y morfológicamente muy similares como son
los tlacuaches D. virginiana y D. marsupialis.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a toda la gente que ayudó a la colecta
de muestras en el campo, la curación, catalogación e
incorporación de ejemplares a la CNMA, particularmente
DEL I NSTITU T O D E B I O L O G Í A , UNAM. A PORTACIONES AL C O N OCIMIENTO Y C O N S E R V A C I Ó N D E LOS M AMÍFEROS MEXICANOS •257
 Jésica Arcangeli y Fernando A. Cervantes

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 Identificación molecular de dos especies de tlacuache: Didelphis virginiana y D. marsupialis, utilizando enzimas de restricción

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 Jésica Arcangeli y Fernando A. Cervantes

Apéndice 1. Procedencia de las muestras de hígado y su ejemplar de referencia utilizados en este estudio. CNMA = Colección Nacional
de Mamíferos; FAC = número de catálogo personal de Fernando A. Cervantes; ECO-SC-M = Colección Mastozoológica de El Colegio de la
Frontera Sur, Unidad San Cristóbal de las Casas, Chiapas; FMVZ-UADY = Colección Mastozoologica de la Universidad Autónoma de
Yucatán; ASNHC = Angelo State University Natural History Collections, Texas. * Ejemplares colectados en este estudio.

Localidad de colecta Número de ejemplares Colección Biológica y número de catálogo

Didelphis virginiana
Curry County, Oregon, U. S. A 1 ASNHC Tejido 6475
Escuinapa, Sinaloa, Mexico 3* CNMA 45120, 43121, 45122
Tlacotalpan, Veracruz, Mexico 5* CNMA 45123, 45124, 45125, 45126, 45127
Reserva Ecológica del Pedregal de San Ángel,
Distrito Federal, México 5* CNMA 45114, 45115, 45116
Tlalpan, Distrito Federal, México 1 CNMA FAC1929
Yetla, Guerrero, México 1* CNMA 45117
Omiltemi, Guerrero, México 1 CNMA FAC2003
Montecillo, Oaxaca, México 2 ECO-SC-M 1862, 1867
Mixtepec, Oaxaca, México 2 CNMA 44179, 44180
Cosoltepec, Oaxaca, México 1 CNMA 45141
Izta – Popo, México, México 1* CNMA 45119
Monterrey, Nuevo León, México 1* CNMA FAC3836
Constitución, Campeche, México 3 ASNHC 6421, 6433, Tejido 2589
Mérida, Yucatán, México 1 FMVZ-UADY docencia
Isla Cozumel, Quintana Roo, México 1 ASNHC 1282

Didelphis marsupialis
Tuxtlas, Veracruz, México 3* CNMA 45109, 45110, 45111
Peñuela, Veracruz, México 1* CNMA 45112
Catemaco, Veracruz, México 1 CNMA 43475
Huitepec, Chiapas, México 1 ECO-SC-M 744
Ruinas Acalán, Tabasco, México 1 ASNHC 1280
Candelaria, Campeche, México 2 ASNHC 1276, 6410
Constitución, Campeche, México 1 ASNHC 6413
Escárcega, Campeche, México 2 ASNHC 1281, 6416

260• 60 AÑOS DE LA C O L ECCIÓN N ACIONAL DE MAMÍFEROS DEL I NSTITU T O D E B I O L O G Í A , UNAM. A PORTACIONES AL C O N OCIMIENTO Y C O N S E R V A C I Ó N D E LOS MAMÍFEROS MEXICANOS
 Identificación molecular de dos especies de tlacuache: Didelphis virginiana y D. marsupialis, utilizando enzimas de restricción

Apéndice 2. Secuencias del gen citocromo b de los tlacuaches Didelphis virginiana (CNMA 45119, ASNHC 6475) y D. marsupialis (CNMA
45109, ASNHC 1280). Los sitios de corte encontrados en el análisis de restricción para las enzimas HaeIII (GG CC) y TaqI (T CG A) se
muestran sombreados.

10 20 30 40 50 60
CNMA 45119 ATGACCAATA TTCGCAAAAC ACATCCACTC ATAAAAATCA TTAATGATTC ATTCATTGAT
ASNHC 6475 ATGACCAATA TTCGCAAAAC ACATCCACTC ATAAAAATCA TTAATGATTC ATTCATTGAC
CNMA 45109 ATGACCAATA TTCGCAAAAC ACATCCACTC ATAAAAATTA TCAATGATTC ATTCATTGAC
ASNHC 1280 ATGACCAATA TTCGCAAAAC ACATCCACTC ATAAAAATTA TCAATGACTC ATTCATTGAC
70 80 90 100 110 120
CNMA 45119 CTACCAACAC CATCTAACAT CTCAGCTTGA TGGAATTTTG GTTCACTATT AGGAGTGTGC
ASNHC 6475 CTACCAACAC CATCTAACAT CTCAGCCTGA TGGAATTTTG GTTCACTATT AGGAGTGTGC
CNMA 45109 CTGCCAACAC CCTCCAACAT CTCAGCTTGA TGAAATTTCG GTTCACTATT AGGAATATGC
ASNHC 1280 CTACCAACAC CATCCAACAT CTCAGCTTGA TGGAATTTCG GTTCACTATT AGGAATATGC
130 140 150 160 170 180
CNMA 45119 CTAATTATTC AAATCCTTAC AGGCTTATTC TTAGCAATAC ATTACACATC TGACACATCA
ASNHC 6475 CTAATTATTC AAATCCTCAC AGGCTTATTC TTAGCAATAC ATTATACATC TGATACATTA
CNMA 45109 CTAATTATCC AAATCCTAAC AGGCTTATTC TTAGCAATAC ATTATACATC AGACACACTA
ASNHC 1280 CTAATTATCC AAATCCTAAC AGGCTTATTC TTAGCAATAC ATTATACATC AGATACACTA
190 200 210 220 230 240
CNMA 45119 ACCGCATTTT CATCAGTAGC CCATATTTGC CGAGACGTAA ATTACGGATG ACTTATCCGA
ASNHC 6475 ACCGCATTTT CATCAGTAGC CCATATTTGC CGAGACGTAA ACTACGGATG ACTTATCCGA
CNMA 45109 ACCGCATTCT CATCAGTAGC CCATATTTGC CGAGATGTAA ACTACGGATG ACTTATCCGA
ASNHC 1280 ACCGCATTCT CATCAGTAGC CCATATTTGC CGAGATGTAA ACTACGGATG ACTTATCCGA
250 260 270 280 290 300
CNMA 45119 AATATCCACG CCAACGGAGC ATCTATATTC TTTATATGCC TCTTCCTTCA TGTAGGACGA
ASNHC 6475 AATATCCATG CCAACGGAGC ATCTATATTC TTTATATGCC TTTTCCTTCA TGTAGGACGA
CNMA 45109 AACATCCATG CTAACGGAGC ATCTATATTC TTTATATGCC TTTTCCTCCA TGTAGGACGA
ASNHC 1280 AACATCCATG CCAACGGAGC ATCTATATTC TTTATATGCC TTTTTCTCCA TGTAGGACGA
310 320 330 340 350 360
CNMA 45119 GGAATCTATT ACGGATCATA CCTTTACAAA GAAACATGAA ATATTGGAGT TATCCTACTA
ASNHC 6475 GGAATTTACT ATGGATCATA TCTTTACAAA GAAACATGAA ATATTGGAGT TATCCTACTA
CNMA 45109 GGAATCTACT ACGGATCATA TCTTTACAAA GAAACATGAA ACATTGGAGT TATTCTACTA
ASNHC 1280 GGAATCTACT ACGGATCATA TCTTTACAAA GAAACATGAA ACATTGGAGT TATTCTTCTA
370 380 390 400 410 420
CNMA 45119 TTAACAGTTA TAGCTACTGC ATTCGTTGGC TACGTTCTAC ATGAGGACA AATATCATTT
ASNHC 6475 CTAACAGTTA TAGCTACTGC ATTCGTTGGC TACGTACTAC CATGAGGACA AATATCATTT
CNMA 45109 TTAACAGTTA TAGCCACTGC ATTCGTAGGA TACGTACTAC CTTGAGGACA AATATCATTT
ASNHC 1280 TTAACAGTTA TAGCCACTGC ATTCGTGGGC TACGTACTAC CTTGAGGACA AATATCCTTC
430 440 450 460 470 480
CNMA 45119 TGAGGCGCAA CGGTTATTAC TAACTTATTA TCTGCCATCC CATATATCGG AAGTACACTA
ASNHC 6475 TGAGGCGCAA CAGTTATTAC TAACCTATTA TCTGCCATCC CATATATCGG AAGTACACTA
CNMA 45109 TGAGGCGCAA CAGTTATTAC TAATCTATTA TCCGCTATCC CCTATATCGG AAATACATTA
ASNHC 1280 TGAGGGGCAA CAGTTATTAC TAATCTATTA TCCGCTATCC CCTATATCGG AAATATATTA
490 500 510 520 530 540
CNMA 45119 GTAGAATGAA TTTGAGGAGG ATTCTCCGTT GATAAAGCTA CACTAACTCG ATTTTTTGCT
ASNHC 6475 GTAGAATGAA TTTGAGGAGG ATTCTCCGTT GATAAAGCTA CACTAACCCG ATTTTTTGCT
CNMA 45109 GTAGAGTGAA TTTGAGGAGG ATTCTCCGTT GACAAAGCCA CCCTAACCCG ATTTTTCGCA
ASNHC 1280 GTAGAGTGAA TTTGAGGAGG ATTCTCCGTT GACAAAGCCA CCCTAACCCG ATTTTTCGCA
550 560 570 580 590 600
CNMA 45119 TTTCACTTTA TTCTTCCATT CATCATTTTA GCTATAGTAG TAGTACATCT CCTATTTCTT
ASNHC 6475 TTTCACTTTA TTCTTCCATT CATCATTTTA GCTATAGTAG TAGTACATCT TCTATTTCTT
CNMA 45109 TTCCACTTTA TTCTTCCATT TATTATTCTA GCTATAGTAC TAGTACATCT TCTATTCCTA
ASNHC 1280 TTCCACTTTA TTCTTCCATT TATTATTCTA GCTATAGTAC TAGTACATCT TCTATTCCTC

60 AÑOS DE LA C O L ECCIÓN N ACIONAL DE MAMÍFEROS DEL I NSTITU T O D E B I O L O G Í A , UNAM. A PORTACIONES AL C O N OCIMIENTO Y C O N S E R V A C I Ó N D E LOS M AMÍFEROS MEXICANOS •261
 Jésica Arcangeli y Fernando A. Cervantes

610 620 630 640 650 660

CNMA 45119 CACGAAACAG GATCAAGCAA TCCAACAGGC CTAGATCCCA ACTCAGATAA AATTCCATTC
ASNHC 6475 CACGAAACAG GATCAAGCAA TCCAACAGGC CTAGATCCAA ACTCAGATAA AATTCCATTC
CNMA 45109 CACGAAACTG GATCAAACAA TCCAACAGGC CTAGATCCCA ACTCAGATAA AATCCCATTT
ASNHC 1280 CACGAAACTG GATCAAACAA TCCAACAGG? CTAGATCCCA ACTCAGATAA AATCCCATTT
670 680 690 700 710 720
CNMA 45119 CACCCATACT ATACCATAAA AGATATCCTA GGCTTATTTC TAATAATTAT TATTCTTCTA
ASNHC 6475 CACCCCTACT ATACCATAAA AGATATCCTA GGCTTATTCC TAATAATTAT TATTCTTCTA
CNMA 45109 CATCCCTACT ATACTATCAA AGATATCCTA GGCCTATTCC TAATGATTAT TATCCTATTA
ASNHC 1280 CATCCCTACT ATACTATCAA AGATATCCTA GGCTTATTCC TAATGATTAT TATCCTATTA
730 740 750 760 770 780
CNMA 45119 TCACTAGCAA TATTCTCACC AGATCTTTTA GGAGACCCAG ACAACTTCAC CCCAGCTAAT
ASNHC 6475 TCACTAGCAA TATTCTCACC AGATCTTTTA GGAGACCCTG ACAACTTCAC CCCAGCTAAT
CNMA 45109 TCATTAGCAA TACTCTCACC AGACCTTTTA GGAGACCCAG ACAACTTTAC CCCCGCTAAT
ASNHC 1280 TCATTAGCAA TATTCTCACC AGACCTTTTA GGAGACCCAG ACAACTTTAC CCCCGCTAAT
790 800 810 820 830 840
CNMA 45119 CCCCTCAACA CCCCACCTCA TATTAAGCCA GAATGGTACT TTCTATTTGC CTATGCTATC
ASNHC 6475 CCCCTTAACA CCCCGCCTCA TATCAAGCCA GAATGGTACT TTCTATTTGC CTATGCTATC
CNMA 45109 CCCCTTAACA CCCCACCTCA TATCAAGCCA GAATGGTATT TTCTATTTGC TTATGCCATC
ASNHC 1280 CCCCTCAATA CCCCACCTCA TATCAAGCCA GAATGGTATT TTCTATTTGC CTATGCCATC
850 860 870 880 890 900
CNMA 45119 CTACGATCAA TCCCAAACAA ACTAGGAGGA GTTTTAGCCC TATTAGCATC CTCCTAATTA
ASNHC 6475 TTACGATCAA TCCCAAACAA ACTAGGAGGA GTTTTAGCCC TATTAGCATC CATTTTAGTA
CNMA 45109 CTACGATCAA TTCCAAACAA ACTAGGAGGA GTTTTAGCCC TATTAGCATC CATTTTAATT
ASNHC 1280 CTACGATCAA TTCCAAACAA ATTAGGAGGA GTTTTAGCCC TATTAGCATC CATTTTAATT
910 920 930 940 950 960
CNMA 45119 CATTTTAGTA TCCCTATATT ACATACATCA ACCCAACGAA GCATGGCATT CCGACCCATC
ASNHC 6475 CTCCTAATTA TCCCTATATT ACATACATCA ACCCAACGAA GCATGGCATT CCGACCCATC
CNMA 45109 CTCCTTATCA TACCGCTACT ACACACATCA ACCCAACGAA GCATGATATT TCGACCTATC
ASNHC 1280 CTCCTCATTA TACCTTTATT ACACACATCA ACCCAACGAA GTATAATATT TCGACCTATC
970 980 990 1000 1010 1020
CNMA 45119 TCACAAACAC TATTCTGAAT ATTAACAGCT AACCTAATTA TCCTTACCTG AATTGGAGGA
ASNHC 6475 TCACAAACTC TATTCTGAAT ATTAACAGCT AACCTAATTA TCCTGACCTG AATCGGAGGA
CNMA 45109 TCACAAACAC TATTCTGAAT ACTAACAGCC AATCTGATCA TTCTTACCTG AATCGGAGGG
ASNHC 1280 TCACAAACAC TATTCTGAAT ACTAACCGCC AATCTGATCA TCCTTACCTG AATCGGGGGG
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CNMA 45119 CAACCAGTAG AACAACCCTA TATCACCATT GGCCAATGAG CCTCCATTTC CTACTTTACT
ASNHC 6475 CAACCAGTAG AACAACCCTA TATTACCATT GGCCAATGAG CCTCCATTTC CTACTTTACT
CNMA 45109 CAACCAGTAG AGCAACCTTA TATTTCCATT GGCCAATGAG CCTCCATCTC CTACTTTACC
ASNHC 1280 CAACCAGTAG AGCAACCTTA CATCTCCATT GGCCAATGAG CCTCCATCTC CTACTTTACC
1090 1100 1110 1120 1130 1140
CNMA 45119 ATTATTATCA TCCTCATACC TCTAGCAGGA ATACTAGAAA ACCATATACT AAAACCAAAA
ASNHC 6475 ATTATCATCA TCCTTATACC TCTAGCAGGA ATACTAGAAA ACTATATACT AAAACCAAAA
CNMA 45109 ATTATTATTA TTCTTATACC CCTAGCAGGA GCACTAGAAA ACTACATATT AAAACCAAAA
ASNHC 1280 ATTATTATTA TTCTTATACC CCTAGCAGGA ACACTAGAAA ACTACATATT AAAACCAAAA
1150
CNMA 45119 TTTCCATAA
ASNHC 6475 TTTCCATAA
CNMA 45109 TTCCCATAA
ASNHC 1280 TTCCCATAA

262• 60 AÑOS DE LA C O L ECCIÓN N ACIONAL DE MAMÍFEROS DEL I NSTITU T O D E B I O L O G Í A , UNAM. A PORTACIONES AL C O N OCIMIENTO Y C O N S E R V A C I Ó N D E LOS MAMÍFEROS MEXICANOS