Food - Wastes Book

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Desechos de alimentos
Materia prima para valor agregado
productos
Editado por
mamá diomi
Edición Impresa del Número Especial Publicado en Fermentación
www.mdpi.com/journal/fermentación
Materia prima para productos de valor agregado
Redactor de números especiales
mamá diomi
MDPI • Basilea • Beijing • Wuhan • Barcelona • Belgrado • Manchester • Tokio • Cluj • Tianjin
Redactor de números especiales
mamá diomi
Universidad Técnica Nacional de Atenas
Grecia
Oficina editorial
MDPI
St. AlbanAnlage 66
4052 Basilea, Suiza
Esta es una reimpresión de artículos del número especial publicado en línea en la revista de acceso abierto Fermentation
(ISSN 23115637) (disponible en: https://www.mdpi.com/journal/fermentation/special issues/ferment food wastes).
Para fines de citación, cite cada artículo de forma independiente como se indica en la página del artículo en línea y como
indicada a continuación:
Apellido, AA; Apellido, BB; Apellido, CC Título del artículo. Nombre de la revista Año, Número de artículo,
Rango de páginas.
ISBN 9783039364190 (Hbk)
ISBN 9783039364206 (PDF)
c 2020 por los autores. Los artículos de este libro son de acceso abierto y se distribuyen bajo la licencia
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El libro en su totalidad es distribuido por MDPI bajo los términos y condiciones de Creative Commons.
licencia CC BYNCND.
Contenido
Acerca del Editor de Números Especiales ....................................... viii
mamá diomi
Desechos de alimentos: Materia prima para productos de
valor agregado Reimpreso de: Fermentation 2020, 6, 47, doi:10.3390/fermentation6020047 ............. 1
Daniel Bustamante, Marta Tortajada, Daniel Ramón y Antonia Rojas
Producción de Ácido DLáctico por Fermentación de Residuos de Cáscara de Naranja Hidrolizados por Láctico
bacterias ácidas
Reimpreso de: Fermentation 2020, 6, 1, doi:10.3390/fermentation6010001 ............. 5
Hisao Tomita y Yutaka Tamaru El
biometano de segunda generación de la cáscara de naranja mandarina bajo cocultivo con metanógenos y
Clostridium cellulovorans armado Reimpreso de: Fermentation
2019, 5, 95, doi:10.3390/fermentation5040095 ............ . 17
Nathan D. Schwalm III, Wais Mojadedi, Elliot S. Gerlach, Marcus Benyamin, Matthew A.
Perisin y Katherine L. Akingbade
desarrollan un consorcio microbiano para mejorar la producción de metabolitos a partir de desechos de
alimentos simulados
George Prasoulas, Aggelos Gentikis, Aikaterini Konti, Styliani Kalantzi, Dimitris Kekos y
mamá diomi
Producción de bioetanol a partir de desechos de alimentos aplicando el sistema multienzimático producido
in situ por Fusarium oxysporum F3 y cultivos microbianos mixtos
Vinicio CarriónPaladines, Andreas Fries, Rosa Elena Caballero, Pablo P´erez Dani ̈els y
Roberto GarcíaRuiz
Biodegradación de residuos de la extracción de aceite esencial de Palo Santo (Bursera graveolens) y su
potencial para la producción de enzimas utilizando hongos Xylaria nativos del sur de Ecuador
Reimpreso de: Fermentation 2019, 5, 76 , doi:10.3390/fermentation5030076 ........ ..... 61
Friedrich Felix Jacob, Lisa Striegel, Michael Rychlik, Mathias Hutzler y FrankJ ̈urgen
methner
Levadura gastada de los procesos de elaboración de cerveza: un material de partida biodiverso para la
producción de extracto de levadura
Zehra Gulsunoglu, Smitha Aravind, Yuchen Bai, Lipu Wang, H. Randy Kutcher y Takuji Tanaka
Acumulación de deoxinivalenol (DON) y recuperación de nutrientes en larvas de mosca soldado negra
(Hermetia illucens) alimentadas con trigo infectado con Fusarium spp.
vassileios varelas
Los desperdicios de alimentos como una nueva fuente potencial para la producción masiva de insectos comestibles para alimentos y piensos:
Una revisión
v
Acerca del editor de ediciones especiales
Diomi Mamma, Ph.D., es profesora asistente de ingeniería de bioprocesos en la Escuela de
Ingeniería Química de la Universidad Técnica Nacional de Atenas, Grecia. Estudió Ingeniería Química
en la Escuela de Ingeniería Química de la Universidad Técnica Nacional de Atenas, donde obtuvo su
Ph.D. (2002). Imparte asignaturas relacionadas con la ingeniería de bioprocesos. Sus intereses de
investigación se centran en la producción microbiana y caracterización de enzimas, bioconversión de
biomasa a etanol aplicando diferentes estrategias de fermentación y biotecnología ambiental, con
énfasis en el diseño de procesos biológicos apropiados para la eliminación completa de xenobióticos.
viii
fermentación
Editorial
Desechos de alimentos: materia prima para productos de valor agregado
mamá diomi
Laboratorio de Biotecnología, Escuela de Ingeniería Química, Universidad Técnica Nacional de Atenas Campus Zografou,
15780 Atenas, Grecia; dmamma@chemeng.ntua.gr
Recibido: 22 de abril de 2020; Aceptado: 24 de abril de 2020; Publicado: 27 abril 2020
Los alimentos son un bien preciado y su producción puede requerir muchos recursos. Según la Organización de las
Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, se pierden casi 1300 millones de toneladas de productos alimenticios
por año a lo largo de la cadena de suministro de alimentos, y se prevé que en los próximos 25 años la cantidad de alimentos
desperdiciados aumente exponencialmente. El desperdicio de alimentos se produce en cualquier etapa de la cadena de
suministro, que se extiende desde el sitio agrícola hasta la planta de procesamiento y, finalmente, el mercado minorista. La
gestión del desperdicio de alimentos debe seguir ciertas políticas basadas en el concepto de las 3R, es decir, reducir, reutilizar
y reciclar [1]. Generalmente, los residuos de alimentos están compuestos por una mezcla heterogénea formada por
carbohidratos (almidón, celulosa, hemicelulosa o lignina), proteínas, lípidos, ácidos orgánicos y partes inorgánicas más
pequeñas. Actualmente, la mayoría de los desechos de alimentos se reciclan, principalmente como alimento para animales y
compost. Las cantidades restantes se incineran y se desechan en vertederos, lo que provoca graves emisiones de metano
(CH4), que es 23 veces más potente que el dióxido de carbono (CO2) como gas de efecto invernadero y contribuye significativamente al cambio clim
La valorización de los componentes de los residuos de alimentos podría, de hecho, generar numerosas posibilidades para la producción
de productos químicos, combustibles y productos valiosos [1].
El presente número especial recopila un amplio espectro de aspectos de la investigación y la tecnología en el
área de la “explotación de los desechos alimentarios”, y destaca las principales líneas de investigación actuales en
el campo para la producción de productos de valor agregado como ácido poliláctico, hidrógeno, etanol, enzimas e
insectos comestibles.
El ácido poliláctico (PLA) es un polímero biodegradable con gran potencial para reemplazar a los polímeros
petroquímicos. Las propiedades morfológicas, mecánicas y térmicas del polímero están determinadas por la presencia de
diferentes cantidades de monómeros u oligómeros de ácido l y dláctico [3]. La producción microbiana de ácido láctico
ópticamente puro se ha estudiado ampliamente porque el ácido láctico sintetizado químicamente es una mezcla racémica.
Optimizar las condiciones de cultivo y seleccionar las cepas de LAB capaces de producir ácido dláctico con alto rendimiento
y pureza óptica a partir de desechos de cáscara de naranja como materia prima puede contribuir al desarrollo de refinerías de
biorresiduos. Bustamante et al. [4] evaluaron seis cepas de la especie Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus para la
producción de ácido dláctico a partir de hidrolizado de residuos de piel de naranja. L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5037
tuvo el mejor rendimiento, con un rendimiento del 84 % p/p para la producción de DLA y hasta un 95 % de exceso
enantiomérico (pureza óptica).
La biometanización (fermentación de metano) es un proceso biológico complejo, que se puede dividir en cuatro fases
de degradación y conversión de biomasa, a saber, hidrólisis, acidogénesis, acetogénesis y metanización. Las fases individuales
son realizadas por diferentes grupos de microorganismos (bacterias), que en parte se encuentran en interrelación sintrófica y
plantean diferentes requisitos en el medio ambiente. Los compuestos no disueltos como la celulosa, las proteínas y las grasas
se hidrolizan en monómeros mediante enzimas producidas por bacterias anaeróbicas facultativas y obligatorias [5]. El uso de
un consorcio microbiano que consiste en la flora microbiana de la producción de metano y microorganismos que pueden
degradar la biomasa celulósica como Clostridium cellulovorans demostró ser eficiente en la cáscara de mandarina degradada
sin ningún tratamiento previo y produjo metano que representó el 66,2% del gas total producido [6 ].
Fermentación 2020, 6, 47; doi:10.3390/fermentación6020047 1 www.mdpi.com/journal/fermentación
Fermentación 2020, 6, 47
El hidrógeno es un combustible no carbonoso y portador de energía que posee un valor calorífico neto más
alto en comparación con otros combustibles (120 MJ/kg frente a 46,7 MJ/kg de la gasolina). Los microbios producen
principalmente hidrógeno a través de la fotofermentación de las bacterias púrpuras no azufradas Rhodobacter y
Rhodopseudomonas, y durante la fermentación oscura por especies estrictamente anaeróbicas de Clostridium [7,8].
Dependiendo de la disponibilidad de sustrato, la selección de microorganismos funcionales necesarios para la
producción de hidrógeno es un paso importante. La simulación de los flujos metabólicos de intercambio de
monocultivos y cocultivos por pares utilizando modelos metabólicos a escala genómica en lodo de basura artificial
dio como resultado la identificación de uno de los principales cocultivos productores de hidrógeno que comprende
Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 y Yokenella regensburgei ATCC 43003. El consorcio produjo una cantidad
similar de gas hidrógeno y aumento de butirato (atribuido a la alimentación cruzada de lactato producido por Y.
regensburgei), en comparación con el monocultivo de C. beijerinckii, cuando se cultiva en lodo de basura artificial [9].
Los residuos alimentarios domésticos son una biomasa compleja que contiene varios componentes que la convierten en una
fuente de posibles sustratos fermentativos. El esquema general de producción de bioetanol a partir de materiales tan complejos implica
un paso de pretratamiento que aumenta la digestibilidad del material (hidrólisis enzimática) para liberar los monosacáridos y la
fermentación de estos azúcares a etanol. En términos de costo, el paso más exigente, que aumenta significativamente el costo total
de la producción de bioetanol y se identifica como una barrera en el desarrollo posterior de la producción de etanol, es la hidrólisis
enzimática. Si las enzimas necesarias pudieran producirse de manera eficiente en el sitio, el costo podría reducirse significativamente.
Un estudio reciente estimó que el costo de la celulasa se puede reducir de 0,78 a 0,58 $/galón al pasar del enfoque de producción de
celulasa fuera del sitio al sitio en el sitio [10]. El hongo mesófilo Fusarium oxysporum F3 cultivado en estado sólido sobre salvado de
trigo produjo un sistema multienzimático capaz de hidrolizar los carbohidratos presentes en los desechos alimentarios domésticos. El
uso de cultivos microbianos mixtos en la etapa de producción de bioetanol que consiste en el cultivo en estado sólido de F. oxysporum
y la levadura Saccharomyces cerevisiae aumentó la productividad volumétrica del bioetanol, en comparación con el monocultivo del
hongo. La producción de bioetanol aumentó aproximadamente un 23 % cuando el cultivo microbiano mixto se complementó con dosis
bajas de glucoamilasa comercial [11].
CarriónPaladines et al. [12] evaluaron dos Xylaria spp. de las zonas de bosque seco del sur del Ecuador, para la producción de
ligninasa y celulasa bajo fermentación en estado sólido a partir de residuos obtenidos de la extracción del aceite esencial de Palo
Santo. El Palo Santo es considerado un recurso vital para el local
comunidades del bosque seco, ya que diferentes partes del árbol son utilizadas en la medicina tradicional, así como para la extracción
de aceite esencial. El proceso de extracción del aceite esencial genera abundantes desechos orgánicos, que comúnmente se desechan
directamente en los ecosistemas naturales o se queman. Actividades de lacasa, celulosa y xilanasa de Xylaria feejeensis y Xylaria cf.
microceras fueron generalmente más altos que los del hongo control Trametes versicolor (L.) Lloyd, lo que mejoró la comprensión del
uso potencial de los hongos nativos como descomponedores lignocelulósicos ecológicos y para fines industriales.
La producción de cerveza genera grandes cantidades de levadura gastada durante el proceso de fermentación y
lagering. La levadura gastada es un material de partida eficaz para producir extracto de levadura, que generalmente se
define como el contenido soluble de una célula de levadura que queda una vez que se ha destruido y eliminado la pared
celular. La variedad de diferentes sustancias fisiológicamente valiosas en las células de levadura ofrece la posibilidad
de uso como extracto de levadura en diferentes áreas de la industria alimentaria. Jacob et al. [13] demostraron que la
composición de varios grupos de sustancias fisiológicamente valiosas de un extracto de levadura depende de la
biodiversidad de la levadura gastada de la producción de cerveza, lo que indica que la levadura gastada de cerveza
debe seleccionarse cuidadosamente para producir un extracto de levadura con una composición nutricional definida.
En muchos casos, los desechos de alimentos son difíciles de utilizar para la recuperación de productos de valor agregado
debido a su inestabilidad biológica o naturaleza potencialmente patógena. El tizón de la espiga por Fusarium (FHB), una enfermedad
fúngica causada por varias especies de Fusarium, es una de las causas más importantes de pérdidas económicas en los cultivos de cereales.
Fusarium spp. producen diversas cantidades y tipos de micotoxinas de tricoteceno, siendo el deoxinivalenol el
principal, que son altamente tóxicos para los seres humanos y el ganado. Gulsunoglu et al. informaron sobre un
método para recuperar los nutrientes de los cereales afectados, sin las micotoxinas. [14].
Los granos infectados fueron fermentados inicialmente bajo cultivo en estado sólido con Aspergillus oryzae y/o
2
Lactobacillus plantarum. El material fermentado se suministró a larvas de mosca soldado negra, que
consumieron materiales contaminados con deoxinivalenol y los convirtieron en biomasa de insectos sin
acumular deoxinivalenol en sus cuerpos. Esta tecnología de tratamiento que utiliza larvas de mosca soldado
negra puede contribuir a reducir la carga de la escasez de proteína animal en el mercado de alimentos para animales.
Varelas [15] recopiló información actualizada sobre la cría masiva de insectos comestibles para alimentos y piensos a partir
de desechos alimentarios. Los insectos comestibles son especies de insectos que pueden ser utilizados para el consumo humano
pero también para la alimentación del ganado en su totalidad, partes de ellos, y/o extracto proteico y lipídico.
Financiamiento: Esta investigación no recibió financiamiento externo.
Agradecimientos: El editor desea agradecer a los colaboradores de nuestros artículos, miembros del Consejo Editorial, Revisores y Editores Asistentes de esta
revista, cuyas contribuciones hicieron posible la publicación de este Número Especial.
Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.
Referencias
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2019, 5, 76. [CrossRef]
13. Jacob, FF; Striegel, L.; Rychlik, M.; Hützler, M.; Methner, F.J. Levadura gastada de procesos de elaboración de cerveza:
Un material de partida biodiverso para la producción de extracto de levadura. Fermentación 2019, 5, 51. [CrossRef]
3
14. Gulsunoglu, Z.; Aravind, S.; Bai, Y.; Wang, L.; Kutcher, recursos humanos; Tanaka, T. Acumulación de deoxinivalenol (DON) y recuperación de
nutrientes en larvas de mosca soldado negra (Hermetia illucens) alimentadas con trigo infectado con Fusarium spp.
Fermentación 2019, 5, 83. [CrossRef]
15. Varelas, V. Los desperdicios de alimentos como una nueva fuente potencial para la producción masiva de insectos comestibles para alimentos y
piensos: una revisión. Fermentación 2019, 5, 81. [CrossRef]
© 2020 por el autor. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo
los términos y condiciones de Creative Commons Attribution
(CC BY) licencia (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
4
fermentación
Artículo
Producción de Ácido DLáctico por Fermentación de
Residuos de Cáscara de Naranja Hidrolizados por Láctico
bacterias ácidas
Daniel Bustamante 1,2, Marta Tortajada 2, Daniel Ramón 2 y Antonia Rojas 2,*
1
Dirección actual: Centro Nacional de Energías Renovables (CENER), Av. Ciudad de la Innovación,
7, 31621 Sarriguren, España; dbustamante@cener.com
2
ADMBIOPOLIS, Parc Científic Universitat de València, C/Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna,
España; marta.tortajada@adm.com (MT); daniel.ramonvidal@adm.com (RD)
* Correspondencia: antonia.rojas@adm.com
Recibido: 31 de octubre de 2019; Aceptado: 16 de diciembre de 2019; Publicado: 18 diciembre 2019
Resumen: El ácido láctico es uno de los monómeros candidatos más interesantes para reemplazar algunos
monómeros derivados del petróleo. La aplicación de ácido poliláctico (PLA) convencional está limitada debido a
propiedades térmicas insuficientes. Esta limitación se puede superar mezclando ácido poliD y poliLláctico.
El principal problema es el conocimiento limitado de la producción de ácido Dláctico (DLA). Se están
desarrollando procesos bioquímicos eficientes para sintetizar DLA a partir de residuos de piel de naranja (OPW).
OPW es una materia prima renovable interesante para procesos de biorrefinería de naturaleza biocatalítica,
catalítica o térmica debido a su bajo contenido en lignina y cenizas. El bioprocesamiento del OPW pretratado se
lleva a cabo mediante hidrólisis enzimática y fermentación de los azúcares liberados para producir DLA. Varias
cepas de la especie Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus han sido evaluados para la producción de DLA a
partir de hidrolizado OPW utilizando Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286 como cepa de referencia
ya que su desempeño en este tipo de sustrato ha sido ampliamente reportado en estudios previos. Los resultados
preliminares muestran que Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5037 tuvo el mejor rendimiento con
un rendimiento del 84 % p/p para la producción de DLA y hasta el 95 % (ee).
Palabras clave: producto de valor agregado; ácido Dláctico; cepas LAB; Desechos alimentarios; residuos de piel de naranja
1. Introducción
El ácido láctico es un químico importante y ha atraído una gran atención debido a sus amplias aplicaciones en las industrias
alimenticia, farmacéutica, cosmética y textil. El ácido poliláctico (PLA) es un polímero biodegradable con gran potencial para reemplazar
a los polímeros petroquímicos y, por lo tanto, los ácidos L y Dlácticos son monómeros destacados de la industria bioplástica [1]. Las
propiedades morfológicas, mecánicas y térmicas del polímero están determinadas por la presencia de diferentes cantidades de
monómeros u oligómeros de ácido L y Dláctico [2–6]. La producción microbiana de ácido láctico ópticamente puro ha sido ampliamente
estudiada porque el ácido láctico sintetizado químicamente es una mezcla racémica [7]. De hecho, la optimización de las condiciones de
operación es muy efectiva para lograr una alta selectividad al isómero de interés [8]. Aunque el isómero L se ha estudiado en detalle, la
información sobre la biosíntesis del ácido Dláctico (DLA) aún es limitada [5,9].
La demanda del mercado de PLA representa el 11,4% de la producción total de bioplásticos en todo el mundo, aproximadamente
18 × 104 toneladas métricas por año y se estima que la demanda de PLA crecerá un 28% por año hasta 2025. Sin embargo, los costos
de producción de PLA siguen siendo altos, principalmente debido a costosas Componentes de los medios de fermentación.
Para superar este problema, se han empleado varios residuos como materia prima [3,5,7,10–12].
Se ha estudiado la producción de DLA a partir de desechos líquidos de piña [13], jugo de dátiles [14], rastrojo de maíz [15], hidrolizado
de pulpa de madera dura [16] y arroz integral [17] . En este sentido, la valorización de los residuos alimentarios para
productos útiles como DLA es una buena alternativa [1,18,19]. En particular, los desechos de cáscara y pulpa de naranja
(OPW) se pueden usar para producir DLA después de procesos de pretratamiento adecuados [20–22].
Los desechos de naranja son los desechos de cítricos más abundantes, con hasta 50 millones de toneladas métricas de
naranjas consumidas cada año [23]. Esta enorme cantidad de residuos representa entre el 45% y el 60% del peso total de la
fruta y, por lo tanto, hasta la fecha se han estudiado muchas aplicaciones potenciales para su valorización [24].
La principal aplicación de este residuo es como ingrediente para la alimentación del ganado o como combustible sólido seco
peletizado, pero su procesamiento genera aguas residuales altamente contaminadas [25]. Recientemente se ha descrito el uso
de residuos de cítricos para producir compuestos de alto valor agregado, aceites esenciales, fertilizantes, pectina, enzimas
industriales, etanol y absorbentes [21,23–28]. Además, los residuos de naranja presentan bajos niveles de lignina y una gran
cantidad de azúcares [27], lo que los convierte en un sustrato ideal para los procesos de fermentación después de la
implementación de las etapas de pretratamiento e hidrólisis enzimática requeridas.
El ácido láctico es producido en grandes cantidades por las bacterias del ácido láctico (BAL), que pueden hacerlo de
forma homofermentativa empleando la vía de EmbdenMeyerhof, donde el ácido láctico es el único ácido producido, o por vía
heterofermentativa siguiendo la vía del fosfogluconato y la fosfocetolasa, donde el ácido láctico el ácido es uno de los productos
y rinde 0,5 g g−1 de hexosa. Las LAB producen una o las dos formas de lactato [4,11,29,30]. La especie Lactobacillus
delbrueckii ssp. delbrueckii ha sido reportado como un productor homofermentativo de DLA utilizando varios residuos
agroindustriales [9]. Esta bacteria produce un 90 % de DLA a partir de melaza de caña de azúcar, un 95 % de DLA a partir
de jugo de caña de azúcar, un 88 % de DLA a partir de jugo de remolacha azucarera [31] y un 88 % de DLA a partir de
residuos de cáscara de naranja (OPW) [32]. Además, la especie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus se ha utilizado en
la industria láctea para transformar la leche en yogur y algunas cepas pueden producir DLA de alta pureza [33]. Por lo tanto,
la lactosa y el suero han sido ampliamente estudiados como materias primas para la producción de ácido láctico [34–36],
incluso clonando el gen de la Dlactato deshidrogenasa en Escherichia coli [37]. Otros estudios incluyeron harina de trigo,
melaza, sorgo e hidrolizados lignocelulósicos como materias primas para la producción de ácido láctico por Lactobacillus
delbrueckii subsp. bulgaricus, especialmente para la producción de isómeros LLA [11,38]. Este hecho significa que algunas
cepas de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus podrían ser candidatos potenciales para la producción de DLA a partir
de materias primas sostenibles.
El objetivo de este trabajo fue encontrar cepas de LAB capaces de producir DLA con alto rendimiento y
pureza óptica a partir de OPW como materia prima para contribuir al desarrollo de biorresiduosrefinerías.
Para este propósito, varios Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus se evaluaron en comparación con la cepa de referencia
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286, que se ha informado como un productor de alto rendimiento de DLA a
partir de biorresiduos e hidrolizado de OPW en particular.
2. Materiales y métodos
2.1. Cepas bacterianas, medios y condiciones de crecimiento
Las cepas bacterianas empleadas en este estudio se enumeran en la Tabla 1 y Lactobacillus delbrueckii
ssp. delbrueckii CECT 286 se utilizó como cepa de referencia. Las cepas seleccionadas se adquirieron de la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Tras su recepción se recuperaron en medio MRS y se
almacenaron en glicerol al 20% a −80 ◦C para su conservación a largo plazo. Los precultivos se prepararon en
tubos que contenían medio MRS con un espacio de cabeza pequeño y se incubaron durante la noche a 37 ◦C
y en condiciones microaeróbicas estáticas .
Tabla 1. Cepas de baterías de ácido láctico (LAB) seleccionadas para el cribado de producción de ácido Dláctico.
Microorganismo L. Código de cepa
delbrueckii ssp. bulgaricus L. CECT 4005
delbrueckii ssp. bulgarico CECT 5038
6
El cribado de las cepas de BAL se realizó en tubos de 15 mL a 37 ◦C y utilizando un medio con azúcares
similares al hidrolizado de OPW de la siguiente manera: caldo MRS más glucosa 30 g L−1, fructosa 20 g L−1,
galactosa 5 gL−1 y arabinosa 6 g L−1. Los cultivos se inocularon por duplicado con 5% v/v de precultivo y se
incubaron en un agitador orbital a 200 rpm. Las condiciones aeróbicas y microaeróbicas se probaron a pH 6,2
durante 40 h.
2.2. Ensayos de tolerancia al hidrolisato OPW
Los ensayos de tolerancia se realizaron por triplicado utilizando cepas seleccionadas y preparando una
placa multipocillo con 200 μL de MRS con hidrolizado de OPW diluido al 50%, 85% y 100% v/v como medio
de cultivo para cada condición. Los precultivos se prepararon en MRS y se inocularon al 10% del volumen total.
Se utilizó un espectrofotómetro incubador de microplacas con temperatura fijada a 37 ◦C durante 45 h. La placa
se agitó cada hora durante 5 segundos antes de cada medición de OD600 para obtener las curvas de crecimiento
de las cepas.
2.3. Ensayos de fermentación
Las cepas se cultivaron en tubos de 50 mL que contenían MRS con hidrolizado de OPW al 85 % v/v a pH 6,2,
37 ◦C y 45 ◦C en condiciones microaeróbicas. Se realizó un ensayo adicional ajustando el pH a 5,8 cada 24 h con
NaOH 5 M. Todos los experimentos comenzaron inoculando 15 % v/v de precultivo y luego se incubaron en un
agitador orbital a 200 rpm durante 120 h.
Los experimentos en la configuración del biorreactor se realizaron en 1.5 L Applikon® en modo discontinuo
con OPW hidrolizado al 85 % v/v con MRS y 5 g L1 de extracto de carne como fuente adicional de nitrógeno. El
hidrolizado de OPW se esterilizó utilizando filtros de membrana de acetato de celulosa y fibra de vidrio estériles
con un tamaño de poro de 0,2 μm , y luego se agregó al biorreactor. Antes de la adición del inóculo, se obtuvo la
atmósfera anaeróbica eliminando el oxígeno con una corriente de nitrógeno. Las condiciones experimentales se
establecieron a 37 ◦C, 200 rpm y pH de 5,8, adicionando NaOH 5 M o HCl 2 M para el control del pH durante la fermentación.
2.4. Pretratamientos OPW
El sustrato utilizado en este estudio fue OPW obtenido de la elaboración de jugo. Estos residuos se
molieron con cuchillas hasta un diámetro final de partícula de alrededor de 5 mm y luego, las muestras se
almacenaron posteriormente en un congelador a 20 ◦C hasta su uso. La caracterización de la materia prima
se realizó de acuerdo con los procedimientos NREL para la determinación de carbohidratos estructurales y
azúcares libres, además de extractivos [39–41], mientras que la humedad se evaluó utilizando una balanza de
secado por infrarrojos a temperaturas entre 70 y 90 ◦C . hasta peso constante. Los resultados obtenidos al
aplicar la metodología NREL se recopilan en la Tabla 2. Para los ensayos de producción de DLA, el OPW se
molió hasta un tamaño de partícula de 1 a 2 mm y la hidrólisis se llevó a cabo al 10 % p/p de sólido seco, 50
◦C , 300 rpm y pH inicial de 5,2 utilizando cócteles enzimáticos con celulasas, βglucosidasa, xilanasa, β
xilosidasa, pectinasa y actividades auxiliares (Celluclast 1,5 l, Novozym 188, Pectinex Ultra SPL donado por
Novozymes) tal y como describen los de la Torre y colaboradores [22].
Tabla 2. Análisis de composición OPW según protocolos NREL.
Componente % peso seco (p/p)
Solidos totales 19,2 ± 0,5
Ceniza 3,9 ± 0,2 y
Grasas 37,5
Agua ± 0,4
extractivos
azúcares libres 36,4 ± 0,6
glucano 19,1 ± 0,1
hemicelulosa 14,8 ± 0,2
Lignina 6,2 ± 0,5
Pectina 17,9 ± 1,5
7
2.5. Procedimientos analíticos
El contenido de azúcares y ácidos orgánicos se determinó mediante cromatografía líquida HPLC (2695 HPLC
con un refractive Index Detector 2414; Waters, Cerdanyola del Vallés, España) utilizando una columna de ácidos
orgánicos Rezex ROA, con H2SO4 a 2,5 mM y 0,5 mL min−1 fluir. La pureza óptica de DLA se determinó mediante
HPLC (Agilent Technologies 1100 Series, Waldbronn, Alemania) utilizando un detector DAD, una columna Chirex
3126 (D)penicilamina (250 × 4,6; Phenomenex) trabajando a temperatura ambiente y una columna de CuSO4 .
Solución 1 mM como fase móvil que fluye a 1,2 mL min−1.
3. Resultados y discusión
3.1. Detección de cepas de LAB para la producción de DLA
La producción de ácido láctico se probó en tubos de 15 ml que contenían 3 ml de cultivo similar al hidrolizado
OPW para condiciones aeróbicas y 14 ml de cultivo para condiciones microaeróbicas para comparar el comportamiento
de las diferentes cepas de BAL. Los resultados se muestran en la Figura 1. Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus
CECT 4005 y CECT 5038 no produjeron una cantidad significativa de ácido láctico mientras que L. delbrueckii ssp.
bulgaricus CECT 5036 produjo hasta 14 g L−1 de mezcla racémica de ácido láctico en condiciones aeróbicas y
microaeróbicas. Además, tres cepas, L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 4006, CECT 5035 y CECT 5037
transformaron azúcares en ácido láctico en condiciones microaeróbicas con exceso enantiomérico DLA de la misma
manera que L. delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286. Esas cepas produjeron alrededor de 15 g L−1 de ácido láctico
con alrededor del 75% (ee) de DLA mientras que L. delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286 alcanzó el 92% (ee) de D
LA. Por lo tanto, esas tres cepas fueron seleccionadas para estudiar la producción de DLA a partir de hidrolizado
OPW en condiciones microaeróbicas.
A B
100 100
90 90
80 80
70 70
60 60
50 50
40 40
30 30
20 20
10 10
0 0
CECT CECT CECT CECT CECT CECT CECT CECT CECT CECT CECT CECT CECT CECT
286 4005 4006 5035 5036 5037 5038 286 4005 4006 5035 5036 5037 5038
Azúcares consumidos (%) Rendimiento (%) DLA (%) Azúcares consumidos (%) Rendimiento (%) DLA (%)
Figura 1. Producción de DLA en tubos de 15 ml con medio MRS que contiene azúcares que se asemejan al hidrolizado
de OPW utilizando cepas de LAB seleccionadas para el cribado. A. Condiciones aeróbicas. B. Condiciones microaeróbicas.
Informes anteriores mostraron que la lactosa en lugar de la glucosa aumenta notablemente la tasa de crecimiento de L.
delbrueckii ssp. cepas bulgaricus [33,34]. Por lo tanto, es probable que los sistemas de transporte de azúcares distintos de la
lactosa varíen entre estas cepas y, por lo tanto, algunas cepas, como L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 4005 y CECT 5038,
parecen tener dificultades para asimilar los azúcares probados en este trabajo. Además, cepas como L. delbrueckii ssp.
bulgaricus CECT 5035 y CECT 5037 muestran bajo rendimiento en ensayos en condiciones aeróbicas de la misma manera que
L. delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286. Se sabe que durante el crecimiento se producen derivados tóxicos del oxígeno para
las cepas de BAL en condiciones aeróbicas, pero las enzimas necesarias para eliminarlos parecen no expresarse en algunas L.
delbrueckii ssp. cepas bulgaricus [42].
Los agentes reductores pueden brindar protección contra productos tóxicos, particularmente si las condiciones de
crecimiento no son estrictamente anaeróbicas. Sin embargo, con excepción de L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT
5036, las otras cepas mostraron mayor selectividad a DLA que L. delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286 en
condiciones aeróbicas y como se mencionó anteriormente, L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5036 tienen resultados similares en
8
condiciones aeróbicas y microanaeróbicas pero produjeron una mezcla racémica en ambos casos. L. delbrueckii ssp.
bulgaricus CECT 4005 parece preferir las condiciones aeróbicas, pero los rendimientos siguen siendo bajos.
3.2. Uso de hidrolizado OPW para la producción de DLA por cepas seleccionadas
Los hidrolizados OPW se prepararon siguiendo la metodología descrita en la Sección 2.4. y desarrollado
por de la Torre y colegas [22] obteniendo un rendimiento de glucosa de alrededor del 60% p/p que corresponde
a alrededor de 30 g L−1, y obteniendo una concentración de azúcar total por encima de 50 g L−1. Por lo tanto,
OPW es una buena fuente de varios monosacáridos pero también tiene aceites esenciales ricos en limoneno
y que contienen terpenos y fenoles con cierta actividad antimicrobiana [21]. La tolerancia de las cepas al
sustrato se probó con diferentes concentraciones de hidrolizado OPW que van desde 50% a 100% v/v diluido
con caldo MRS. El monitoreo del crecimiento se realizó en una incubadora de microplacas durante 48 h
(Figura 2). Los microorganismos crecieron bien con un contenido de hidrolizado del 50% v/v, pero la cepa L.
delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286 toleró el hidrolizado y pudo crecer incluso cuando el contenido de
hidrolizado fue del 100 % v/v. Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 4006 parece ser más sensible al
hidrolizado OPW mientras que L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5037 fue capaz de crecer en cualquier
concentración de OPW; sin embargo, cuanto mayor sea la concentración de hidrolizado, mayor será la fase
de latencia y menor el crecimiento. Las diferencias radican en el rendimiento de las cepas, que es ligeramente
inferior cuando se utilizan hidrolizados de OPW, probablemente debido a la presencia de componentes del
aceite esencial, ya sea terpenos o fenoles. Sin embargo, los lactobacilos pueden soportar concentraciones
relativamente altas de extractos de cítricos [43].
A B
2 2
Hidrolizado de OPW al 50 % Hidrolizado de OPW al 50 %
1,8 1,8 85% OPW hidrolizado
85% OPW hidrolizado
1,6 Hidrolizado 100% OPW 1,6 Hidrolizado 100% OPW
1,4 1,4
1,2 1,2
600nm
DE 600nm
DE
1 1
0,8 0,8
0,6 0,6
0,4 0,4
0,2 0,2
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
Tiempo (h) Tiempo (h)
C D
2 2
Hidrolizado de OPW al 50 % Hidrolizado de OPW al 50 %
1,8 1,8 85% OPW hidrolizado
85% OPW hidrolizado
1,6 Hidrolizado 100% OPW 1,6 Hidrolizado 100% OPW
1,4 1,4
1,2 1,2
600nm
DE 600nm
DE
1 1
0,8 0,8
0,6 0,6
0,4 0,4
0,2 0,2
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
Figura 2. Curvas de crecimiento para ensayos de tolerancia al hidrolizado OPW en microplacas y condiciones
microarbic. (A) Lactobacillus delbrueckii ssp. delbreckii CECT 286. (B) Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CECT
4006. (C) Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5035. (D) Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CECT
5037. Los resultados se obtuvieron como el promedio de tres réplicas y estándar
desviación fue inferior al 0,5%.
En cuanto a los requerimientos nutricionales, estudios previos demostraron que la niacina, el pantotenato de
calcio, la riboflavina y la vitamina B12 eran esenciales para el crecimiento de L. delbrueckii ssp. bulgaricus, y que el
ácido fólico, el piridoxal y el CaCl2 eran importantes para un crecimiento eficiente [44,45]. Podría haber discrepancias debido a
9
diferencias en la composición del medio o a los requisitos específicos de la cepa, como en el caso de L. delbrueckii
ssp. bulgaricus CECT 5037, que no solo parece tolerar el hidrolizado, sino que también parece crecer con requisitos
nutricionales menos estrictos. Aunque L. delbrueckii ssp. delbueckii CECT 286 y L. delbrueckii ssp. bulgaricus
CECT 5037 han mostrado la mayor robustez cultivada en hidrolizado de OPW, los siguientes ensayos se realizaron
utilizando las cuatro cepas seleccionadas e inoculando las células recuperadas del 15 % v/v de precultivo con
respecto al volumen de cultivo al 85 % v/v de hidrolizado de OPW diluido con medio MRS y condiciones
microaeróbicas. Se aumentó la cantidad de inóculo para comparar el rendimiento de las cepas seleccionadas con
la concentración máxima de hidrolizado OPW durante los ensayos preliminares de fermentación.
La temperatura óptima de crecimiento de los lactobacilos oscila entre 30 y 40 ◦C, aunque algunas cepas
termófilas crecen bien y tienen un metabolismo muy activado a temperaturas en torno a los 45 ◦C [35].
Las cuatro cepas de Lactobacillus seleccionadas se cultivaron a 37 ◦C y 45 ◦C durante 120 h para probar su
actividad en condiciones lo más cercanas posibles a las de la etapa de hidrólisis y, por tanto, evaluar si las etapas
de hidrólisis y fermentación se podían realizar simultáneamente (SSF ) como resultado preliminar para la futura
optimización y escalado del proceso. En general, el proceso SSF ofrece mejores rendimientos porque evita la
inhibición del producto y da como resultado una mayor productividad [10]. Aghababaie y colegas [36] informaron
que la temperatura y el pH óptimos para el crecimiento y la producción de lactato a partir del suero de L. delbrueckii
ssp. bulgaricus fueron 44 ◦C y 5,7, respectivamente. Sin embargo, los resultados de la Figura 3 muestran que las
cepas seleccionadas en este estudio produjeron DLA hasta un 90 % (ee) en todos los casos, pero el rendimiento
de las cepas fue aún mejor a 37 ◦C usando hidrolizados OPW.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
CECT 286 CECT 286 CECT 4006 CECT 4006 CECT 5035 CECT 5035 CECT 5037 CECT 5037
(37 C) (45 C) (37 C) (45 C) (37 C) (45 C) (37 C) (45 C)
Azúcar consumida (%) Producir (%) DLA (%)
Figura 3. Resultados de producción de DLA de tres L. delbrueckii ssp. bulgaricus seleccionado frente a L.
delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286 utilizando OPW hidrolizado al 85 % v/v e incubado a 37 ◦C y 45 ◦C para
comparar el rendimiento de las cepas a diferentes temperaturas.
De manera similar a la temperatura, el efecto del cambio de pH en las características de crecimiento varió
entre las diferentes especies de BAL y, en la mayoría de los casos, se observó una disminución de la producción
de lactato con una disminución del pH [ 35]. Por lo tanto, las cepas se cultivaron en hidrolizado de OPW al 85% v/
v y se ajustó el pH a 5,8 cada 24 h durante la fermentación para probar su capacidad de producción con regulación
de pH. Los cultivos se incubaron a 37 ◦C y microaerobiosis durante 120 h. Los resultados muestran que el
consumo de azúcar y los rendimientos fueron mayores cuando se ajustó el pH y se produjo DLA hasta un 95 % (ee) (Figura 4).
L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5037 mostró los mejores resultados en comparación con las otras L.
delbrueckii ssp. bulgaricus y su rendimiento fue comparable al de L. delbrueckii ssp. delbrueckii CECT
286 usando hidrolizado OPW, cuyas productividades estuvieron entre 0.23 y 0.29 g L−1 h−1, respectivamente.
Debido a la homofermentación de L. delbrueckii ssp. delbrueckii y L. delbrueckii ssp. bulgaricus [9,11], solo se
podía producir ácido láctico. Sin embargo, se observó un pequeño aumento en la concentración de etanol a
partir de las 48 h de fermentación durante los ensayos de regulación de pH. La explicación de este hecho,
según la literatura [38,46], es que algunos homofermentadores, cuando se cultivan en un entorno limitado de
azúcar o en presencia de diferentes azúcares, pueden dar lugar a otros productos finales. La principal diferencia
está en el metabolismo del piruvato, pero todavía se usa la vía de homofermentación. Además, la acumulación de etanol
10
en el medio (2–3 g L−1) fue muy bajo para cambiar significativamente la generación del producto objetivo. Por lo tanto, DLA
continúa siendo el principal producto de fermentación y el metabolismo de las cepas puede considerarse homofermentativo.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
CECT 286 CECT 4006 CECT 5035 CECT 5037
Azúcar consumida (%) Producir (%) DLA (%)
Figura 4. Resultados de producción de DLA de tres L. delbrueckii ssp. bulgaricus seleccionado frente a L.
delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286 utilizando OPW hidrolizado al 85 % v/v y ajustando el pH a 5,8 cada 24 h
para evaluar el rendimiento de las cepas con la regulación del pH. Los resultados de desviación estándar de las
cepas con respecto a la cepa CECT 286 son: SDCECT4006 = 12,02; SDCECT5035 = 34,22; SDCECT5037 = 0,69.
3.3. DLA Producción por L. delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286 frente a L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5037
Los ensayos de aumento de escala preliminares se realizaron en un biorreactor de 1,5 litros controlando el pH a 5,8
en modo discontinuo. Los resultados anteriores mostraron que el rendimiento de las cepas era mejor en condiciones
microaeróbicas , por lo que las pruebas del biorreactor se realizaron en condiciones anaeróbicas utilizando una corriente de nitrógeno.
Las células del precultivo de MRS al 15 % v/v se inocularon en hidrolizado de OPW al 85 % v/v con MRS y se complementaron
con 5 g L1 de extracto de carne. Según la literatura, cuanto más suplementado sea el medio, mayor será el valor de la
biomasa final y mayor será la productividad del ácido láctico alcanzable [45,47]. Trabajos previos demostraron la importancia
del extracto de carne y el extracto de levadura en la producción de DLA, probablemente no debido a la cantidad total de
nitrógeno sino a los factores de crecimiento y vitaminas contenidos en estos extractos [32]. La fermentación finalizó a las 72
h (Figura 5), L. delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286 produjo 45 g L−1 de ácido láctico (99,5 % DLA (ee)) con un rendimiento
del 86 % p/p mientras que L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5037 produjo 39 g L−1 de ácido láctico (99,3 % DLA (ee))
con un rendimiento del 84 % p/p.
A B
50 50
gramo de glucosa por litro gramo de glucosa por litro
45 gramo de fructosa+galactosa por litro 45 gramo de fructosa+galactosa por litro
gramo de ácido Dláctico por gramo de ácido Dláctico por
40 40
litro gramo de CDM por litro litro gramo de CDM por litro
35 35
30 30
25 25
20 20
Concentración
l1)
(g Concentración
l1)
(g
15 15
10 10
5 5
0 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80
Figura 5. Crecimiento, consumo de azúcar y producción de DLA a partir de hidrolizado OPW en biorreactor y
modo discontinuo. A. Lactobacillus delbrueckii ssp. delbreckii CECT 286. B. Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus
CECT 5037. CDM = Peso seco celular.
11
Los rendimientos obtenidos fueron similares a los obtenidos en ensayos anteriores ajustando el pH, pero las
productividades fueron superiores en este caso, con valores de 0,63 y 0,55 g L−1 h−1, respectivamente.
Los experimentos muestran que los azúcares no se consumen por completo durante la fermentación, probablemente
debido a deficiencias en los requerimientos nutricionales de las cepas. Por lo tanto, el proceso de producción de D
LA se puede optimizar aún más utilizando L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5037 como un prometedor productor
de DLA a partir de hidrolizado OPW y otras materias primas sostenibles para contribuir al desarrollo de refinerías de
biorresiduos. En este sentido, las cepas de LAB productoras de LA comercialmente importantes, como las cepas de
Lactobacillus y Sporolactobacillus, son particularmente útiles debido a su alto rendimiento de ácido láctico, alta
tolerancia al ácido y su capacidad para modificarse metabólicamente [9,12]. La conversión eficiente de biomasa a D
LA aún enfrenta desafíos considerables, como la alta demanda de energía y el alto costo de las enzimas para el
pretratamiento de la biomasa lignocelulósica, la ineficiencia en la utilización del azúcar por parte de los microorganismos
y los subproductos no deseados generados durante el proceso de fermentación [46]. La Tabla 3 resume los estudios
de producción de DLA a partir de materias primas sostenibles, como residuos agroindustriales, mediante tinciones de tipo salvaje.
Estos resultados indican que el hidrolizado de OPW es una materia prima interesante para la producción de DLA, ya
que el rendimiento del producto es cercano a su valor teórico (1 g g 1) en la mayoría de los casos. Aparte de eso, el
valor de la productividad es bastante alto y muy atractivo cuando se prevén desarrollos industriales [32,48]. Es común
que los bioprocesos basados en residuos de biomasa den peores resultados que sus experimentos de control basados
en mezclas de azúcares que se asemejan a la composición de los hidrolizados. En este caso, los rendimientos
alcanzados tienen valores cercanos en ambos casos. De acuerdo con la pureza de ácido láctico lograda (> 95%), no
se observaron diferencias cuando se usa hidrolizado de OPW, lo que sugiere que los compuestos de desecho no
influyen en la pureza de DLA.
Tabla 3. Producción de DLA a partir de materias primas sostenibles en cultivos por lotes por cepas de LAB de tipo salvaje.
Producir Productividad DLA

materia prima Proceso Referencia
Microorganismo (g L−1 h−1) (%)
(g g−1)
Almidón de arroz L. delbrueckii LD 0028 Salvado de arroz desgrasado SHF 0,70 1,55 97,5 [49]

L. delbrueckii IFO 3202 Melaza de caña de azúcar L. delbrueckii JCM 1148 SSF 0,78 1,25 > 95 [10]
– 0,90 1,48 97,2
Jugo de caña de azúcar L. delbrueckii JCM 1148 Jugo de remolacha [31]
– 0,95 1,66 98,3
azucarera L. delbrueckii JCM 1148 Microalga L. coryniformis ssp. torquens [31]
– 0,88 1,16 97,6
ATCC 25600 Desecho de cúrcuma longa L. coryniformis ssp. torquens [31]
ATCC 25600 L. delbrueckii ATCC 9649 SSF 0,46 1,02 95.8 [50]
SSF 0,65 2,08 > 95 [51]
Pulpa SHF 0,83 1,01 99 [9]
– 0,49 0,61 > 98
Permeado de suero de caseína L. delbrueckii ssp. lactis ATCC 4797 L. [52]
Residuos de plantas de celulosa coryniformes ssp. torquens ATCC 25600 L. delbrueckii SHF 0,97 2,80 99 [53]
Residuos de piel de naranja ssp. delbrueckii CECT 286 L. delbrueckii ssp. SHF 0,88 2,35 > 95 [32]
Residuos de piel de naranja delbrueckii CECT 286 L. delbrueckii ssp. bulgaricus SHF 0,86 0,63 99.5 Este estudio
Residuos de piel de naranja CECT 5037 SHF 0,84 0,55 99,3 Este estudio *
* Resultados preliminares del cribado de LAB para una mayor optimización. SSF: sacarificación y fermentación simultáneas;
SHF: Hidrólisis y fermentación por separado.
Los resultados obtenidos con la L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5037 son prometedores ya que el rendimiento
de la cepa fue comparable al de L. delbrueckki ssp. rendimiento de la cepa delbrueckii CECT 286 usando hidrolizado
OPW en las condiciones probadas en este trabajo. Estudios previos muestran que la cepa de referencia puede
alcanzar una productividad de 2,35 g L1 h1 cuando se optimizan las condiciones de fermentación [32].
Por lo tanto, el trabajo futuro con L. delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5037 se centrará en la optimización de la
metodología de fermentación, incluido el método de inoculación de los cultivos, la mejora de los medios de cultivo
mediante la prueba de fuentes de nutrientes de bajo costo, así como la evaluación de los costos operativos en el
desarrollo de un proceso sostenible de producción de ácido láctico.
4. Conclusiones
Seis cepas de la especie Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus fueron evaluados para la producción de
DLA a partir de hidrolizado OPW en comparación con el Lactobacillus delbrueckii ssp. de referencia. cepa
delbrueckii CECT 286. Sorprendentemente, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus CECT 5037 es capaz de
tolerar el hidrolizado OPW y producir DLA hasta un 95 % (ee). Los resultados del rendimiento de la tensión muestran
12
un rendimiento del 84 % p/p para la producción de ácido láctico que está cerca del rendimiento del 86 % p/p
obtenido con la referencia Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii CECT 286 en este trabajo y 88% p/p
informado de trabajos anteriores cuando se preveía la mejora del proceso. Se realizarán experimentos para
desarrollar el proceso y una mayor optimización contribuirá a proporcionar una alternativa adecuada a los
procesos de refinería de biorresiduos que utilizan OPW y otras materias primas residuales como sustrato
potencial para la valorización.
Contribuciones de los autores: DR y MT concibieron la investigación; AR y DB diseñaron los experimentos; DB realizó los experimentos; AR evaluó los
resultados; DB escribió el artículo. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
Financiamiento: Esta investigación fue financiada por la Comisión Europea, número de subvención EIB.12.007
Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; en la
recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito, o en la decisión de publicar los resultados.
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© 2019 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo
15
fermentación
Artículo
El biometano de segunda generación del mandarín
Piel de naranja bajo cocultivo con metanógenos y el armado
Clostridium cellulovorans
Hisao Tomita 1,† y Yutaka Tamaru 1,2,3,*
1 Departamento de Ciencias de la Vida, Escuela de Graduados en Biorecursos, Universidad de Mie, 1577 Kurimamachiya,
Tsu, Mie 5148507, Japón; 516d301@m.mieu.ac.jp o drhtomitaent@gmail.com
2 Departamento de Bioinformática, Instituto del Centro de Investigación Avanzada, Universidad de Mie, 1577 Kurimamachiya,
Tsu, Mie 5148507, Japón 3
Centro de Investigación de Innovación de Células Inteligentes, Mie University, 1577 Kurimamachiya, Tsu, Mie 5148507, Japón
* Correspondencia: ytamaru@bio.mieu.ac.jp; Tel.: +81592319560 † Dirección
actual: 15 Maeda, Fujie, Higashiura, Chita, Aichi 4702105, Japón.
Recibido: 10 de septiembre de 2019; Aceptado: 31 de octubre de 2019; Publicado: 4 noviembre 2019
Resumen: Este estudio demuestra que el consorcio, que consiste en la flora microbiana de producción de metano
(MFMP) y Clostridium cellulovorans cultivados con celulosa, puede realizar la conversión directa de biomasa celulósica
en metano. El MFMP se tomó de una planta comercial de fermentación de metano.
tanque y era extremadamente complicado. Por lo tanto, C. cellulovorans cultivada con celobiosa no
pudo realizar una alta capacidad de degradación en la biomasa celulósica debido a la competencia de
varios microorganismos en MFMP. Centrándonos en el hecho de que C. cellulovorans se cultivó con
celulosa, que está armada con celulosoma, por lo que ahora está armada C. cellulovorans; la
conversión directa fue realizada por el consorcio formado por MFMP y el armado C. cellulovorans.
Como resultado, el consorcio de C. cellulovorans cultivado con celobiosa y MFMP (CCeM) no pudo
degradar la celulosa purificada y la piel de mandarina. Sin embargo, MFMP y el armado C. cellulovorans
redujeron 78,4% del azúcar total de la celulosa purificada como MN301, y produjeron 6,89 mL de metano simultáneament
Además, el consorcio estaba formado por MFMP y el armado C. cellulovorans degradó la cáscara de mandarina sin
ningún tratamiento previo y produjo metano que representaba el 66,2 % del gas total producido.
Palabras clave: metanogénesis; degradación de biomasa celulósica; consorcios; C. cellulovorans armada
1. Introducción
Aunque los biocombustibles de primera generación, que se elaboran a partir de maíz y caña de azúcar, se han
generalizado, existe preocupación por la competencia con el suministro de alimentos. Sin competir por los alimentos,
los biocombustibles de segunda generación se producen a partir de biomasa no comestible, como desechos agrícolas
y sustratos celulósicos [1,2].
La pared celular de una planta está compuesta de celulosa, hemicelulosa, lignina, pectina, etc. La celulosa es una
fibra de monómeros de dglucosa y tiene una estructura cristalina fuerte [3]. Además, la celulosa, la hemicelulosa y la lignina
componen las estructuras rígidas y complejas [4]. La hemicelulosa es un heteropolímero como xilano, glucuronoxilano,
arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Además, la lignina, compuestos fenólicos, refuerza la estructura de la celulosa y
la hemicelulosa, haciéndola más difícil de degradar. Así, dado que en la biomasa celulósica se construyen estructuras
rígidas y complejas, es muy difícil degradarlas enzimáticamente.
El jugo de naranja es uno de los principales jugos de frutas y casi la misma cantidad de desechos de naranja que el
jugo de naranja sale como subproducto en las fábricas de jugo de naranja. Por lo tanto, se ha considerado que dichos
desechos de naranja están disponibles para biomasa no comestible en todo el mundo. Sin embargo, el dlimoneno, que se incluye
en cítricos, tiene un efecto extremadamente tóxico sobre los microorganismos fermentadores [5,6]. Según el tipo de
cítrico, la piel de naranja contiene aproximadamente un 3% de limoneno. Por lo tanto, era necesario separar el d
limoneno antes del cultivo o proteger los microorganismos del dlimoneno mediante encapsulación o inmovilización
[7,8]. Recientemente, se informó que Clostridium cellulovorans puede degradar los desechos de naranja en el cultivo,
incluido el dlimoneno, y Clostridium beijerinckii puede llevar a cabo la fermentación de isopropanolbutanoletanol (IBE),
que es un proceso de fermentación bacteriana que produce isopropanol en lugar de acetona en acetonaetanol. –
fermentación de butanol (ABE) [9–11]. Así, el gran avance se obtuvo utilizando residuos de naranja para biocombustibles
de segunda generación sin ningún tratamiento previo.
Se sabe que algunos Clostridia, como C. cellulovorans y Clostridium thermocellum, tienen la capacidad de
degradar la biomasa celulósica de manera eficiente utilizando celulosomas y enzimas no celulosomales secretadas [12].
Entre esas especies, hemos estado estudiando C. cellulovorans, que es una bacteria celulolítica amesófila y anaeróbica
[13]. C. cellulovorans degrada no solo la celulosa sino también las hemicelulosas que consisten en xilosa, fructosa,
galactosa y manosa [14–16]. La secuenciación del genoma completo de C. cellulovorans y los perfiles de exoproteoma
revelaron 57 genes que codifican proteínas celulosomales y 168 genes que codifican carbohidrasas secretadas [17,18].
Además, hasta ahora se ha informado sobre la alta capacidad de degradación en las paredes celulares de las plantas [19].
C. cellulovorans crecido en el cultivo con celulosa tiene grandes protuberancias en su superficie [20] y las protuberancias
contienen celulosomas [21]; por otro lado, C. cellulovorans cultivada en el cultivo con celobiosa no presenta las
protuberancias (Figura 1a,b). C. cellulovorans adquiere una alta capacidad para degradar la pared celular vegetal con
celulosoma, es decir, C. cellulovorans se arma de celulosoma para atacar la pared celular vegetal. Por tanto, se puede
decir que son las C. cellulovorans armadas las que crecen con celulosa.
Aunque C. cellulovorans tiene una alta capacidad de degradación en las paredes celulares de las plantas en el monocultivo
de C. cellulovorans, existen desafíos en el sentido de que C. cellulovorans no puede realizar una alta capacidad de
degradación en el cocultivo o consorcios de otros microorganismos. La mayoría de los informes utilizaron C. cellulovorans
cultivada con celobiosa, y estos desafíos probablemente se derivaron de C. cellulovorans cultivada con celobiosa. Por lo
tanto, este estudio se centra en utilizar el C. cellulovorans armado especialmente para el consorcio de otros microorganismos.
(a) (b)
Figura 1. (a) Superficie celular de C. cellulovorans cultivada con celobiosa y (b) superficie celular de C.
cellulovorans cultivada con celulosa. La barra blanca indica 2 μm. Modificado de [21].
Se han publicado muchos estudios sobre la fermentación de metano (CH4) en una amplia gama de campos de
estudio [22]. La fermentación de metano utilizando biomasa celulósica es también biometano de segunda generación.
Dado que la producción de metano la lleva a cabo la flora microbiana compleja, incluidos los metanógenos, el proceso de
biometano de segunda generación necesita que el consorcio se construya con flora microbiana de producción de metano
(MFMP) y microorganismos que pueden degradar la biomasa celulósica, como C. cellulovorans. El consorcio de C.
cellulovorans con MFMP (CCeM) puede degradar pulpa de remolacha azucarera, que es el residuo en una fábrica de
refinería de azúcar, y fermenta biogás incluido metano simultáneamente [23]. Sin embargo, los azúcares relictos en la
pulpa de remolacha pudieron ayudar a C. cellulovorans a sobrevivir y coexistir con MFMP, y el mismo CCeM no pudo
llevar a cabo la degradación de la celulosa purificada y la producción de metano.
En el presente estudio, investigamos la capacidad de degradación de la biomasa celulósica de CCeM que era
consistente con el armado de C. cellulovorans (ACCeM).
18
2.1. Materiales
Las naranjas de mandolina se compraron en una tienda de comestibles en Japón en 2017. El flavedo y
el albedo, en lo sucesivo llamados cáscara eliminada, se cortaron en tiras con tijeras justo después de sacarlos
de una naranja de mandolina. El tamaño de la tira era de aproximadamente 10 mm de largo y 2 mm de ancho
(Figura 2). La cáscara se usó fresca, no seca y molida. Además, la cáscara no fue tratada con ningún producto
químico. Se midió el peso seco de la cáscara removida, contenía 71,6% de agua. La concentración de sustrato
de la cáscara eliminada, las celulosas purificadas, como Avicel (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) y MN301
(MACHEREYNAGEL, Düren, Deutschland), y celobiosa (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) fue del 0,5% (p/v)
del peso seco. Avicel es polvo de celulosa cristalina que se refina industrialmente a partir de celulosa natural,
y el tamaño de partícula de Avicel es inferior a 50 μm. MN301 también es polvo de celulosa refinado
industrialmente , y el 80 % del tamaño de partícula es inferior a 160 μm.
(b)
Figura 2. (a) Cáscara removida antes de cortar. (b) Tiras de piel removida en el medio.
19
2.2. Condición de cultivo y microorganismos
El medio fue parcialmente modificado por medio de Clostridium cellulovorans [11]. Un medio de arena
contenía 4 g de extracto de levadura, 1 mg de sal de resazurina, 1 g de LcisteínaHCl, 5 g de NaHCO3,
0,45 g de K2HPO4, 0,45 g de KH2PO4 , 0,3675 g de NH4Cl, 0,9 g de NaCl, 0,1575 g de MgCl2.6H2O,
0,12 g de CaCl2.2H2O, 0,85 mg de MnCl2.4H2O, 0,942 mg de CoCl2.6H2O, 5,2 mg de Na2EDTA, 1,5 mg
de FeCl2.4H2O, 0,07 mg de ZnCl2, 0,1 mg H3BO3, 0,017 mg de CuCl2.2H2O, 0.024 mg de NiCl2.6H2O,
0.036 mg de Na2MoO4.2H2O, 6.6 mg de FeSO4.7H2O y 0.1 g de ácido paminobenzoico y se ajustó a pH
7. C. cellulovorans 743B (ATCC 35296) se utilizó y cultivó anaeróbicamente en celobiosa al 0,5% (p/v),
Avicel y MN301 a 37 ◦C en reposo durante 19 h, durante 4 días y 2 días respectivamente. El MFMP se
obtuvo del líquido digerido por fermentación de metano en enero de 2017 en Gifu, Japón. El MFMP se
cultivó anaeróbicamente en medio Clostridium cellulovorans con 0,5 % (p/v) de glucosa (Wako) y 0,25 %
(p/v) de celobiosa, o 0,5 % (p/v) de hojas de raigrás a 37 ◦C durante 19 h estacionarias. Las hojas de
raigrás se obtuvieron en mayo de 2017 en Aichi, Japón, y se secaron y granularon hasta convertirlas en polvo.
2.3. Deposición de datos
Las secuencias de MFMP que se informan en este documento se han depositado en el Banco de datos de ADN de Japón
(DDBJ) (número de acceso 104 DRR160954).
2.4. Medición de la concentración de azúcar total
La concentración de azúcar total se midió a partir de la precipitación después de la centrifugación que fue de
20.000 rpm a 4 ◦C durante 5 min. El precipitado se lavó con sales tamponadas con fosfato y NaOH 5N.
La concentración de azúcar total de la precipitación lavada se midió por el método de fenolácido sulfúrico como equivalentes de d
glucosa.
2.5. Concentración de gases
El volumen de gas producido del espacio de cabeza en el vial de cultivo se recogió y midió con una jeringa
(Terumo, Tokio, Japón). Las concentraciones de CH4, H2 y CO2 se midieron mediante un cromatógrafo de gases
GC8A (Shimadzu, Kyoto, Japón) con un Detector de Conductividad Térmica (TCD) y una columna SINCARBON
ST (longitud total 6 m, diámetro interior 3 mm; Shinwa , Kyoto, Japón). La temperatura de la columna fue de 200 ◦C.
El argón fue un gas portador y se ajustó a un caudal de 50 ml/min. El volumen de inyección de cada muestra fue
de 5 mL. La concentración de CH4 también se midió mediante un cromatógrafo de gases GC2010plus (Shimadzu,
Kyoto, Japón) con una columna capilar RtQBOND (30 m, diámetro interior. 0,32 mm; RESTEK, Centro, PA, EE.
UU.) . La temperatura del horno fue de 250 ◦C y la temperatura de la columna de 150 ◦C. El nitrógeno fue el gas
portador y se ajustó a un caudal de 1,21 ml/min. El volumen de inyección de cada muestra fue de 0,5 ml.
2.6. Concentración de ácidos orgánicos
La concentración de ácidos orgánicos se midió por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), CBM20A, LC20AD,
CTO20AC, SPD20A y DGU20A3 (Shimadzu, Kyoto, Japón) con detector UV y un columna KC811 (300 mm × 2 mm, diámetro
interior. 8 mm; Showa Denko, Tokio, Japón). La temperatura de la columna fue de 60 ◦C. Se utilizó el método postcolumna de azul
de bromotimol (BTB) . El eluyente fue ácido perclórico 2 mM y el caudal fue de 1,0 ml/min. El reactivo fue BTB 0,2 mM e hidrógeno
fosfato disódico 15 mM, y la velocidad de flujo fue de 1,2 ml/min a la longitud de onda de 445 nm. El volumen de inyección de cada
muestra fue de 20 μL.
2.7. Crecimiento celular
El crecimiento celular se midió con Lumitester PD20, LuciPac Pen y enzima eliminadora de trifosfato
de adenosina (ATP) (Kikkoman Biochemifa, Tokio, Japón). Se sabe que la concentración de ATP
intracelular integrada se correlaciona con el crecimiento celular [24]. El crecimiento celular se estimó midiendo ATP
20
concentración de 0,1 mL de cultivo celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se expresó por
el valor de la unidad relativa de luz (RLU).
2.8. Estadísticas
Se analizó la significación estadística de los datos utilizando la prueba t de Welch. La diferencia fue evaluada
con una prueba bilateral con un nivel α de 0.05.
3. Resultados
3.1. Degradación de celulosa y cáscara eliminada bajo cocultivo con metanógenos y C. cellulovorans no armados
C. cellulovorans se cultivó previamente en medios que contenían 0,5 % (p/v) de celobiosa, lo que significaba que C. cellulovorans
no estaba armado con celulosoma. Se llevaron a cabo cultivos discontinuos anaerobios de C. cellulovorans, CCeM y MFMP en un medio
de 50 ml que contenía Avicel al 0,5 % (p/v) y se quitó la piel a 37 ◦C sin agitación.
De acuerdo con el crecimiento celular medido de los precultivos, las cantidades de inoculación para los monocultivos
de C. cellulovorans y MFMP se decidieron de modo que los valores iniciales de RLU de cada monocultivo se acercaran a
2000. Los valores RLU del precultivo de C. cellulovorans y MFMP fueron 45.310 y 50.494, respectivamente.
El volumen de inoculación se decidió en 2 mL para 50 mL de monocultivo; era 26 veces la dilución, de modo que
el valor RLU inicial del monocultivo de C. cellulovorans y MFMP fue 1743 y 1942, respectivamente.
Se inoculó CCeM con 2 ml de cada uno de ambos precultivos para que las concentraciones de crecimiento celular frente al sustrato
fueran las mismas que en el monocultivo.
Los valores RLU aumentaron durante 1 día de cultivo y luego se observó crecimiento celular en todos los cultivos
(Figura 3a,b). Curiosamente, los perfiles RLU de CCeM y MFMP fueron bastante similares, incluso CCeM incluía C.
cellulovorans y MFMP. Las concentraciones de azúcar total se redujeron significativamente en monocultivos de C.
cellulovorans con Avicel y cáscara removida después de 11 días de cultivo, se demostró que C. cellulovorans podía
degradar Avicel y cáscara removida. Sin embargo, las concentraciones de azúcar total en CCeM con Avicel y cáscara
removida fueron casi las mismas que las de MFMP; C. cellulovorans no pudo degradar Avicel y quitó la cáscara en cultivos
que incluían MFMP (Figura 3c, d).
Se pensaba que C. cellulovorans no crecía en CCeM porque los crecimientos celulares de CCeM y MFMP eran casi iguales. No se
detectó metano en el espacio de cabeza en CCeM sin cáscara y se detectó levemente en CCeM y MFMP con Avicel (Figura 3e,f).
(a) (b)
(C) (d)
Figura 3. Continuación.
21
(mi) (F)
Figura 3. Cultivo de C. cellulovorans, celobiosa y MFMP (CCeM) y flora microbiana productora de metano
(MFMP) con Avicel. ( a ) Crecimiento celular, donde se incluyen C. cellulovorans (_círculo abierto), CCeM
(_círculo cerrado) y MFMP (Δ_triángulo abierto); (c) concentración total de azúcar; (e) Se incluye la
producción de gas de H2 (barra rayada), CH4 (barra cerrada) y CO2 (barra abierta). Cultivo de C.
cellulovorans, CCeM y MFMP sin piel. (b) Crecimiento celular, donde se incluyen C. cellulovorans (_círculo
abierto), CCeM (_círculo cerrado) y MFMP (Δ_triángulo abierto); (d) concentración total de azúcar; (f) Se
incluye la producción de gas de H2 (barra rayada), CH4 (barra cerrada) y CO2 (barra abierta). Los valores
con barras de error son la media ± SE de tres muestras independientes. SE significa un error estándar.
Un asterisco indica una diferencia significativa (p < 0,05).
3.2. Degradación de celulosa y producción de metano bajo cocultivo con metanógenos y el armado
C. cellulovorans
C. cellulovorans se cultivó previamente en medios que contenían 0,5 % (p/v) de MN301 durante 2 días, lo que
significaba que C. cellulovorans estaba armado con celulosoma. Los cultivos discontinuos anaerobios de C.
cellulovorans armados, ACCeM y MFMP se llevaron a cabo en un medio de 40 ml que contenía 0,5 % (p/v) de MN301
a 37 ◦C sin agitación. Los valores RLU del precultivo del armado C. cellulovorans y MFMP fueron 6786 y 38538,
respectivamente. El valor RLU del cultivo de C. cellulovorans armado no aumentó más de 10.000 como el de C.
cellulovorans no armado. Por lo tanto, las cantidades de inoculación para monocultivos de C. cellulovorans armados
y MFMP se decidieron de modo que los valores iniciales de RLU de cada monocultivo se acercaran a 1000. Los
volúmenes de inoculación de C. cellulovorans armados y MFMP se decidieron en 7 ml y 1,2 ml, respectivamente. El
C. cellulovorans armado tenía una dilución de 6,69 veces y el MFMP tenía una dilución de 40,17 veces, por lo que los valores iniciales de
de monocultivo del armado C. cellulovorans y MFMP fueron 1014 y 959, respectivamente. ACCeM se inoculó en 7
mL del precultivo armado de C. cellulovorans y 1,2 mL del precultivo MFMP para que las concentraciones de
crecimiento celular contra el sustrato fueran las mismas que en el monocultivo. Se midieron los crecimientos celulares
en el monocultivo armado de C. cellulovorans, el cultivo ACCeM y el monocultivo MFMP durante 7 días de cultivo.
Los valores RLU en cultivo ACCeM y monocultivo MFMP aumentaron rápidamente más de 100 000 durante 10 h de
cultivo. El valor de RLU en el monocultivo armado de C. cellulovorans aumentó durante 2 días de cultivo y luego
disminuyó lentamente. Curiosamente, el valor RLU en el cultivo ACCeM fue mayor que el del monocultivo MFMP
después de 2 días de cultivo. Sugirió que el C. cellulovorans armado creció durante un par de días de cultivo y
coexistió con MFMP (Figura 4a). La concentración de azúcar total en el monocultivo armado de C. cellulovorans
disminuyó a 0,38 mg/mL desde 5 mg/mL durante 7 días de cultivo; indicó que el 92,4% de MN301 fue degradado por
C. cellulovorans armado durante 1 semana (Figura 4b).
La concentración de azúcar total en el cultivo ACCeM no disminuyó durante los 3 días de cultivo, sin embargo,
disminuyó rápidamente a partir de los 4 días de cultivo. También sugirió que los C. cellulovorans armados
sobrevivieron durante 3 días usando celulosoma traído mientras se adaptaba al MFMP coexistente. La concentración
de azúcar total en el cultivo de ACCeM disminuyó a 1,08 mg/mL durante 7 días de cultivo, por lo que se demostró
que ACCeM podía degradar el 78,4 % de MN301 durante 1 semana. La concentración de azúcar total en el
monocultivo de MFMP no disminuyó durante los 27 días de cultivo, lo que indicó que MFMP no tenía la capacidad
de degradar MN301. Las concentraciones de azúcar total en el monocultivo armado de C. cellulovorans y el cultivo
ACCeM fueron significativamente más bajas que en MFMP durante 7 días de cultivo (Figura 4c). El volumen total
de gas en el cultivo ACCeM aumentó rápidamente durante 10 h de cultivo y el volumen total de gas se mantuvo durante 1 a 7 días de cu
Curiosamente, la proporción de metano en el gas total aumentó durante 1 a 7 días de cultivo, aunque el
volumen total de gas no aumentó. Además, el volumen de metano aumentó continuamente durante 21 días de
22
cultivo. Finalmente, el volumen de metano aumentó 6,89 mL durante 1 a 21 días de cultivo, por lo que reveló que
la tasa de producción de metano de MN301 fue de 0,014 mL/h (Figura 4d). Se midieron las concentraciones de
ácidos orgánicos en el sobrenadante del cultivo de ACCeM. La concentración de ácido láctico se detectó
levemente durante 1 día de cultivo y no se detectó después de 2 días de cultivo (Figura 4e). La concentración de
ácido fórmico aumentó temporalmente en 1 día de cultivo y luego no se detectó después de 2 días de cultivo.
La concentración de ácido acético aumentó durante 6 días de cultivo, mismo término cuando la concentración de
azúcar total alcanzó el 78,4%. La concentración de ácido acético volvió a disminuir a partir de los 8 días de cultivo.
Por otro lado, la concentración de ácido propiónico aumentó pero no disminuyó. Se sugirió que
MN301 fue degradado por C. cellulovorans y se produjeron ácido acético y metano, y el metano se
produjo continuamente utilizando ácido acético después de degradar la celulosa. Además, sugirió que
el ácido acético se convirtió en metano con preferencia al ácido propiónico.
(a) (b)
(C)
(d)
23
(mi)
Figura 4. Cultivo de C. cellulovorans, CCeM y MFMP con Avicel. ( a ) Crecimiento celular, donde se incluyen C.
cellulovorans (_círculo abierto), CCeM (_círculo cerrado) y MFMP (Δ_triángulo abierto); (b) concentración total de
azúcar; (c) curso temporal del azúcar total, donde se incluyen C. cellulovorans (_círculo abierto), CCeM (_círculo
cerrado) y MFMP (Δ_triángulo abierto); d) curso temporal de la producción de gas, donde se incluyen el volumen
total de gas (_círculo cerrado) y el volumen de metano (Δ_triángulo abierto); (e) curso temporal de la concentración
de ácidos orgánicos de CCeM, donde se incluyen ácido láctico (barras negras), ácido fórmico (barras blancas),
ácido acético (barras negras) y ácido propiónico (barras punteadas). Los valores con barras de error son la media
± SE de tres muestras independientes. SE significa un error estándar. Un asterisco indica una diferencia
significativa (p < 0,05).
3.3. Degradación de la cáscara eliminada y producción de metano bajo cocultivo con metanógenos y el
armado C. cellulovorans
Se confirmó que el C. cellulovorans armado podía degradar la celulosa y el MFMP también trabajaba para
producir metano simultáneamente. Los cultivos discontinuos anaerobios de ACCeM se llevaron a cabo en un
medio de 20 ml que contenía un 0,5 % (p/v) de cáscara eliminada, que era un desecho agrícola real, a 37 ◦C
sin agitación. El C. cellulovorans armado se precultivó en medios que contenían 0,5% (p/v) de MN301 durante 2
días. De acuerdo con el crecimiento celular medido de precultivos, se decidieron las cantidades de inoculación
para monocultivos de C. cellulovorans armados y MFMP de modo que los valores iniciales de RLU de cada monocultivo
de cerca se convirtió en 1000. Los valores RLU del precultivo de C. cellulovorans armado y MFMP fueron 3448 y
38,538, respectivamente. Los volúmenes de inoculación de C. cellulovorans armados y MFMP se decidieron en
8,5 mL y 0,8 mL, respectivamente. El C. cellulovorans armado tenía una dilución de 3,44 veces y el MFMP una
dilución de 36,6 veces, de modo que los valores RLU iniciales de ACCeM fueron 1002 para el C. cellulovorans armado y
1052 para MFMP. La degradación de la cáscara removida se observó durante 5 días de cultivo (Figura 5a).
La producción de gas comenzó inmediatamente después de la inoculación y continuó durante 4 días de cultivo.
Sin embargo, no se detectó metano durante estos primeros 4 días de cultivo (Figura 5b). El metano comenzó a
detectarse después de 12 días de cultivo. Curiosamente, el incremento de metano fue de 4,7 mL para 12–26
días de cultivo frente a que el total de gas fue de 7,1 mL para el mismo plazo, por lo que el metano ocupó el
66,2% del incremento de gas. Esta concentración de metano tiene un buen desempeño como combustible para
la generación de energía a partir de biogás. Además, la productividad de metano fue de 0,014 ml/h durante 12
a 26 días de cultivo, igual a la del sustrato MN301. La concentración de ácido acético en el sobrenadante del
cultivo aumentó en la misma cantidad que el sustrato MN301. Sin embargo, la concentración de ácido acético
fue 2,5 veces mayor que la del sobrenadante del cultivo con MN301 (Figura 5c). Sugirió que había espacio para
convertir mucho ácido acético en metano para mejorar la producción de metano.
24
(a) (b)
(C)
Figura 5. (a) Cultivo CCeM (izquierda), control negativo (derecha); (b) evolución temporal de la producción de gas, donde
se incluyen el volumen total de gas (_círculo cerrado) y el volumen de metano (Δ_triángulo abierto); (c) curso temporal de
la concentración de ácidos orgánicos de CCeM, donde se incluyen ácido láctico (barras cerradas), ácido fórmico (barras
abiertas), ácido acético (barras cerradas) y ácido propiónico (barras punteadas). Los valores con barras de error son la
media ± SE de tres muestras independientes. SE significa un error estándar. Un asterisco indica una diferencia
significativa (p < 0,05).
4. Discusión
Dado que la reducción del dióxido de carbono para conservar el medio ambiente global es uno de los
propósitos para reemplazar los combustibles fósiles con biocombustibles, es deseable adoptar el proceso de
biocombustible que tiene una carga ambiental baja. La degradación del ácido sulfúrico de la biomasa celulósica
provoca la corrosión de un reactor y necesita un tratamiento de líquido residual, y el proceso de explosión de vapor
requiere mucha energía para crear alta presión y temperatura [25,26], por lo tanto, estos no son métodos de baja
carga ambiental. . La sacarificación enzimática es respetuosa con el medio ambiente, ya que es un proceso mesófilo y no utiliza ácidos.
Sin embargo, el costo de degradación es alto porque las enzimas purificadas son caras y se usan en grandes
cantidades. En lugar de usar enzimas costosas, el costo se reducirá al utilizar microorganismos que puedan producir
enzimas. Además, dado que C. cellulovorans tiene muchos genomas relacionados con celulosomas y no
celulosomales [27], existe potencial para mejorar la eficiencia de la sacarificación enzimática.
Además, cuando se usa el proceso de ácido sulfúrico o el proceso de explosión de vapor para sacárido
de biomasa celulósica, varios microorganismos adheridos a la biomasa y llevados al proceso de
sacarificación no son un problema, porque son tratados con alta temperatura y calor o ácido. Sin embargo,
existe la cuestión clave de que los microorganismos que producen enzimas deben sobrevivir y realizar su
capacidad de sacarificación coexistiendo con otros diversos microorganismos, porque muchos
microorganismos se introducen en el aparato de cultivo junto con la biomasa celulósica. En este sentido,
el presente estudio proporcionó un método que permite el cocultivo de varios microbiota y C. cellulovorans,
lo que ha sido difícil hasta ahora. Aunque hay pocos informes de cocultivo de C. cellulovorans y otro
microbio [28], se pueden realizar muchas experiencias de celulosa a metano utilizando un consorcio y C. cellulovorans arma
En particular, este C. cellulovorans armado no es OGM (organismos no modificados genéticamente) y no se
modifica con la edición del genoma, como CRISPR/Cas9 [29], por lo tanto, cualquiera puede cultivar fácilmente el
C. cellulovorans armado a partir de un medio de sustrato celulósico. y usarlo en cualquier lugar. Es útil y poderoso.
25
que el C. cellulovorans armado, que cualquiera puede utilizar, degrada los desechos de naranjas incluyendo el d
limoneno y la producción de metano, que representa el 66% del volumen total de gas, se produjo a partir de los
consorcios .
Sin embargo, para una producción estable de biogás, es esencial que el carbono, el nitrógeno, el fósforo, el
azufre y la relación carbononitrógeno (relación C/N) en el medio de cultivo tengan los valores deseados. Para
lograr una producción sostenible de biogás a partir de biomasa celulósica, es necesario investigar en detalle cómo
estos componentes son indispensables para el cambio del crecimiento microbiano. Por otro lado, dado que el
contenido de azufre contenido en la biomasa celulósica es pequeño, se puede esperar la simplificación de un
equipo de desulfuración en la planta de biogás.
Además, una naranja contiene betacriptoxantina (βcry), especialmente en la piel de naranja [30]. βcry es
un pigmento carotenoide natural y se sabe que los carotenoides contribuyen al sistema de defensa del cuerpo
humano contra las especies reactivas del oxígeno. Se han informado asociaciones inversas de βcry en suero con
el riesgo de cáncer, diabetes y disfunción hepática [31–34]. La degradación enzimática de la piel de naranja
permite extraer los carotenoides contenidos en el cultivo. Esto significa que la piel de naranja, que hasta ahora se
desechaba, se puede convertir en materia prima útil para tener alimentos funcionales. Además, la sacarificación
enzimática no descompone el compuesto por alta temperatura y presión y por ácido, por lo que la sacarificación
enzimática es el proceso más avanzado para extraer los compuestos útiles.
5. Conclusiones
Este estudio reveló que C. cellulovorans al crecer con celulosa en lugar de celobiosa puede coexistir con
una microbiota compleja como la microbiota metanogénica. Por lo tanto, proporcionó un método útil para
investigar el cultivo conjunto de C. cellulovorans con varios otros microorganismos. Además, C. cellulovorans
y la microflora metanogénica coexistieron entre sí manteniendo la capacidad de degradación de celulosa y la
capacidad de producción de metano. Como resultado, el biogás se produjo con un contenido del 66,2 % de
metano utilizando la cáscara de mandarina como fuente de carbono, y cuando el biogás contiene un 60 % o
más de metano, el biogás se puede usar directamente como combustible para un motor a gas.
Contribuciones de los autores: Conceptualización, YT y HT; metodología, YT y HT; validación, YT y HT; recursos, YT; curación de datos, HT; redacción
—preparación del borrador original, HT; redacción—revisión y edición, YT; supervisión, YT; administración de proyectos, HT; adquisición de fondos, YT
Agradecimientos: Nos gustaría agradecer a Daimasa Engineering Co. LTD por la preparación y asignación de muestras.
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© 2019 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto
distribuido bajo los términos y condiciones de Creative Commons Attribution
28
fermentación
Artículo
Desarrollo de un consorcio microbiano para mejorar
Producción de metabolitos a partir de residuos de alimentos simulados
Nathan D. Schwalm III 1*, Wais Mojadedi 2, Elliot S. Gerlach 1, Marcus Benyamin 2,
1 Mateo A. Perisin 1,*
y Katherine L. Akingbade
1
Comando de Desarrollo de Capacidades de Combate Laboratorio de Investigación del Ejército, FCDDRLSEB, 2800
Powder Mill Road, Adelphi, MD 20783, EE. UU.; elliot.s.gerlach.civ@mail.mil
(ESG); matthew.a.perisin.civ@mail.mil (MAPA)
2
Universidades Asociadas de Oak Ridge, 4692 Millennium Drive, Suite 101, Belcamp, MD 21017, EE. UU.;
wais.mojadedi.ctr@mail.mil (WM); marcus.s.benyamin2.ctr@mail.mil (MB)
* Correspondencia: nathan.d.schwalm.civ@mail.mil (NDSIII); katherine.l.akingbade.civ@mail.mil (ELK);
Tel.: +3013940193 (NDSIII); +3013940604 (KLA)
Recibido: 25 de septiembre de 2019; Aceptado: 22 de noviembre de 2019; Publicado: 27 noviembre 2019
Resumen: La eliminación de desechos de alimentos y el transporte de productos químicos básicos hasta el punto de necesidad
son desafíos importantes en entornos militares. Aquí, proponemos abordar estos desafíos a través del diseño de un consorcio
microbiano para la fermentación de desechos de alimentos a hidrógeno. Primero, simulamos los flujos metabólicos de
intercambio de monocultivos y cocultivos por pares utilizando modelos metabólicos a escala del genoma en un proxy de
desperdicio de alimentos. Identificamos que uno de los principales cocultivos productores de hidrógeno comprendía Clostridium
beijerinckii NCIMB 8052 y Yokenella regensburgei ATCC 43003. Un consorcio de estas dos cepas produjo una cantidad similar
de gas hidrógeno y aumentó el butirato en comparación con el monocultivo de C. beijerinckii, cuando se cultivó en un lodo de
basura artificial. El aumento de la producción de butirato en el consorcio se puede atribuir a la alimentación cruzada de lactato
producido por Y. regensburgei.
Además, el lactato exógeno promueve el crecimiento de C. beijerinckii con o sin una cantidad limitada de glucosa.
Aumentar la escala de la fermentación del consorcio resultó ser un desafío, ya que dos intentos distintos de aumentar la
producción mejorada de butirato dieron como resultado perfiles metabólicos diferentes a los observados en fermentaciones
a menor escala. Aunque las simulaciones del modelo metabólico a escala del genoma proporcionaron un punto de partida
útil para el diseño de consorcios microbianos para generar productos de valor agregado a partir de materiales de desecho,
se requieren refinamientos adicionales del modelo basados en resultados experimentales para predicciones más sólidas.
Palabras clave: butirato; Clostridium beijerinckii; alimentación cruzada; Desechos alimentarios; modelo metabólico a escala
del genoma ; hidrógeno; lactato; Yokenella regensburgei
1. Introducción
La generación de desperdicio de alimentos es un problema global [1,2]. Aproximadamente el 33 % de los alimentos
producidos se desperdicia, lo que contribuye entre el 30 y el 60 % del total de desechos sólidos producidos en todo el mundo [3].
La carga de la eliminación de desperdicios de alimentos se extiende a los entornos militares, donde impone una carga logística
adicional en las operaciones del Ejército [4]. El desecho principal producido por el soldado es la basura relacionada con los
alimentos [4], y las prácticas actuales dictan que los desechos generados en el campo deben ser enterrados o quemados
diariamente [5]. Una alternativa a estas prácticas es la fermentación anaeróbica de los desechos de alimentos a productos
químicos básicos [1]. La fermentación anaeróbica de una sola materia prima de carbono se usa con frecuencia en procesos a
escala industrial para producir biocombustibles [6] y productos químicos básicos [7]. Existen desafíos significativos al aplicar
fermentaciones anaeróbicas a la descomposición de los desechos de alimentos, debido a la complejidad y la inconsistencia de la materia prima de ferm
Utilizando microbios adicionales que pueden soportar la cepa de fermentación primaria como parte de un microbio
El consorcio es una vía potencialmente prometedora para aumentar la viabilidad del desperdicio de alimentos para la conversión
química de valor agregado .
Se están realizando considerables esfuerzos de investigación para aprovechar tanto los consorcios microbianos que
comprenden múltiples genotipos de la misma especie [8,9] como los consorcios de múltiples especies [10,11] para mejorar
la producción de productos químicos a partir de sustratos complejos fácilmente disponibles [12,13]. Los consorcios
microbianos permiten la separación de la descomposición compleja del sustrato y la producción química entre diferentes
especies, lo que puede reducir la carga metabólica en las células individuales y reducir la necesidad de modificar estos microbios [14,15].
La alimentación cruzada de metabolitos de la descomposición del sustrato extracelular [16], la secreción celular [17] o
mediante interacciones directas de célula a célula [18,19] puede respaldar la estabilidad de un consorcio microbiano.
Estas interacciones pueden diseñarse para forzar la dependencia de las cepas auxotróficas entre sí para el crecimiento
[20] o pueden ser el resultado de subproductos metabólicos nativos de un organismo que actúa como sustrato para otro
organismo [21].
El hidrógeno es una fuente de combustible alternativa prometedora a los productos petroquímicos debido a su
alto contenido energético (120 MJ/kg frente a 46,7 MJ/kg de la gasolina) [22]. Los microbios producen principalmente
hidrógeno a través de la fotofermentación de las bacterias púrpuras no azufradas Rhodobacter y Rhodopseudomonas
[23], y durante la fermentación oscura por especies de Clostridium estrictamente anaeróbicas [22]. En las bacterias
moradas sin azufre, la producción de hidrógeno se combina con la utilización de ácidos orgánicos [23]. En las especies
de Clostridium, la producción de hidrógeno se combina con la oxidación de ferredoxina y se acompaña de la producción
de ácidos orgánicos [24], que inhibe la actividad hidrogenasa y la producción de hidrógeno [25]. Se están explorando
consorcios microbianos de Clostridium que generan ácidos orgánicos y bacterias moradas sin azufre que usan ácidos
orgánicos para la producción de hidrógeno [26,27], al igual que consorcios que comprenden múltiples especies de Clostridium [13,28].
El complejo formiatohidrógeno liasa, que se encuentra principalmente en Proteobacteria, produce hidrógeno a través
de la descomposición anaeróbica del formiato [29]. Este complejo también se está explorando como una ruta para la
producción de hidrógeno en Escherichia coli diseñada para expresar una hidrogenasa [29], y como parte de consorcios
microbianos con Clostridium [30].
Los modelos metabólicos a escala del genoma (GSMM), combinados con el análisis de balance de flujo (FBA),
proporcionan marcos predictivos no solo para evaluar los resultados metabólicos de una entrada variable, sino también
para evaluar las interacciones metabólicas entre múltiples microbios. Estos modelos se construyen a partir de
anotaciones enzimáticas del genoma que determinan las reacciones disponibles para cada microbio, lo que da como
resultado una tabla de reactivos/productos por reacción [31]. Luego, estas tablas se envían a FBA para determinar qué
resultados metabólicos son posibles dado un conjunto de entradas, asumiendo un estado estable [32]. Para limitar aún
más el espacio de la solución, se supone que cada microbio optimizará el crecimiento (es decir, la producción de biomasa) [32].
Se ha demostrado que este marco recapitula con precisión los metabolismos de microbios individuales y las interacciones
metabólicas entre los miembros de un consorcio [33–37].
Recientemente, Magnusdottir et al. creó GSMM de aproximadamente el mismo refinamiento para 773 microbios
intestinales y simuló todos los monocultivos y cocultivos con aportes dietéticos occidentales y ricos en fibra [38].
Se predijo que las interacciones ecológicas entre estos microbios variarían según la dieta y si el entorno era aeróbico o
anaeróbico [38]. Perisin y Sund dieron seguimiento a estos hallazgos para predecir si las combinaciones de microbios
podrían producir productos químicos especializados/productos básicos a tasas más altas que los monocultivos [39]. Se
identificaron cocultivos que podrían producir en exceso sustancias químicas de interés, como gas hidrógeno, butanol,
metano, formaldehído, propionato y urea [39].
Desarrollamos un marco para probar experimentalmente la producción de productos químicos básicos a
partir de consorcios microbianos que predijeron producir en exceso sinérgicamente un producto químico
individual (Figura 1). Utilizamos modelos metabólicos a escala genómica y análisis de balance de flujo de cepas
de microbiota intestinal humana que proporcionaron un desperdicio de alimentos simulado para identificar dos
especies de consorcios bacterianos con la mayor producción sinérgica de gas hidrógeno. Luego medimos los
gases y los metabolitos producidos por uno de los consorcios de sobreproducción más altos y sus especies
componentes cuando se cultiva en un medio de lodo de basura artificial (AGS). Además, demostramos la
alimentación cruzada de metabolitos entre las dos especies. Finalmente, intentamos escalar la fermentación
AGS con dos condiciones distintas, fermentación estacionaria o fermentación agitada con control de pH, para evaluar la viabilidad d
30
método. Las fermentaciones experimentales en consorcio mejorarán aún más los modelos metabólicos para futuras
pruebas experimentales.
Figura 1. Marco experimental. Se utilizaron modelos metabólicos a escala del genoma (GSMM) y análisis de
equilibrio de flujo (FBA) para predecir los resultados metabólicos de 298 378 combinaciones por pares de consorcios
microbianos que proporcionaron un medio de desperdicio de alimentos simulado. Se predijo que el consorcio de
Clostridium beijerinckii y Yokenella regensburgei tendría la segunda sobreproducción sinérgica más alta de hidrógeno
en comparación con cualquier cepa individual. Se realizaron fermentaciones a pequeña escala utilizando el consorcio
C. beijerinckii e Y. regensburgei en un medio de lodo de basura artificial para simular el desperdicio de alimentos.
Se midieron el crecimiento (UFC), los metabolitos y el porcentaje de gases producidos en viales de cromatografía de gases.
Se usaron medios usados de cultivos de C. beijerinckii y Y. regensburgei para alimentar de forma cruzada a las
otras especies, y se midió el crecimiento y la producción de metabolitos. Se utilizaron experimentos a pequeña
escala para informar el diseño de fermentaciones a mayor escala de monocultivos y el consorcio de C. beijerinckii y
Y. regensburgei. Los resultados de estos experimentos se pueden utilizar para mejorar aún más GSMM y FBA
formando un marco amplio para probar la producción de productos químicos básicos por parte de consorcios microbianos.
2.1. Modelado metabólico a escala del genoma
Las simulaciones se realizaron como en Perisin y Sund [39]. Los modelos metabólicos a escala del genoma (GSMM)
para Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 y Yokenella regensburgei ATCC 43003 (AGORA v 1.01) se descargaron de la
base de datos Virtual Metabolic Human (http://vmh.uni.lu) [38]. Los límites inferiores para las reacciones de intercambio
de entrada se establecieron para imitar el desperdicio de alimentos de la dieta occidental (Tabla complementaria 1 en [39]).
Todas las simulaciones se realizaron en R v3.4.0 [40] con gráficos creados con ggplot2 v 2.2.1 [41]. Los modelos de lenguaje de
marcado de biología de sistemas (SBML) se cargaron por primera vez con el paquete sybilSBML v 3.0.1 [42] .
Luego, se usaron los paquetes sybil v2.0.4 [43] y glpkAPI v 1.3.0 [44] para manipular modelos y
31
análisis de balance de flujo (FBA). Para las simulaciones de monocultivo, se maximizó el flujo a través de la
reacción de biomasa de cada modelo . A continuación, se usó el flujo de biomasa máximo para ejecutar FBA de
uso parsimonioso de enzimas (pFBA, algoritmo mtf en sybil) de modo que se minimice el flujo absoluto total.
Para las simulaciones de cocultivo, los modelos se combinaron de manera similar a Magnusdottir et al. [38]. Se
utilizó como plantilla el script COBRA [45] de MATLAB , createMultipleSpeciesModel.m que se encuentra en:
https://github.com/opencobra/cobratoolbox, que se basa en la implementación de FBA en Klitgord y Segre [46] .
Este script se convirtió para funcionar en R con el paquete sybil y crea un entorno común para el intercambio de
metabolitos entre modelos, pero no crea un compartimento de host como en la implementación de COBRA.
Después de combinar los modelos, los flujos de intercambio de entrada se actualizaron en función del desperdicio de alimentos de la dieta
occidental como se indicó anteriormente, y se usó pFBA para simular el crecimiento, maximizando simultáneamente el crecimiento de
cada modelo y minimizando el flujo absoluto total.
2.2. Cepas y condiciones de crecimiento bacteriano
Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 (ATCC 51743) y Yokenella regensburgei ATCC 43,003 se obtuvieron
de ATCC. Ambas cepas se cultivaron en condiciones anaeróbicas (5% dióxido de carbono, 5% hidrógeno, 90%
nitrógeno) a 37 ◦C en una cámara anaeróbica Coy y se mantuvieron como stocks a −80 ◦C en medios que
contenían 20 % de glicerol. C. beijerinckii se cultivó de forma rutinaria en medio de crecimiento de clostridios
(CGM) [47] o medio Luria Bertani (LB) (Fisher, Fair Lawn, NJ, EE. UU.), complementado con glucosa al 0,5 %, a
menos que se indique lo contrario. Se usó tiamfenicol (30 μg mL−1) para seleccionar C. beijerinckii cuando fue
necesario [48,49]. Y. regensburgei se cultivó de forma rutinaria en LB suplementado con glucosa al 0,5 % o
medio Brain Heart Infusion (BHI) (Oxoid, Lenexa, KS, EE. UU.). Se utilizó eritromicina (40 μg mL−1) y
crecimiento aeróbico a 37 ◦C para seleccionar Y. regensburgei, cuando fue necesario [49]. El lodo de basura
artificial se generó para modelar los residuos sólidos orgánicos, como se describió anteriormente [50], con
modificaciones limitadas. Brevemente, se mezcló 10 % (p v−1) de alimento para perros (Kibble 'n Bits® Chef
Choice Bistro Oven Roasted Beef, Spring Vegetable & Apple Flavor) en agua destilada y se sometió a autoclave
(121 ◦C, 30 min de exposición). Después del primer ciclo de autoclave, el pH se equilibró a 7,0 mediante la
adición de solución de hidróxido de sodio y se tamponó a fosfato de potasio 50 mM, pH 6,7, antes de un segundo
ciclo de autoclave. Para los experimentos de alimentación cruzada, se cultivaron C. beijerinckii o Y. regensburgei
en LB suplementado con glucosa al 0,5 % durante 24 h y se filtró a través de una membrana PES de 0,2 μm
(Corning, Corning, NY, EE. UU.) para producir medios agotados. Se usaron medios gastados con la adición de
fosfato de potasio 50 mM pH 6,8 durante 24 h adicionales de cultivo de C. beijerinckii o Y. regensburgei. Para
los experimentos que evalúan la capacidad de C. beijerinckii para utilizar lactato exógeno, se añadió a los
cultivos la cantidad indicada de ácido DLláctico (Fluka, St. Louis, MO, EE. UU.) y se neutralizó con hidróxido de
sodio. El crecimiento bacteriano se evaluó midiendo la absorbancia a 600 nm, para experimentos de alimentación
cruzada y suplementos de lactato, o sembrando en placas múltiples diluciones para contar las unidades
formadoras de colonias por mililitro (CFU mL1) en medios selectivos, para experimentos que utilizan AGS.
2.3. Fermentaciones en biorreactores
Las fermentaciones en biorreactor se realizaron en un sistema de fermentación en paralelo DASGIP® (Eppendorf, Jülich, Alemania).
AGS se llevó a pH 6,7 mediante la adición de solución de hidróxido de sodio, después de la adición de fosfato de potasio 50 mM y se
dividió en alícuotas en los recipientes de reacción antes del autoclave (121 ◦C, 30 min de exposición) una sola vez. Para el experimento
del biorreactor de pH controlado, el sistema DASGIP® agregó automáticamente hidróxido de sodio para mantener un pH de al menos 6,7.
La temperatura se mantuvo a 37 ◦C y el espacio de cabeza anaeróbico se mantuvo mediante la adición de nitrógeno a un caudal de 1 L
min−1.
2.4. Cuantificación HPLC de metabolitos
Los productos de fermentación se separaron y cuantificaron utilizando una columna de ácido orgánico
Aminex HPX87H (300 × 7,8 mm; BioRad, Hercules, CA, EE. UU.) en un HPLC Agilent serie 1200 (Agilent
Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) equipado con un detector UV/vis de múltiples longitudes de onda (210 nm
32
y 280 nm) y detector de índice de refracción. Las muestras se filtraron a través de una membrana de PES de 0,2
μm (Corning) y se almacenaron a 4 ◦C hasta que se aplicaron a la columna con un volumen de inyección de 20
μL. La separación se realizó utilizando una fase móvil isocrática que constaba de ácido sulfúrico 3,25 mM a un
caudal de 0,600 mL min−1 durante un tiempo de ejecución total de 55 min, y se controló la temperatura durante
todo el tiempo a 35 ◦C. La cuantificación de acetato, acetona, butirato, etanol, formiato, glucosa y lactato se
realizó mediante el uso de gradientes de concentración estandarizados con estándares de grado HPLC obtenidos
de varios proveedores (no se muestra). Los datos se procesaron utilizando ChemStation (Agilent).
2.5. Cromatografía de gases
La producción de gas hidrógeno y dióxido de carbono se midió utilizando un cromatógrafo de gases
(GC; Infinicon 3000 microGC®) equipado con un detector de conductividad térmica. Se utilizó una columna
capilar 5A de tamiz molecular fijo que usaba argón como gas portador para la cuantificación de hidrógeno
y nitrógeno, y una columna Plot U con helio como gas portador para la cuantificación de dióxido de carbono.
Los datos de GC se procesaron utilizando el software ezIQ y Diablo EZReporter (Diablo Analytical, Antioch, CA, EE.
UU.). Para los experimentos realizados en la cámara anaeróbica, inmediatamente después de la inoculación, se
transfirieron 1,5 ml de cada cultivo a un vial de GC que luego se selló. Para el muestreo del biorreactor, se utilizaron
los mismos parámetros con muestras tomadas automáticamente del espacio de cabeza cada 11 minutos a través de
una configuración en línea. Las tasas de producción de gas se derivaron del porcentaje de salida de gas del GC
utilizando la ley de los gases ideales, el caudal del espacio de cabeza (1 L min−1) y el volumen de fermentación (1 L).
Se usó la regla trapezoidal para aproximar la producción total de gas a partir de las tasas de producción de GC usando integración numérica
3. Resultados
3.1. Las simulaciones de cocultivo predicen una mayor producción de hidrógeno que ambos monocultivos
Un consorcio de C. beijerinckii NCIMB 8052 e Y. regensburgei ATCC 43 003 se identificó originalmente como el
segundo productor de hidrógeno previsto más alto entre 298 378 cocultivos simulados (Tabla 1) [39]. Estas simulaciones
de cocultivo representaron cada combinación por pares de 773 GSMM de microbios intestinales humanos [38]. Tras un
examen más detallado de los flujos de intercambio de salida para el cultivo conjunto de C. beijerinckii y Y. regensburgei
y sus monocultivos, se predijo que C. beijerinckii sería el único productor de hidrógeno (Figura 2). En comparación con
el monocultivo, la adición de Y. regensburgei impulsó la biomasa de C. beijerinckii (Figura 2) y la producción de
hidrógeno (Figura 2). El aumento de la producción de hidrógeno no se debió solo al aumento de la biomasa, ya que
cuando el flujo de hidrógeno se normalizó a la tasa de crecimiento, la tasa de producción de hidrógeno del cocultivo (86
milimoles por gramo de peso de célula seca por hora) fue mayor que la producción de hidrógeno del monocultivo (69
milimoles por hora). milimoles por gramo de peso de células secas por hora). Se predijo que el aumento en los flujos
de producción de cocultivo se debía a la alimentación cruzada de lactato de Y. regensburgei a C. beijerinckii (Figura 2).
Se predijo que la interacción ecológica general sería comensal ya que la tasa de crecimiento de C. beijerinckii aumentó
del monocultivo al cocultivo, mientras que la tasa de crecimiento de Y. regensburgei no cambió (Figura 2). En la Tabla
1 se enumeran consorcios microbianos adicionales que contienen C. beijerinckii que se predijo que tendrían una
producción de hidrógeno dos veces mayor que la de C. beijerinckii sola .
33
Tabla 1. Se prevé que los consorcios microbianos tengan un flujo de hidrógeno de C. beijerinckii superior al doble.
Se predijo que los organismos aumentarían el flujo de hidrógeno más del doble que el flujo de hidrógeno de C.
beijerinckii solo, cuando se simularon en un cultivo conjunto con C. beijerinckii. Cambios en la biomasa predicha
para cada organismo (Δ Biomasa Organismo) y la biomasa predicha de C. beijerinckii (Δ Biomasa C. beijerinckii)
de cocultivos simulados versus monocultivos simulados.
Doble hidrógeno versus Δ Biomasa Δ Biomasa

Organismo
C. Beijerinckii solo C. Beijerinckii Organismo
Yokenella regensburgei ATCC 43003 2,25 0,58 0
Kluyvera ascorbata ATCC 33433 2,20 0,54 0
Hafnia alvei ATCC 51873 2,08 0,48 0

Yersinia rohdei ATCC 43380 2,07 0,49 0
Yersinia kristensenii ATCC 33638 2,07 0,49 0
Vibrio mímico MB 451 2,06 0,43 0
Solobacterium moorei DSM 22971 2,06 −0,34 0,51
Escherichia hermannii NBRC 105704 2,05 0,44 0
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 2,05 0,45 0
Capnocytophaga sputigena ATCC 33612 2,05 0,43 0,21
Lactococcus garvieae ATCC 49156 2,05 −0,29 0,43
Trabulsiella guamensis ATCC 49490 2,01 0,42 0
Celulosimicrobium cellulans J36 2,01 0,37 0,28
Figura 2. Flujo de metabolitos previsto para un consorcio de C. beijerinckii y Y. regensburgei. Simulaciones de
análisis de balance de flujo (FBA) de monocultivos de Clostridium beijerinckii y Yokenella regensburgei (Solo) y
cocultivos de C. beijerinckii y Y. regensburgei (Consorcio) para predecir la producción de (a) biomasa, (b)
hidrógeno, (c) dióxido de carbono, (d) acetato, (e) Llactato, (f) Dlactato, (g) formiato, (h) etanol. C. beijerinckii
Consortium indica la contribución de C. beijerinckii a los metabolitos en el cocultivo FBA y Y. regensburgei
Consortium indica la contribución de Y. regensburgei a los metabolitos en el cocultivo FBA. Las unidades de flujo
simulado son milimoles de metabolitos producidos por gramo de peso de células secas por hora.
34
3.2. Producción de metabolitos por un consorcio de C. beijerinckii y Y. regensburgei
Se predijo que el consorcio de C. beijerinckii NCIMB 8052 e Y. regensburgei ATCC 43,003 (Tabla 1) exhibiría
el segundo aumento más grande en la producción de hidrógeno sobre cualquier cepa bacteriana modelada individual
cuando se le proporcionó un simulante de desperdicio de alimentos. Para probar el potencial de esta interacción in
vivo, las células se cultivaron en un medio de suspensión de basura artificial (AGS) en una cámara anaeróbica.
Después de 24 h de crecimiento, C. beijerinckii y Y. regensburgei se sembraron en placas en medios selectivos para
determinar el número de unidades formadoras de colonias por mililitro de cultivo (CFU mL1) para cada cepa.
Observamos un aumento en CFU mL1 sobre el inóculo para ambas cepas, lo que indica que AGS apoya el
crecimiento de estas bacterias de forma independiente (Figura 3a). Ambas cepas también crecieron dentro de las 24
h en un cocultivo, según lo medido por placas para CFU en medios selectivos (Figura 3a). El recuento de UFC de
cada cepa en los consorcios fue significativamente menor que el de cada cepa individual (Figura 3a). Sin embargo, el
recuento total de UFC de ambas cepas en los consorcios fue mayor que el de los cultivos de C. beijerinckii solo y
similar al recuento de UFC en los monocultivos de Y. regensburgei (Figura 3a). Las células viables no pudieron
recuperarse de forma consistente mediante placas para CFU en momentos posteriores (datos no mostrados),
probablemente debido al agotamiento de un factor de crecimiento esencial o la acumulación de un subproducto tóxico en el medio.
Medimos la producción de gas de C. beijerinckii y Y. regensburgei, solos o como parte de un consorcio, como
un aumento en el porcentaje atmosférico sobre la atmósfera de fondo mediante cromatografía de gases (GC),
después de tres días de crecimiento en el medio de lodo de basura artificial. en viales sellados. C. beijerinckii produjo
aproximadamente un 8 % de hidrógeno por encima del fondo atmosférico, mientras que Y. regensburgei produjo solo
alrededor de un 1 % de hidrógeno por encima del fondo atmosférico, cuando cada uno se cultivó individualmente
(Figura 3b). El consorcio produjo un porcentaje estadísticamente similar de hidrógeno por encima del fondo (p = 0,89,
mediante la prueba t de Student de dos colas) al monocultivo de C. beijerinckii (Figura 3b). Cada cepa individual y el
consorcio de las dos cepas produjeron un porcentaje proporcional aproximadamente equivalente de dióxido de
carbono a hidrógeno (Figura 3b).
Cuantificamos los ácidos orgánicos producidos por C. beijerinckii e Y. regensburgei individualmente y en
consorcio a partir de extractos filtrados mediante HPLC. Tanto los monocultivos de C. beijerinckii como el consorcio
produjeron principalmente butirato, de acuerdo con informes anteriores [28], y el consorcio produjo una cantidad
pequeña pero significativamente mayor que el monocultivo de C. beijerinckii (Figura 3c). Como predijo la FBA (Figura
2), el monocultivo de Y. regensburgei casi no produjo butirato (Figura 3c), pero produjo aproximadamente 30 mM de
lactato, que no se observó ni en el consorcio ni en el monocultivo de C. beijerinckii (Figura 3d). El consorcio produjo
un lactato sustancialmente más bajo de lo que se esperaría, si la Y. regensburgei presente produjera una cantidad
proporcional de lactato a la del monocultivo de Y. regensburgei (Figura 3d). El acetato fue un producto de fermentación
secundario en todos los cultivos, acumulándose hasta aproximadamente 11 mM tanto en el monocultivo de C.
beijerinckii como en el consorcio, y aproximadamente 4 mM en el monocultivo de Y. regensburgei (Figura 3e). Se
consumió una cantidad significativa de formiato en ambos monocultivos, mientras que el consorcio produjo una
pequeña cantidad de formiato (Figura 3f). El consumo de formiato por parte de Y. regensburgei podría ser una
indicación de la actividad de formiatohidrógeno liasa [29], aunque se observaron bajas cantidades de hidrógeno para
los monocultivos de Y. regensburgei (Figura 3b).
35
Figura 3. Producción de metabolitos por un consorcio de C. beijerinckii y Y. regensburgei. Clostridium beijerinckii y
Yokenella regensburgei se cultivaron como monocultivos o como un consorcio en medio de suspensión de basura
artificial (AGS) durante 144 h en una cámara anaeróbica, ya sea en viales de cromatografía de gases (b) o tubos
sellados (a, c, d, e). (a) Unidades formadoras de colonias después de 24 h. (b) Porcentaje normalizado de hidrógeno
y dióxido de carbono medido por cromatografía de gases después de 72 h. (c) producción de butirato, (d) lactato, (e)
acetato y (f) formiato después de 72 h y 144 h. Las unidades para los metabolitos son mM normalizados a los
estándares de HPLC. Se representan gráficamente la media y el error estándar de la media de cuatro repeticiones independientes.
Los asteriscos indican una diferencia significativa entre las muestras indicadas (ns (no significativo), p > 0,05; *, p ≤
0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001 mediante la prueba t de Student de dos colas).
36
3.3. Y. regensburgei alimenta de forma cruzada lactato a C. beijerinckii para la producción de butirato
Presumimos que el lactato producido por Y. regensburgei fue utilizado como fuente de carbono por C.
beijerinckii, que posteriormente produjo butirato adicional, porque se observó una mayor concentración de butirato
en el consorcio que en el monocultivo de C. beijerinckii (Figura 3c). Para examinar esta posibilidad en un sistema
más simple, cultivamos C. beijerinckii o Y. regensburgei en medios gastados filtrados estériles de monocultivos de
24 h de Y. regensburgei o C. beijerinckii que se cultivaron en medio Luria Bertani (LB) suplementado con glucosa
al 0,5 %. . Inicialmente no se observó crecimiento de C. beijerinckii ni de Y. regensburgei en los medios gastados
filtrados estériles (datos no mostrados); sin embargo, la adición de fosfato de potasio 50 mM estéril, pH 6,8, a los
medios gastados filtrados permitió el crecimiento de ambas cepas (Figura 4a), lo que sugiere que la disminución
del pH de los medios inhibió el crecimiento. El crecimiento tanto de C. beijerinckii como de Y. regensburgei fue
significativamente mayor en medios gastados derivados de las especies opuestas (es decir, crecimiento de C.
beijerinckii en medios gastados de Y. regensburgei y crecimiento de Y. regensburgei en medios gastados de C.
beijerinckii ) que lo observado para el crecimiento en medios gastados derivados de la misma especie (es decir,
crecimiento de C. beijerinckii en medios gastados de C. beijerinckii y crecimiento de Y. regensburgei en medios gastados de Y. regensb
(Figura 4a). Esto es consistente con la idea de alimentación cruzada entre las dos especies.
Figura 4. Alimentación cruzada de medios gastados por C. beijerinckii y Y. regensburgei. Clostridium beijerinckii y
Yokenella regensburgei se cultivaron como monocultivos durante 24 h en LB + glucosa al 0,5 % en una cámara
anaeróbica. El medio gastado se filtró en condiciones estériles y se añadió fosfato de potasio 50 mM, pH 6,8.
Los medios usados de cada especie se inocularon 1:100 con cultivos nocturnos de C. beijerinckii o Y. regensburgei
y después de 24 h, (a) OD600, (b) butirato, (c) lactato y (d) un metabolito desconocido que se midieron los eluidos
en el tiempo de elución esperado para la acetona. Las unidades para los metabolitos son mM normalizados a los
estándares de HPLC. Se representan gráficamente la media y el error estándar de la media de seis réplicas
independientes . Los asteriscos indican una diferencia significativa entre las muestras indicadas (*, p ≤ 0,05; **, p
≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001 mediante la prueba t de Student de dos colas).
37
C. beijerinckii aumentó significativamente la concentración de butirato en los medios usados tanto de C.
beijerinckii como de Y. regensburgei, similar al crecimiento en AGS; sin embargo, este aumento fue
sustancialmente mayor en los medios gastados de Y. regensburgei que en los medios gastados de C. beijerinckii
(~700 % frente a ~12 % de aumento) (Figura 4b). C. beijerinckii agota significativamente el lactato de los medios
gastados de Y. regensburgei, junto con el gran aumento de butirato (Figura 4c), lo que sugiere que el lactato
producido por Y. regensburgei respalda el crecimiento adicional y la producción de butirato de C. beijerinckii. Y.
regensburgei produce una cantidad significativa de lactato adicional en los medios gastados de C. beijerinckii y
Y. regensburgei (Figura 4c), lo que sugiere que C. beijerinckii puede producir nutrientes capaces de ser
metabolizados aún más por Y. regensburgei, y que el pH es probablemente un factor limitante para su
crecimiento en LB suplementado con glucosa.
El método de HPLC utilizado para la detección de metabolitos se optimizó previamente para la detección
de ácidos grasos de cadena corta, acetona, butanol y etanol de Clostridium acetobutylicum [51]. Se detectó un
pico que eluía en el momento del pico de acetona esperado en los medios gastados de Y. regensburgei (Figura
4d). No se ha informado previamente que Y. regensburgei produzca acetona, y no codifica los genes necesarios
para producirla [52]. El medio gastado de C. beijerinckii también contiene un metabolito con el mismo tiempo de
elución de HPLC; sin embargo, su área de pico es solo ~25–30% del pico observado en los medios gastados
de Y. regensburgei. C. beijerinckii agota significativamente el metabolito indeterminado cuando se cultiva en
medios gastados de Y. regensburgei (Figura 4d), mientras que Y. regensburgei aumenta significativamente la
concentración del metabolito cuando se cultiva en medios gastados de C. beijerinckii y Y. regensburgei (Figura
4d ). Además, Y. regensburgei acumula ~1,7 veces más del metabolito cuando se cultiva de forma anaeróbica
que aeróbica, a pesar de que los cultivos aeróbicos crecen a una densidad óptica dos veces mayor a 600 nm
(datos no mostrados). La espectrometría de masas de ionización por electropulverización (ESI) se realizó en
una fracción de HPLC recogida del medio gastado de Y. regensburgei correspondiente al pico de acetona.
Los principales picos de relación masa/carga (m/z) que no se identificaron como picos de solvente o portador
estaban en m/z = 171,11 en el espectro ESI+ y m/z = 127,99 y 111,00 en el espectro ESI (datos no mostrados) .
Estos picos no corresponden a un metabolito conocido que podría ser producido por Y. regensburgei dado el
conocimiento actual de su metabolismo. Se requiere más experimentación para determinar el papel de esta
molécula en la posible alimentación cruzada entre Y. regensburgei y C. beijerinckii.
3.4. C. beijerinckii utiliza lactato como fuente de carbono
Dado que C. beijerinckii es capaz de agotar el lactato de los medios gastados de Y. regensburgei (Figura
4c), y el GSMM predijo la alimentación cruzada de lactato de Y. regensburgei a C. beijerinckii (Figura 2),
planteamos la hipótesis de que el lactato podría apoyar el crecimiento de C. beijerinckii con o sin una cantidad
limitada de glucosa. De hecho, la densidad óptica de los cultivos de C. beijerinckii aumentó en comparación con
un control no inoculado en medio LB que contenía ácido láctico 30 mM y fosfato de potasio 20 mM, cuando el
pH inicial se controló a 6,7 con hidróxido de sodio (Figura 5a). Simultáneamente con el aumento de la densidad
óptica, se agotó una cantidad significativa de lactato del medio, lo que sugiere su uso como fuente de carbono
por parte de C. beijerinckii (Figura 5b). Además, C. beijerinckii creció (Figura 5a) y redujo significativamente el
lactato del medio (Figura 5b) en cultivos con glucosa 5 mM y lactato 15 mM en 24 h, aunque la cantidad de
crecimiento fue significativamente menor que la observada en cultivos que contenían 10 mM glucosa durante la
misma duración (Figura 5a). En ambos casos, la glucosa se agotó por completo del medio (datos no mostrados).
C. beijerinckii produjo principalmente butirato en cada una de las tres condiciones, y la cantidad producida se
correlacionó positivamente con la cantidad de glucosa presente (Figura 5c). C. beijerinckii produjo
sustancialmente más etanol en ausencia de lactato, exhibiendo una baja producción de etanol tanto en los
cultivos de lactato solo como en los cultivos de fuente de carbono mixto (Figura 5d).
38
Figura 5. El lactato puede apoyar el crecimiento de C. beijerinckii con o sin glucosa. C. beijerinckii se cultivó en LB +
fosfato de potasio 20 mM pH 6,8 + glucosa 10 mM o lactato 30 mM o glucosa 5 mM y lactato 15 mM, en una cámara
anaeróbica. (a) OD600, (b) lactato, (c) butirato y (d) etanol, se midieron después de 24 h de los cultivos de C. beijerinckii
y controles no inoculados (Medios). Las unidades para los metabolitos son mM normalizados a los estándares de HPLC.
La media y el error estándar de la media de
se grafican cuatro repeticiones independientes. Los asteriscos indican una diferencia significativa entre las muestras
indicadas (ns, *, p > 0,05; **, p ≤ 0,01; ***, p ≤ 0,001 mediante la prueba t de Student de dos colas).
3.5. La producción mejorada de metabolitos por parte del consorcio depende de la condición
Para cuantificar la tasa de producción y la cantidad de gases producidos por C. beijerinckii e Y. regensburgei
solos o como un consorcio, utilizamos un sistema de biorreactor paralelo DASGIP® junto con dos cromatógrafos
de gases para realizar mediciones casi constantes de gases (cada 11 min) de dos réplicas independientes
cultivadas en volúmenes de un litro en AGS. El experimento se realizó con dos conjuntos distintos de condiciones
de biorreactor. Primero, para imitar de cerca los tubos cerrados en la cámara anaeróbica, las mezclas del
biorreactor se dejaron estacionarias hasta quince segundos antes de la recolección de la muestra y no se controló el pH.
En segundo lugar, para mantener el pH óptimo para la producción de hidrógeno por la hidrogenasa de C. beijerinckii [25], el
pH de los recipientes del biorreactor se controló automáticamente a pH 6,7, con agitación continua a 100 rpm durante todo
el experimento.
Los dos experimentos con biorreactor dieron como resultado distintos patrones de crecimiento y producción de
metabolitos tanto para el consorcio como para los monocultivos de C. beijerinckii y Y. regensburgei. En los
experimentos con biorreactores estacionarios sin control de pH, C. beijerinckii creció a una densidad más alta en
monocultivo que en el consorcio a partir de ocho horas después de la inoculación y continuando durante la duración
del experimento, hasta que fue indetectable tanto en el monocultivo como en los consorcios a las 48 h. punto de tiempo (Figura 6a).
Por el contrario, no se observaron diferencias en la cantidad de unidades formadoras de colonias para Y. regensburgei
entre el monocultivo y el consorcio hasta el punto de tiempo de 36 h cuando hubo una disminución de 2 log de Y.
regensburgei en el consorcio. Los niveles de Y. regensburgei disminuyeron aún más a niveles indetectables en el
punto de tiempo de 48 h (Figura 6a). Aunque había una cantidad inicial más baja de C. beijerinckii en el consorcio,
tanto C. beijerinckii como Y. regensburgei estuvieron presentes en cantidades similares de 12 a 24 h (Figura 6a).
Con el control del pH, Y. regensburgei mantuvo un alto nivel de UFC cultivables tanto en el
39
monocultivo y el consorcio, incluso a las 72 h (Figura 7a). Con el control del pH, C. beijerinckii tanto en el
monocultivo como en el consorcio alcanzó una densidad máxima aparente a las 12 h, antes de disminuir a
niveles casi indetectables a las 72 h (Figura 7a).
Los monocultivos de C. beijerinckii y el consorcio produjeron cantidades similares de hidrógeno (Figura
6b) y dióxido de carbono (Figura 6c), sin control de pH, aunque se observó variabilidad entre las muestras.
Con el control del pH, los monocultivos de C. beijerinckii produjeron mayores cantidades de hidrógeno
(Figura 7b) y dióxido de carbono (Figura 7c) que el consorcio. Las cantidades totales de hidrógeno y
dióxido de carbono producidas fueron mayores para las fermentaciones con control de pH que sin él,
aunque se observaron diferencias en la cinética entre los biorreactores individuales de los monocultivos
de C. beijerinckii y el consorcio con control de pH. Y. regensburgei produjo pequeñas cantidades de
hidrógeno (Figuras 6b y 7b) y dióxido de carbono (Figuras 6c y 7c) a lo largo de los experimentos con y sin control de pH.
Figura 6. Metabolitos producidos por el consorcio C. beijerinckii e Y. regensburgei en biorreactores estacionarios.
Clostridium beijerinckii y Yokenella regensburgei se cultivaron como monocultivos o como un consorcio en AGS durante
48 h en recipientes de biorreactor de 1 L. El contenido de los recipientes solo se agitó a 100 rpm durante 15 s antes de
la recolección de cada muestra. (a) Unidades formadoras de colonias, (b) hidrógeno, (c) dióxido de carbono, (d) butirato,
(e) lactato, (f) acetato cuantificados en los puntos de tiempo indicados. Cada réplica se grafica de forma independiente.
Las unidades para la producción de gas son moles de gas producidos por litro de volumen de fermentación (mol L1),
derivados del porcentaje de salida de gas del GC utilizando la ley de los gases ideales, el caudal de espacio de cabeza
y el volumen de fermentación. Las unidades para los metabolitos son mM normalizados a los estándares de HPLC.
40
Figura 7. Metabolitos producidos por el consorcio C. beijerinckii e Y. regensburgei en biorreactores con agitación y
control de pH. Clostridium beijerinckii y Yokenella regensburgei se cultivaron como monocultivos o como un consorcio
en AGS durante 144 h en recipientes de biorreactor de 1 L, manteniendo el pH en 6,7 mediante la adición de
hidróxido de sodio y agitación constante a 100 rpm. (a) Unidades formadoras de colonias, (b) hidrógeno, (c) dióxido
de carbono, (d) butirato, (e) lactato, (f) acetato cuantificados en los puntos de tiempo indicados. Cada réplica se
grafica de forma independiente. Las unidades para la producción de gas son moles de gas producidos por litro de
volumen de fermentación (mol L1), derivados del porcentaje de salida de gas del GC utilizando la ley de los gases
ideales, el caudal de espacio de cabeza y el volumen de fermentación. Las unidades para los metabolitos son mM
normalizados a los estándares de HPLC.
Los monocultivos de C. beijerinckii produjeron principalmente butirato a un nivel más alto que el
consorcio, tanto con control de pH (Figura 7d) como sin control de pH (Figura 6d). Los monocultivos de
Y. regensburgei produjeron principalmente lactato en ambas condiciones (Figuras 6e y 7e). Sin embargo,
la cantidad de lactato producido por Y. regensburgei con control de pH fue menor que la cantidad de
lactato producido por el consorcio (Figura 7e), y la cantidad de lactato producido por Y. regensburgei sin
control de pH fue sustancialmente menor que en cualquier otro experimento (Figura 6e). C. beijerinckii,
Y. regensburgei y el consorcio produjeron niveles similares de acetato (Figuras 6f y 7f) y etanol (datos no
mostrados) como productos de fermentación secundarios en los experimentos con y sin control de pH.
41
4. Discusión
La fermentación anaeróbica de los residuos de alimentos es una alternativa atractiva a otros métodos de
eliminación, para reducir el volumen de residuos y recuperar la energía perdida [1–3]. Aquí, desarrollamos un
marco para probar experimentalmente las predicciones de modelos metabólicos de consorcios microbianos por
su capacidad para producir productos químicos básicos (Figura 1). Hemos establecido que un consorcio de C.
beijerinckii y Y. regensburgei es capaz de producir mayores cantidades de productos químicos básicos a partir de
un medio de desperdicio de alimentos simulado, en comparación con los monocultivos de cualquiera de las
especies. El modelado metabólico a escala del genoma predijo que los cocultivos de C. beijerinckii y Y.
regensburgei darían como resultado una sobreproducción sinérgica de hidrógeno como resultado de la alimentación
cruzada de lactato de Y. regensburgei a C. beijerinckii. Observamos una producción similar de gas hidrógeno por
parte de C. beijerinckii y el consorcio en condiciones estacionarias (Figuras 3b y 6b) y una sobreproducción de
butirato (Figura 3c) y lactato (Figura 7e) de productos químicos básicos por parte del consorcio en distintas
condiciones experimentales. Además, demostramos que C. beijerinckii es capaz de utilizar lactato exógeno como
fuente de carbono (Figura 5) y que Y. regensburgei cruza lactato con C. beijerinckii (Figura 4). Las diferencias en
los metabolitos producidos por el consorcio de C. beijerinckii y Y. regensburgei durante los experimentos con el
medio de lechada de basura artificial (Figuras 3, 6 y 7) muestran la dificultad en el aumento de escala de la
fermentación, pero también demuestran que existen oportunidades para modular la fermentación. Condiciones para la producción de p
4.1. Implementación experimental de predicciones de modelado metabólico a escala del genoma
GSMM y FBA predijeron que el consorcio de C. beijerinckii e Y. regensburgei tendría la segunda
sobreproducción más alta de gas hidrógeno en comparación con cualquier especie individual de modelos de 773
especies de microbiota intestinal [38,39], lo que llevó a su selección para experimentación adicional . Se
observaron niveles similares de hidrógeno para C. beijerinckii y el consorcio de C. beijerinckii y Y. regensburgei
en experimentos a pequeña escala realizados en una cámara anaeróbica (Figura 3). Esta configuración
experimental impidió la cuantificación de gas desde más de un único punto de tiempo. Todos los viales de GC del
experimento tenían el mismo volumen de espacio de cabeza, pero las ligeras variaciones en el crecimiento pueden
haber causado diferentes presiones para cualquier vial determinado en el momento del análisis de espacio de
cabeza. Es posible medir la presión en un vial dado; sin embargo, esto no se hizo, ya que es difícil obtener una
medición de presión sin liberar gas del vial de GC, lo que podría afectar potencialmente las mediciones de
concentración de GC. Se realizó una monitorización continua de GC a lo largo del tiempo a partir de cultivos de
biorreactor de 1 L (Figuras 6 y 7). Para cultivos estacionarios sin control de pH, que imitaban más fielmente el
diseño experimental a pequeña escala, la producción de hidrógeno por parte del consorcio fue similar a la cantidad
de hidrógeno producido por los monocultivos de C. beijerinckii (Figura 6b) . Si bien el consorcio no produjo
cantidades de hidrógeno similares a las de los monocultivos de C. beijerinckii cultivados con control de pH, que
exhibieron las cantidades más altas de hidrógeno producido a partir de cualquier condición experimental probada
(Figura 7b), el modelo FBA no tuvo en cuenta tales condiciones. La manipulación de condiciones simuladas con
modelos FBA podría proporcionar vías adicionales para mejorar la producción de productos químicos básicos.
4.2. Y. regensburgei Alimentación cruzada con C. beijerinckii
En fermentaciones a pequeña escala del AGS, el consorcio produjo una cantidad de lactato sustancialmente
menor de lo que se esperaría si la Y. regensburgei presente produjera una cantidad proporcional de lactato a la
del monocultivo de Y. regensburgei (Figura 3d) . Esto sugirió que la alimentación cruzada prevista de lactato de
Y. regensburgei a C. beijerinckii (Figura 2) puede estar ocurriendo cuando el consorcio se cultivó en AGS.
Clostridium butyricum [53] y Clostridium saccharoperbutylacetonicum [54] se describieron previamente para
metabolizar acetato y lactato a butirato, mientras que varios otros Clostridium, incluido C. beijerinckii, se propusieron
para descomponer el lactato [55]. Aquí mostramos que C. beijerinckii puede metabolizar una cantidad limitada de
lactato, con o sin una cantidad limitada de glucosa (Figura 5).
El mecanismo propuesto para el metabolismo del lactato en Clostridium se basa en la vía de oxidación del lactato
en Acetobacterium woodii, que acopla un lactato dependiente de flavina adenina dinucleótido (FAD)
42
deshidrogenasa con un complejo de flavoproteína de electrones para convertir una ferredoxina reducida, lactato y
dos dinucleótidos de nicotinamida y adenina oxidados (NAD) en una ferredoxina oxidada, piruvato y dos dinucleótidos
de nicotinamida y adenina reducidos (NADH) [53]. Es probable que C. beijerinckii utilice un mecanismo similar , ya
que se encuentra un locus genómico con una homología de secuencia significativa con el locus propuesto para
descomponer el lactato en C. butyricum [53] en C. beijerinckii (Cbei_2884Cbei_2888) utilizando la búsqueda de
alineación local básica Herramienta (BLAST) [56]. Si bien FBA predice que múltiples especies pueden cruzar lactato
con C. beijerinckii, la capacidad de cruzar lactato con Clostridium puede ser algo limitada, ya que las bacterias del
ácido láctico, que producen grandes cantidades de lactato, suelen ser perjudiciales para los esfuerzos por producir
hidrógeno de consorcios microbianos complejos [55]. Además, un experimento piloto que intentó cruzar lactato de
la bacteria del ácido láctico Lactobacillus fermentum con C. beijerinckii no tuvo éxito, ya que L. fermentum produjo
una cantidad significativa de lactato (~30 mM), pero no se observaron cambios en los niveles de lactato o butirato.
observado cuando se cultivó C. beijerinckii en el medio gastado (datos no mostrados).
4.3. Condiciones de crecimiento variables para controlar la producción metabólica
Si bien se observó una pequeña variabilidad en el rendimiento metabólico entre réplicas con cultivos a
pequeña escala (Figura 3), se observó una cantidad sustancial de variabilidad entre todas las réplicas individuales
que contenían C. beijerinckii para los experimentos del biorreactor (Figuras 6 y 7). Parte de esta variabilidad
puede deberse a diferencias en el manejo de los inóculos para los biorreactores frente a los cultivos a pequeña escala.
C. beijerinckii es sensible al oxígeno y la inoculación de los biorreactores requirió una breve exposición al oxígeno a
medida que el inóculo se transportaba desde una cámara anaeróbica al entorno anaeróbico de los biorreactores.
Esta exposición, junto con ligeras diferencias en la fase de crecimiento o la densidad de cultivo de los inóculos de C.
beijerinckii, podría haber sesgado a los biorreactores individuales para que fueran más o menos favorables para el
crecimiento de C. beijerinckii. El AGS es otra fuente potencial de variabilidad, ya que la composición precisa del
componente principal podría haber variado de un barco a otro. El control del pH también podría haber introducido
variabilidad entre las réplicas, porque se añadieron automáticamente cantidades notablemente diferentes de
hidróxido de sodio a cada recipiente, lo que afectó de manera diferente el pH y la osmolalidad del medio. Tanto el
pH como la concentración de sodio pueden tener efectos profundos en la producción metabólica de Clostridium
[57,58].
En los experimentos con control de pH, el consorcio de C. beijerinckii e Y. regensburgei produjo un perfil
metabólico drásticamente diferente al de otros experimentos (Figura 7). Después de una disminución inicial de
lactato , que correspondía a un aumento en las unidades formadoras de colonias de C. beijerinckii (Figuras 7a y 6e),
los cultivos del consorcio produjeron más lactato que los monocultivos de Y. regensburgei. Este aumento en el
lactato correspondió a una disminución en C. beijerinckii, mientras que los niveles de Y. regensburgei permanecieron casi constantes.
Por lo tanto, es probable que Y. regensburgei dominara el perfil de metabolitos de los cultivos y que C. beijerinckii
pudiera haber cambiado su metabolismo para producir lactato adicional o haberse alimentado de forma cruzada con
un metabolito de Y. regensburgei aumentando su producción de lactato. Modificar la producción metabólica de un
consorcio controlando o no el pH del cultivo es un mecanismo que podría usarse para aumentar la agilidad de un
consorcio microbiano diseñado para una aplicación futura.
4.4. Consorcios microbianos con distintos mecanismos de sobreproducción química
El modelado predijo que el consorcio de C. beijerinckii y Y. regensburgei produciría una mayor biomasa de C.
beijerinckii (Tabla 1), debido a la alimentación cruzada de lactato de Y. regensburgei a C. beijerinckii que se observó
experimentalmente (Figura 4). Otros consorcios que se predijo que producirían una mayor cantidad de hidrógeno en
comparación con los monocultivos de C. beijerinckii (Tabla 1) probablemente tengan diferentes mecanismos que
podrían contribuir a la sobreproducción de productos químicos básicos. Por ejemplo, Cellulosimicrobium cellulans
puede descomponer la celulosa y los xilanos [59], polisacáridos complejos comunes en el material vegetal [60], que
son inaccesibles para C. beijerinckii. En contraste con el consorcio de C. beijerinckii y Y. regensburgei, FBA predijo
que la biomasa de C. beijerinckii y Cellulosimicrobium cellulans aumentaría en un cocultivo en comparación con los
monocultivos (Tabla 1), quizás debido al aumento del carbono disponible y al cruce. alimentación de metabolitos
de C. beijerinckii a Cellulsimicrobium cellulans. Del mismo modo, los miembros
43
del género Capnocytophaga puede metabolizar polisacáridos complejos [61] y dióxido de carbono [62], lo que
podría explicar la sobreproducción de hidrógeno pronosticada por un consorcio de C. beijerinckii y
Capnocytophaga sputigena (Tabla 1). La integración de mejoras en el modelo metabólico a escala del genoma
y la prueba de consorcios adicionales con diferentes interacciones previstas podrían permitir el descubrimiento
de vías para mejorar la producción de productos químicos básicos.
5. Conclusiones
Los modelos metabólicos a escala del genoma y el análisis de equilibrio de flujo predijeron que se esperaba que varios
consorcios microbianos produjeran una cantidad significativamente mayor de hidrógeno que cualquier especie individual [39]
(Cuadro 1). Nos enfocamos en el consorcio de C. beijerinckii e Y. regensburgei que se predijo que tendría el
mayor aumento en la producción de biomasa e hidrógeno por parte de C. beijerinckii. El análisis de balance de
flujo predijo el aumento de hidrógeno y biomasa basado en la alimentación cruzada de lactato a C. beijerinckii
(Figura 2). Establecimos que puede ocurrir una alimentación cruzada de lactato de Y. regensburgei a C.
beijerinckii (Figura 4), y que el lactato exógeno es capaz de soportar el crecimiento de C. beijerinckii (Figura 5).
No pudimos demostrar que el cultivo de C. beijerinckii como parte de un consorcio con Y. regensburgei
aumentara la producción de hidrógeno por encima de los niveles observados para los monocultivos de C.
beijerinckii (Figura 3 ). El consorcio fue capaz de producir más butirato (Figura 3c) o lactato (Figura 7e) que los
monocultivos individuales, según las condiciones de crecimiento. Examinar los efectos de agregar otra especie
que se predice que tendrá un papel diferente en la promoción de la producción de hidrógeno que la alimentación
cruzada de lactato al consorcio de C. beijerinckii y Y. regensburgei, o probar que las especies con C. beijerinckii
sola podrían proporcionar una mejor mejora de producción de hidrógeno a partir de la suspensión de basura
artificial que la observada. El marco que se presenta aquí se puede utilizar para examinar un gran número de
posibles combinaciones microbianas utilizando primero modelos metabólicos a escala genómica y análisis de
balance de flujo para predecir consorcios con una mayor probabilidad de convertir desechos en productos
químicos básicos y luego probar experimentalmente los consorcios de mayor producción para su capacidad
para producir productos químicos de interés a partir de materiales fácilmente disponibles.
Contribuciones de los autores: NDS, MAP y KLA conceptualizaron la investigación; MAP realizó el GSMM y FBA, y escribió el borrador original de
la sección de Introducción, Materiales y Métodos y Resultados para el GSMM.
WM realizó el análisis de HPLC y GC y escribió el borrador original de la sección de Materiales y Métodos para
HPLC y GC. NDS y ESG realizaron los experimentos de fermentación del biorreactor y editaron el documento.
MB realizó el análisis de los datos de GC del biorreactor. NDS realizó todos los demás experimentos y escribió el borrador original del resto del
documento.
Agradecimientos: Los autores desean agradecer a los miembros del Laboratorio de Investigación del Ejército del Comando de Desarrollo y
Capacidades de Combate por sus útiles debates y a Yue Li de la Universidad de Maryland por realizar espectrometría de masas.
Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio;
en la recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito, o en la decisión de publicar los resultados.
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© 2019 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los
términos y condiciones de Creative Commons Attribution
47
fermentación
Artículo
Producción de bioetanol a partir de residuos alimentarios aplicando el
Sistema multienzimático producido in situ por
Fusarium oxysporum F3 y cultivos microbianos mixtos
1
George Prasoulas 1, Aggelos Gentikis 1, Aikaterini Konti 2, Styliani Kalantzi 1, Dimitris Kekos y Diomi Mamma 1,*
1 Laboratorio de Biotecnología, Escuela de Ingeniería Química, Universidad Técnica Nacional de Atenas, Campus de
Zografou, 15780 Atenas, Grecia; geo.prasoulas@gmail.com (GP); gentangelos@gmail.com (AG); stykalan@chemeng.ntua.gr (SK);
kekos@chemeng.ntua.gr (DK)
2 Centro Común de Investigación (JRC), Comisión Europea, 21027 Ispra, Italia; Aikaterini.KONTI@ec.europa.eu *
Correspondencia: dmamma@chemeng.ntua.gr; Teléfono: +302107723160
Recibido: 27 de febrero de 2020; Aceptado: 24 de marzo de 2020; Publicado: 26 de marzo de 2020
Resumen: La gestión de residuos y la producción de energía limpia y asequible son dos grandes retos a los
que se enfrentan nuestras sociedades. Los residuos de alimentos (FW), en particular, pueden utilizarse
como materia prima para la producción de etanol debido a su composición rica en celulosa, hemicelulosa y
almidón. Sin embargo, el costo de las enzimas necesarias para convertir FW en etanol sigue siendo un
obstáculo. La producción in situ de las enzimas necesarias podría ser una posible solución. En el presente
estudio se exploró la producción de multienzimas por parte del hongo Fusarium oxysporum F3 bajo cultivo
en estado sólido utilizando diferentes residuos agroindustriales. Los títulos máximos de amilasa,
glucoamilasa, endoglucanasa, bglucosidasa, celobiohidrolasa, xilanasa, bxilosidasa y celulasa total en
salvado de trigo (WB) fueron 17,8, 0,1, 65,2, 27,4, 3,5, 221,5, 0,7, 0,052 y 1,5 U/g WB respectivamente. F.
oxysporum se utilizó para la hidrólisis de FW y la posterior producción de etanol. Para impulsar la producción
de etanol, también se utilizaron cultivos mixtos de F. oxysporum y S. cerevisiae. La producción de bioetanol
por monocultivo de F. oxysporum alcanzó 16,3 g/L (productividad 0,17 g/L/h), mientras que la del cultivo
mixto fue de 20,6 g/L (productividad 1,0 g/L/h). La suplementación del cultivo mixto con glucoamilasa dio
como resultado 30,3 g/L de etanol con una productividad volumétrica de 1,4 g/L/h.
Palabras clave: bioetanol; Desechos alimentarios; producción de enzimas in situ; Fusarium oxysporum F3;
Saccharomyces cerevisiae; cultura mixta
1. Introducción
El desperdicio de alimentos ha sido identificado como un gran problema económico, social y ambiental en la actualidad.
Según las estadísticas oficiales publicadas por Eurostat, cada año se producen en la UE más de 240.000 t de residuos [1].
Los biorresiduos, la fracción orgánica de los residuos sólidos municipales, es decir, los residuos de jardín, cocina y alimentos,
representan un tercio del total de residuos y se consideran un recurso valioso que podría utilizarse como materia prima para
la producción de residuos de alto valor. productos añadidos. Este hecho también se refleja en la Estrategia de Bioeconomía
actualizada de la UE. Una bioeconomía sostenible puede convertir los biorresiduos, los residuos y los descartes en recursos
valiosos y puede crear innovaciones e incentivos para ayudar a los minoristas y consumidores a reducir el desperdicio de
alimentos en un 50 % para 2030 [2]. Sin embargo, el uso de subproductos alimentarios y la conversión de residuos
alimentarios aún es limitado. Esto se debe a las limitaciones actuales en su cuantificación a lo largo de la cadena de
suministro de alimentos, datos limitados sobre su calidad y nivel de homogeneidad, y diferencias en las implementaciones
nacionales de la legislación sobre residuos [2].
La composición de los residuos de alimentos, como ya se ha dicho, no es estable. Presenta importantes
variaciones relacionadas con la estación, la zona y los hábitos alimentarios de la población. A pesar de la inevitable variación
en la composición de los residuos alimentarios, se puede decir indiscutiblemente que son ricos en carbohidratos,
proteínas, lípidos y minerales, lo que los convierte en una materia prima ideal para la producción de biocombustibles a
través de la conversión microbiana [3,4]. La explotación del desperdicio de alimentos para la producción de
biocombustibles también está en línea con la Agenda 2030 para el Desarrollo Sostenible establecida por la ONU en
2015 [5]. Más precisamente, está directamente relacionado con los Objetivos de Desarrollo Sostenible: 7. Energía
Limpia y Asequible, 12. Consumo y Producción Responsable y 13. Acción Climática. A nivel de la UE, la importancia de
producir biocombustibles a partir de biorresiduos se refleja en la Directiva sobre energías renovables 2009/28/CE [6] y
la refundición recientemente adoptada de la Directiva sobre energías renovables, también conocida como RED II [7]. La
citada legislación define como biocombustibles avanzados los 'biocombustibles que se producen a partir de las materias
primas enumeradas en la Parte A del Anexo IX' que incluye, entre otros, la fracción de biomasa de los residuos sólidos
urbanos, la fracción de biomasa de los residuos industriales así como los biorresiduos de hogares La directiva establece
un subobjetivo del 3,5 % para los biocombustibles avanzados dentro del objetivo del 14 % para las energías renovables
en el transporte en 2030. Además, esos biocombustibles seguirán contando el doble para los objetivos.
Desde un punto de vista técnico, la producción de bioetanol a partir de materiales lignocelulósicos es un
proceso bien estudiado y recientemente revisado [8]. Incluye los siguientes procesos: pretratamiento, hidrólisis
enzimática, fermentación y recuperación de etanol. La fase de pretratamiento tiene como objetivo modificar las
características estructurales de la materia prima facilitando el acceso de las enzimas y maximizando la
producción de monómeros de azúcar. La hidrólisis enzimática se dirige a los carbohidratos estructurales
almidón, celulosa y hemicelulosa. Durante este paso, se liberan pentosas y hexosas que se pueden usar más
en el paso de fermentación . En el paso de fermentación subsiguiente, los microorganismos metabolizan esos
azúcares fácilmente disponibles, produciendo etanol, que posteriormente se recupera a través de la destilación.
En términos de costo, el paso más exigente, que aumenta significativamente el costo total de la producción
de bioetanol y se identifica como una barrera en el desarrollo de la producción de etanol, es la hidrólisis
enzimática [9]. Una posible solución a este problema es la producción in situ de las enzimas pertinentes en
lugar de utilizar enzimas disponibles comercialmente [10]. Pocos organismos son capaces de producir las
enzimas necesarias; la mayoría pertenecen a las especies Aspergillus sp., Penicillium sp., Trichoderma sp.
Neurospora sp. [11].
El hongo filamentoso Fusarium oxysporum podría usarse tanto para la producción de enzimas celulolíticas
como para la producción de etanol debido a su capacidad para fermentar tanto hexosas como pentosas [12,13].
El objetivo principal del presente trabajo es, por un lado, la inducción del sistema metabólico de F. oxysporum
para producir las enzimas pertinentes utilizando diferentes materias primas (a saber, paja de trigo, salvado de
trigo, mazorca de maíz), y por otro por un lado, explotar esas enzimas para la hidrólisis de residuos alimentarios
(FW) con el fin de producir etanol. Enfocándose en aumentar la producción de etanol, se estudió la adición de
una glucoamilasa , así como el uso de cultivos mixtos de F. oxysporum y Saccharomyces cerevisiae.
2.1. Materias primas, reactivos, microorganismos
Los residuos de alimentos (FW) utilizados en el presente estudio fueron proporcionados por el profesor
Gerasimos Lyberatos (Laboratorio de Tecnología Química Orgánica, Escuela de Ingeniería Química, Universidad
Técnica Nacional de Atenas), en forma seca y con un tamaño de partícula promedio de aproximadamente 3
mm. FW eran desechos de alimentos domésticos del Municipio de Halandri, Grecia. El concepto de secado se
enfoca en la deshidratación del material resultando en una reducción significativa de su masa y volumen,
facilitando así su almacenamiento y protegiendo los azúcares fácilmente fermentables al inhibir la actividad
microbiana debido al bajo contenido de humedad.
La paja de trigo (WS), el salvado de trigo (WB) y las mazorcas de maíz (CC) se cortaron en partículas de menos
de 3 mm de diámetro.
Todos los productos químicos eran de grado analítico. La glucoamilasa comercial (Spirizyme® Fuel) fue amablemente
proporcionada por Novozymes Corporation (Dinamarca).
50
En el presente estudio se utilizó la cepa de laboratorio F3 de F. oxysporum, aislada del comino [14] .
El cultivo madre se mantuvo en agar patatadextrosa (PDA).
2.2. Análisis químico de FW
La humedad, las cenizas, la grasa bruta, la proteína bruta (método de Kjeldhal) y el contenido total de almidón se
determinaron de acuerdo con los métodos estándar [15]. Los polisacáridos pécticos se determinaron según Phatak et al.
[16], mientras que los materiales solubles en agua, la celulosa, la hemicelulosa y el contenido de lignina insoluble en ácido
descritos por Sluiter et al. [17]. El análisis se llevó a cabo por triplicado.
2.3. Pretratamiento de FW
Los FW secos fueron pretratados como se describe en otra parte [18]. Brevemente, FW a una concentración
del 30% p/v se pretrató a 100 ◦C durante 1 h en presencia de 1 g de ácido sulfúrico/100 g de FW seco. Después
de ajustar el pH a 6,0, el material pretratado (toda la suspensión) se usó en experimentos de fermentación.
2.4. Medios y condiciones de crecimiento para la producción in situ de enzimas
El cultivo en estado sólido (SSC) se llevó a cabo en matraces Erlenmeyer de 100 mL que contenían 3,0 g
de fuente de carbono seca (WB, WS o CC) humedecida con medio mineral de Toyama (en g∙L−1: (NH4)2SO4,
10; KH2PO4, 3, MgSO4∙7H2O, 0,5, CaCl2, 0,5) [19]. El pH del cultivo inicial se ajustó a 6,0 y el nivel de
humedad al 75%. Después de la esterilización por calor (121 ◦ C) durante 20 min, cada matraz se inoculó con
1 ml de suspensión de esporas (aproximadamente 107 conidias) y se incubó a 30 ◦ C en condiciones estáticas.
Los experimentos se llevaron a cabo por duplicado.
2.5. Extracción de enzimas
Después de períodos de tiempo adecuados, las enzimas se extrajeron de la SSC con 10 veces (v/p) de
tampón de citratofosfato 50 mM pH 6,0 mediante agitación (250 rpm) a 25 ◦C durante 60 min. Los materiales
en suspensión y la biomasa fúngica se separaron por centrifugación (12.000 xga 4 ◦C durante 15 min) y el
sobrenadante clarificado se utilizó para medir la actividad enzimática.
2.6. Hidrólisis enzimática de FW
La SSC en la máxima producción de enzimas se complementó con el FW pretratado (relación SSC a
FW, 1/10 p/p) y la cantidad apropiada de glucoamilasa comercial (Spirizyme® Fuel) para lograr 20 y 40
Unidades de glucoamilasa por gramo de almidón. . La contaminación microbiana se evitó mediante la
adición de azida de sodio (0,02 % p/v). La hidrólisis se realizó a 50 ± 1 ◦C en un agitador rotatorio (250
rpm). Las muestras se extrajeron periódicamente, se centrifugaron (10.000 xg durante 10 min) y se
analizaron en busca de glucosa.
2.7. Conversión de FW en Bioetanol
Los residuos de alimentos se convirtieron en etanol aplicando un proceso de dos fases donde la producción de
enzimas bajo SSC se combinó con la sacarificación y fermentación simultánea (SSF) de FW por el hongo mesófilo F.
oxysporum F3 o por un cultivo mixto de este último con la levadura S .cerevisiae . Inicialmente, F. oxysporum F3 se cultivó
bajo SSC, como se describió anteriormente para la producción de enzimas celulolíticas, hemicelulolíticas y amilolíticas. Se
transfirió SSC entera (micelios fúngicos y enzimas producidas in situ) al FW pretratado (proporción SSC a FW, 1/10 p/p). La
fermentación se llevó a cabo en un agitador rotatorio que operaba a 30 ± 1 ◦C y 80 rpm en matraces Erlenmeyer provistos
de tapones de goma especiales, que aseguraban condiciones anaeróbicas y permitían la liberación del dióxido de carbono
producido.
En el caso del cultivo microbiano mixto , se añadió levadura de panadería comprimida (Yiotis, Atenas, Grecia)
correspondiente a 15 mg de levadura por gramo de FW seco inicial.
51
2.8. Métodos analíticos
Las actividades de endoglucanasa (EG), exoglucanasa (EXG), xilanasa (XYL), celulasa total (FPU) y amilasa
(AMYL) se analizaron en carboximetilcelulosa, Avicel, papel de filtro de xilano de madera de abedul y almidón,
respectivamente, como se describe [18,20] . Las actividades de βglucosidasa (βGLU), βxilosidasa (βXYL) y
glucoamilasa (GLAMYL) se determinaron espectrofotométricamente utilizando los respectivos glucósidos de p
nitrofenilo como sustratos [18,20]. Todos los ensayos se realizaron a 50 ◦C y pH 5,0. Los blancos con enzima
inactivada (después de hervir durante 15 min) se usaron como referencia.
Una unidad (U) de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de producto
por minuto.
La concentración de glucosa se determinó utilizando un kit comercialmente disponible (Biosis SA, Atenas, Grecia)
que empleó el método de glucosa oxidasaperoxidasa (GOXPER).
El análisis de etanol se realizó en una columna de cromatografía Aminex HPX87H (BioRad, 300 x 7,8
mm, tamaño de partícula 9 μm). La fase móvil fue H2SO4 5 mM en agua HPLC desgasificada a un caudal
de 0,6 ml/min y la temperatura de la columna fue de 40 ◦C [21].
3.1. Composición de los residuos de alimentos
En general, la composición de los desechos de alimentos es compleja e incluye aceite y agua, así como alimentos
en mal estado y sobrantes de los desechos de la cocina y los mercados. Estas sustancias están compuestas
principalmente por azúcares solubles, polímeros de carbohidratos (pectina, almidón, celulosa y hemicelulosas), lignina,
proteínas, lípidos y una parte inorgánica restante más pequeña. Un alto contenido de humedad conduce a una rápida
descomposición de los desechos orgánicos y la producción de olores desagradables, que pueden atraer moscas e
insectos, que son vectores de diversas enfermedades [22]. La materia prima utilizada en el presente estudio se proporcionó
en forma seca como se mencionó anteriormente. El análisis de composición de FW se presenta en la Tabla 1.
Tabla 1. Análisis químico de FW seco.
Componente % (p/p, base seca)
Materiales solubles en agua a 27,29 ± 1,71
Almidón 10,68 ± 0,07
Celulosa 10,31 ± 0,07
hemicelulosa 11,32 ± 0,02
Pectina 3,27 ± 0,82
Proteína 13,70 ± 3,31
lípidos 12,26 ± 0,11
Lignina 6,75 ± 0,16
Ceniza 5,16 ± 0,20
a Azúcares reductores totales: 4,96 ± 0,94 % (p/p, base seca), sacarosa: 0,51 ± 0,04 % (p/p, base seca), proteína: 0,33 ±
0,02 (p/p, base seca) y almidón soluble: 1,15 ± 0,09 (p/p, base seca).
La composición de FW, carbohidratos, proteínas, lo convierte en una excelente materia prima para la producción
de biocombustibles y productos químicos de base biológica a través de la conversión microbiana. El contenido de
polisacáridos de FW es difícil de utilizar por microorganismos productores de etanol como Saccharomyces cerevisiae.
Se han utilizado diferentes enzimas comerciales (amilasa, glucoamilasa, carbohidrasa, celulasa) para mejorar la
sacarificación de FW [23].
3.2. Producción de multienzimas bajo cultivo en estado sólido
Para que la hidrólisis enzimática de FW sea más rentable, las enzimas deben producirse in situ a
partir de una materia prima barata [11]. SSC tiene varias ventajas biotecnológicas, como una mayor
capacidad de fermentación, una mayor estabilidad del producto final, una menor represión catabólica y
una tecnología rentable [24,25]. SSC es un proceso atractivo para el cultivo de hongos filamentosos porque el sólido
52
Los sustratos tienen características similares al hábitat natural de los hongos, lo que resulta en un mejor
crecimiento y secreción de una amplia gama de enzimas. Seleccionar el sustrato apropiado es un aspecto
extremadamente importante de SSC, ya que el material sólido actuará como soporte físico y fuente de nutrientes
[26]. En el presente estudio se evaluaron tres residuos agroindustriales diferentes, paja de trigo (WS), salvado de
trigo (WB) y mazorcas de maíz (CC) para la producción de enzimas celulolíticas, hemicelulolíticas y amilolíticas
por parte del hongo mesófilo F. oxysporum F3. El salvado de trigo (WB), un intermediario más rico en nutrientes
de la industria de procesamiento de trigo, fue la fuente de carbono más efectiva para la producción de múltiples
enzimas por parte de F. oxysporum F3 (Figura 1 ). La implementación de partículas de mazorcas de maíz (CC) y
paja de trigo (WS) como sustratos se asoció con títulos de enzimas más bajos. Las actividades enzimáticas
máximas se registraron en el quinto día de fermentación. La actividad de amilasa se encontró 5 veces mayor que
la producida en WS y CC, mientras que se produjeron trazas de glucoamilasa en WS y CC. Los títulos máximos
de endoglucanasa, bglucosidasa celobiohidrolasa, xilanasa y bxilosidasa en WB fueron 65,2, 27,4, 3,5, 221,5,
0,7, 0,052 U/g WB, respectivamente, mientras que la actividad de celulasa total fue de 1,5 FPU/g WB.
Figura 1. Producción de enzimas celulolíticas, hemicelulolíticas y amilolíticas por F. oxysporum F3 cultivadas
en estado sólido sobre paja de trigo, salvado de trigo y mazorcas de maíz como fuentes de carbono.
A modo de comparación, F. oxysporum F3 cultivada bajo SSC en rastrojo de maíz como fuente de carbono
dio como resultado títulos finales de endoglucanasa, bglucosidasa, celobiohidrolasa, xilanasa, bxilosidasa de
211, 0,088, 3,9, 1216, 0,052 U/g, respectivamente [27 ]. Además, Trichoderma virens cultivada en WS tratada con
álcali bajo SSC produjo 123,26 y 348 U/g de endoglucasa y xilanasa, respectivamente [28].
Está bien documentado que el tipo y la composición de los carbohidratos presentes en WB son
adecuados para la inducción de celulasas, hemicelulasas y amilasas de hongos filamentosos bajo SSC [24,25].
Dado que el objetivo del presente estudio es la producción de un sistema multienzimático capaz de hidrolizar
los principales polisacáridos presentes en FW, se eligió WB para otros experimentos.
3.3. Hidrólisis de FW por el sistema multienzimático producido in situ de F. Oxysporum F3
Se evaluó el sistema multienzimático de F. oxyporum F3 producido bajo SSC en WB como fuente de carbono
en la hidrólisis de FW. Además, debido al bajo título de glucoamilasa producido, la mezcla de hidrólisis se
complementó con 20 y 40 Unidades/g de FW. La concentración de glucosa aumentó gradualmente con el tiempo
y alcanzó un valor constante a las 69 h (Figura 2a). La liberación de glucosa aplicando el sistema enzimático de
F. oxysporum fue de 33,7 g/L correspondiente a un rendimiento de hidrólisis del 47,4% (basado en el contenido
de celulosa y almidón de FW). Cabe mencionar que la liberación de glucosa por pretratamiento de FW fue de 11,2
g/L. La suplementación de la mezcla de hidrólisis con glucoamilasa (Spirizyme® Fuel) aumentó la liberación de
glucosa en aproximadamente un 25 %.
53
Figura 2. (a) Evolución temporal de la liberación de glucosa durante la hidrólisis de FW por el sistema multienzimático
F. oxysporum F3 (•), suplementado con 20 (), 40 () Unidades/g de almidón Spirizyme® Fuel. (b) Tasa inicial de
liberación de glucosa.
La cantidad de glucoamilasa agregada afecta la tasa inicial de liberación de glucosa (Figura 2b) durante la
hidrólisis. La adición de 20 U/g de glucoamilasa de almidón dio como resultado una mejora del 66% en la tasa de
liberación de glucosa, mientras que un aumento adicional en la carga de glucoamilasa no mejoró el resultado.
3.4. Producción de Bioetanol por Cultivo Microbiano Mixto de F. Oxysporum F3 con la Levadura S. Cerevisiae
Los procesos generalmente utilizados en la producción de bioetanol son la sacarificación y
fermentación simultáneas (SSF) y la hidrólisis y fermentación separadas (SHF). Al realizar la hidrólisis y
la fermentación en un solo paso, el proceso SSF tiene varias ventajas sobre el SHF. En SSF, se evita la
inhibición del producto final de la bglucosidasa y se elimina la necesidad de reactores separados [29].
En el presente estudio, FW se convirtió en bioetanol aplicando el proceso SSF en modo discontinuo. La
producción de etanol a partir de FW por monocultivo de F. oxysporum F3 alcanzó 16,3 g/L después de
94 h de fermentación (Figura 3a) correspondiente al 31,8% del máximo teórico en base a la fracción
soluble y al contenido de carbohidratos (celulosa, almidón y hemicelulosa). ) de FW (Figura 4).
Figura 3. Producción de bioetanol a partir de FW por (a) monocultivo de F. oxysporum F3 (•), suplementado
con 20 () y 40 () Unidades/g de almidón Spirizyme® Fuel; y (b) cultivo microbiano mixto de F. oxysporum
F3 con la levadura S. cerevisiae (•), suplementado con 20 () y 40 () Unidades/g de almidón Spirizyme® Fuel.
54
Figura 4. Valores máximos de producción de bioetanol (g/L) (), rendimiento de bioetanol (g/100 g FW) (),
rendimiento teórico (%) ().
Cuando se complementó el medio de fermentación con 20 U/g de glucoamilasa de almidón, el título de
etanol fue de 23,9 g/L (correspondiente al 46,8,0% del máximo teórico). El aumento de la suplementación con
glucoamilasa no mejoró la producción de bioetanol (Figura 3a). La producción máxima de etanol se registró a
las 139 h de fermentación, y no se encontró un mayor aumento en la concentración de etanol cuando la
fermentación se extendió a 163 h. Las productividades volumétricas del bioetanol estuvieron en el rango de
0,17 a 0,23 g/L/h (Figura 5).
Figura 5. Productividades volumétricas del bioetanol.
Para mejorar la tasa de asimilación de azúcar, se aplicaron cultivos mixtos de F. oxysporum F3 con la
levadura S. cerevisiae con la misma configuración de bioconversión. Los resultados se presentan en la Figura
3b. Como se puede observar, la concentración de etanol a las 18 h de proceso fue de unos 18,3 g/L en el
cultivo mixto de F. oxysporum F3 con S. cerevisiae aproximadamente 7,5 veces superior al valor correspondiente
alcanzado con el monocultivo de F. oxysporum F3 . La fermentación se completó después de 42 h usando
cultivo microbiano mixto y la producción de etanol alcanzó 20,6 g/L (correspondiente al 40,1% del máximo teórico)
(Figura 4). Se alcanzaron concentraciones de etanol de alrededor de 26,8 y 25,1 g/L a las 18 h cuando los
cultivos mixtos se suplementaron con 20 y 40 U/g de almidón de glucoamilasa, mientras que los valores
correspondientes en monocultivos estuvieron en el rango de 1 g/L. La producción máxima de etanol de 29,9 y
30,8 g/L se logró a las 69 h (Figura 3b). Al final de todas las fermentaciones, concentración de glucosa en la fermentación.
55
caldo fue inferior a 2,0 g/l. Las productividades volumétricas oscilaron entre 1,0 g/L/h (cultivo microbiano
mixto) y 1,5 g/L/h (cultivo microbiano mixto suplementado con 20 U/g de glucoamilasa) (Figura 5).
Es evidente que el cultivo microbiano mixto disminuye significativamente el tiempo necesario para que
se complete la fermentación, por lo que aumenta la productividad volumétrica. Se han implementado con éxito
cultivos mixtos de hongos mesófilos, como F. oxysporum F3 y N. crassa, con la levadura S. cerevisiae para la
bioconversión de sorgo dulce y bagazo de sorgo dulce en bioetanol [30,31] . La Tabla 2 resume los resultados
obtenidos de la bioconversión de diferentes tipos de FW.
Tabla 2. Producción de bioetanol a partir de FW aplicando diferentes procesos.
Microorganismo Tipo de Proceso Enzimas Utilizadas Etanol (g/L) Productividad (g/L/h) Referencia
S. cerevisiae SHF amilasa, glucoamilasa 8.0 0.33 [32]

S. cerevisiae 1
SHF enzimas producidas in situ 19.7 0.92 [33]
(levadura seca de panadería)
S. cerevisiae SSF 2 20.0 0.8
Carbohidrasa [34]
S. cerevisiae
amilasa glucoamilasa
SHF celulasa 23.3 0.49 [35]
bglucosidasa
S. cerevisiae SSF glucoamilasa 33.0 0.49 [36]
S. cerevisiae 2
SHF enzimas producidas in situ 58.0 1.8 [37]
enzimas producidas in situ +
F. oxysporum S. cerevisiae SSF 30.8 1.4 Estudio actual
glucoamilasa
1 2
Enzimas celulolíticas producidas a partir del hongo termófilo Myceliophthora thermophila, sistema enzima celulolítica
3
enzimas amilolíticas, celulolíticas y hemicelulolíticas producidas por Aspergillus awamori.
La producción de bioetanol del presente estudio fue de 30,8 g/L, superior a la reportada por Matsakas
y Christakopoulos [33] utilizando enzimas celulolíticas producidas in situ a partir del hongo termófilo
Myceliophthora thermophila. Por otro lado, Kiran y Liu [37] lograron una producción de etanol mucho mayor
(58,0 g/L) utilizando el sistema multienzimático producido in situ por el fugus Aspergillus awamori. Wang et
al. [36] utilizó la metodología de superficie de respuesta para optimizar las condiciones de SSF para la
producción de etanol a partir de basura de cocina. Se reportó una concentración máxima de etanol de 33.0
g/L con las condiciones óptimas de tiempo de 67.60 h, pH= 4.18 y T = 35 ◦C utilizando glucoamilasa en la
etapa de sacarificación. Los desechos de cocina se trataron con una mezcla de enzimas amilolíticas y
celulolíticas, el hidrolizado se convirtió en bioetanol utilizando levadura de panadería seca comercial y dio
como resultado una producción de bioetanol de 23,3 g/L [35].
Las productividades volumétricas de bioetanol oscilaron entre 0,33 y 1,8 g/L/h y la del presente estudio
se encuentra entre las más altas (Cuadro 2). Es evidente que la variabilidad en el contenido de FW de una
región a otra, la concentración de sustrato, el tipo y dosis de enzimas utilizadas y los procesos aplicados
afectan la producción de bioetanol.
El costo de las enzimas sigue siendo alto, y esto se identifica como un desafío importante en el despliegue
de etanol lignocelulósico [9]. Si las enzimas necesarias pudieran producirse de manera eficiente en el sitio, el
costo podría reducirse significativamente. Un estudio reciente ha estimado que este costo de la celulasa se
puede reducir, de 0,78 a 0,58 $/galón, al pasar del enfoque de producción de celulasa fuera del sitio al sitio [38].
4. Conclusiones
En el presente estudio se demostró la factibilidad de producir bioetanol a partir de FW aplicando el sistema
multienzimático producido in situ . El hongo mesófilo F. oxysporum F3 cultivado bajo SSC en salvado de trigo
como fuente de carbono produjo una mezcla de enzimas hidrolíticas capaces de hidrolizar los polisacáridos en
FW. Los cultivos microbianos mixtos de F. oxysporum con la levadura S. cerevisiae aumentaron la productividad
volumétrica del bioetanol en comparación con el monocultivo del hongo. La producción de bioetanol aumentó
aproximadamente un 23 % cuando el cultivo microbiano mixto se complementó con glucoamilasa comercial.
Los resultados del estudio demostraron que los productos enzimáticos no comerciales obtenidos
56
de hongos podría ser una alternativa eficiente a las preparaciones comerciales en tecnologías que
utilizan cargas de sustrato elevadas o donde una carga precisa es imposible debido a limitaciones prácticas.
Contribuciones de los autores: Conceptualización, AK, DK y DM; Metodología, AK y DM; Investigación, GP, AG, SK; Escritura—Preparación del borrador
original, DM; Redacción: revisión y edición, todos los autores. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.
Financiamiento: Esta investigación no recibió financiamiento externo
Agradecimientos: Los autores desean agradecer a Gerasimos Lyberatos del Laboratorio de Tecnología Química Orgánica, Escuela de Ingeniería Química,
Universidad Técnica Nacional de Atenas por proporcionar el FW seco. Los autores también quisieran agradecer a Novozymes Corporation por proporcionar
generosamente las muestras de enzimas de celulosa.
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© 2020 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es de acceso abierto
artículo distribuido bajo los términos y condiciones de Creative Commons Attribution
59
fermentación
Artículo
Biodegradación de Residuos del Palo Santo
(Bursera graveolens) Extracción de aceite esencial y
Su potencial para la producción de enzimas usando Native
Hongos Xylaria del sur de Ecuador
4
Vinicio CarriónPaladines 1,*, Andreas Fries 2, Rosa Elena Caballero 3, Pablo Pérez Daniëls y
Roberto GarcíaRuiz 5
1
Departamento de Ciencias Biológicas, Sección de Ecología y Sistemática, Universidad Técnica Particular de
Loja, San Cayetano Alto s/n CP, Loja 110160, Ecuador
2
Departamento de Geología, Minas e Ingeniería Civil (DGMIC), Universidad Técnica Particular de Loja,
San Cayetano Alto s/n CP, Loja 110160, Ecuador
3
Departamento de Química, Universidad Autónoma de Chiriquí, El Cabrero, David,
Chiriquí PO Box 0427, Panamá
4
Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal, Universidad de Córdoba, Ed. Celestino Mutis,
3ª pta., Campus de Rabanales, 14071 Córdoba,
5
Spain Departamento de Biología Animal, Biología Vegetal y Ecología, Sección de Ecología, Universidad de
Jaén, España, Campus Las Lagunillas, Edificio Ciencias Experimentales y de la Salud (B3), 23071 Jaén, España
* Correspondencia: hvcarrionx@utpl.edu.ec; Tel.: +59372570275 (ext. 3034)
Recibido: 9 de julio de 2019; Aceptado: 17 de agosto de 2019; Publicado: 23 agosto 2019
Resumen: Se analizó la dinámica de degradación de la lignina y la celulosa mediante un experimento de
biodegradación en estado sólido, utilizando residuos de la extracción del aceite esencial del árbol de Palo
Santo (Bursera graveolens). Como tal, dos especies nativas de Xylaria spp. y un hongo exótico Trametes
versicolor se incubaron en el sustrato gastado (Residuos de B. Graveolens, BGR's). Los contenidos
relativamente altos de lignina y celulosa de los BGR (9,1% y 19%, respectivamente) indicaron el potencial
de este recurso para la producción de metano (biogás) y etanol. Sin embargo, la degradación del
contenido de lignina y celulosa podría atribuirse a la actividad relativamente alta de las enzimas lacasa,
celulasa y xilanasa, producidas por los hongos. Los resultados mostraron que las actividades lacasa
(30,0 U/L y 26,6 U/L), celulasa (27,3 U/L y 35,8 U/L) y xilanasa (189,7 U/L y 128,3 U/L) de Xylaria
feejeensis y Xylaria cf. microceras fueron generalmente más altos que T. versicolor (9.0 U/L, 29.5 U/L, 99.5 U/L respectivam
Además, durante el experimento se analizó la dinámica del carbono total (TC: 47,3 %), nitrógeno total (TN:
1,5 %), fósforo total (TP: 0,2 %) y potasio total (TK: 1,2 %) y su importancia para la degradación. proceso
destacado. Los resultados de este trabajo pueden servir como guía para futuros estudios en áreas de
bosque seco, al mismo tiempo que mejoran la comprensión del uso potencial de los hongos nativos como
descomponedores lignocelulósicos ecológicos y para propósitos industriales.
Keywords: Dinámica de descomposición; residuos de Bursera graveolens; xilariáceas; lacasa; celulasa; xilanasa
1. Introducción
El Palo Santo (Bursera graveolens [Kunth] Triana & Planchon; Burseraceae) es una especie arbórea nativa,
caducifolia, dioica, no maderable de áreas de bosque seco y se distribuye desde el occidente de México hasta
el noroeste de Perú. En Ecuador, B. graveolens es nativa de las planicies costeras occidentales y también de
las Islas Galápagos [1]. Particularmente, en las áreas de bosque seco del sur de Ecuador, el árbol de Palo Santo
es la especie de árbol nativo más dominante [2].
El Palo Santo es considerado un recurso vital para las comunidades locales del bosque seco, ya que
diferentes partes del árbol son utilizadas en la medicina tradicional, así como para la extracción de aceite esencial [3].
Además, la madera y los tallos se aplican para prevenir las picaduras de mosquitos y para tratar dolores y molestias
de diferentes orígenes, como el fibrosarcoma, la aterosclerosis y la artritis [4]. La producción de aceite esencial de
diferentes partes del árbol de Palo Santo ha crecido durante las últimas décadas debido al aumento de la demanda
mundial dentro de la industria cosmética y farmacológica. Generalmente, el material leñoso del árbol se utiliza para
la extracción de aceite esencial. Sin embargo, actualmente también se extrae de los frutos, como se practica en
Ecuador.
El proceso de extracción del aceite esencial genera abundantes desechos orgánicos, que comúnmente se
desechan directamente en los ecosistemas naturales o se queman. Los residuos orgánicos pueden causar
problemas ambientales como la contaminación del aire y/o del agua y del suelo debido a la baja capacidad de
degradación natural de estos residuos. El contenido de aceite esencial de las diferentes partes de B. graveolens
es relativamente alto. La madera en forma de leña contiene hasta un 5,2% de aceite esencial y las virutas hasta
un 3,4% [3]. Usando las frutas, el proceso de destilación es menos eficiente porque las frutas frescas solo
contienen hasta un 3% de aceite esencial. Por tanto, al mismo tiempo se produce una cantidad considerable de
residuos orgánicos (al menos el 95% de la biomasa fresca), por lo que es necesaria la gestión de residuos.
Una posible reutilización de estos residuos es la producción de vermicompostas con fines agrícolas.
Sin embargo, los desechos deben mezclarse con otros residuos orgánicos, como desechos de cocina o estiércol
animal, para que el producto sea apto para fines agrícolas [5]. Otro potencial de reutilización es la producción de
enzimas con fines industriales mediante la biodegradación de los residuos con hongos específicos. De hecho, se
sabe que las enzimas microbianas desempeñan un papel crucial como catalizadores metabólicos, por lo que se
utilizan con frecuencia en diversas industrias, entre otras aplicaciones. El uso de enzimas está muy extendido,
especialmente en industrias [6] donde más de 500 productos están hechos de enzimas y alrededor de 150 procesos
industriales necesitan enzimas como catalizadores de células microbianas [7]. Por lo tanto, la demanda de enzimas
industriales aumenta continuamente, lo que conduce a una necesidad creciente de soluciones sostenibles. Los
microbios son una de las fuentes más grandes y útiles de enzimas en la naturaleza [8], pero aún se necesita
investigación debido a la inmensa biodiversidad, particularmente en los países tropicales. Analizar la diversidad de
sustratos y microorganismos potenciales en diferentes ecosistemas, como el bosque seco de Ecuador, puede
ampliar el conocimiento sobre las fuentes de producción de enzimas.
Algunas de las enzimas que se utilizan con frecuencia para aplicaciones industriales son la celulasa, la
lacasa y la xilanasa. Estas enzimas detoxifican los efluentes industriales de las industrias del papel, pulpa,
textil y petroquímica. Además, se utilizan en herramientas de diagnóstico médico, como catalizadores en la
fabricación de medicamentos y como agentes de limpieza para sistemas de purificación de agua. Además,
estas enzimas son necesarias como ingredientes en la industria cosmética, así como para la biorremediación
de herbicidas y pesticidas [9].
La celulasa es especialmente importante como aditivo para detergentes porque cataliza la ruptura de
enlaces químicos y se usa en la industria textil para procesos de limpieza y para reducir la producción de
desechos. Además de esto, la celulasa contribuye a la producción sostenible de biocombustibles de segunda
generación y otros derivados químicos [10]. La lacasa se utiliza para la decoloración de efluentes textiles y el
blanqueo de textiles [11], así como para oxidar compuestos fenólicos y no fenólicos relacionados con la lignina
y otros contaminantes ambientales [12]. Además, las lacasas también se utilizan en la formulación de
biocombustibles, biosensores y la síntesis de nuevas moléculas híbridas [13]. La xilanasa se necesita
principalmente en las industrias de pulpa, papel, alimentos y bebidas, así como para la sacarificación de
biomasa lignocelulósica pretratada para la producción de biocombustibles de segunda generación [14].
En los trópicos, un género de hongo prominente utilizado para la biodegradación y la producción de
enzimas es Xylaria Hill ex Schrank (Xylariaceae, Xylariales, Sordariomycetes, Ascomycota), que comprende
más de 300 especies [15]. Xylaria spp. se consideran productores importantes de diferentes enzimas
ligninolíticas, incluidas lacasa, xilanasa y celulasa [16], además de su capacidad para degradar la lignina [17],
la hemicelulosa [18] y la celulosa de árboles y residuos agrícolas [19–22]. Dentro de los ecosistemas,
62
este tipo de hongo participa en los ciclos del carbono y del nitrógeno [23] y juega un papel importante en los
procesos de biodegradación de la madera y la hojarasca debido a su complejo y diverso sistema enzimático.
En otras aplicaciones biotecnológicas se analizan los sustratos gastados, especialmente las cantidades de lignina,
hemicelulosa y celulosa. La lignina y la hemicelulosa se utilizan en procesos de bioconversión para la producción de
bioetanol, biogás y otros biocombustibles, mientras que la celulosa se utiliza en la fabricación de cosméticos y en el
desarrollo de nuevas fuentes de energía renovable [24]. Además de estos parámetros, la relación C/N del sustrato gastado
es importante, ya que una relación C/N alta puede causar la inmovilización de nutrientes, lo que limita algunos procesos
biológicos como la tasa de respiración y el desarrollo de biomasa microbiana [25]. Además, los nutrientes inorgánicos
(fósforo y potasio) de los sustratos gastados son esenciales durante el proceso de biodegradación, ya que estos elementos
pueden restringir la degradación del sustrato gastado y el desarrollo de las células microbianas [26].
Hasta donde sabemos, los residuos de B. graveolens obtenidos durante el proceso de extracción del aceite esencial
no han sido evaluados por su potencial como sustrato agotado para la producción de enzimas, a pesar de otros recursos
tropicales como la caña de arroz (Oryza sativa), los tallos de banano ( Musa paradisiaca), paja de trigo (Triticum spp.), caña
de azúcar (Saccharum officinarum) y aceitunas (Olea europea) [27] . Además, en Ecuador, sólo dos hongos, a saber, Xylaria
guianensis(Mont.) Fr. y Lentinula edodes(Berk.) Pegler fueron estudiados para la producción de enzimas, en el que el
primero no mostró ninguna actividad enzimática [28,29], lo que subraya la necesidad de más experimentos de biodegradación
con otras Xylaria spp. para ser llevado a cabo.
El objetivo general de este estudio fue evaluar el posible uso biotecnológico de la Xylaria spp.
utilizando residuos obtenidos de la extracción del aceite esencial de Palo Santo (BGR's). Para ello, se
analizó la dinámica de degradación de lignina y celulosa de los BGR's por dos hongos nativos (Xylaria
spp.) de las zonas de bosque seco del sur del Ecuador, y se comparó con el comportamiento de Trametes
versicolor (L.) Lloyd, debido a su conocidas capacidades de degradación y producción de enzimas.
Además, se evaluaron los cambios en los contenidos de carbono, nitrógeno, fósforo y potasio de los BGR
durante el proceso de degradación .
2.1. Identificación de Hongos
Los cuerpos fructíferos de Xylaria spp. fueron recolectados en tocones de madera muerta de árboles de B. graveolens
en el bosque seco tropical del sur de Ecuador (Figura 1). Las muestras fueron analizadas y depositadas en el Herbario de la
Universidad Técnica de Loja (HUTPL), sección Fungarium, utilizando criterios taxonómicos [30,31]. El hongo utilizado como
control fue Trametes versicolor (aislado en MEA: Malt Extract Agar), que fue donado por el Consejo Superior de
Investigaciones Científicas ( CSIC) de España. Este hongo fue seleccionado como modelo debido a su alta actividad
enzimática, especialmente en lacasa, xilanasa y celulosa, durante el proceso de degradación [27].
2.2. Aislamiento, extracción de ADN, PCR y secuenciación de hongos
Luego de la identificación taxonómica de la Xylaria spp. las muestras se desinfectaron con solución de hipoclorito de
sodio al 5% durante tres minutos. Para enjuagar la solución y limpiar las muestras, se usó agua destilada durante tres
minutos. Luego, se aplicó una segunda desinfección con una solución de etanol al 70% durante un minuto. Finalmente, las
muestras se limpiaron nuevamente con agua destilada durante un minuto [20].
Los resultados desinfectados de cada hongo se colocaron por separado en cajas de Petri en MEA (agar
extracto de malta), donde los cultivos celulares se incubaron a 25 ◦C hasta que se completó el crecimiento del
micelio (después de siete días). Después de esto, los hongos individuales se extrajeron y se colocaron
nuevamente en placas de Petri en MEA para garantizar la pureza del aislamiento fúngico.
63
Figura 1. Modelo Digital de Elevaciones (DEM) del Ecuador continental (izquierda) y ecosistemas naturales
de la provincia de Loja (derecha). El mapa fue adaptado del Ministerio del Medio Ambiente de Ecuador [32].
Los símbolos rojos indican el punto de muestreo de la Xylaria spp.
Para asegurarse de que el aislamiento fúngico individual solo contenía las especies de hongos requeridas,
se realizó una extracción de ADN (PCR y prueba de secuenciación), siguiendo el protocolo descrito por Iotti y
Zambonelli [33] y Tamura et al. [34]. La ubicación filogenética de los aislamientos se estableció mediante
observaciones morfológicas y la secuencia de ADN de la región ITS5.8S. Como cebadores universales ITS1/
LR5 o ITS1/NL4: ITS1 5 TCC GTA GGT GAA CCTGGG 3 [35], LR5 5 TCC TGAGGG AAA CTT CG 3 [36], NL4
5 GGT CCG TGT TTC AAG ACGG 3 [35] se utilizaron para amplificar la región ITS5.8S.
Las secuencias de ADN de Xylaria spp. se clasificaron por medio de las especies registradas en la base de datos
GenBank utilizando la búsqueda BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov; ver también (material complementario).
2.3. Preparación y Análisis Químico del Sustrato Usado
El sustrato usado para el experimento de degradación fueron los residuos de frutos de la extracción
del aceite esencial de B. graveolens (BGR's). Los BGR consisten principalmente en la piel y las semillas de
las frutas, que contienen fibra, agua y ácidos grasos [5]. Los residuos se obtuvieron del Instituto de
Productos Naturales de la UTPL (Loja, Ecuador), donde se produce la mayor parte del aceite esencial del país.
Los BGR crudos se secaron a 60 ◦C durante 48 h para evitar la contaminación y el biodeterioro [37].
Luego, el sustrato se tamizó a través de una malla de 2 mm y se determinó el pH. Los contenidos de fibra
detergente ácida (ADF), lignina detergente ácida (ADL) y celulosa en los BGR se analizaron según el
método de Van Soest [38]. Brevemente, las muestras se digirieron con bromuro de cetiltrimetilamonio
(CTAB) durante 1 hora a 150 ◦C y luego los residuos se lavaron con agua destilada y luego se filtraron
(Whatman GF/C) usando una bomba de vacío. Los residuos retenidos en el filtro se secaron al horno y se
pesaron para calcular el FDA y el peso de los residuos después de la digestión se comparó con el peso
original y se determinó la diferencia. Luego, se aplicó una segunda digestión de los residuos con H2SO4
durante 3 ha 25 ◦C. Posteriormente, los residuos se lavaron varias veces con agua destilada para eliminar
el exceso de ácido, luego se secaron en estufa durante un día a 105 ◦C y se pesaron nuevamente. La
ADL se calculó mediante el porcentaje de los residuos después de la segunda digestión en comparación
con el peso del material después de la primera digestión. Finalmente, los residuos de la segunda digestión
se incineraron en un horno por un período de 5 h a 500 ◦C para estimar el contenido de cenizas. El
porcentaje de celulosa se estimó por la diferencia entre ADF y ADL [39].
Los contenidos de carbono total (TC) y nitrógeno total (TN) de los BGR se midieron usando un
autoanalizador CHNS (Elemental Thermo Finnigan Flash EA1112 CHNSO). Los contenidos de fósforo
total (FT) y potasio total (TK) se determinaron después de la digestión ácida siguiendo la metodología
propuesta por Sommer y Nelson [40]. Brevemente, 200 mg de las muestras de BGR trituradas se mezclaron
con 5 mL de una solución de ácido perclórico (60%) y ácido nítrico (60%) en relación 3:5 (v/v), la cual se
ejecutó en un digestor BD40. bloque dividido en dos fases: 90 min a 130 ◦C y 75 min
64
a 204 ◦C. Finalmente, TP y TK se midieron mediante extracciones ácidas en el kit Agilent 750 Series ICPMS.
2.4. Fermentación en estado sólido
Para el experimento de fermentación en estado sólido, se añadieron 20 g de BGR a matraces Erlenmeyer
de 250 mL y se mezclaron con 80 mL de agua destilada. Para evaluar la biodegradación y actividades enzimáticas
a lo largo del tiempo mediante la fermentación de los BGR's, se prepararon diferentes series de ensayo de los
dos hongos nativos seleccionados (Xylaria spp.) y el hongo control T. versicolor (20 matraces Erlenmeyer para
cada tipo de hongo) .
Antes de inocular los hongos en su matraz específico, el micelio creció durante 15 días en MEA, y todos los matraces que
contenían los BGR se esterilizaron en un autoclave Gemmy SA300VF. Después de enfriar los matraces, los hongos individuales
se inocularon utilizando 1 cm2 de cada cultivo celular. Luego, los frascos y su contenido se incubaron a una temperatura de 25 ◦C,
siguiendo el método propuesto para Xylaria spp. por Liers et al. [41] y Rodrigues Negrão et al. [22].
El experimento de fermentación en estado sólido duró 60 días y las muestras se analizaron los días 7, 15, 30 y 60 después
de la incubación. En cada día de muestreo se seleccionaron y examinaron cinco recipientes de cada hongo, elegidos al azar,
aplicando el método de cuarteo [42]. Luego, las cinco muestras seleccionadas de cada hongo fueron transferidas a otros recipientes
para su liofilización. La liofilización se realizó a −4 ◦C y 0,1 mm Hg utilizando un equipo LABCONCO [43].
2.5. Análisis químico y cuantificación de la degradación de BGR
Después de la liofilización, los BGR se analizaron para cuantificar la cinética de degradación en cada día de
muestreo (7, 15, 30 y 60), aplicando los mismos métodos relacionados con la preparación y análisis químico del
sustrato gastado. En el proceso, la relación de degradación de la lignina y la celulosa se calculó mediante la
siguiente ecuación [44]:
Ri (%) = 100 (mes − mi)/mes (1)
donde Ri es el porcentaje de degradación para el muestreo de la semana; mo es el contenido inicial de lignina y
mi es el contenido de la muestra de lignina para cada semana de degradación.
Además, se determinó la reducción de carbono total (TC), nitrógeno total (TN), fósforo total (TP) y potasio
total (TK) de los BGR.
2.6. Ensayo enzimático
Las muestras liofilizadas se mezclaron con agua destiladadesionizada, se filtraron y centrifugaron durante
30 min a 7 ◦C y 8500 rpm, antes del análisis enzimático [45]. La actividad lacasa (EC1.10.3.2; pdifenol: dioxígeno
oxidorreductasa) se determinó mediante la oxidación de siringaldazina (4hidroxi 3,5dimetoxibenzaldehidacina)
en una solución metanólica 0,22 mM [45,46]. La reacción se llevó a cabo a pH 6,5 para medir la quinona
correspondiente a una longitud de onda de 530 nm (ε= 65.000 M−1 cm−1).
La actividad enzimática de la lacasa se definió por la cantidad de enzima que catalizaba la transformación de 1 μmol de sustrato
por minuto.
La actividad de xilanasa se determinó midiendo la reducción de glucosa. Por lo tanto, se utilizó una solución
de xileno al 1 % en un tampón de acetato (50 mM) [47,48]. La reacción se ejecutó a un pH de 5,0 y se midió a
una longitud de onda de 575 nm. Para cuantificar la actividad enzimática se determinó la cantidad de enzima que
reducía 1 μmol de xilosa por minuto.
La actividad celulasa (EC3.2.1.4; β1,4endoglucanasa) se determinó midiendo la formación de
azúcar reducido (glucosa) [48,49] utilizando carboximetilcelulosa (1%) en un tampón de acetato (50
mM) como sustrato La reacción se ejecutó a un pH de 5,0 y el producto se midió a una longitud de
onda de 550 nm. La actividad enzimática se definió por la cantidad de enzima que producía 1 μmol
de glucosa por minuto.
sesenta y cinco
En este estudio, la actividad enzimática se expresa en términos de actividad volumétrica en Unidades por
Litro (U/L). Para obtener el valor de actividad de cada enzima (laccasa, xilanasa y celulasa) y de cada hongo en
el respectivo día de muestreo, se calculó la media aritmética de las cinco muestras analizadas.
2.7. Análisis estadístico
La capacidad de degradación de los hongos estudiados inoculados en los BGR se evaluó mediante un
ANOVA de una vía utilizando el paquete SPSS Statistical Software (v.15.0; SPSS Inc., Chicago, EE. UU.). Las
correlaciones entre las variables medidas fueron determinadas por el coeficiente de correlación de Pearson; la
significación se aceptó en un valor de p < 0,05 en todos los casos. La actividad enzimática de los hongos durante
el experimento de fermentación en estado sólido se evaluó mediante ANOVA de medidas repetidas. Las
diferencias entre las medias se evaluaron a través de la Prueba de Tukey de rangos múltiples (HSD) y se
aceptaron a un nivel de significancia del 5% (pvalor < 0,05).
3.1. Identificación de Hongos
Las secuencias de las Xylaria sp. se compararon con las especies registradas en el
GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) para realizar el análisis filogenético (Tabla 1).
Tabla 1. De accesiones en el GenBank de especies utilizadas para análisis filogenéticos (https://
www.ncbi.nlm.nih.gov ).
Número de colección Número de
Aislados de especies País Referencia
y región de ADN acceso de GenBank
Xylaria feejeensis KF192827
EGJMP22 ITS5.8S India EGJMP30 ITS5.8S India Jagan et al. [50]
Xylaria feejeensis KF177680
HMJAU 22039 ITS5.8S JX256824 China Malasia A2S4 Jagan et al. [50]
Xylaria feejeensis D46 ITS5.8S KJ767110 A1S3D88 ITS5.8S KJ767104 Ma et al. [51]
Xylaria feejeensis Genes; ITS5.8S AB569622 Japón Malasia Teh y Latiffah. [52]
Xylaria feejeensis Tailandia Genes; ITS5.8S AB809464 E6912b ITS5.8S Teh y Latiffah. [52]
Xylaria feejeensis HM992808 EE. UU. GU322460 — GU991523 — Siriwach et al. [53]
Xylaria feejeensis — GU300095 — KF312440 GU300088 EU715634 Srisapoomi et al. [54]
Xylaria feejeensis — EF026123 EF026149 JN198529 GU300086 — BascomSlack et al. [55]
Xylaria feejeensis 1012 ITS5.8S Hsieh et al. [56]
Xylaria feejeensis 860 ITS5.8S Hsieh et al. [56]
Xylaria SGLAf81 ITS5.8S SocaChafre et al. [57]
feejeensis Xylaria 95082001 ITS5.8S Hsieh et al. [56]
—
curta Xylaria hypoxylon Xylaria grammica Jagan et al. [50]
152 ITS5.8S Xylaria bambusicola 162 Hsieh et al. [56]
—
ITS5.8S Xylaria bambusicola 205 Hsieh et al. [56]
—
ITS5.805S Xylaria 805S ITS5.805S Xylaria Hsieh et al. [56]
—
5.8S Xylaria venosula ITS5.8S Wu et al. [58]
Xylaria microceras 414 ITS5.8S Hsieh et al. [56]
Collodiscula japonica CJ ITS5.8S JF440974 Austria Jaklitsch y Voglmayr [59]
Xylaria cf. microceras 1m_VC ITS5.8S KT250967 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
Xylaria feejeensis Cb_VC4 ITS5.8S Xylaria KT250968 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
feejeensis Cn_VC3ITS5.8S Xylaria cf. KT250969 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
microceras VCF1 ITS5.8S Xylaria KT250970 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
feejeensis VCF10 ITS5.8S Xylaria feejeensis KT250971 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
VCF3c ITS5.8S Xylaria feejeensis VCF4c KT250972 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
ITS5.8S Xylaria cf. microceras VCF7 KT250973 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
ITS5.8S Xylaria cf. microceras VCF7c KT250974 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
ITS5.8S Xylaria feejeensis VCF9c ITS5.8S KT250975 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
Xylaria cf. microceras xml_ VC8 ITS5.8S KT250976 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
KT250977 Ecuador CarriónPaladines et al. [60]
Los resultados se muestran en la Figura 2, donde se presentan dos clados, que indican una
concordancia superior al 70%, al analizar las regiones ITS5.8S. Por medio de las secuencias GenBank, un hongo
66
utilizado en este estudio se identificó como X. feejeensis, mientras que el otro hongo nativo no se pudo clasificar
con precisión. La secuencia más cercana estaba relacionada con X. microceras (código de acceso GU300086),
porque la morfología era similar pero la genética diferente. Por lo tanto, este hongo es probablemente una especie
nueva, que debería ser analizada más sistemáticamente. En consecuencia, este hongo se denomina X. cf.
microceras para el presente estudio.
Figura 2. Localización filogenética de X. feejeensis (verde) y X. cf. microceras (rojo) basado en nuestras
secuencias ITS5.8S (en negrita) y las secuencias más relacionadas del GenBank. Solo los valores ≥ 70% se
muestran en los nodos. La secuencia de Camarops ustulinoides con número de acceso AY908991 se utilizó
como grupo externo.
67
3.2. Caracterización del sustrato gastado
La Tabla 2 muestra la caracterización química de los BGR antes de la biodegradación por las tres especies de
hongos. El sustrato usado tenía un contenido promedio de lignina y celulosa de 9,1% y 19,5%, respectivamente. La
media de TC y TN fue de 47,3 % y 1,5 %, lo que dio como resultado una relación C/N media de 30,4. Los contenidos
de TP y TK fueron 0,2% y 1,2% respectivamente. El azufre (S) estuvo ausente en los BGR, lo que indica que el sustrato
es adecuado para la biodegradación porque no se puede emitir SO2 (gas reactivo) [61]. El valor medio de pH del
sustrato agotado fue de 7,0.
Tabla 2. Propiedades bioquímicas de BGR en forma natural, antes de la inoculación con las cepas (X. feejeensis, X. cf. microceras y T.
versicolor) y su desviación estándar en base a cuatro repeticiones.
Compuesto bioquímico Desviación estándar promedio
Lignina (%) 9,1 0,79

Celulosa (%) 19,5 0,91
CT (%) 47,3 0,20
TN (%) 1,5 0,08
relación C/N 30,4 1,57
PT (%) 0,2 0,02
CC.TT. (%) 1,2 0,20
S (%) 0,0 0,00
pH 7,0 0,16
El contenido de lignina es importante para la producción de metano (biogás) [62], donde los desechos de jardín
(lignina: 10,5 %), paja de arroz (10,8 %), cáscaras de Durio zibethinus (11,4 %) y residuos de vinagre (lignina: 12,4 %)
son generalmente utilizado [63]. El contenido de lignina de los BGR's (9,1 %, Tabla 2) es ligeramente inferior al de
estos sustratos, pero superior en comparación con otros residuos, que también se utilizan para la producción de
metano, como las hojas y semillas de Chenopodium album (lignina: 7,7 %). , sus frutas y hortalizas (7,9 %) y semillas
de Durio zibethinus (8,8 %) [63,64], lo que hace que las BGR sean aptas para la producción de metano (biogás).
El contenido de celulosa es importante para la producción de etanol [65], donde generalmente se utiliza cáscara
y piel de plátano (13,2% y 9,2%, respectivamente), así como salvado de arroz. Los BGR (19,5%, Tabla 2) tenían un
contenido de celulosa notablemente más alto, lo que indica que se puede producir etanol potencialmente a partir de los BGR.
Sin embargo, para la fabricación de cosméticos se requieren mayores contenidos de celulosa [24], la cual se puede
encontrar en el sorgo de fibra (Sorghum sp. 41,8%) y en la cascarilla de arroz (Oryza sativa, 33,0%) [66].
El contenido de TC (47.3%) y TN (1.5%) establecen la relación C/N, la cual es importante para los experimentos
de biodegradación, ya que los sustratos con altas relaciones C/N suelen producir la inmovilización de los nutrientes
durante el proceso [25]. El rango óptimo de la relación C/N se encuentra entre 20 y 30, ya que Montingelli et al. [67]
declaró. Para los BGR's se obtuvo una relación C/N casi óptima (30,4), aunque los contenidos de TC y TN fueron
menores en comparación con otros residuos utilizados para la extracción de aceite, como los orujos de aceituna (Olea
europaea; 58,5% TC, 1,8 % TN , relación C/N: 31) o las semillas del litchi (Litchi chinensis 56,1% TC, 1,1% TN; relación
C/N: 51) [68]. Sin embargo, la relación C/N de los BGR es mucho más apropiada que la de estos sustratos agotados,
así como otros sustratos agotados (p. ej., paja de arroz, Oryza sativa; TC: 57,7, TN 0,5 %, relación C/N: 115,0)
utilizados en experimentos de biodegradación [69], lo que subraya la utilidad de los BGR. Además, Motingelli et al. [67]
encontraron que el rendimiento máximo de metano se produce cuando la relación C/N es de alrededor de 30, lo que
además afirma el uso potencial de los BGR para la producción de biogás.
Los contenidos de TP y TK (Cuadro 2) pueden restringir la degradación del sustrato gastado, debido a que estos
nutrientes tienen influencia en la fisiología y el crecimiento de los hongos [26,70,71]. Los BGR mostraron un contenido
promedio de PT de 0,2%, que es similar a los orujos de aceituna y la paja de arroz [68]. Sin embargo, según ElHaddad
et al. [69], los valores óptimos de TP oscilan entre 0,7% y 1,1%, lo que indica una deficiencia de este elemento en los
BGR's. El rango óptimo de TK se encuentra entre 1 % y 3 % [59], lo que indica que el contenido de TK de los BGR (1,2
%, Tabla 2) se encuentra en el extremo inferior del rango óptimo, pero sigue siendo adecuado para experimentos de
biodegradación. Finalmente, el pH neutro de los BGR favorece
68
el desarrollo de los hongos, ya que valores de pH alrededor de 7 incrementan su crecimiento, especialmente para
Xylaria spp. [72].
3.3. Eficiencia de la Degradación de los Tres Hongos en los BGR's
La Figura 3 muestra la degradación de lignina (a) y celulosa (b) de los BGR's en presencia de los hongos. La
degradación aumentó para todos los hongos durante el período de incubación, reduciéndose el contenido original de
lignina entre 15% y 34% y de celulosa entre 28% y 56%.
Figura 3. Degradación de lignina (a) y celulosa (b) de BGR's por hongos nativos de Xylaria spp. y T. versicolor
en fermentación en estado sólido. Las barras muestran el error estándar de la actividad media medida de las
cuatro muestras analizadas en cada día de muestreo. Letras diferentes (a,b) indican diferencia significativa
(p ≤ 0,05%, HSD Tukey).
69
Sin embargo, se encontraron diferencias significativas entre los tipos de hongos, en los que T. versicolor fue el
hongo más eficiente para la degradación de la lignina (33,8 %, Figura 3a), pero el más pobre para la degradación de la
celulosa (28,3 %, Figura 3b). Los dos hongos nativos aislados de la madera de Palo Santo, X. cf. microceras y X.
feejeensis, fueron menos efectivos en la degradación de la lignina (Figura 3a), pero demostraron su capacidad, lo que
también es confirmado por Osono y Takeda [17] y Koide et al. [18]. Estos estudios ilustraron que Xylaria spp. tienen el
potencial de degradar tanto la lignina como la holocelulosa, porque producen una deslignificación selectiva y por lo tanto
tienen una buena capacidad ligninolítica. Además, la alta capacidad de degradación de Xylaria spp. es reportado por
Pointing et al. [73], Chaparro et al. [20] y Rodrigues Negrão et al. [22], quienes consideran a Xylaria spp. dentro del grupo
de los hongos de la podredumbre blanca, que degradan la lignina de forma eficaz.
En cambio, X. cf. microceras fue el hongo más efectivo para la degradación de la celulosa, reduciendo el contenido
de celulosa original de los BGR en aproximadamente un 56,6% durante el período de incubación (Figura 3b), seguido
por X. feejeensis (42,3%) y T. versicolor (28,3). La tasa de degradación relativamente alta de las dos Xylaria spp. son
consistentes con los hallazgos de estudios previos [73], donde se afirmó que todos los taxones de Xylariaceae tienen
altas capacidades para hidrolizar recursos lignocelulósicos.
3.4. Mineralización de TC, TN y Evaluación de Relación C/N
Durante la degradación de la materia orgánica, los hongos necesitan carbono orgánico como fuente
de energía y biomasa, convirtiéndolo parcialmente en CO2 y, en determinadas circunstancias, también en
metano (CH4). El nitrógeno orgánico se transforma principalmente en N disponible (nitrato y amonio) por
los hongos durante la descomposición, y luego se asimila parcialmente para construir nueva biomasa [74].
Por lo tanto, después de 60 días de incubación, el contenido inicial de TC de los BGR se redujo fuertemente,
mientras que el contenido original de TN de los BGR (1,5%, Tabla 1) mostró solo pequeñas variaciones durante
todo el experimento de estado sólido (Tabla 3).
La mineralización de TC fue más alta durante los primeros siete días de incubación para los tres hongos,
cuando se degradó casi el 50 % del contenido inicial de TC. Sin embargo, el contenido de TC fue degradado
más efectivamente por T. versicolor (contenido final: 16,1 %), seguido de X. feejeensis (contenido final: 17,0 %)
y X. cf. microceras (contenido final: 19,1%), lo que se debe a la alta secreción de enzimas celulolíticas de todos
los hongos durante el experimento, debido a que el sustrato gastado es relativamente rico en carbono orgánico.
La mineralización de TC se correlacionó positivamente con la degradación de lignina (0.58, p < 0.01) y mayor con
la degradación de celulosa (0.82, p < 0.01; Cuadro 4). Además, la correlación entre la reducción de lignina o celulosa y
la disminución del contenido de TC en los BGR fue significativa, lo que también se encontró en otras investigaciones [75].
El contenido de NT se mantuvo estable (~1,4 %) durante el período de incubación para los tres hongos (Tabla 3).
Las pequeñas variaciones en el contenido de TN durante el proceso de mineralización pueden explicarse por el moderado
contenido de TN de los BGR. Los hongos utilizaron principalmente el contenido de carbono como fuente de energía y
para construir biomasa. Este hallazgo es confirmado por Rigby et al. [76], quienes afirmaron que el contenido de TN del
sustrato gastado solo se degrada si es necesario para los requerimientos metabólicos de los hongos (células microbianas).
En este caso, el contenido de TC de los BGR's es suficiente para el requerimiento metabólico y desarrollo de los hongos,
mientras que el contenido de TN se mantuvo más o menos estable durante todo el período de incubación. Además , el
contenido moderado de TN de los BGR (inicialmente; 1,5%) hace que el sustrato sea adecuado como fertilizante
orgánico, ya que, según la etiqueta ecológica europea, un fertilizante orgánico no debe superar el 3% de TN .
Como era de esperar, la relación C/N disminuyó notablemente durante el período de inoculación (Cuadro
3) debido a la degradación del contenido de TC de los BGR [77]. La relación C/N se correlacionó positivamente
con la degradación de lignina (r = 0,56, valor de p < 0,01) y celulosa (r = 0,84, valor de p < 0,01), lo que subraya
la relación entre la degradación de TC y la reducción de lignina/celulosa (Cuadro 4).
70
71
T. 3.
Cambios
en
los
constituyentes
bioquímicos
de
los
residuos
de
Palo
Santo
(B.
graveolens)
durante
60
días
de
fermentación
en
estado
sólido,
con
hongos
nativos
Xylaria
spp.
y
versicolor.Cuadro
Parámetro
Relación
C/
N
20,7
±
0,4
17,2
±
1,3
14,1
±
1,0
11,9
±
0,7
21,4
±
1,8
18,4
±
0,6
15,0
±
0,7
13,3
±
0,9
21,1
±
0,4
16,6
±
1,0
13,8
±
0,8
11,7
±
0,5
CC.TT.
(%) PT
(%) TN
(%) CT
(%)
28,4
±
0,8
24,2
±
1,0
20,7
±
1,1
17,0
±
0,4
0,8
±
0,1 0,2
±
0,0 1,4
±
0,0 7
0,5
±
0,1 0,2
±
0,0 1,4
±
0,1
Días
de
incubación
15
X.
feejeensis
0,7
±
0,0 0,3
±
0,0 1,5
±
0,0
30
0,8
±
0,1 0,3
±
0,0 1,4
±
0,1
60
0,7
±
0,1 0,2
±
0,0 1,3
±
0,1 28
±
1,0
25,4
±
1,2
21,7
±
1,2
19,1
±
1,1
26,7
±
0,4
22,7
±
0,7
19,6
±
0,8
16,1
±
0,7
7
0,5
±
0,1 0,3
±
0,0 1,4
±
0,0
Días
de
incubación
X.
cf.
microceras
15
0,7
±
0,0 0,3
±
0,0 1,4
±
0,1
30
0,8
±
0,1 0,3
±
0,0 1,4
±
0,1
60
0,7
±
0,1 0,2
±
0,0 1,3
±
0,0
7
0,6
±
0,1 0,3
±
0,0 1,4
±
0,1
Días
de
incubación
15
T
versicolor
0,7
±
0,1 0,3
±
0,0 1,4
±
0,1
30
0,8
±
0,0 0,3
±
0,0 1,4
±
0,0
60
Fermentación 2019 , 5, 76
Tabla 4. Coeficiente de correlación de Pearson entre propiedades de BGR. Se muestra una correlación significativa en p <
0,05 (*) y p < 0,01 (**).
Celulosa (%) TC (%) TN (%) C/N TP (%) TK (%)
Pérdida de lignina (%) 0,457 ** 0,581 ** −0,377 ** 0,821 0,564 ** −0,265 * 0,164

Celulosa (%) ** −0,683 ** 0,835 ** −0,372 ** 0,383 **
CT (%) −0,666** 0,967 ** −0,446 ** 0,442 **
TN (%) −0,827 ** 0,550 ** 0,636 **
C/N −0,516 ** 0,571 **
PT (%) −0,385 **
3.5. Mineralización de Fósforo y Potasio
El contenido de TP de las tres series de prueba aumentó ligeramente de 0,2 % a 0,3 % durante el
experimento de estado sólido (Tabla 3). Esto es causado por la transformación del fósforo orgánico (Po) en
su forma inorgánica (Pi) [78]. El Pi soluble se incorpora luego a la MO de los hongos para formar biomasa.
Estos resultados coinciden con los informados por Kuehn y Suberkropp [79], quienes también observaron un
aumento de PT al inocular diferentes hongos en la hojarasca en descomposición de Juncus effusus.
El rango óptimo de contenido de PT en el abono orgánico se encuentra entre 0,15% y 1,5%, lo que convierte a los BGR en un recurso
adecuado para los mejoradores de suelo.
El contenido inicial de TK de los BGR (1,2 %, Tabla 2) se redujo al 50 % después de los primeros 15
días de incubación por los tres hongos, y luego los valores aumentaron nuevamente, alcanzando el valor final
de aproximadamente 0,8 % en el último muestreo. día (Cuadro 3). El potasio es un nutriente muy móvil e
inestable , que los hongos necesitan particularmente al comienzo del proceso de degradación [80].
Sin embargo, el aumento de TK al final del período de incubación probablemente se debió a la mineralización de la MO y la producción
de CO2 por parte de los hongos. El rango típico de potasio en fertilizantes orgánicos es 0.41.6%, lo que indica que los BGR's no
presentan deficiencia en este nutriente. Además, el contenido normal de TK de los BGR induce un buen equilibrio C/N, porque los TK
juegan un papel importante en el metabolismo del carbono (C) y del nitrógeno (N) [81].
3.6. Actividades enzimáticas
La degradación de la lignina y la celulosa es consecuencia de la actividad enzimática de los hongos, que es causada principalmente
por la producción de las enzimas lacasa, xilanasa y celulasa [44,82].
La Figura 4 muestra la variación en las actividades de lacasa (a), xilanasa (b) y celulasa (c) para los tipos de
hongos individuales durante el período de incubación.
3.6.1. Actividad de lacasa
Se detectó actividad lacasa para los tres hongos en el primer día de muestreo (Figura 4a), lo que
probablemente se debió a la ausencia de azufre (S) y a los contenidos moderados de TC y TN de los BGR
(Tabla 2), lo que facilitó la descomposición inmediata. de lignina [83]. La variabilidad temporal de la actividad
lacasa de X. feejeensis y T. versicolor fue similar, aumentando notablemente durante los primeros siete días
de incubación (33,5 U/L y 32,4 U/L; respectivamente), y permaneciendo después más o menos estable hasta
el final . del período de incubación (valores finales: de 33,7 U/L, X. feejeensis; 31,5 U/L, T. versicolor). X. cf.
microseras mostró un comportamiento diferente, especialmente durante los primeros siete días de incubación,
cuando se detectó la actividad lacasa más baja de los tres hongos (15,6 U/L), y durante el final del período de
incubación, cuando la actividad lacasa de X. cf . microceras aumentó notablemente, alcanzando 41,3 U/L,
que fue el valor más alto de todas las series de ensayo durante todo el período de observación.
72
Figura 4. Actividades de lacasa (a), xilanasa (b) y celulasa (c) en BGR's con especies nativas de Xylaria
spp. y T. versicolor incubadas a 25 ◦C. Las barras muestran el error estándar de la actividad media medida
de las cuatro muestras analizadas en cada día de muestreo. Letras diferentes indican diferencia significativa
(p ≤ 0,05%, HSD Tukey).
73
Sin embargo, se esperaba la variabilidad en la producción de la enzima lacasa, ya que, como Dong et al. [44] ,
la lacasa actúa sinérgicamente con otras enzimas degradantes de la lignina, como la polifenol oxidasa (PPO) y la
manganeso peroxidasa (MnP).
La actividad lacasa observada de los tres hongos estudiados parece ser baja en comparación con otros estudios
[41], pero estas investigaciones aplicaron fermentación líquida (sustratos líquidos agotados) y utilizaron 2,5xilidina o
alcohol veratrílico como inductor enzimático, lo que aumenta la lacasa. actividad en particular [84].
El experimento de estado sólido de este estudio no utilizó ningún inductor enzimático, lo que explica la actividad de
lacasa relativamente baja de T. versicolor y Xylaria spp. Sin embargo, las investigaciones que utilizan sustratos sólidos
obtuvieron valores de actividad similares a los observados aquí [20,85]. Generalmente, todas las Xylaria spp. tienen
una capacidad inusualmente alta para degradar la lignina en comparación con otros Ascomycota, como Liers et al.
[23] y Rodrígues Negrão et al. [22] declaró, porque Xylaria spp. mineralizan la lignina casi tan eficientemente como los
hongos agresivos de la pudrición blanca (p. ej., T. versicolor).
Además de la fermentación sólida aplicada, la actividad moderada de la enzima lacasa puede deberse al bajo
contenido de lignina de los BGR (9,1%; Tabla 2), que provocan una reducción en la producción de lacasa.
Como Coronel et al. [85] , la actividad enzimática está muy influenciada por la composición química del sustrato
donde se incubó el hongo. Por lo tanto, la actividad lacasa promedio de todos los hongos fue más o menos similar
(X. feejeensis: 30,0 U/L; T. versicolor: 29,5 U/L; X. cf. microceras: 26,6 U/L). Sin embargo, el análisis estadístico
mostró que una diferencia significativa entre X. cf. microceras y los otros dos hongos (X. feejeensis y T. versicolor)
con respecto a la actividad de lacasa existe (valor de p < 0,05; Figura 4a, letras diferentes), mientras que no se
encontraron diferencias entre X. feejeensis y T. versicolor (Figura 4a , letras similares).
3.6.2. Actividad de xilanasa
La xilanasa también actúa sinérgicamente con otras enzimas hidrolíticas, como la esterasa, para modificar la
configuración estructural de las lignocelulosas [44], lo cual es necesario para que la celulosa sea accesible para la
degradación. Por ejemplo, la esterasa, en combinación con la xilanasa, escinde los enlaces covalentes entre
polisacáridos o hemicelulosas y, por lo tanto, juega un papel clave en la degradación de la matriz de hemicelulosa
[82]. El presente estudio prueba la degradación preliminar de la matriz de ligninahemicelulosa porque se detectó
actividad de xilanasa en las tres especies de hongos en el primer día de muestreo, alcanzando valores entre 100,7 U/
L y 196,0 U/L (Figura 4b).
Durante todo el período de observación, la actividad de xilanasa de X. feejeensis siempre fue más alta en
comparación con los otros dos hongos, excepto el día 15 cuando la actividad de X. feejeensis disminuyó y valores
similares para Xylaria spp. se midieron (140,8 U/L y 141,6 U/L). La mayor actividad de X. feejeensis se observó el día
30 con 284,3 U/L, pero luego la actividad disminuyó. La actividad de xilanasa de X. cf. microceras y T. versicolor
comenzaron con valores más bajos (150.3 U/L y 100.7 U/L respectivamente), pero sus curvas de actividad mostraron
comportamientos similares (Figura 4b), disminuyendo levemente entre el día 7 y el día 15 después de la incubación y
luego se mantuvieron casi estables durante el resto del período de observación, alcanzando valores finales de 117,9
U/L (X. cf. microceras) y 99,0 U/L (T. versicolor). Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre X.
feejeensis y las otras dos especies de hongos, pero entre X. cf. microceras y T. versicolor no fueron significativos
(Figura 4b).
En general, X. feejeensis y X. cf. microceras mostró una mayor actividad de xilanasa en comparación con T.
versicolor, pero también con otras Xylaria spp. que fueron inoculados en experimentos de estado sólido [23].
Todas las Xylaria spp. puede degradar la hemicelulosa de manera efectiva [18,19], pero las dos Xylaria spp.
estudiado aquí mostró valores de actividad aún más altos que los informados en la literatura y, por lo tanto, podría
ser adecuado para la producción comercial de xilanasa requerida para procesos industriales en la industria del
papel, alimentos y vinos. T. versicolor también mostró una alta actividad de xilanasa, aunque la producción de
xilanasa de esta especie de hongo suele ser baja y se necesita un mecanismo inducible (inductor de enzimas) para
aumentar la actividad. Irbe et al. [86] utilizaron alcohol de glicerol como inductor y observaron un aumento notable
en la actividad de xilanasa y la producción de enzimas. Sin embargo, en este estudio no se aplicó ningún inductor,
pero la actividad de xilanasa fue alta para los tres hongos, lo que probablemente se deba al contenido de xilano de los BGR. Xylan es el
74
segundo polisacárido hemicelulósico más abundante en la naturaleza y presente en las paredes celulares de las
plantas [43]. Los residuos de la extracción del aceite esencial de Palo Santo consisten principalmente en partes de
las frutas frescas [5] y, por lo tanto, el contenido de xilano no se redujo por otros procesos de degradación, lo que
podría explicar la alta actividad de xilanasa de los tres hongos.
3.6.3. Actividad de celulasa
Como era de esperar, la actividad de la celulasa se retrasó (Figura 4c), porque la matriz de ligninahemicelulosa
tuvo que degradarse primero para hacer accesible la celulosa [44], lo que indica que la celulasa es una enzima
inducible [87]. Como afirmaron Arantes y Sadler [88] , las regiones de celulosa están estrechamente empaquetadas
con lignina y hemicelulosa, que es el principal factor que contribuye a la resistencia de la celulosa a la degradación.
Por lo tanto, se necesita la amorfogénesis, un proceso que consiste en la degradación de la lignina y la hemicelulosa,
para liberar la celulosa, que luego puede ser degradada por la celulasa.
La actividad de celulasa de las dos Xylaria spp. se detectó el primer día de muestreo, en contraste con T.
versicolor, donde no se midió actividad significativa hasta el día 30 (Figura 4c). El hongo X. feejeensis alcanzó
su máxima actividad (49,2 U/L) el día 30, mientras que X. cf. microceras alcanzó su punto máximo el día 15
(59,5 U/L), que fue al mismo tiempo el valor más alto de las tres especies de hongos durante todo el período
de observación. T. versicolor no mostró actividad celulasa hasta el día 15 de incubación y luego mostró un
aumento casi lineal hasta su valor máximo y final de 28,7 U/L en el último día de muestreo.
En general, el sistema enzimático de la celulasa consta de tres tipos de enzimas; endo1,4βglucanasa
(celulasa), celobiohidrolasa o exoglucanasas (avicelasa) y βglucosidasa (celobiasa), que actúan en conjunto para
degradar el contenido de celulosa del sustrato gastado [44]. Como Du et al. [89] demostraron que T. versicolor
primero degrada la celulosa a través de la enzima celobiasa (βglucosidasa), y luego en combinación con la enzima
celulasa, por lo que se observó un retraso en la actividad de la celulasa de T. versicolor. Por el contrario, la Xylaria
spp. produjo la enzima celulasa inmediatamente después de la incubación para degradar el contenido de celulosa.
Como también se muestra en la Figura 4c, los valores máximos de actividad de celulasa de los hongos
individuales no se alcanzaron simultáneamente, debido a los diferentes requerimientos metabólicos de cada hongo.
La diferencia puede deberse al tipo de hongo utilizado (Basidiomycota y Ascomycota), ya que T. versicolor es un
hongo de pudrición blanca, que está específicamente indicado en la degradación de la lignina. Además, la menor
actividad de celulasa de T. versicolor podría ser consecuencia del sustrato utilizado (sólido), ya que T. versicolor
puede producir hasta 100 U/L de celulasa cuando se inocula en medios líquidos [90].
Las diferencias en la actividad de la celulasa también se muestran mediante el ANOVA de medidas
repetidas, en el que no se observaron diferencias significativas entre X. feejeensis y X. cf. microceras, pero las
diferencias entre Xylaria spp. y T. versicolor fueron significativos (valor p < 0,05). En general, la producción
promedio de celulasa de Xylaria spp. fue notablemente mayor (27,3 U/L a 35,8 U/L) en comparación con T.
versicolor (9,0 U/L), especialmente durante los primeros 30 días de incubación.
La alta actividad celulasa de las dos Xylaria spp. es consistente con los resultados de investigaciones previas
que comparan la producción enzimática de diferentes especies de hongos [19,73]. Estos estudios demostraron que
Xylaria spp. son productores potenciales de enzimas celulolíticas, debido a su alta actividad celulolítica, y por lo
tanto pueden ser utilizadas tanto en aplicaciones biotecnológicas como con fines industriales. Así lo confirman
GutiérrezSoto et al. [16], quienes midieron la actividad celulasa de Xylaria spp. hasta 199 U/L. Sin embargo, estos
estudios incubaron los hongos en medios líquidos; en sustratos gastados sólidos , la actividad es generalmente
más baja [23]. La variación en la actividad de la enzima celulasa de Xylaria spp. aparentemente depende de dos
factores: primero, la especie [73] y segundo, el tipo de sustrato [19].
75
4. Conclusiones
El contenido de lignina y celulosa en los BGR's hace que el sustrato sea apto para aplicaciones
biotecnológicas, especialmente para la producción de metano y etanol. Además, los contenidos de los
macronutrientes estuvieron dentro del rango óptimo y, por lo tanto, los BGR se pueden aplicar a los suelos
como fertilizantes.
Los BGR también eran adecuados para la producción de enzimas con fines industriales mediante
degradación fúngica. La nativa Xylaria spp. mostraron generalmente una actividad enzimática más alta
que el hongo de control y fueron especialmente prácticos para la producción de xilanasa y celulasa.
Materiales complementarios: los materiales complementarios se pueden encontrar en http://www.mdpi.com/23115637/5/3/76/s1.
Contribuciones de los autores: Análisis formal, VCP. y FA; Investigación, VCP.; Metodología, VCP., REC y RGR.; Supervisión, RGR.; Validación, PPD;
Redacción—borrador original, VCP., REC y RGR.; Redacción: revisión y edición, VCP., AF, PPD y RGR.
Financiamiento: Esta investigación fue financiada por la Secretaría de Ciencia y Tecnología de Ecuador (SENESCYT—CEREPS—2007) y la Universidad
Técnica Particular de Loja (UTPL).
Agradecimientos: Agradecemos a la Secretaría de Ciencia y Tecnología del Ecuador (SENESCYT), al
Ministerio del Ambiente del Ecuador (MAE, permisos de investigación 015ICUPNDRLEOZCHMA y
0272013DPLMA) y al Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Técnica Particular de Loja
por su apoyo. Agradecimiento especial al Consejo Superior de Investigaciones Científicas ( CSIC) de
España por su generosa contribución. Finalmente, nos gustaría agradecer a Gregory Gedeon por la revisión del texto.
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© 2019 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido bajo
80
fermentación
Artículo
Levadura gastada de procesos cerveceros: una biodiversa
Material de partida para la producción de extracto de levadura
Friedrich Felix Jacob 1*, Lisa Striegel 2, Michael Rychlik 2, Mathias Hutzler 3 y
1
FrankJürgen Methner
1 Technische Universität Berlin—Institut für Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie—Fachgebiet Brauwesen, Seestraße
13, 13353 Berlín, Alemania; frankjuergen.methner@tuberlin.de Technische Universität München—
2 Lehrstuhl für Analytische Lebensmittelchemie, MaximusvonImhofForum 2, 85354 Freising,
Alemania; lisa.striegel@tum.de (LS); michael.rychlik@tum.de (MR)
3 Technische Universität München—Forschungszentrum Weihenstephan für Brauund Lebensmittelqualität,
Alte Akademie 3, 85354 FreisingWeihenstephan, Alemania; m.hutzler@tum.de
* Correspondencia: f.jacob@campus.tuberlin.de
Recibido: 5 de junio de 2019; Aceptado: 20 de junio de 2019; Publicado: 24 junio 2019
Resumen: La levadura gastada de la fabricación de cerveza es un material de partida rentable y rico en nutrientes
para la producción de extractos de levadura. En este estudio, se muestra cómo los ingredientes fisiológicamente
importantes en un extracto de levadura están influenciados por la composición de la levadura gastada del proceso
de elaboración de la cerveza. En las fermentaciones piloto, se varió el tiempo de cultivo (fermentación primaria,
lagering) de la levadura gastada y la gravedad original (12 ◦P, 16 ◦P, 20 ◦P) del medio de fermentación, y se
utilizaron cuatro cepas de levadura no Saccharomyces alternativas. se compararon con dos cepas comerciales
de levadura Saccharomyces. Además, la levadura gastada estaba contaminada con el spoiler de cerveza
Lactobacillus brevis. Se investigó la composición general de nutrientes (proteínas totales, grasas, cenizas), así
como el espectro de aminoácidos proteinogénicos, los diversos vitámeros de folato (5CH3H4folato, 5CHO
H4folato, 10CHOPteGlu, H4folato, PteGlu) y la actividad biológica (reducción, potencial antioxidante) de un
extracto de levadura producido mecánicamente (sonotrodo ultrasónico) y autolíticamente. Todos los ingredientes
investigados del extracto de levadura fueron influenciados por la composición de la levadura gastada del proceso de elaboración de la
La biodiversidad de la levadura gastada del proceso de elaboración de la cerveza, por lo tanto, afecta directamente el
contenido de ingredientes fisiológicamente valiosos de un extracto de levadura y debe tenerse en cuenta en los
procesos de fabricación industrial.
Palabras clave: extracto de levadura; levadura gastada de cerveza; autólisis; sonotrodo ultrasónico; Saccharomyces
cerevisiae/pastorianus; levadura no Saccharomyces; aminoácidos proteinogénicos; vitámeros de folato; actividad
biológica
1. Introducción
La producción de cerveza genera grandes cantidades de levadura gastada durante el proceso de fermentación y lagering.
Después de la fermentación primaria, esto equivale a alrededor de 0,7 a 1,1 kg de levadura comprimida por hectolitro de cerveza
terminada [1]. De acuerdo con el estado actual de la tecnología cervecera, la levadura gastada después de la fermentación
primaria solo se usa en pequeñas cantidades para preparar el siguiente lote [2]. La mayor parte se obtiene de una planta de
propagación, que proporciona una levadura altamente viable y vital que fermenta vigorosamente [2]. Al final del proceso de
maduración en frío, se genera una levadura denominada "levadura de bodega de maduración" (0,50,9 kg de levadura comprimida
por hl de cerveza terminada), junto con partículas de turbidez precipitadas y "cerveza con levadura" [1].
La levadura gastada del proceso de elaboración de la cerveza es adecuada para su uso como material de partida eficiente
para producir extracto de levadura [1,3]. El extracto de levadura se define generalmente como el contenido soluble de una levadura
célula que queda una vez que la pared celular ha sido destruida y eliminada [4–6]. La variedad de diferentes sustancias
fisiológicamente valiosas en las células de levadura ofrece la posibilidad de usarlas como extracto de levadura en diferentes
áreas de la industria alimentaria [3,7]. Como "alimento de levadura", estos extractos pueden aumentar el nitrógeno αamino
libre (FAN) al fermentar mostos de cerveza con un alto contenido de granos sin maltear [8] o un alto contenido de extracto
(mostos de alta densidad) [9,10] y , en consecuencia, mejorar el suministro de nutrientes de la levadura y el rendimiento de la
fermentación [11,12]. Los aminoácidos proteinogénicos libres suministran la mayor parte de la FAN [12]. La cantidad y
composición de los aminoácidos relevantes son, en última instancia, críticos para el rendimiento durante la fermentación [13]
y también afectan el perfil de aroma de la cerveza [14]. Desde un punto de vista nutricional, los extractos de levadura de
levadura gastada aportan una alta concentración de aminoácidos esenciales y semiesenciales para el ser humano [5,7]. Los
extractos de levadura también son una buena fuente de vitaminas B [6,15]. Entre estos, los diversos vitámeros de folato
naturales desempeñan un papel esencial en la dieta humana, y la forma biológicamente activa 5metiltetrahidrofolato (5CH3
H4folato) cumple tareas metabólicas clave en las células humanas [16]. La bioactividad de los extractos de levadura, que se
demuestra en forma de potencial reductor y antioxidante, también hace que estos extractos sean particularmente interesantes
para la industria alimentaria [6,7,15,17].
La mayoría de la cerveza producida a nivel mundial se fabrica mediante la fermentación de mostos de alta densidad [18].
El contenido de extracto del mosto se incrementa mediante la adición de jarabe de azúcar, lo que modifica el equilibrio de
nutrientes del mosto con respecto a todos los componentes fisiológicamente activos [18]. El metabolismo alterado de la
levadura durante la fermentación de alta gravedad no solo cambia la calidad de la cerveza terminada sino también la
composición material de la levadura [10,18]. Además, la biodiversidad de la levadura gastada generada en las cervecerías
aumenta mediante el uso de varias cepas alternativas distintas de Saccharomyces como cultivos iniciadores puros para la
producción de cerveza [19,20]. El almacenamiento o la manipulación inadecuados de la levadura gastada pueden provocar la
contaminación con diversos microorganismos, lo que puede afectar al proceso de producción del extracto de levadura posterior [21].
La composición de los ingredientes de los extractos de levadura disponibles comercialmente varía mucho [17]. Una de las
razones es la influencia de los diferentes métodos de fabricación de extractos de levadura, que hemos evaluado en estudios
anteriores [5,6]. Otra razón radica en la diversidad del material de partida de la levadura [22]. Según nuestro conocimiento,
hasta ahora no se ha realizado ninguna investigación sobre la influencia de la biodiversidad de la levadura gastada del proceso
de elaboración de la cerveza en la composición de los ingredientes de los extractos de levadura.
En este trabajo, se mostró por primera vez cómo la composición de varios grupos de sustancias
fisiológicamente valiosas de un extracto de levadura depende de la biodiversidad de la levadura gastada de la
producción de cerveza. Por ello, se elaboró cerveza a escala piloto utilizando mosto de 12 ◦P y diferentes cepas
de levadura (S. cerevisiae TUM 68, S. pastorianus TUM 34/70, Saccharomycodes ludwigii TUM SL 17,
Saccharomycopsis fibuligera TUM 525, Brettanomyces bruxellensis TUM Bret 1 y Torulaspora delbrueckii T 90).
Además, se fermentaron diferentes gravedades del mosto (12 ◦P, 16 ◦P, 20 ◦P) con S. cerevisiae TUM 68 para
investigar la influencia de la elaboración de cerveza de alta gravedad en una cepa de levadura comercial. La
levadura gastada generada después de la fermentación primaria y la maduración se procesó luego en extracto
de levadura utilizando un método mecánico (sonotrodo ultrasónico) y de disrupción celular autolítica. Todos los
extractos de levadura fueron investigados para determinar su composición general (proteínas, grasas y cenizas).
El contenido de proteínas valiosas fisiológicamente se analizó en detalle con respecto a diferentes aminoácidos
libres y unidos a proteínas. También se observaron los efectos sobre el espectro de aminoácidos del extracto de
levadura a través de la contaminación de la levadura gastada por el estropeador obligado de la cerveza
Lactobacillus brevis. Adicionalmente, caracterizamos la actividad biológica del extracto de levadura en base a su
potencial reductor y antioxidante. También mostramos cómo se distribuyó el contenido total de folato entre los
diferentes vitámeros de folato (5CH3H4folato, 5CHOH4folato, 10CHOPteGlu, H4folato, PteGlu) en el medio
de fermentación o en la levadura usada relevante y luego cómo se podría transferir al extracto de levadura. Estos
resultados deberían aumentar el conocimiento sobre la composición nutricional fluctuante de los extractos de
levadura. Además, podría seleccionarse la levadura gastada de cerveza más apropiada para producir un extracto de levadura con la c
82
2.1. Propagación y fermentación de levadura
Se utilizó un concentrado de mosto de malta esterilizado, lupulado y estandarizado (N53940; Döhler GmbH,
Darmstadt, Alemania) para producir el mosto de propagación y fermentación estandarizado. El concentrado de
mosto de malta se diluyó a una gravedad original de 12 ◦P. Para ajustar el mosto a las densidades más altas de
16 ◦P y 18 ◦P, respectivamente, se añadió monohidrato de D(+)maltosa (Merck, Darmstadt, Alemania) al mosto
de 12 ◦P como complemento. Antes de su uso, los mostos se sometieron a un tratamiento térmico a 100 ◦C
durante 10 minutos para su esterilización. El peso original del mosto de fermentación estandarizado correspondía
al peso original del mosto de propagación estandarizado. Para conocer la composición precisa del mosto de malta
estandarizado, consulte la Tabla 1.
Tabla 1. Composición del mosto.
Parámetro Cantidad
Gravedad original (◦P) 12,00
5,17
Espec. de pH peso SL 20/20 ◦C 1,04
Zinc (mg/L) 0,15
VENTILADOR (mg/100 mL) 25,00
AS totales (mg/100 mL) 201,38
Azúcar total (g/L) 80,03
EBCUnidades de amargor (EBU) 20,00
Glucosa (g/L) 10,46
Fructosa (g/L) 2,17
Sacarosa (g/L) 1,02
Maltosa (g/L) 49,34
Maltotriosa (g/L) 13,79
El procedimiento de propagación descrito a continuación se utilizó para todas las cepas de levadura del estudio.
Saccharomyces cerevisiae TUM 68 (en adelante Scer), Saccharomyces pastorianus TUM 34/70 (en adelante
Spas), Saccharomycodes ludwigii TUM SL17 (en adelante Slud ) , Saccharomycopsis fibuligera TUM 525 (en
adelante Sfib), Brettanomyces bruxellensis TUM Bret1 (en adelante Bbru) y Torulackspora delbru T90 (en adelante,
Tdel) se obtuvieron del Centro de levadura en el Centro de investigación Weihenstephan para la elaboración de
cerveza y la calidad de los alimentos (RCW) de la Universidad Técnica de Munich (TUM) en agar inclinado. Un
asa de inoculación de una colonia inclinada de agar puro se transfirió a 40 ml de mosto estandarizado y se incubó
durante 48 h a 20 ◦C en un agitador orbital (80 rpm). Los 40 mL se transfirieron a 400 mL de mosto estándar y se
incubaron nuevamente durante 48 h a 20 ◦C en un agitador orbital (80 rpm). Este proceso se repitió desde 400
mL hasta 4 L de mosto estandarizado seguido de una incubación de 48 h a 20 ◦C en un agitador orbital (80 rpm).
El procedimiento de fermentación descrito a continuación se utilizó para todas las cepas de levadura y mostos
estandarizados en el estudio. Se realizaron ensayos estandarizados de elaboración de cerveza a escala de laboratorio
utilizando recipientes de acero inoxidable de 10 cm de diámetro × 33 cm de altura (2,5 L) con un 20 % de espacio
libre y tapas herméticas según MeierDörnberg et al. [23]. La levadura propagada se sembró en mosto estandarizado
y aireado (10 mg O2/L) en un recipiente Cornelius (20 L) con un recuento de células vivas de 15 millones de UFC/
mL. A continuación, cada lote se dividió en tres recipientes de fermentación. La fermentación se realizó a 18 ◦C y se
despresurizó hasta la atenuación final. La levadura de fermentación primaria viscosa se recolectó en el fondo del
recipiente inmediatamente después de la atenuación final. A continuación, el sobrenadante fermentado se almacenó
en estado carbonatado y presurizado (0,6 bar) durante 14 días a 2 ◦C. La levadura de bodega de maduración se
extrajo de la parte inferior al final del proceso de maduración en frío nuevamente. El sobrenadante fermentado y la
levadura agotada de cada lote se usaron inmediatamente para el análisis y la producción de extracto de levadura.
83
2.2. Pretratamiento de levadura
Después de cosechar la levadura, se la sometió inmediatamente a tres procesos de lavado para eliminar los
componentes residuales del mosto. Cada proceso de lavado se realizó de la siguiente manera: la levadura gastada
cosechada viscosa se diluyó con agua destilada al 10 % de materia seca, se pasó a través de un tamiz de levadura
(tamaño de malla de 0,5 mm), se centrifugó (1000 g, 5 min, 18 ◦C, 500 mL tubo de centrífuga) y se descartó el sobrenadante.
A continuación, la levadura sedimentada en el tubo de centrífuga se resuspendió con agua destilada durante 5 minutos hasta el 10 % de
materia seca y se inició de nuevo el procedimiento de lavado. La levadura lavada se recogió posteriormente y se diluyó al 7 % de materia
seca en agua destilada antes de introducirla en el proceso de disgregación.
2.3. Control de calidad de la levadura
La levadura de propagación, la levadura agotada, la levadura agotada lavada antes de la rotura y la suspensión
de levadura macerada solo se usaron después de pasar el control de calidad. Las pruebas de control de calidad ya
se describieron en detalle en nuestro trabajo anterior [5,6] y tenían que dar resultados negativos para levaduras y
microorganismos extraños.
2.4. Métodos de interrupción de células de levadura
2.4.1. Sonotrodo ultrasónico
La disrupción celular mediante cavitación se llevó a cabo utilizando el homogeneizador ultrasónico SONOPLUS HD 3400 (Bandelin).
El diámetro del sonotrodo fue de 25 mm con una frecuencia de operación de 20 kHz. En un recipiente de acero inoxidable (400 mL) la
suspensión del proceso (200 mL) se sometió durante 30 minutos a una salida ultrasónica constante de 400 W sin pulsación. El calor del
proceso resultante se eliminó mediante un baño de enfriamiento con glicol para mantener una temperatura constante de 7 ◦C. Este proceso
de disrupción fue adoptado según Jacob et al. [5,6].
2.4.2. Autolisis estándar
Para autolizar las células de levadura, se calentaron 200 mL de la suspensión de levadura en un recipiente de
reacción (400 mL) durante 24 ha 50 ◦C con agitación constante (100 rpm). Se añadieron cloruro de sodio (0,086 mol/
L) y acetato de etilo (0,051 mol/L) al comienzo del proceso. Este proceso de disrupción fue adoptado según Jacob et
al. [5,6].
2.4.3. Autolisis con Contaminación de Lactobacillus brevis
Lactobacillus brevis BLQ 6 (procedente de RCW) se cultivó en medio de caldo MRS (Sifin Diagnostics GmbH,
Alemania) durante 3 días a 28 ◦C y se cosechó por centrifugación (2500 g, 10 min).
Las células se lavaron con agua estéril y se centrifugaron nuevamente. Se añadió Lactobacillus brevis a un
proceso de autolisis (dando como resultado una concentración final en la suspensión de autolisis de 106 CFU/mL) que
se llevó a cabo como se describe en la Sección 2.4.2.
2.4.4. Autolisis para mejorar la producción de ácido γaminobutírico (GABA)
Los parámetros del proceso de Masuda et al. se utilizaron para mejorar la producción de GABA durante la autolisis [24].
La levadura gastada (S. cerevisiae) después de la fermentación primaria (12 ◦P) se lavó (ver Sección 2.2)
y se añadió a un contenido de materia seca del 7% a una solución que contenía agua destilada estéril,
glutamato monosódico (0,060 mol/L) (Merck , Darmstadt, Alemania) y D(+)glucosa monohidrato (0,266
mol/L) (Merck, Darmstadt, Alemania). A continuación, 200 mL de la solución de reacción se ajustaron a pH
6 con HCl 2N o NaOH 2N y se incubaron a 37 ◦C durante 72 h con agitación constante (100 rpm). Después
de 72 h, la solución de reacción se calentó durante 15 min a 85 ◦C. Para el control, el proceso se llevó a
cabo sin glutamato monosódico o monohidrato de D(+)glucosa.
84
2.5. Producción de extracto de levadura
Después del proceso de ruptura de las células de levadura (Secciones 2.4.1–2.4.4), los componentes de la pared
celular primero debían separarse del extracto celular. Por tanto, las muestras se centrifugaron durante 20 minutos a
10.000 g y 4 ◦C. El sobrenadante se extrajo cuidadosamente con pipeta de los tubos de centrífuga y se liofilizó (Christ
Alpha 1–4 LSCbasic, temperatura del condensador: −55 ◦C, vacío: 0,1 mbar, capacidad del condensador de hielo: 4 kg/24 h).
De esta forma, se produjo un polvo de extracto de levadura para los análisis posteriores que ofreció una base constante de comparación.
Los extractos secos de levadura permitieron comparar directamente los métodos de disrupción en
términos del siguiente análisis sin necesidad de considerar la efectividad de los diferentes métodos. Los
resultados sobre la eficacia de los tres métodos de disrupción se pueden revisar en un trabajo anterior de Jacob et al. [5].
En la Tabla 2 se puede ver una descripción general de la descripción de la muestra y los detalles del proceso relacionado .
Tabla 2. Descripción general de la muestra y detalles del proceso de la levadura excedente cosechada después de la
fermentación primaria (F.) y la maduración en frío (L.); los datos se expresan como valores medios; Se determinó que los
límites de confianza eran inferiores al 5% del valor medio.
Cepa de levadura
Original Aparente cultivo de levadura
Nombre de la muestra Especies de levadura
Gravedad (◦P) Atenuación (%) Después
Scer 12◦P Saccharomyces cerevisiae TUM 68 12 79 F.

Scer 12◦P L Saccharomyces cerevisiae TUM 68 12 79 l
Balnearios 12◦P Saccharomyces pastorianus TUM 34/70 12 80 F.
Lodo 12◦P Saccharomycodes ludwigii TUM SL 17 12 11 F.
Tdel 12◦P Torulaspora delbrueckii TUM T 90 12 45 F.
Bbru 12◦P Brettanomyces bruxellensis TUM Bretta 1 12 40 F.
Sfib 12◦P Saccharomycopsis fibuligera TUM 525 12 60 F.
2.6. Análisis
2.6.1. Proteínas y Aminoácidos
El contenido de nitrógeno en el extracto de levadura se determinó utilizando el método Kjeldahl descrito en los métodos de análisis
de tecnología de elaboración de cerveza MEBAK (Comisión de Análisis de Tecnología de Cerveza de Europa Central) (Método 2.6.1.1)
[25]. El contenido de proteína de los extractos de levadura se estimó multiplicando su contenido de nitrógeno por el factor 5,5 [26].
Los aminoácidos proteinogénicos libres (excepto la prolina y la cisteína) se cuantificaron mediante cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) según el método MEBAK 2.6.4.1 [27]. El procedimiento detallado para prolina y cisteína (Método 4.11.1) se tomó de
Buch für chemische Untersuchung von Futtermitteln (El análisis químico de los alimentos) [25]. Para determinar todos los aminoácidos
libres y unidos a proteínas (cantidad total de aminoácidos), los extractos de levadura resuspendidos se sometieron a hidrólisis ácida antes
de tomar las medidas de acuerdo con el Método 4.11.1 del análisis químico de alimentos [25].
2.6.2. Gordo
La grasa cruda se determinó de acuerdo con el Método 5.1.1 del Methodenbuch für chemische Untersuchung von Futtermitteln (El
análisis químico de los alimentos) [25].
2.6.3. Contenido de agua y cenizas
El contenido de agua se determinó utilizando el Método MEBAK 2.2 [27], el contenido de cenizas de manera similar según el Método
8.1 del Methodenbuch für chemische Untersuchung von Futtermitteln (El análisis químico de los alimentos) [25].
85
2.6.4. folato
La vitamina B9 (folato total) y los derivados del folato (5CH3H4folato, 5CHOH4folato, 10CHOPteGlu, H4folato,
PteGlu) se analizaron mediante LCMS/MS según el método publicado recientemente por Striegel et al. . [28].
2.6.5. Potencial antioxidante y reductor
El potencial antioxidante de los extractos de levadura se midió utilizando un kit SigmaAldrich, en el que los
antioxidantes de una muestra inhiben la formación de cationes radicales. Se utilizó espectrofotometría para medir esta
inhibición proporcionalmente por medio de una reacción de color. Trolox (TE), un análogo de la vitamina E, se utilizó como
antioxidante de control.
El potencial de reducción del extracto de levadura se puede determinar mediante el método MEBAK 2.15.2 [27]. Las
reductonas de la muestra reducen una determinada cantidad de reactivo de Tillmann (2,6diclorofenolindofenol, DPI) en
un tiempo determinado, que puede medirse espectrofotométricamente (520 nm).
2.6.6. Densidad del mosto
La densidad del mosto se midió usando un densímetro portátil DMA™ 35 Basic (Anton Paar GmbH, Ostfildern,
Alemania), y la densidad se expresó en grados Plato (◦P). 1 ◦P correspondió a 1 g de extracto por 100 g de solución
líquida, donde el extracto incluía tanto azúcares fermentables como fuentes de carbono no fermentables.
2.6.7. Cálculos de atenuación aparente
La atenuación aparente (%) del mosto fue la proporción de sólidos disueltos en el mosto (extracto),
que fue fermentado durante la fermentación:
Atenuación aparente (%) = [(gravedad original (◦P) − gravedad final (◦P))/(gravedad original (◦P))] × 100.
2.7. Evaluación estadística
Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los resultados relevantes se dieron como medias aritméticas.
Con un nivel de confianza del 95 %, el rango esperado (intervalo de confianza) para cada media se calculó a
partir de la varianza utilizando la distribución t de Student. Se realizaron un análisis de varianza de factor único
(ANOVA) y una prueba t pareada para demostrar las diferencias entre los resultados. Las diferencias
"significativas" se describieron con un valor de p < 0,05. Se utilizó una prueba de Dixon para evaluar los resultados.
3.1. Composición general de nutrientes
El valor nutritivo de los extractos de levadura generados mostró una gran variabilidad. La Tabla 3 enumera los
resultados del análisis de la composición general de nutrientes de los extractos de levadura producidos utilizando el
método mecánico (sonotrodo ultrasónico). Para calcular el contenido de proteína total de los extractos de levadura, la
cantidad de nitrógeno determinada mediante análisis Kjeldahl se multiplicó por el factor de conversión 5,5 propuesto
por Reed et al. [26] Se demostró que este es un factor de conversión adecuado en nuestros artículos publicados
anteriormente en relación con los extractos de levadura [5,6] y también fue utilizado por CaballeroCórdoba et al. [29].
El factor de 6,25, que generalmente se utiliza, sobrestima el contenido de proteína ya que el volumen de nitrógeno total
contiene la cantidad de nitrógeno de ARN (ácidos ribonucleicos, 510% de la masa seca del extracto de levadura) así
como el nitrógeno proteinogénico [5,6 ]. En la evaluación estadística de los resultados obtenidos, establecimos que el
contenido de proteína total de los extractos de levadura producidos mecánicamente no difería significativamente
(ANOVA pvalue > 0.05) del contenido de proteína de los extractos de levadura producidos autolíticamente (todos los
datos nutricionales de los extractos de levadura producidos autolíticamente (Tabla S1) se pueden encontrar en los materiales complementar
Esta observación ya fue anotada y discutida en uno de nuestros artículos anteriores [6]. Extractos de levadura
producidos con levadura de fermentación primaria con diferentes contenidos de mosto original (Scer 12 ◦P, Scer
86
16 ◦P, Scer 20 ◦P), difieren significativamente (ANOVA pvalue < 0.05), sin diferencia significativa entre las
fermentaciones Scer 16 ◦P y Scer 20 ◦P (ttest pvalue > 0.05) (Cuadro 3 ). Este hecho se justifica porque la adición de
maltosa a los mostos de alta densidad (Scer 16 ◦P, Scer 20 ◦P) modificó el balance de nutrientes en comparación con
los mostos de gravedad normal (Scer 12 ◦P), y esto provocó una mayor presión osmótica. al inicio de la fermentación y
un mayor grado alcohólico al final de la fermentación. En consecuencia, la vitalidad y la viabilidad de la levadura
disminuyeron [30], lo que se asocia con tasas reducidas de crecimiento específico y fermentación [18,31]. Para las
fermentaciones de alta gravedad, esto también está relacionado con tasas reducidas de absorción de aminoácidos,
mayor FAN residual (nitrógeno amino disponible libremente) y una mayor acumulación de trehalosa y glucógeno [1,18].
Presumiblemente, esto reduce el contenido de proteína de la masa seca de células de levadura y, en última instancia, da
como resultado un contenido de proteína total más bajo en el extracto de levadura. En nuestros ensayos, al utilizar
levadura gastada de fermentaciones de alta gravedad (Scer 16 ◦P, Scer 20 ◦P), establecimos un contenido de proteína
en el extracto de levadura reducido en un 8,5 % en comparación con la levadura gastada de gravedad normal (Scer 12 ◦ P) fermentaciones.
Tabla 3. Composición nutricional general de extractos de levadura elaborados a partir de levadura gastada de la producción
de cerveza mediante un método de disrupción mecánica (sonotrodo ultrasónico); influencia de la gravedad original (12 ◦P, 16
◦P, 20 ◦P), tiempo de cultivo de la levadura (después de la fermentación primaria vs. después del lagering con cerveza fría
(L)) y cepa de levadura (Scer, Spas, Slud, Tdel, Bbru, fibrilación); para ver los resultados de ANOVA y la prueba t por pares,
consulte el texto; los datos se expresan como valores medios ± límites de confianza; Cal.: parámetro de suma calculado de
carbohidratos, ARN, fracción no nitrogenada y otros componentes.
Scer Scer Scer Scer Lodo Tdel Bbru Sfib

Nombre de la muestra
12◦P 12◦P L 16◦P 20◦P Balnearios 12◦P 12◦P 12◦P 12◦P 12◦P
Proteína (mg/g dw) 480,08 ± 448,53 ± 411,80 ± 395,26 ± 411,54 ± 574,28 ± 446,81 ± 508,34 ± 598,01 ±
(N × 5,5) 10,25 4,93 9,61 5,67 8,62 11,23 8,57 8,75 13,88
10,6 ± 10,5 ± 10,3 ± 10,4 ± 11,8 ± 15,5 ± 9,88 ± 18,2 ± 9,68 ±
Grasa (mg/g peso seco)
0,32 0,31 0,36 0,52 0,72 0,43 0,53 0,37 0,69
130,55 ± 120,11 ± 84,20 ± 87,10 ± 82,10 ± 110,40 ± 79,12 ± 130,64 ± 89,70 ±
Ceniza (mg/g dw)
2,49 3,45 2,73 3,02 1,98 2,57 1,94 2,47 3,24
California. (mg/g peso seco) 378,77 420,86 493,70 507,24 494,56 299,82 464,19 342,82 302,61
9,30 ± 9,35 ± 9,41 ± 9,46 ± 9,34 ± 9,43 ± 9,31 ± 9,32 ± 9,29 ±
Humedad (%)
0,11 0,13 0,10 0,12 0,13 0,12 0,13 0,11 0,14
También pudimos ver una reducción significativa (prueba t pvalor < 0,05) del contenido de proteína (3 %) en el extracto
de levadura cuando se usa levadura de bodega lagering (Scer 12 ◦PL) en comparación con la levadura de fermentación primaria
(Scer 12 ◦P ) (Cuadro 3). Al final de la fermentación primaria, parte de la levadura todavía estaba suspendida y sedimentada
como "levadura de bodega de maduración" solo una vez que comenzó la maduración en frío. En este sentido, Powell et al.
mostró que la levadura no sedimentada tenía una edad celular más baja con un rendimiento de fermentación y una tendencia a
la floculación reducidos , lo que sugiere un estado fisiológico modificado [32]. Un estado fisiológico modificado podría explicar los
diferentes contenidos de proteína del extracto de levadura producido a partir de la levadura de bodega (Scer 12 ◦PL) y la
levadura de fermentación primaria (Scer 12 ◦P), también. Durante las fases de maduración más prolongadas, el material
proteinogénico de la levadura también podría perderse a través de la excreción, según lo establecido por Steckley et al. [33].
El contenido de proteína de los extractos de levadura producidos a partir de levadura de fermentación primaria con
diferentes cepas de levadura también difirió significativamente (valor de p de ANOVA < 0,05). La cepa de levadura no
Saccharomyces S. fibuligera TUM 525 (Sfib 12 ◦P) dio el valor más alto con 598 mg/g de extracto de levadura. La cepa
que se usa a menudo para producir cerveza sin alcohol o con bajo contenido de alcohol, S. ludwigii TUM SL 17 (Slud 12
◦P), tuvo el segundo valor más alto con 574 mg/g de extracto de levadura. La cepa de levadura B. bruxellensis TUM Bret
1 (Bbru 12 ◦P) proporcionó 508 mg de proteína por gramo de extracto de levadura. Solo para la cepa de levadura no
Saccharomyces T. delbrueckii TUM T 90 (Tdel 12 ◦P) y las dos cepas de levadura comercialmente utilizadas S. cerevisiae
TUM 68 (Scer 12 ◦P) o S. pastorianus TUM 34/70 (Spas 12 ◦ P) el contenido de proteína fue inferior a 500 mg/g de
extracto de levadura. Spas 12 ◦P dio el valor más bajo en general en nuestros ensayos (411,54 mg/g). Para una cepa de
levadura S. pastorianus, Vieira et al. determinaron valores de 698 mg/g y 765 mg/g de extracto de levadura al reutilizar
la levadura de dos a cuatro veces en el proceso de fermentación [34]. En otro trabajo, el mismo grupo determinó un
contenido proteico de 641 mg/g de extracto de levadura [15]. Se desconocía el tiempo de muestreo durante la
fermentación y se aplicó el factor de conversión más alto de 6,25 para calcular el contenido de proteína. Para una levadura gastada de cervece
87
Podpora et al. estableció un contenido de proteína de 625 mg/g o 638 mg/g de extracto de levadura, sin dar detalles sobre
la cepa de levadura o las condiciones del proceso. La proteína del medio de fermentación también se registró para la
producción de extracto de levadura y se aplicó el factor de conversión más alto de 6,25 [35].
No hubo una diferencia significativa en el contenido de cenizas de los extractos de levadura producidos mecánica
y autolíticamente (valor p de ANOVA > 0,05), como se demostró en nuestro trabajo anterior al investigar varios métodos
de disrupción [6]. El uso de levadura gastada de fermentaciones de alta gravedad (Scer 16 ◦P, Scer 20 ◦P) dio valores
significativamente más bajos (prueba t pvalor < 0,05) para el contenido de cenizas en el extracto de levadura que una
levadura gastada de levadura normal. fermentación por gravedad (Scer 12 ◦P). Esta observación se puede atribuir
presumiblemente al mismo efecto que redujo el contenido de proteína en el extracto de levadura. Por lo tanto, el
porcentaje de cenizas de la masa seca total presumiblemente podría reducirse por un mayor contenido de trehalosa y
glucógeno debido al metabolismo modificado de la levadura. Otro resultado significativamente más bajo (prueba t pvalor
< 0,05) fue la concentración de cenizas en el extracto de levadura causada por el uso de levadura de bodega (Scer 12
◦PL) en lugar de levadura usada obtenida después de la fermentación primaria (Scer 12 ◦P). También se sospecha que
el diferente estado fisiológico de estas dos levaduras de partida mencionadas anteriormente influye en la composición de
los ingredientes celulares. El contenido de cenizas de los extractos de levadura de todas las cepas de levadura
investigadas difería significativamente (valor p de ANOVA < 0,05). Solo Bbru 12 ◦P y Scer 12 ◦P no mostraron diferencias
significativas (ttest pvalue > 0.05). En la literatura, para el contenido de cenizas, se encuentra un rango de 78 mg/g a
140 mg/g de extracto de levadura [15,34,35]. Debido a las diferentes cepas de levadura, medios de fermentación y
procesos de producción de extracto de levadura, no es posible realizar una comparación directa.
El contenido de grasa de todos los extractos de levadura producidos autolíticamente estuvo entre el 0,04 y el 0,05
% de la masa seca y no difirió significativamente (valor p de ANOVA > 0,05). Usando el método de disrupción celular
mecánica, el contenido de grasa de los extractos de levadura alcanzó un máximo de 18,2 mg y un mínimo de 9,68 mg
por g de extracto de levadura (Tabla 3). Ni el tiempo de cultivo de la levadura gastada (Scer 12 ◦P vs. Scer 12 ◦PL) ni el
contenido de mosto original (Scer 12 ◦P, Scer 16 ◦P, Scer 20 ◦P) en el proceso de fermentación tuvieron una influencia
significativa en el contenido de grasa del extracto de levadura (ANOVA y prueba t pvalor > 0,05).
Solo las cepas de levadura Slud 17 12 ◦P y Bbru 12 ◦P diferían significativamente de las demás (ttest pvalue < 0,05).
En general, el contenido de grasa de los extractos de levadura fue muy bajo como ya se estableció en otros estudios
[6,15,34].
3.2. Composición de aminoácidos
Desde un punto de vista fisiológico, la composición del material proteinogénico es crucial. Los aminoácidos esenciales
(His, Thr, Val, Met, Ile, Phe, Leu Lys) son indispensables para la nutrición humana ya que no pueden ser sintetizados por el
cuerpo y deben ser absorbidos a través de los alimentos [36]. La rápida usabilidad del material proteinogénico en medios
de cultivo microbiológicos está especialmente asegurada para las levaduras si este material está presente en forma de
aminoácidos libres, es decir, los aminoácidos individuales no están unidos mediante enlaces peptídicos [13].
Esto asegura que los aminoácidos puedan ser transportados a través de varios mecanismos a través de la pared celular
y la membrana celular y luego ser metabolizados [13]. Los aminoácidos específicos son preferentemente absorbidos por
la célula [13]. Además, los aminoácidos individuales pueden afectar significativamente el metabolismo del aroma de una
levadura y, por lo tanto, influir en el aroma general de un subproducto de la fermentación [14]. En un estudio anterior,
mostramos cómo los diferentes métodos de disrupción celular afectaban la composición de aminoácidos y el material
proteinogénico [5]. Después de un proceso autolítico, el contenido de aminoácidos libres en el extracto de levadura fue
significativamente mayor que el producido mediante métodos de disrupción mecánica debido a procesos de degradación
enzimática [5]. Esto también se confirmó en los ensayos presentados aquí, como lo revela la comparación entre los
métodos mecánicos (Figura 1) y autolíticos (Figura 2) para la serie de ensayos relevante (prueba t pvalor < 0,05).
88
Figura 1. Aminoácidos libres y unidos a proteínas en extractos de levadura elaborados a partir de levadura gastada de la producción
de cerveza mediante el método de disrupción mecánica (sonotrodo ultrasónico); influencia de la gravedad original (12 ◦P, 16 ◦P, 20
◦P), tiempo de cultivo de la levadura (después de la fermentación primaria vs. después del lagering con cerveza fría (L)) y cepa de
levadura (Scer, Spas, Slud, Tdel, Bbru, fibrilación); para los resultados de ANOVA y la prueba t por pares, consulte el texto; los datos
se expresan como valores medios ± límites de confianza.
Figura 2. Aminoácidos libres y unidos a proteínas en extractos de levadura elaborados a partir de levadura gastada de la producción
de cerveza mediante autolisis; influencia de la gravedad original (12 ◦P, 16 ◦P, 20 ◦P), tiempo de cultivo de la levadura (después de
la fermentación primaria vs. después del lagering con cerveza fría (L)) y cepa de levadura (Scer, Spas, Slud, Tdel, Bbru, fibrilación);
para los resultados de ANOVA y la prueba t por pares, consulte el texto; los datos se expresan como valores medios ± límites de confianza.
Sin embargo, el objetivo de este trabajo fue evaluar la influencia del material de partida en la composición de
aminoácidos del extracto de levadura según los dos métodos de disrupción. Se demostró que la producción del
extracto de levadura vía sonotrodo (Figura 1) generó diferencias significativas (ANOVA pvalue < 0.05) en el
contenido de aminoácidos libres en el extracto de levadura al utilizar levadura gastada de procesos de fermentación
con diferentes gravedades (Scer 12 ◦ P, Scer 16 ◦P, Scer 20 ◦P). No se registraron diferencias significativas entre
las series de pruebas Scer 16 ◦P y Scer 20 ◦P (prueba t pvalor > 0,05). El uso de levadura de bodega lagering
(Scer 12 ◦PL) también generó un contenido significativamente más bajo de aminoácidos libres (prueba t pvalor <
0,05). En la comparación de la serie de pruebas Scer 12 ◦P, Scer 12 ◦PL, Scer 16 ◦P, Scer 20 ◦P, también fue
evidente que las cantidades totales más bajas de todos los aminoácidos resultaron en cantidades más bajas de
aminoácidos libres . Es probable que el contenido de aminoácidos libres después de la disrupción mecánica se
derive en gran medida del conjunto de aminoácidos libres en la célula [1,5], que está influenciado por el proceso de extracción [37]. Amin
89
Los ácidos que se liberaron enzimáticamente de la proteína (a pesar de una temperatura de proceso constante de
7 ◦C), también estaban presentes en el extracto de levadura producido mecánicamente, como ya se evidenció en
un artículo anterior [5]. El contenido de aminoácidos libres en el extracto de levadura de las cepas de levadura Scer
12 ◦P, Spas 12 ◦P, Slud 12 ◦P, Sfib 12 ◦P, Bbru 12 ◦P y Tdel 12 ◦P fueron significativamente diferentes (ANOVA
pvalue < 0,05 (Figura 1) No hubo correlación entre la cantidad total de todos los aminoácidos (o aminoácidos
unidos ) y los aminoácidos libres en el extracto de levadura.
Se establecieron diferencias significativas para la serie de pruebas Scer 12 ◦P y Scer 12 ◦PL(ttest pvalue
< 0,05) o Scer 12 ◦P, Scer 16 ◦P y Scer 20 ◦P (ANOVA pvalue < 0,05) y ninguna diferencia entre Scer 16 ◦P y
Scer 20 ◦P (ttest pvalue > 0.05) siguiendo el proceso autolítico (Figura 2). Al comparar las series de pruebas
Scer 12 ◦P, Scer 12 ◦PL, Scer 16 ◦P, Scer 20 ◦P, también se demostró que cuanto menor es la cantidad total de
todos los aminoácidos, mayor es la cantidad de aminoácidos libres. Esto indicó que a mayor gravedad en el
proceso de fermentación o debido al mayor período de maduración, la levadura usada obtenida durante el proceso
de producción del extracto de levadura autolítica tenía un mayor potencial hidrolítico. El aumento de la liberación
de aminoácidos de la proteína celular durante el proceso autolítico presumiblemente se atribuyó a una mayor
cantidad de varias proteinasas en las células de levadura. Por lo tanto, se informó una mayor cantidad de
proteinasas en el medio de fermentación para fermentaciones de alta gravedad, que es causada por la excreción
de la célula de levadura viva, así como por la autolisis celular [38,39]. Fukal et al. también informaron que las
proteinasas de levadura tienen alta termoestabilidad a una temperatura de 50 ◦C [40], que corresponde a la
temperatura del proceso de autolisis seleccionada en este estudio. También se pudo evidenciar que la baja
vitalidad de la levadura está asociada con una mayor excreción de proteinasa [38]. La vitalidad de la levadura al
final de la maduración también cae sustancialmente con la producción de cerveza, por lo que se libera proteinasa
[38]. Esto podría explicar el aumento de la actividad proteolítica de la levadura de bodega durante la producción de extracto de levadur
En consecuencia, agregar levadura gastada de fermentaciones de alta gravedad y usar levadura de bodega lager
da como resultado una mayor cantidad de aminoácidos libres en el extracto de levadura. De la Figura 3 es obvio
que los aminoácidos individuales en la serie de prueba relevante (Scer 12 ◦P, Scer 12 ◦PL, Scer 16 ◦P, Scer 20
◦P) también se liberan de la proteína en diferentes porcentajes. Esto significa que no solo la cantidad total de
aminoácidos libres difería entre las series de pruebas individuales, sino también el espectro de aminoácidos libres
individuales en el extracto de levadura. Las células de levadura contienen una variedad de enzimas proteolíticas
diferentes [41,42], que probablemente estén presentes y activas en diferentes cantidades en las respectivas series
de pruebas. Por lo tanto, el rango de aminoácidos libres individuales en el extracto de levadura depende no solo
del método de producción, como ya se mostró [5], sino también del contenido de mosto original y el período de
maduración de la cerveza, de donde se origina la levadura agotada. Para las diferentes cepas de levadura Scer 12
◦P, Spas 12 ◦P, Slud 12 ◦P, Sfib 12 ◦P, Bbru 12 ◦P y Tdel 12 ◦P, pudimos mostrar una diferencia significativa
(ANOVA pvalue < 0.05) en el contenido de aminoácidos libres en los extractos de levadura producidos
autolíticamente (Figura 2). Sin embargo, no hubo correlación entre la cantidad total de aminoácidos y los
aminoácidos libres. Los extractos de levadura de levadura usada de levadura no Saccharomyces contenían un
máximo de 200 mg de aminoácidos libres por gramo de extracto de levadura. Por el contrario, las dos cepas de
levadura comerciales Scer 12 ◦P y Spas 12 ◦P proporcionaron 340 mg/g. Berlowska et al. determinó 449,7 mg de
aminoácidos libres por g de extracto de levadura para una cepa de levadura S. cerevisiae [22]. Para las especies
de levadura no Saccharomyces analizadas K. marxianus, S. stipitis y P. angusta, el contenido de aminoácidos
libres oscilaba entre 101,4 mg y 405,3 mg por g de extracto de levadura [22]. No es posible comparar directamente
estos resultados con el estudio actual debido a los diferentes procesos de producción y condiciones de
fermentación. En la comparación ejemplar, la figura 4 presenta el espectro detallado de aminoácidos libres de
extractos de levadura, producidos a partir de levadura gastada de la cepa de levadura comercial Spas 12 ◦P y la cepa de levadura alte
Se encontraron diferencias significativas (prueba t pvalor < 0,05) para los aminoácidos Asp, Glu, Asn, Ser, Gly,
Thr, Tyr, Val, Trp, Ile, Phe y Leu. La cantidad de todos los aminoácidos individuales (total, libre) de los experimentos
realizados se puede encontrar en las Figuras S1–S4 de los materiales complementarios.
90
Figura 3. Porcentaje de participación de aminoácidos libres de proteína de extracto de levadura (de S. cerevisiae TUM 68)
liberada mediante autolisis; influencia de la gravedad original (12 ◦P, 16 ◦P, 18 ◦P) y el tiempo de cultivo de la levadura
(después de la fermentación primaria vs. después de la cerveza fría (L)).
Figura 4. Espectro de aminoácidos proteinogénicos libres en extractos de levadura elaborados a partir de levadura gastada (S.
pastorianus TUM 34/70 y S. ludwigii TUM SL 17) después de la fermentación primaria mediante autolisis; para ver los resultados de
ANOVA y la prueba t por pares, consulte el texto; los datos se expresan como valores medios ± límites de confianza.
La composición de aminoácidos proteinogénicos del extracto de levadura depende del método de
producción [5] y, como se muestra arriba, de la levadura de partida. Si no se mantienen los estándares de
higiene al producir cerveza y almacenar la levadura, la levadura inicial podría estar potencialmente contaminada
con microorganismos. El organismo más común que deteriora la cerveza en las primeras etapas del proceso
de producción de cerveza es la especie Lactobacillus brevis [43]. Se ha demostrado la capacidad de esta
especie de bacteria para convertir el ácido glutámico en ácido γaminobutírico (GABA) de valor nutricional [44].
Masuda et al. demostraron que esta reacción también ocurre durante la autolisis de diferentes cepas de
levadura [24]. Un mecanismo enzimático intrínseco con la enzima glutamato descarboxilasa es responsable
de esta reacción [24]. Un exceso de ácido glutámico como sustrato y glucosa como proveedor de energía
puede aumentar la formación de GABA [24]. En un estudio previo pudimos establecer un aumento en la
concentración de GABA en el extracto de levadura para la cepa S. cerevisiae TUM 68 [5] y también supusimos
que esto fue causado por el mecanismo postulado por Masuda et al. [24]. Como todas las demás cepas de levadura en este estud
91
Concentraciones de GABA (ver material complementario) en sus extractos de levadura producidos autolíticamente
que S. cerevisiae TUM 68 (Scer 12 ◦P, 50 ◦C), intentamos aumentar aún más la formación de GABA para la
autólisis de S. cerevisiae TUM 68 (Scer 12 ◦ P + Gluc + Glu, 37 ◦C), utilizando los mismos parámetros de proceso
que Masuda et al. Al mismo tiempo, investigamos si la contaminación de la levadura con L. brevis (Scer 12 ◦P + L,
50 ◦C) también producía una concentración elevada de GABA en el extracto de levadura producido autolíticamente,
o alteraba la composición de aminoácidos proteinogénicos. Sin embargo, la contaminación con L. brevis (Scer 12 ◦P
+ L, 50 ◦C) no influyó en el espectro de aminoácidos proteinogénicos del extracto de levadura, ni la concentración
de GABA difirió significativamente de la muestra de control (Figura 5) (prueba t valor p > 0,05). Los resultados
coincidieron con los datos de nuestro estudio anterior [5]. Champán et al. también informaron que no observaron una
influencia significativa de la contaminación bacteriana en el rendimiento del extracto, el nitrógeno total, el FAN o la
turbidez de un extracto de levadura producido autolíticamente [45]. El acetato de etilo solvente presumiblemente
inhibió los contaminantes, informado por Champagne et al. [45] y en este estudio. Barrette et al. por lo tanto, podría
mostrar una viabilidad reducida en una población de bacterias durante la producción de extracto de levadura
autolítica utilizando acetato de etilo [21]. Bajo las condiciones de autolisis de Masuda et al., la concentración de
GABA podría aumentar en el extracto de levadura de S. cerevisiae (Figura 5), lo que sugiere un mecanismo
enzimático con la enzima glutamato descarboxilasa activa. Mientras que la concentración de GABA en nuestro
extracto de levadura de S. cerevisiae casi se duplicó, Masuda et al. fue capaz de aumentar los valores de varias
cepas de Candida y Pichia en más de diez veces [24].
Figura 5. Ácido gammaaminobutírico en extractos de levadura elaborados a partir de excedentes de levadura (S.
cerevisiae TUM 68) tras fermentación primaria vía autólisis (37 ◦C, 72 h o 50 ◦C, 24 h); Scer 12 ◦P (control); Scer 12 ◦P
+ Gluc + Glu (Scer 12 ◦P + glucosa + ácido glutámico); Scer 12 ◦P + L (Scer 12 ◦P + Lactobacillus brevis); para ver los
resultados de ANOVA y la prueba t por pares, consulte el texto; los datos se expresan como valores medios ± límites de confianza.
3.3. Distribución de vitamina folato
Las levaduras y los extractos de levadura son conocidos por su alto contenido de diferentes vitaminas B, que
incluyen folatos (vitamina B9) [6,15]. Los folatos, especialmente tetrahidrofolato(H4folato)poliglutamatos,
desempeñan un papel esencial en varias vías metabólicas, como la síntesis de aminoácidos en las mitocondrias y la
replicación del ADN en el núcleo celular [28]. El cuerpo humano no puede generar vitamina B9 por sí mismo y, por
lo tanto, necesita obtener un suministro adecuado a través de la dieta [28]. En un estudio anterior, ya demostramos
que se pueden producir extractos de levadura con un contenido de folato de entre 1,35 y 4,94 mg/100 g utilizando
una levadura gastada (S. cerevisiae TUM 68) procedente de un proceso de fermentación alta [6] . En este contexto,
presentamos la influencia de diferentes métodos de extracción mecánicos y autolíticos sobre el contenido de los
vitámeros de folato 5CH3H4folato, 5CHOH4folato, 10CHOPteGlu, H4folato y PteGlu. Hjortmo et al. evidenciaron
un contenido de folato total en un rango de 4000–1,4500 μg/100 g de materia seca de levadura para varias cepas
de levadura, donde el material de muestra provino de la fase de crecimiento exponencial de la población de levadura
y se utilizó un medio de cultivo sintético [46] . La levadura gastada de la preparación de la cerveza se cultiva al final
del proceso de fermentación o como levadura de bodega lagering y, como tal, ya se encuentra en la fase estacionaria
de crecimiento de células de levadura. En esta fase, el contenido de folato de la masa seca de levadura cae bruscamente y permanece
92
a un nivel más bajo que en la fase de crecimiento exponencial [47]. La composición material del medio de cultivo
también juega un papel fundamental [47].
Con el fin de proporcionar una imagen completa del proceso, también establecimos el contenido de folato del medio
fermentado y la levadura gastada además del extracto de levadura producido de forma autolítica y mecánica. Esto mostró
que todos los medios fermentados tenían un bajo contenido de folato total (6–17 μg/100 g), calculado a partir de los vitameros
de folato 5CH3H4folato, 5CHOH4folato, 10CHOPteGlu, H4folato y PteGlu. No se pudo determinar una diferencia
significativa entre los medios fermentados investigados de ninguna serie de prueba (Scer 12 ◦P, Scer 12 ◦PL, Scer 16 ◦P,
Scer 20 ◦P, Bbru 12 ◦P, Slud 12 ◦P, Tdel 12 ◦P , Spas 12 ◦P, Sfib 12 ◦P) (valor p de ANOVA > 0,05). Hjortmo et al. no
pudo mostrar folato en el medio fermentado de una cepa de S. cerevisiae [47]. Esto puede explicarse por el hecho de que no
había más células de levadura en el sobrenadante [47]. En nuestro trabajo, sin embargo, los sobrenadantes todavía contenían
células de levadura suspendidas, que no se eliminaron por centrifugación antes del análisis de folato. Con respecto al extracto
de levadura, el contenido de mosto original (Scer 12 ◦P, Scer 16 ◦P, Scer 20 ◦P) no tuvo una influencia significativa (ANOVA
pvalue > 0.05) en el contenido de folato total de la levadura agotada (Figura 6 ) . Las fermentaciones de alta gravedad
generalmente conducen a tasas de crecimiento de levadura específicas más bajas que las fermentaciones de gravedad
normal [18]. Para un cultivo continuo de levadura (quimiostato), Hjortmo et al. demostró una correlación positiva significativa
entre el crecimiento específico y el contenido total de folato de una población de levaduras [47]. Esto se ha evidenciado en la
fase de crecimiento exponencial de una población de levaduras [47]. La levadura de fermentación primaria se encuentra en
la fase estacionaria. En este caso, el contenido de folato total de las levaduras agotadas de las fermentaciones normales y
de alta densidad no difería y presumiblemente se estabilizaba en torno al mismo nivel, independientemente del efecto de las
diferentes tasas de crecimiento específicas experimentadas previamente. Por el contrario, la levadura de bodega de
maduración precipitada (Scer 12 ◦PL) tenía un contenido de folato total significativamente menor que el de la levadura de
fermentación primaria (prueba t pvalor < 0,05). Durante el proceso de maduración en frío, la levadura de fermentación
primaria no precipitada permanece en la fase estacionaria y precipita dentro de este período como levadura de bodega (12
◦PL). No se produce más división celular durante este período, lo que presumiblemente provocó la degradación constante de
los vitámeros de folato necesarios para la síntesis de aminoácidos y la replicación del ADN.
La relación de los vitámeros de folato individuales en la levadura agotada (Scer 12 ◦P, Scer 12 ◦PL, Scer 16 ◦P, Scer 20 ◦P)
no cambió significativamente (valor p de ANOVA > 0,05). Los extractos de levadura producidos a través del sonotrodo tenían
contenidos de folato más altos en cada caso que las correspondientes levaduras agotadas. La eliminación de los componentes
celulares insolubles (principalmente las paredes celulares) enriqueció el contenido de folato. Una vez más, no se pudo
determinar ninguna influencia significativa (valor p de ANOVA > 0,05) del contenido original del mosto (Scer 12 ◦P, Scer 16
◦P, Scer 20 ◦P) sobre el contenido total de folato o la distribución de los vitámeros de folato individuales. observado. El folato total
el contenido de los extractos de levadura producidos autolíticamente estuvo entre 800 y 1400 μg/100 gy no
difirió significativamente (valor p de ANOVA > 0,05).
En una comparación de las diferentes cepas de levadura (Figura 7), Scer 12 ◦P con 3640 μg/100 g de masa seca de
levadura tuvo el mayor contenido de folato total en la levadura agotada. Se pudo determinar un valor de 2970 μg/100 g para
la levadura gastada de la cepa de levadura Bbru 12 ◦P. Establecimos el contenido de folato total más bajo (1930 μg/100 g)
para la cepa de levadura Spas 12 ◦P y no pudimos determinar ninguna diferencia significativa con Sfib 12 ◦P (prueba t p
valor > 0,05). Entre las cepas Slud 12 ◦P y Tdel 12 ◦P tampoco hubo diferencia significativa en el contenido de folato total
de la levadura gastada (prueba t pvalor > 0,05) (Figura 7).
La cantidad del vitámero de folato fisiológicamente valioso 5CH3H4folato varió en la levadura agotada de
todas las cepas de levadura investigadas (valor p de ANOVA < 0,05). También se observó que la proporción
de 5CH3H4folato a los otros vitámeros de folato, 5CHOH4folato, 10CHOPteGlu, H4folato y PteGlu, difería
significativamente en la levadura gastada de las cepas de levadura particulares (ANOVA p valor < 0,05) (Figura 7).
A 2200 μg/100 g, la proporción de 5CH3H4folato fue de aproximadamente el 60 % del contenido total de folato de
la levadura gastada Scer 12 ◦P, mientras que para Tdel 12 ◦P fue solo de alrededor del 20 % . El contenido total de
folato de los extractos de levadura (sonotrodo) de las levaduras usadas Scer 12 ◦P, Bbru 12 ◦P y Spas 12 ◦P difería
significativamente de los otros extractos de levadura producidos mecánicamente (prueba t pvalor < 0,05). Los
extractos de levadura Slud 12 ◦P, Tdel 12 ◦P y Sfib 12 ◦P, sin embargo, no difirieron significativamente (ttest pvalue > 0.05).
El alto contenido de folato total (6000 μg/100 g) del extracto de levadura de la levadura gastada Bbru 12 ◦P fue
93
sorprendente con respecto al contenido de folato total de la correspondiente levadura gastada (2970 μg/100
g). La proporción de los vitámeros de folato fisiológicamente valiosos 5CH3H4folato de la constante de folato
total tampoco fue constante en los extractos de levadura producidos mecánicamente. El contenido de folato
total de los extractos de levadura producidos autolíticamente en la Figura 7 estaba entre 800 y 2100 μg/100 g.
Sólo el extracto de levadura Tdel 12 ◦P difirió significativamente (prueba t pvalor < 0,05) de los demás. La
influencia de los diferentes métodos de producción (autólisis, sonotrodo) sobre el contenido total de folato y la
distribución de vitamina de folato ya se ha discutido en nuestro trabajo anterior [6].
Figura 6. Distribución de los vitámeros de folato 5CH3H4folato, 5CHOH4folato, 10CHOPteGlu, H4folato y PteGlu
en levadura gastada (S. cerevisiae TUM 68) y en el extracto de levadura correspondiente (vía sonotrodo o autólisis);
influencia de la gravedad original (12 ◦P, 16 ◦P, 20 ◦P), tiempo de cultivo de la levadura (después de la fermentación
primaria vs. después de la cerveza fría (L)); para ver los resultados de la prueba t por pares, consulte el texto; los datos
se expresan como valores medios ± límites de confianza.
Figura 7. Distribución de los vitámeros de folato 5CH3H4folato, 5CHOH4folato, 10CHOPteGlu, H4folato y PteGlu en
levadura gastada, extractos de levadura (vía sonotrodo o autólisis); influencia de la cepa de levadura (Scer, Spas, Slud,
Tdel, Bbru, Sfib); para ver los resultados de la prueba t por pares, consulte el texto; los datos se expresan como valores
medios ± límites de confianza.
94
3.4. Actividad biológica
Las células de levadura tienen una amplia gama de diferentes componentes funcionales, que imparten
propiedades bioactivas a un extracto de levadura una vez extraído de la célula. Estos incluyen péptidos,
aminoácidos, flavonoides, polifenoles y carotenoides [15,34,48]. Mediante autólisis, Vieira et al. aumentó el
potencial antioxidante de un extracto de levadura producido mecánicamente debido a la liberación de
componentes fenólicos y aminoácidos [ 49]. Cuando la carga térmica es demasiado alta, el potencial antioxidante
cae, lo que, según Vieira et al., probablemente se atribuya a la descomposición de los componentes fenólicos,
las vitaminas y los péptidos bioactivos [49]. Evidenciamos esta correlación en un trabajo anterior de la siguiente
manera. Observamos una caída significativa en la concentración del péptido bioactivo glutatión o el contenido
total de polifenoles después de un método de producción de extracto de levadura autolítico expuesto a estrés
térmico en comparación con un proceso mecánico con una carga térmica adecuada [6]. Los parámetros de
proceso de los dos métodos de producción de extracto de levadura de nuestro estudio anterior [6]
correspondieron a los de estos ensayos. Dado que el extracto de levadura del proceso autolítico mostró una
bioactividad baja en el estudio anterior, solo investigamos el potencial reductor y antioxidante del extracto de
levadura producido mecánicamente en este trabajo (Figura 8). No encontramos diferencias significativas en el
potencial de reducción de las series de prueba Scer 12 ◦P y Scer 12 ◦PL (prueba t pvalor > 0,05). Hubo una
diferencia significativa entre Scer 12 ◦P, Scer 16 ◦P y Scer 20 ◦P (valor p de ANOVA < 0,05), pero no hubo
diferencia significativa entre Scer 12 ◦P y Scer 16 ◦P (ttest p valor > 0,05). Los resultados fueron similares
para el potencial antioxidante, sin diferencia significativa entre Scer 16 ◦P y Scer 20 ◦P. La actividad biológica
de los extractos de levadura de diferentes cepas de levadura varió considerablemente, siendo (Scer 12 ◦P) el
que presentó los valores más altos, seguido de Tdel 12 ◦P y Spas 12 ◦P. Se pudieron establecer diferencias
significativas (valor p de ANOVA < 0,05) para todas las cepas de levadura investigadas en relación con el
potencial reductor y antioxidante. Solo el potencial de reducción de Spas 12 ◦P y Sfib 12 ◦P no fue
significativamente diferente (ttest pvalue > 0,05). Una amplia gama de diferentes componentes como péptidos,
vitaminas, componentes fenólicos y enzimas fueron responsables de la actividad biológica [6,15,49].
Figura 8. Potencial de reducción del extracto de levadura elaborado a partir de levadura gastada (S. cerevisiae TUM 68) de la
producción de cerveza mediante el método de disrupción mecánica (sonotrodo); influencia de la gravedad original (12 ◦P, 16 ◦P, 20
◦P), tiempo de cultivo de la levadura (después de la fermentación primaria vs. después del lagering con cerveza fría (L)) y cepa de
levadura (Scer, Spas, Slud, Tdel, Bbru, fibrilación); para ver los resultados de ANOVA y la prueba t por pares, consulte el texto.
4. Conclusiones
Este estudio mostró que la biodiversidad de la levadura gastada del proceso de elaboración de la cerveza significa
que puede influir sustancialmente en la composición de ingredientes fisiológicamente importantes en el extracto de
levadura resultante . La cepa de levadura (Saccharomyces comercial y cepas de levadura alternativas no Saccharomyces),
el contenido de mosto original del medio de fermentación y el tiempo de cultivo de levadura gastado, tienen una relación directa
95
impacto en diferentes componentes del extracto de levadura. La composición general de nutrientes ( contenido de proteínas,
grasas y cenizas) de los extractos de levadura mostró diferencias significativas después de usar varias levaduras agotadas.
Hemos evidenciado en detalle que la liberación de aminoácidos proteinogénicos durante la autólisis de las levaduras
gastadas difería mucho y, por lo tanto, influía en la FAN de los extractos de levadura. El respectivo espectro de aminoácidos
proteinogénicos también varió. La contaminación de la levadura gastada con L. brevis, que estropea la cerveza, no tuvo
impacto en el perfil de aminoácidos de los extractos de levadura. El uso de condiciones de proceso autolítico relevantes
hizo posible aumentar la concentración de GABA en el extracto de levadura de S. cerevisiae TUM 68, sin embargo, es
dudoso un uso comercial en este contexto. Fue posible influir tanto en el contenido de folato total como en la proporción de
vitámeros de folato individuales mediante el uso de diferentes cepas de levadura. La fermentación de levadura de bodega
como material de partida para producir extracto de levadura dio como resultado un contenido total de folato más bajo en el
extracto de levadura que la levadura de fermentación primaria. El contenido de mosto original del medio de fermentación
no tuvo una influencia significativa sobre el folato total de la levadura gastada o el extracto de levadura. La actividad
biológica (reducción y potencial antioxidante) de los extractos de levadura también dependía de qué levadura gastada se
utilizó en el proceso de elaboración de la cerveza. La cepa de levadura de alta fermentación S. cerevisiae TUM 68 dio valores particularmente alt
En conclusión, los resultados indican que la levadura de cerveza gastada debe seleccionarse cuidadosamente para
producir un extracto de levadura con una composición nutricional definida. Otro objetivo de investigación sería adaptar
el proceso de producción autolítico o mecánico de la levadura gastada de cerveza para influir en el contenido de
ingredientes fisiológicamente importantes en un extracto de levadura.
Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en http://www.mdpi.com/23115637/5/2/51/s1.
Contribuciones de los autores: FFJ diseñó y realizó los experimentos, analizó los datos y escribió el artículo; LS y MR contribuyeron con reactivos/
materiales/métodos/herramientas de análisis para el análisis de folato y apoyaron la implementación práctica. MH seleccionó/proporcionó cepas de
levaduras y bacterias y aisló algunas de las cepas en estudios previos. MR, MH y F.JM revisaron la concepción y el manuscrito, y aceptaron su
presentación.
Agradecimientos: Los autores agradecen a Martin Neumeier (Technische Universität München–Lehrstuhl für Analytische Lebensmittelchemie, Freising,
Alemania) y Steffen Pfeil (Technische Universität München–Forschungszentrum Weihenstephan für Brau und Lebensmittelqualität, Freising,
Alemania) por su asistencia técnica .
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© 2019 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es de acceso abierto
artículo distribuido bajo los términos y condiciones de Creative Commons Attribution
98
fermentación
Artículo
Acumulación de deoxinivalenol (DON) y recuperación de
nutrientes en larvas de mosca soldado negra (Hermetia
illucens) alimentadas con trigo infectado con Fusarium spp.
Zehra Gulsunoglu 1,2, Smitha Aravind 2, Yuchen Bai 2, Lipu Wang 3, H. Randy Kutcher 3 y Takuji Tanaka 2,*
1
Facultad de Química y Metalurgia, Departamento de Ingeniería de Alimentos, Universidad Técnica de Estambul,
Estambul 34469, Turquía
2 Departamento de Ciencias de Alimentos y Bioproductos, Universidad de Saskatchewan, Campus 51 Dr. Saskatoon,
SK S7N5A8,
3 Departamento de Ciencias Vegetales de Canadá, Universidad de Saskatchewan, Campus 51 Dr. Saskatoon, SK S7N5A8, Canadá
* Correspondencia: takuji.tanaka@usask.ca; Tel.: +13069661697; Fax: +13069668898
Recibido: 22 de agosto de 2019; Aceptado: 16 de septiembre de 2019; Publicado: 19 septiembre 2019
Resumen: El tizón de la espiga por Fusarium (FHB, por sus siglas en inglés) es una de las causas más importantes de pérdidas
económicas en los cultivos de cereales, lo que resulta en una pérdida de $ 50–300 millones para la agricultura canadiense. El grano
infectado (que contiene granos dañados por Fusarium (FDK)) a menudo es de menor calidad y peso del grano, y puede ser
inadecuado para el consumo humano y animal debido a la presencia de micotoxinas. Sin embargo, todavía contiene una cantidad
considerable de nutrientes. Un método para recuperar los nutrientes sin las micotoxinas debería ser beneficioso para la economía
agrícola. En este estudio, nuestro objetivo fue examinar los métodos de recuperación de los nutrientes en relación con la acumulación
de micotoxinas en el insecto. Las FDK se fermentaron con Aspergillus oryzae y/o Lactobacillus plantarum (fermentación en estado
sólido (SSF)).
Los granos SSF se proporcionaron luego a 50 larvas jóvenes de mosca soldado negra (BSFL) durante 12 días. Se
evaluaron la ganancia de peso , la composición química y la bioacumulación de micotoxinas de BSFL y alimento gastado.
Después de 12 días de cultivo de insectos, el BSFL creció de 5 a 6 veces su peso inicial. Si bien los pesos generales
no variaron significativamente, las proteínas y los lípidos se acumularon más en los insectos alimentados con SSF FDK.
Durante el período de crecimiento activo, la biomasa de las larvas contenía deoxinivalenol (DON), una micotoxina, en niveles
detectables; sin embargo, el día 12, cuando las larvas estaban en la etapa prepupal, la cantidad de DON en la biomasa del insecto
era casi insignificante, es decir, BSFL no acumuló DON. Por lo tanto, concluimos que la combinación de BSFL y SSF se puede
emplear para recuperar nutrientes libres de DON del grano infectado con FHB para recuperar el valor del grano no comercializable.
Palabras clave: cultivo de insectos; fermentación en estado sólido; micotoxinas; procesamiento de valor agregado; Tizón de la
cabeza por Fusarium
1. Introducción
El tizón de la cabeza por Fusarium (FHB) es una enfermedad fúngica causada por varias especies de Fusarium
spp. El trigo, la cebada, la avena, el maíz y otros cereales pueden verse afectados por FHB, lo que da como resultado
granos pequeños y livianos y, por lo tanto, pérdida de rendimiento. Fusarium spp. producen diversas cantidades y tipos
de micotoxinas tricotecenas, que son altamente tóxicas para los seres humanos y el ganado [1]. Una importante
micotoxina producida por Fusarium spp. es deoxinivalenol (DON). La producción de toxinas ocurre durante el desarrollo
de la enfermedad en el campo bajo condiciones climáticas favorables. La contaminación de alimentos y piensos con DON provoca
efectos adversos a largo plazo sobre la salud humana y la productividad ganadera [2]. Para limitar las micotoxinas en
alimentos y piensos, las reglamentaciones especifican las concentraciones máximas permitidas, que en muchos países
es de 1 mg/kg de muestra. De acuerdo con las regulaciones, los productos son monitoreados y cuando la micotoxina
las concentraciones superan los límites máximos permisibles, los productos se separan de la cadena alimentaria [3].
La pérdida económica de FHB representa muchos millones de dólares solo en Canadá.
Los métodos de desintoxicación son costosos, laboriosos, ineficientes y lentos, y no hay capacidad adecuada
para las aplicaciones industriales. Una forma efectiva de prevenir la FHB en el campo es tratar las plantas de trigo
en flor con fungicidas y desarrollar cultivares resistentes para minimizar la infección de Fusarium spp. Sin embargo,
el fungicida tiene efectos limitados sobre la infección y, cada año, la FHB daña una gran cantidad de granos.
Teniendo en cuenta que los posibles enfoques para prevenir la contaminación del grano con micotoxinas son
limitados antes de la cosecha, se deben considerar enfoques alternativos para utilizar granos no comestibles
dañados por FHB (FDK). En este estudio, nuestro objetivo fue investigar si las larvas de mosca soldado negro
(BSFL) pueden crecer en FDK sin acumulación de toxinas en el cuerpo de la larva.
La población mundial está aumentando y se prevé que alcance los 9.600 millones para 2050, es decir, un
aumento de 2.300 millones en los próximos 30 años. La producción de alimentos se basa en la agricultura, pero
la práctica agrícola actual puede no ser suficiente para suministrar suficientes alimentos para este aumento de
población, sin dañar a la Madre Tierra o introducir cultivos de muy alto rendimiento que no provoquen daños ambientales.
La utilización de productos agrícolas no comestibles puede eludir las preocupaciones anteriores y puede producir productos
comestibles adicionales a partir de la práctica actual de producción agrícola [4].
Existe un interés considerable en el uso de insectos para recuperar materia orgánica no comestible porque los
insectos pueden convertir los carbohidratos en proteínas y lípidos utilizando desechos orgánicos [5]. Hermetia illucens
(mosca soldado negra) es una de las especies más importantes, junto con otras especies de insectos como Tenebrio
molitor (gusano amarillo de la harina), Drosophila melanogaster (mosca común de la fruta), Amyelois transitella (gusano
naranja), Helicoverpa zea (gusano cogollero) , y Trichoplusia ni (guía de repollo) [3]. Si bien las regulaciones varían entre
países y áreas, los valores de los nutrientes y la facilidad de utilización de los nutrientes de los insectos atraen un gran
interés por proporcionar una fuente alternativa de alimentos [6]. Los BSFL se consideran un alimento animal posiblemente
proteico o una fuente de alimento humano debido a la alta acumulación de grasa (29 %) y proteína (42 %) en su cuerpo, y
no transmiten microbios patógenos a humanos y animales [7]. Los BSFL tienen altas tasas de conversión alimenticia y la
capacidad de convertir varios desechos orgánicos en masa corporal [8,9].
La fermentación en estado sólido (SSF) muestra grandes posibilidades en el desarrollo de productos de alto valor.
Las cepas fúngicas y bacterianas se pueden usar en SSF, utilizando sus capacidades de producción de enzimas
como celulasa, pectinasa y xilanasas. En este estudio, utilizamos Aspergillus oryzae y Lactobacillus plantarum
como cepas microbianas según los datos obtenidos de nuestro estudio anterior [4]. El objetivo principal de SSF
fue aumentar la biodisponibilidad de nutrientes en FDK a favor de recuperarlos como biomasa BSFL y cambiar los
perfiles de nutrientes a favor de una recuperación de nutrientes mejorada/eficiente en BSFL. A través de estas
modificaciones microbianas, la eficiencia de la recuperación de nutrientes de los cultivos dañados debe mejorar
durante la digestión de BSFL.
El BSFL se puede utilizar para reducir la contaminación y convertir recursos orgánicos de bajo valor en una
proteína alimenticia de alta calidad. No albergan enfermedades, y su producción no necesita ningún equipamiento
especial de instalaciones. BSFL es una especie extremadamente resistente capaz de hacer frente a condiciones
ambientales exigentes, como sequía, escasez de alimentos o deficiencia de oxígeno. El BSFL ya se utiliza en la
gestión de residuos de algunos sustratos, como estiércol, paja de arroz, residuos de alimentos, residuos de cocina,
granos de destilería, tejidos vegetales en descomposición, lodos fecales, despojos animales y estiércol animal [8].
Demostramos que BSFL puede convertir desechos agrícolas en biomasa con hasta un 95% de recuperación de
materia orgánica usando SSF [4,10]. Nuestra investigación previa [4,10] sugiere que FDK podría alimentarse a
BSFL para recuperar nutrientes a una tasa alta con el tratamiento de materia prima con SSF. Sin embargo, no
está claro si las micotoxinas se acumularían cuando las BSFL se alimentan con FDK. Presumimos que los BSFL
no se ven afectados por el contenido de micotoxinas del grano de trigo infectado con Fusarium spp., no acumularán
micotoxinas en sus cuerpos y la mayoría de los nutrientes en el FDK se recuperarán mediante tratamientos SSF.
La recuperación eficiente de nutrientes de cultivos dañados se puede utilizar para crear un producto de alto valor
a partir de granos de bajo valor. En este estudio, se investigó el desempeño de BSFL en la conversión de FDK
tratado con SSF en biomasa de insectos y la acumulación de DON.
100
2. Material y Métodos
2.1. Materiales
Los BSFL se adquirieron de Worm Lady (McGregor, ON, Canadá). Todos los productos químicos utilizados en
este estudio eran de grado ACS comercialmente disponibles y se adquirieron de Fisher Scientific (Ottawa, ON) y VWR
International (Edmonton, AB). Aspergillus oryzae NRRL 32657 (Ao) y Lactobacillus plantarum NRRL B4496 (Lp) se
obtuvieron de ARS Culture Collection (USDA, Peoria, IL, EE. UU.).
2.2. Fermentación de estado sólido
La concentración inicial de DON de FDK fue de 0,63 ± 0,20 μg/g de materia seca (dm). Las FDK se remojaron
en agua durante 18 ha 21 ◦C para obtener granos más blandos para la fermentación. Los granos remojados fueron
triture utilizando un molinillo de café doméstico (Cuisinart DBM8, Woodbridge, ON, Canadá). Se prepararon
cultivos de semillas de Ao y Lp mediante la inoculación de caldos Potato Dextrose (PD) y De Man, Rogosa y
Sharpe (MRS). El cultivo de semillas de Ao se preparó mediante la inoculación de 250 ml de caldo PD en un
matraz Erlenmeyer con dos asas de esporas, seguido de una incubación de 72 h a 30 ◦C en un agitador rotatorio (150 rpm).
El cultivo semilla de Lp se preparó inoculando 1 mL de precultivo completamente desarrollado en 250 mL de caldo MRS
en un matraz Erlenmeyer e incubando durante 24 h a 37 ◦C en un agitador rotatorio (150 rpm). Después de la
incubación, los cultivos de semillas de hongos y bacterias se recogieron mediante centrifugación a 6000 rpm durante
10 min a 10 ◦C (Sorvall, RC28S, Manasquan, NJ, EE. UU.). La biomasa obtenida se resuspendió en 1/10 del volumen
original de agua destilada estéril.
Se pesaron aproximadamente 58 g (34 g en peso seco) de granos triturados en cada frasco de vidrio y, de los
cultivos de semillas, 1,5 mL de Lp, 2 mL de Ao y 3,5 mL de una combinación de estas dos cepas (Lp + Ao ) fueron
inoculados en los granos triturados. El contenido de humedad se ajustó al 55% (p/p) con agua estéril. La muestra de
control se preparó sin la inoculación inicial del cultivo de semillas.
Las muestras se fermentaron a 30 ◦C durante cuatro días y el contenido de humedad se mantuvo constante mediante
la adición de agua estéril y la mezcla una vez al día en condiciones asépticas.
2.3. Digestión BSFL
Se introdujeron cincuenta BSFL (segundo estadio) en cada muestra de SSF FDK en los frascos de vidrio que
tenían tapas perforadas para permitir la transferencia de humedad y gas durante la digestión de BSFL. Se prepararon
doce frascos en las mismas condiciones para cada muestra SSF FDK. Los frascos se mantuvieron a 30 ◦C durante 12
días. Se añadió agua pesando los frascos de muestra y mezclándolos cada día en condiciones asépticas.
2.4. Separación BSFL después de la digestión
Después de los días de intervalo (días 0, 4, 8 y 12), las larvas se separaron del alimento residual usando pinzas.
Las larvas se enjuagaron con agua para eliminar los residuos de sustrato de su superficie y se secaron sobre papel
toalla; luego, se determinó su peso húmedo. Luego, las larvas se congelaron a 20 ◦C para su posterior análisis. Los
residuos de alimento enjuagados se colocaron nuevamente en el lecho de alimentación para evitar errores en los
análisis de alimento gastado.
2.5. Determinación del aumento de peso de las larvas y tasa de supervivencia de las larvas
Para el análisis de supervivencia, se contó el número de larvas a los 0, 4, 8 y 12 días (inicialmente, exactamente 50 larvas). Para
monitorear el crecimiento larvario, se determinó el peso seco de cada muestra. El volumen de las larvas se calculó multiplicando la
longitud, el ancho y el grosor de 10 larvas individuales antes y después de la digestión.
2.6. Análisis próximo de BSFL y alimentación gastada
El análisis proximal se realizó en el BSFL y el alimento gastado antes y después de la digestión larval del
FDK fermentado. El peso seco de las muestras se midió después de secarlas a 105 ◦C durante 24 h hasta un
101
peso constante según el Método AOAC #930.15 [11]. Las muestras secas se utilizaron para análisis de cenizas, proteína
bruta y grasa bruta. El contenido de cenizas de la biomasa larvaria y el alimento gastado se determinó mediante el método
gravimétrico como se describe en el Método AOAC #942.05 [11]. Las muestras se carbonizaron usando una placa caliente
en la campana de humos y, después de la carbonización, los crisoles se incineraron en un horno de mufla a 550 ◦C
durante la noche. El contenido de proteína bruta se midió mediante el método microKjeldahl como se describe en el
Método AOAC #960.52 [11] con una ligera modificación. Se utilizaron factores de conversión de 6,25 y 5,70 para calcular
la proteína total de la biomasa larval y el alimento gastado, respectivamente. El análisis de grasa cruda se determinó de
acuerdo con el método Goldfisch como se describe en el método AACC #3020.01 [12]. Las muestras se pesaron en papel
de filtro Whatman (No. 1) a 0,5 g para biomasa larval y 1 g para alimento gastado y se colocaron en el aparato Goldfisch
(Labconco Corporation, Kansas City, MO, EE. UU.). Se utilizó éter de petróleo como solvente de extracción y el proceso
de extracción duró 6 h. La grasa bruta se determinó como el peso de grasas en el extracto después de eliminar el solvente.
Los contenidos de carbohidratos de BSFL y alimento gastado se determinaron restando los contenidos de lípidos, proteínas
y cenizas del peso total.
2.7. Análisis de micotoxinas
La biomasa larvaria y el alimento gastado se molieron finamente y se extrajeron para el análisis de
micotoxinas para determinar la concentración de DON acumulado. Las muestras de larvas y el alimento
gastado se extrajeron de acuerdo con el método desarrollado por el Dr. L. Wang, en el programa de Patología
de Cereales y Lino de la Universidad de Saskatchewan (comunicación personal). Grano de trigo finamente
molido (2 g) y una muestra de larva (0,1 g) se mezclaron con acetonitrilo/agua (84:16, v/v) en una proporción
de 1:4 p/v y se extrajeron en un agitador rotatorio durante 2 h . a temperatura ambiente (250 rpm). El extracto
se diluyó 1:10 con acetato de amonio 5 mM y se filtró con jeringa. Se inyectaron treinta microlitros de este
filtrado en el LCMS/MS.
Las condiciones de LCMS/MS se desarrollaron en un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento
(Agilent 1260 Infinity Quaternary; Agilent Technologies, Mississauga, ON, CA) acoplado a un espectrómetro de
masas AB Sciex 4000 híbrido triple cuadrupolo con trampa lineal de iones (4000 QTrap) . (Concord, ON, CA)
equipado con una interfaz TurboionsprayTM . Se utilizó el software Applied Biosystems/MDS Sciex Analyst
(Versión 1.6.2, AB Sciex, Foster City, CA, EE. UU.) para el control y la cuantificación del sistema. La fase móvil
consistió en una mezcla de solvente A (acetato de amonio 5 mM en agua) y solvente B ( acetato de amonio 5
mM en metanol). Las muestras se almacenaron en el muestreador automático a 4 ◦C y se utilizó un volumen
de inyección de 30 μl con un lavado del puerto de lavado de 3 s (para minimizar el arrastre) para introducir la
muestra en la columna.
La separación cromatográfica se obtuvo a un caudal de 300 μL/min a través de una columna Agilent
ZORBAX Eclipse XDB C18 (4,6 × 100 mm, 1,8 μm) equipada con una precolumna Eclipse XDB C18 (4,6 mm,
1,8 μm) mantenida a 30 ◦C en un calentador de columna. Se usó monitoreo de reacción múltiple (MRM) con
electrospray para monitorear DON con las transiciones de m/z 355.0 a m/z 296.1 y m/z 355.0 a m/z 264.9 como
iones cuantificadores y calificadores, respectivamente.
El estándar de DON (pureza > 99%) fue suministrado por Romer Labs Inc. (Tulln, Austria), y la solución
madre se preparó a una concentración de 1 μg/mL en acetonitrilo y se mantuvo a 20 ◦C. Las soluciones
madre de trabajo se prepararon diluyendo en acetato de amonio 5 mM al nivel de 10 veces la concentración de
trabajo final para cada estándar y punto de control de calidad (QC). Las muestras estándar y de control de
calidad se prepararon agregando 100 μL de cada stock de trabajo a 900 μL de muestra en blanco y mezclando suavemente.
Se construyó una curva estándar de siete puntos determinando el mejor ajuste del área del pico frente a la concentración
del analito y ejecutando un análisis de regresión lineal ponderado 1/x.
2.8. Análisis estadístico
Cada tratamiento se analizó por triplicado y los resultados se presentan como un promedio con desviación estándar.
La significación estadística de los resultados se analizó mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía utilizando
MINITAB (MINITAB 18, Minitab Inc., Coventry, Reino Unido). Las medias de los tratamientos se declararon significativamente
diferentes entre sí utilizando la prueba de Tukey a p < 0,05.
102
3.1. Tasa de crecimiento de BSFL
La cantidad de alimento que queda después de los períodos de crianza de BSFL se muestra en la Figura 1. El
BSFL consumió alrededor de 65, 45, 61 y 72 mg FDK/larva/día durante los primeros cuatro días para el control, Lp,
Ao y Lp + grupos Ao, respectivamente. En los siguientes cuatro días, el BSFL consumió 67, 82, 76 y 84 mg FDK/larva/
día para los grupos de control, Lp, Ao y Lp + Ao, respectivamente. Después de ocho días de consumo de FDK, las
tasas de crecimiento de BSFL disminuyeron para todos los tratamientos. El BSFL consumió 30, 42, 21 y 10 mg FDK/
larva/día durante los últimos cuatro días para los grupos control, Lp, Ao y Lp + Ao, respectivamente.
Figura 1. La cantidad relativa de alimento gastado durante la digestión de larvas de mosca soldado negra (BSFL). Las barras
indican las diferencias en la composición de nutrientes del alimento gastado después de la digestión con BSFL según el día inicial.
Durante el tiempo de alimentación, la cantidad residual se calculó teniendo en cuenta el peso de los
granos dañados por Fusarium (FDK) consumidos por BSFL. Cada barra se dividió según la proporción
de nutrientes: área sombreada, cenizas; área negra, proteínas; área punteada, carbohidratos; zona gris, lípidos.
Cada panel representa los resultados de (A) control sin ningún inóculo (es decir, FDK sin fermentar), (B) FDK fermentado con
Lactobacillus plantarum, (C) FDK fermentado con Aspergillus oryzae y (D) FDK fermentado con L. plantarum y A. oryzae.
103
El consumo de alimento fue relativo a la tasa de crecimiento de las larvas. Se determinaron los pesos y
volúmenes de BSFL de cada lote alimentado con FDK fermentado con Lp, Ao y Lp + Ao para cada tiempo de
alimentación (Figura 2). Se observaron aumentos de peso hasta el día ocho para todos los tratamientos. Del
octavo al duodécimo día, el peso de BSFL no difirió para ninguno de los tratamientos. El peso inicial de BSFL (día
cero) fue de 8,5 ± 0,4 mg sobre una base de peso seco (dwb) por larva. Las larvas ganaron significativamente
más peso cuando se alimentaron con FDK fermentado con Lp (58,4 ± 6,3 mg/larva). Kuttiyatveetil et al. [4]
evaluaron la harina de borraja SSF y la harina de linaza como alimentos e informaron que la biomasa BSFL más alta fue de 87,4 mg/la
El volumen de BSFL aumentó de 66,8 ± 21,8 mm3 a 352,7 ± 87,9 mm3 cuando se alimentó con FDK fermentado con Ao
en el día ocho, y no hubo diferencias significativas entre los tratamientos. Las tasas de supervivencia de las larvas no
difirieron entre los tratamientos. Al final del tiempo de alimentación, sobrevivió entre el 90 y el 93 % de las larvas iniciales.
Se especula que los últimos cuatro días fueron el período de pupación. En la prepupa, el último estadio
larvario, las larvas dejan de alimentarse para producir la hormona protoracicotrópica (PPTH), necesaria para la
metamorfosis. En esta etapa, alcanzan el tamaño máximo y tienen un gran contenido de proteínas y grasas
para sostenerlos durante la metamorfosis; no muestran cambios significativos en las características morfológicas
en esta etapa [13]. Nuestros resultados mostraron un bajo consumo de alimentos y ganancias de peso de
BSFL, lo que indica que los últimos cuatro días pueden considerarse como períodos prepupales.
104
Figura 2. Aumento de peso, composición proximal y concentración de deoxinivalenol (DON) de las larvas
durante la crianza de larvas de mosca soldado negra. La longitud total de cada barra muestra el peso seco
de las larvas dividido según la proporción de nutrientes: área incubada, cenizas; zona gris, lípidos; área
punteada, carbohidratos; área negra, proteínas; las líneas, concentración de DON en larvas de mosca
soldado negra. Cada panel representa los resultados de las larvas de (A) granos dañados por Fusarium
(FDK) sin inóculo (es decir, FDK no fermentado), (B) FDK con Lactobacillus plantarum, (C) FDK fermentado
con Aspergillus oryzae y (D) fermentado FDK con L. plantarum y A. oryzae.
3.2. La composición próxima de BSFL y alimentación gastada
Con el fin de lograr un alto crecimiento larvario, se fermentó FDK durante cuatro días usando cepas generalmente
consideradas como seguras (GRAS) (Ao y/o Lp). Las diferencias en el perfil de nutrientes entre los tratamientos SSF en
el día cero indicaron que el FDK sin fermentar contenía 1,5 % de lípidos, 8,9 % de proteínas, 2,2 % de cenizas y 87,7 %
de carbohidratos (Figura 1). Al cuarto día, SSF no cambió el contenido de cenizas y lípidos; sin embargo, los contenidos
de proteínas y carbohidratos diferían. El contenido de proteína del grano aumentó para todos los tratamientos FDK
fermentados; sin embargo, el contenido de carbohidratos disminuyó durante SSF para todos los tratamientos. Si bien la
proporción de carbohidratos disminuyó, su cantidad absoluta siguió siendo la mayor en el alimento SSF, y se especuló
que el aumento del contenido de proteínas beneficiaba el crecimiento de las larvas. No hubo diferencia en la cantidad
de nutrientes entre los microorganismos probados en este estudio; sin embargo, según la observación visual, FDK se
volvió más suave en comparación con el control FDK para una masticación más fácil por parte de BSFL.
Durante las pruebas de alimentación de BSFL, las composiciones de nutrientes del alimento gastado cambiaron
(Figura 1). Los resultados mostraron que BSFL pudo consumir y digerir carbohidratos (es decir, almidón) como sus
principales fuentes de alimento. El BSFL consumió alrededor del 23–25 % de la materia seca en los alimentos SSF en 12
días, es decir, las cantidades residuales se redujeron de 34 g en el día cero a 25–26 g en el día 12. La proteína en el
alimento gastado disminuyó de 4,5 ± 0,5 a 1,8 ± 0,2 g en un dwb de FDK durante la digestión BSFL después de 12 días de
digestión para todos los tratamientos SSF. El contenido de lípidos del alimento gastado disminuyó significativamente para
todos los tratamientos después de cuatro días de digestión, y la disminución no cambió para el día 12. El contenido de
carbohidratos (es decir, almidón) en el alimento gastado disminuyó significativamente durante la digestión BSFL para todos
los FDK fermentados. El contenido de cenizas del alimento gastado disminuyó hasta el día 12 de digestión para los tratamientos control, Ao y Lp +
105
no hubo diferencia en el contenido de cenizas de FDK fermentado con Lp. La disminución en la composición próxima
del alimento gastado durante la digestión de BSFL se asoció con el consumo de nutrientes por parte de BSFL.
Se determinó la composición próxima de la biomasa larvaria (Figura 2). Durante el tiempo de alimentación, la
cantidad de ceniza de BSFL aumentó hasta el día ocho, cuando alcanzó el nivel máximo para todos los tratamientos,
y luego se mantuvo constante hasta el día 12. El contenido inicial de cenizas de BSFL fue de 0,5 ± 0,0 mg/larva y
alcanzó 2,0 ± 0,0 mg/larva en el día ocho para FDK fermentado con Lp + Ao. El contenido de carbohidratos de
BSFL fue de 1,7 ± 0,2 mg/larva y, después del período de alimentación de ocho días, el contenido de carbohidratos
aumentó a 14,6 ± 1,0, 8,3 ± 0,8, 11,3 ± 1,5 y 12,4 ± 1,2 mg/larva alimentada con FDK fermentaron en los tratamientos
control, Lp, Ao y Lp+Ao, respectivamente. El mayor contenido de carbohidratos puede explicarse por un aumento
en el volumen de BSFL, asociado con un aumento en la quitina de la piel de las larvas, que se produce durante la
etapa de crecimiento de la BSFL. Kaya et al. [14] informaron que el contenido de quitina aumentó gradualmente de
larva a adulto, y el mayor contenido de quitina se observó en adultos. El contenido de carbohidratos fue mayor en
el control BSFL que entre los otros tratamientos (p < 0,05). Esto puede explicarse por la reducción de la ganancia
en el contenido de proteínas, lípidos y cenizas, es decir, la concentración de carbohidratos [10].
Estos resultados indicaron que BSFL puede recuperar los nutrientes en FDK dañado y no se ve afectado por la
presencia de micotoxinas.
Además, se observó que las sumas de ganancias de proteínas y lípidos fueron 42,6 ± 4,7, 47,7 ± 3,1, 45,2 ± 0,8
y 40,4 ± 2,1 mg/larva alimentada con FDK fermentada en los tratamientos control, Lp, Ao y Lp + Ao. , respectivamente,
en el día 12. En el día ocho, estas cifras fueron 42,3 ± 1,8, 45,2 ± 1,6, 40,1 ± 2,1 y 43,5 ± 1,3, respectivamente.
Mientras tanto, la acumulación de carbohidratos en el día ocho (y el día 12) fue de 14,6 ± 1,0 (10,1 ± 0,3), 8,3 ± 0,8
(7,0 ± 0,6), 11,3 ± 1,5 (8,5 ± 0,1) y 11,3 ± 2,3, respectivamente. Estos resultados indicaron que los insectos alimentados
con granos SSF pueden lograr mejores perfiles de proteínas y lípidos en comparación con los insectos alimentados
con granos no fermentados. Por lo tanto, se indica que el SSF ayudó a mejorar los componentes nutricionales del
insecto, mientras que la ganancia general de peso en este estudio no varió significativamente entre los alimentos.
3.3. Cantidades de DON en pienso gastado y biomasa BSFL
Durante la digestión de BSFL, la concentración de DON en el alimento gastado al cuarto día fue la más baja
en comparación con otros días (Tabla 1). Después de cuatro días de digestión, la concentración de DON en el
alimento gastado aumentó continuamente hasta el día 12. Este aumento en el contenido de DON del alimento
gastado fue comparable a la tasa de consumo de nutrientes del 23 al 25 % por parte de las larvas. Esto sugirió que
las larvas no asimilaron DON en su cuerpo, sino que simplemente lo pasaron a través de su sistema intestinal. La
mayor concentración de DON en el alimento gastado fue para FDK fermentado con Lp.
Tabla 1. Concentración de deoxinivalenol (DON) en el alimento usado después de la digestión de larvas de mosca soldado negra.
Concentración de DON (μg/g de alimento gastado) *
Día 0 Día 4 Día 8 Día 12
Control 0,63 ± 0,20 c,C 0,15 ± 0,05 c,A 4,17 ± 0,83 b,B 6,72 ± 0,70 a,C

Lactobacillus plantarum 2,60 ± 0,07 b,B 0,20 ± 0,07 c,A 13,66 ± 0,37 a,A 14,17 ± 1,55 a,A
Aspergillus oryzae L. 2,76 ± 0,27 b,B 0,12 ± 0,02 c,A 5,80 ± 0,88 a,B 6,82 ± 1,82 a,B,C
plantarum + A. oryzae 3,58 ± 0,18 b,A 0,12 ± 0,05 b,A 10,69 ± 1,77 a,A 11,41 ± 2,25 a,A,B
* Cada valor se expresa como la media ± DE (n = 3). Símbolos estadísticos: Los medios de concentración de DON para
cada tipo de fermentación marcados con letras minúsculas diferentes (a, b, c) dentro de una fila son significativamente
diferentes entre días, y los seguidos de letras mayúsculas (A, B, C) dentro de una columna representan diferencias en la
concentración de DON en comparación con el tipo de fermentación en el mismo día (p < 0,05).
Hay varias posibilidades para explicar el aumento de DON. Algunas enzimas microbianas producidas durante la
fermentación podrían aumentar los niveles de DON, debido a la liberación de DON de las paredes celulares del grano
u otros componentes celulares [15]. En segundo lugar, el DON puede producirse durante los periodos de alimentación.
El tipo de microorganismo y la proporción de cada uno puede resultar en un aumento en la producción de micotoxinas
entre los microorganismos [5]. Por ejemplo, el aumento también podría deberse al aumento del número de Fusarium
spp. durante el tiempo de fermentación. Gorral et al. [16] investigó la relación entre
106
concentración de biomasa de Fusarium y tricotecenos B (DON y nivalenol). Informaron una relación más fuerte
entre la biomasa de Fusarium y el contenido de DON, según lo confirmado por el índice FHB.
Como otra posibilidad, podrían convertirse a partir de precursores. Nakagawa et al. [17] informó que el
deoxinivalenol3Oglucósido (D3G) tiene menor toxicidad en comparación con su precursor DON, y D3G se puede
convertir en DON en el intestino humano o animal. Las bacterias del ácido láctico tienen la capacidad de hidrolasar
el derivado D3G de nuevo a la forma DON tóxica. Cuando las bacterias del ácido láctico fermentan el alimento,
podrían ser responsables de la conversión química de las micotoxinas conjugadas y explicar la gran cantidad de
DON en el alimento gastado [18]. Si bien estos factores pueden afectar los resultados, es poco probable que sea
apropiado explicar nuestros resultados. Verificamos las cantidades de DON en cada momento de muestreo para
SSF y granos no fermentados. Dichas generaciones y conversiones se contaron en los datos, independientemente
de su efecto. No observamos diferencias significativas en las cantidades de DON entre las cuatro condiciones. Por
lo tanto, concluimos que las diferencias en las cantidades de DON entre SSF y FDK sin fermentar fueron pequeñas
y no afectaron significativamente los contenidos de DON.
Mientras que las cantidades de DON en el alimento gastado aumentaron durante el período de alimentación,
la biomasa BSFL mostró diferentes tendencias en términos de cantidades de DON. En la etapa de crecimiento, la
biomasa larvaria contenía una concentración considerable de DON; sin embargo, no se observó acumulación de
DON en BSFL después de los 12 días de crianza. Bosch et al. [3] evaluaron la tolerancia y la acumulación de
aflatoxina B1 (AFB1) en BSFL alimentados con alimentos que contenían AFB1 para utilizar los cultivos
contaminados con micotoxinas. El BSFL no contenía niveles detectables de AFB1 (<0,10 μg/kg). Sugirieron que
las larvas excretaron o metabolizaron rápidamente el AFB1 después de la ingestión. Otra posible razón fue que
parte de la AFB1 podría encontrarse unida a proteínas y no detectarse. Camenzuli et al. [19] también investigó el
potencial de acumulación de AFB1, DON, ocratoxina A y una mezcla de micotoxinas en BSFL.
Ninguna de las micotoxinas se acumuló en el cuerpo de la larva; se demostró que excretan o metabolizan las
cuatro micotoxinas presentes en el alimento. Nuestros resultados mostraron que los BSFL que crecen con
alimentos FDK no acumulan DON en su cuerpo. Como se muestra en la Figura 1, las larvas consumieron la mayor
parte del alimento durante los primeros ocho días y luego el consumo se detuvo en el día 12 debido a la pupa.
Esto se debe a que defecan su sistema intestinal y tienen un intestino vacío antes de la pupa o poco después de
la emergencia del adulto. El análisis de DON indicó que las BSFL no asimilan DON en su cuerpo, y se especula
que el DON observado durante la etapa de crecimiento está en el contenido de su sistema intestinal.
4. Conclusiones
El FDK utilizado en este estudio tenía una gran cantidad de nutrientes y BSFL convirtió estos nutrientes en
biomasa de insectos sin acumular DON en sus cuerpos. Mientras consumían materiales contaminados con DON,
contenían DON en su cuerpo; sin embargo, las toxinas fueron excretadas de su cuerpo antes de que se convirtieran
en pupas. Consumieron ~2.8 g de FDK por g de masa corporal BSFL ganada, y convirtieron principalmente el
almidón en sus proteínas y lípidos con una alta eficiencia. Por lo tanto, el BSFL se puede utilizar para separar los
nutrientes de DON en FDK. El análisis proximal de FDK fermentado mostró un mayor contenido de proteínas y
lípidos, mientras que no hubo diferencias significativas en la ganancia de masa corporal de BSFL entre los
tratamientos. El procedimiento se puede ampliar a otros materiales contaminados con micotoxinas para recuperar
los valiosos nutrientes desperdiciados en esos materiales contaminados. Esta tecnología de tratamiento de
residuos que utiliza BSFL puede contribuir a reducir la carga de la escasez de proteínas animales en el mercado
de alimentos para animales y brindar nuevas oportunidades de ingresos para pequeños empresarios en países de ingresos bajos y me
Contribuciones de los autores: Conceptualización, TT; Metodología de fermentación, cultivo de insectos y análisis próximos, ZG, SA y TT;
Metodología de análisis de DON, LW y HRK; Investigación, ZG, AS, YB y LW; Redacción de la preparación del borrador original, ZG; Redacción
Revisión y Edición, TT; Supervisión, TT
107
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© 2019 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto distribuido
bajo los términos y condiciones de Creative Commons Attribution
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fermentación
Revisar
Los desechos de alimentos como una nueva fuente potencial de comestibles
Producción en masa de insectos para alimentos y piensos: una revisión
vassileios varelas
Instituto de Investigación Biodinámica, Skillebyholm 7, 15391 Järna, Suecia; vavarelas@chem.uoa.gr o
vassileios.varelas@sbfi.se
Recibido: 9 de agosto de 2019; Aceptado: 27 de agosto de 2019; Publicado: 2 septiembre 2019
Resumen: Alrededor de un tercio de los alimentos producidos anualmente en todo el mundo termina como desperdicio. Una
pequeña parte de estos residuos se utiliza para la producción de biocombustibles y compost, pero la mayor parte se deposita en
vertederos, lo que provoca daños medioambientales. La producción en masa de insectos comestibles para la alimentación
humana y animal parece una solución sostenible para satisfacer la demanda de proteínas de origen animal, que se espera que
aumente debido al rápido crecimiento de la población mundial. El objetivo de esta revisión fue compilar información actualizada
sobre la cría masiva de insectos comestibles para alimentos y piensos basados en desechos de alimentos. También se evaluó
el uso y el papel potencial del proceso de fermentación en la producción masiva de insectos comestibles y el impacto potencial
de este proceso de crianza para lograr una industria alimentaria sostenible y respetuosa con el medio ambiente. El desperdicio
de alimentos comprende una enorme reserva de nutrientes que podría valorizarse para alimentar insectos comestibles nutricionalmente flexibles.
Las dietas artificiales basadas en subproductos alimentarios para la producción en masa de la mosca soldado negra, la mosca
doméstica, el gusano de la harina y el grillo doméstico ya se han probado con resultados prometedores. El uso de la fermentación
y los subproductos de la fermentación pueden contribuir a este proceso y se proponen futuras investigaciones en esta dirección.
Parte de la sostenibilidad del sector alimentario podría basarse en la valorización de los residuos alimentarios para la producción
masiva de insectos comestibles. Se necesita más investigación sobre las propiedades funcionales de los insectos comestibles
criados, la estandarización de las técnicas de cría de insectos comestibles, los aspectos de control de seguridad y las
evaluaciones del ciclo de vida para una industria alimentaria basada en insectos.
Palabras clave: insectos comestibles; desechos de alimentos; producción en masa de insectos; fermentación; sostenibilidad
1. Introducción
La entomofagia, es decir, la práctica de comer insectos como alimento, formó parte de la dieta prehistórica en muchas áreas del
mundo [1,2]. Durante milenios desde entonces, ha sido una parte regular de la dieta de muchas personas de diversas culturas en todo
el mundo [3,4]. A nivel mundial, se estima que más de dos mil millones de personas, principalmente en Asia, África y América del Sur,
practican la entomofagia [2,4,5], y se utilizan más de 2000 especies de insectos comestibles para este propósito [6]. En la cultura
occidental, sin embargo, la entomofagia no se acepta y se considera un comportamiento repugnante y primitivo, mientras que los
insectos se asocian con plagas [7]. Sin embargo, este tabú parece estar debilitándose en los últimos años, ya que los hábitos
alimentarios han ido cambiando y ha comenzado una nueva tendencia hacia los productos a base de insectos y la incorporación de la
entomofagia en la dieta occidental [8,9].
En un futuro próximo, se espera que la demanda de proteínas alimentarias de origen animal aumente hasta un 70 % [10] debido
al crecimiento exponencial de la población mundial, que se prevé que alcance los 9 000 millones para 2050 [3,8]. El aumento de la
producción de alimentos necesaria para satisfacer esta demanda irá acompañado de un mayor agotamiento de los recursos hídricos,
agrícolas, forestales, pesqueros y de la biodiversidad, con impactos ambientales negativos [11]. Cuando el problema del cambio
climático se suma a estas preocupaciones, la seguridad alimentaria mundial se convierte en un tema aún más crucial [12,13].
Los insectos comestibles se denominan especies de insectos que se pueden utilizar para el consumo humano, pero también
para la alimentación del ganado en su totalidad, partes de ellos y/o proteínas y extracto de lípidos [11,14,15] . Comestible

Los insectos parecen una solución alternativa prometedora para lograr la seguridad alimentaria en la próxima crisis alimentaria mundial [16], porque
brindan algunas ventajas significativas para la nutrición humana, que incluyen alto contenido de proteínas, aminoácidos, lípidos, energía y varios
micronutrientes [17, 18]. Además, en comparación con el ganado, la cría de insectos tiene un menor impacto ambiental ya que se pueden utilizar
múltiples y diversas fuentes de alimentos , las emisiones de gases de efecto invernadero son bajas, los requisitos de agua y espacio son bajos y la
tasa de conversión alimenticia es alta [7,11]. Además de servir como alimento y pienso, los insectos también pueden contribuir significativamente a
la sostenibilidad de los alimentos a través de la degradación de los biorresiduos y su conversión en alimentos, piensos y fertilizantes [19]. Además,
pueden ayudar a preservar la biodiversidad [20] y ayudar en la polinización de las plantas y el control de plagas [9].
En la industria alimentaria mundial, cada año se desechan alrededor de 1300 millones de toneladas de diversos residuos
alimentarios [21]. Los residuos generados en la industria alimentaria se originan principalmente en la producción primaria, el
procesamiento de alimentos, la venta al por mayor y la logística, combinados con la venta al por menor y los mercados, el servicio de alimentos y los hogares.
En 2012, el volumen estimado de desperdicio de alimentos solo en la UE fue de unos 88 millones de toneladas [22].
En los EE. UU., se desperdician anualmente casi 45 millones de toneladas de vegetales frescos, frutas, leche y cereales [23]. Según Baiano (2014),
hasta el 42% del total de desperdicio de alimentos se produce en los hogares [24].
En muchos casos, los residuos de alimentos son difíciles de utilizar para la recuperación de productos de valor agregado debido a su
inestabilidad biológica, naturaleza potencialmente patógena, alto contenido de agua, autooxidación rápida y alto nivel de actividad enzimática [25] .
Por otro lado, este biomaterial comprende una enorme reserva de nutrientes [26] y podría valorizarse a través de la biodegradación por varias
especies de insectos comestibles en un sistema de producción en masa [9,27,28].
El objetivo de esta revisión fue recopilar información actualizada sobre la cría de insectos comestibles con fines
alimentarios y de piensos utilizando desechos de alimentos como sustrato. También se consideró el impacto de este sistema
de bioconversión en la consecución de una industria alimentaria sostenible y respetuosa con el medio ambiente.
2. Especies de insectos comestibles comúnmente producidos en masa para alimentos, piensos y otras aplicaciones
En general, dentro de la cría y recolección de insectos comestibles se siguen tres estrategias principales: recolección silvestre (no cultivo),
semidomesticación (cultivo al aire libre) y cultivo (cultivo en interiores) [11].
A nivel mundial, el 92 % de las especies de insectos comestibles se recolectan en la naturaleza, pero la semidomesticación y la agricultura pueden
proporcionar un suministro de alimentos de una manera más sostenible [3]. El cultivo de insectos para alimento humano y animal ha comenzado
recientemente [7].
En cuanto a la aceptación del consumidor, distribución, condiciones de crianza, impacto ambiental, aspectos de seguridad alimentaria, valor
nutricional y uso como componente en la dieta de animales de granja, mascotas y peces, las principales especies comestibles comerciales
recolectadas en la naturaleza en todo el mundo, pero también utilizadas para la producción industrial a gran escala, pertenecen a seis órdenes
principales: Coleoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Orthoptera y Diptera [15,29].
Los insectos comerciales más utilizados en la producción en masa son el gusano de seda de morera, el gusano de cera, el
gusano amarillo de la harina, el grillo doméstico, la mosca soldado negra, la mosca doméstica (cultivo en interiores), el gorgojo de las
palmeras, la oruga de bambú, la hormiga tejedora, el saltamontes (cultivo al aire libre), el gusano de seda eri, muga gusano de seda,
avispón gigante y termitas (cultivo silvestre) [15,30]. Los insectos más utilizados como alimento para animales son la mosca soldado
negra, la mosca doméstica, el gusano de la harina, los escarabajos, las langostas, los saltamontes, los grillos y el gusano de seda [31].
Algunas especies de insectos comestibles también se usan para aplicaciones médicas, por ejemplo, Lucilia sericata ( mosca verde común) se usa
como indicador biológico del intervalo postmortem (PMI) en patología humana, mientras que sus larvas se usan en medicina humana para curar
enfermedades crónicas. lesiones que no se pueden curar con tratamientos convencionales [32]. Además, la alantoína secretada por las larvas se
utiliza en el tratamiento de la osteomielitis [30]. Otras aplicaciones de los insectos comestibles incluyen la biodegradación del poliestireno en el
medio ambiente utilizando el gusano de la harina Tenebrio molitor [33,34], el uso del soldado negro para la gestión de residuos orgánicos
municipales [35] y el uso de modelos no mamíferos como las larvas de Galleria mellonella, también conocidas como waxworm, para modelar
enfermedades humanas causadas por una serie de patógenos bacterianos [36].
110
Los insectos comestibles criados comercialmente más comunes y sus aplicaciones para la alimentación humana y animal
y de peces, como medicamentos, para la extracción de componentes y como tratamientos ambientales se enumeran en la Tabla
1.
Tabla 1. Resumen de las especies de insectos comestibles que se crían con más frecuencia como alimento
humano y animal, la etapa de desarrollo en la que se utilizan, el tipo de sistema de cultivo y las aplicaciones comerciales.
Nombre común De desarrollo Fuente Referencia

especies de insectos Solicitud
Escenario
Gusano de
Bombyx Mori larvas, pupas Agricultura Alimentación humana, alimentación animal [11,15,37]
seda de morera
Alimentos humanos, alimentos para
Gusano
tenebrio molitor larvas Agricultura mascotas, animales de [15,28,31,33,34]
amarillo
zoológico y peces, degradación de poliestireno
Alimentación humana, modelo para el
Galleria mellonela gusano de cera larvas Agricultura [7,30,36]
estudio de enfermedades humanas
Rhynchophorus ferrugineus Picudo rojo de las palmeras Larvas, pupas Semicultivo comida humana [38,39]
Rhynchophorus phoenicis Picudo de las palmeras larvas Semicultivo comida humana [39,40]
Alimentación humana, alimentos para
Acheta domesticus grillo de la casa Adulto Agricultura [15,41]
mascotas, extracción de proteínas
Grillo de campo
Gryllus bimacalatus Adulto Agricultura Alimentación animal [30]
mediterráneo
Gusano mopane larvas
Imbrasia belina Agricultura comida humana [42]
(MW) (oruga)
Musca domestica Mosca doméstica
larvas Agricultura Alimentos para animales y peces [43,44]
Alimentos para animales y peces,
lucilia sericata Mosca de botella verde Larvas(gusanos) Semicultivo [30–32]
Tratamiento médico
Bambú
Omphisa fuscidentalis larvas Semicultivo comida humana [1,4]
oruga
Adulto, larvas, comida humana, medicina
Oecophylla esmaragdina hormiga tejedora Semicultivo [38,45]
pupas, huevos usar
Patanga succincta Saltamontes Adulto Cosecha silvestre comida humana [46]
Oxya spp. Saltamontes Adulto Cosecha silvestre comida humana [29]
Langosta Agricultura, Alimentos para humanos, alimentos para mascotas y

Locusta migratoria Adulto, ninfas [11,47,48]
cebos para peces
recolección silvestre
Alimentación humana, usos
Adulto Agricultura,
Apis mellifera abeja médicos (veneno de abeja, [7,30,49]
semicultivo
propóleos, jalea real)
Hermetia illucens mosca soldado negro larvas Agricultura Alimentación humana, alimentación animal [50]

(BSF)
Macrotermes spp. Termita Adulto Cosecha silvestre comida humana [51,52]
Encosternum spp. Chinche Adulto Cosecha silvestre comida humana [29,53]
Vespula spp. avispa (social) larvas Cosecha silvestre comida humana [54,55]
Alimentos para humanos,
Panchoda marginata escarabajo del sol larvas Agricultura [7,56]
animales y peces
3. Especies de insectos comestibles que pueden utilizar los desechos de alimentos como alimento y sus requisitos nutricionales
en la producción en masa
Hasta la fecha, se han descrito y clasificado alrededor de 1 millón de especies de insectos, pero se estima que
el número real de especies de insectos en la Tierra oscila entre 4 y 30 millones. Jongema (2015) compiló un catálogo
detallado que enumera 2037 especies de insectos comestibles [6], pero aún se desconoce el número real de
especies de insectos adecuadas para aplicaciones de alimentación humana o animal [3].
En los últimos años, las dietas efectivas y de bajo costo, las llamadas dietas artificiales, se utilizan a escala de laboratorio
y/o industrial para criar insectos con diversos fines (por ejemplo, insectos comestibles, insectos como depredadores de plagas
para el control biológico de plagas, etc.) [ 57–59]. Se han introducido varias dietas artificiales para la cría de insectos, pero incluso
las más prometedoras siguen siendo inferiores a las fuentes naturales de nutrientes [60]. Las especies de insectos que más se
cultivan con fines alimentarios y de piensos son principalmente omnívoros, que pueden utilizar diversas fuentes de alimentos y,
por lo tanto, muestran una amplia flexibilidad nutricional. Por esta razón, sus requerimientos nutricionales y tasa de alimentación
cuando se les alimenta con una dieta artificial son difíciles de determinar [30,61,62]. Debido a su flexibilidad nutricional, el uso de
fuentes de alimentos de bajo valor puede ser ideal para el cultivo a gran escala de insectos comestibles [11].
Una dieta balanceada compuesta de subproductos orgánicos puede ser tan adecuada para el crecimiento exitoso de las
especies de gusanos de la harina como las dietas utilizadas por los criadores comerciales [28]. Se ha informado que una dieta
basada en alimentos orgánicos es fundamental para el crecimiento larvario, la densidad de masa y el mantenimiento de la colonia
[63]. Reciclaje de residuos de origen vegetal de baja calidad y su conversión en un alimento de alta calidad rico en energía, proteínas,
111
y la grasa se puede lograr con gusanos de la harina en un tiempo relativamente corto [31]. Además, el grillo doméstico
omnívoro Acheta domesticus puede alimentarse con una amplia gama de materiales orgánicos, lo que facilita su cultivo en
un sistema que produce seis o siete generaciones por año [31].
La mayoría de los estudios con resultados alentadores sobre dietas artificiales basadas en desechos de alimentos o
mezclas de desechos se han realizado utilizando gusanos comestibles de la harina (Tenebrio molitor L., Coleoptera:
Tenebrionidae), mosca soldado negra (Hermetia illucens, Diptera: Stratiomyidae), mosca doméstica (Musca domestica ,
Diptera: Muscidae) y grillo camboyano (Teleogryllus testaceus, Orthoptera: Gryllidae) y han utilizado materia prima alimenticia
como alimento para insectos [28,31,60,62,64–67].
Los insectos comestibles cultivados que utilizan materiales alimentarios y desechos durante la crianza se resumen en
la Tabla 2.
Cuadro 2. Resumen de varias especies de insectos comestibles criados sobre desechos alimentarios y sus características.
Común De desarrollo
Orden Familia Especies Material degradado Referencia
Nombre Escenario
Granos usados y levadura
de cerveza, restos de pan,
restos de galletas, cáscaras
coleópteros Tenebrionidae Tenebrio molitor L. Gusano de harina larvas [28]
de patata al vapor, granos
secos de destilería de maíz
con solubles
Rastros de maíz gastados de
champiñones, harina de soja
coleópteros Tenebrionidae Tenebrio molitor L. Gusano de harina larvas [64]
altamente desnaturalizada,
granos de destilería de alcohol
coleópteros Tenebrionidae Zophobas atratus Fab. Gusano de harina larvas [28]
con solubles
coleópteros Tenebrionidae Alphitobius diaperinus Gusano de harina: larvas [28]
con solubles
Residuos de tejidos
mosca soldado vegetales, residuos
dípteros Stratiomyidae Hermetia illucens larvas [68]
negro de jardín, té de compost,
residuos de catering, restos de comida
Mezcla de contenido de huevo,
dípteros Muscidae Musca domestica Mosca doméstica
larvas desechos de criadero y [31]
salvado de trigo
Desperdicios de alimentos de
supermercados después de la
grillo de
ortópteros Gryllidae Acheta domesticus Adulto digestión enzimática aeróbica, [41]
la casa
desperdicios de alimentos municipales
sustrato heterogéneo
Salvado de arroz, cogollos de
Grillo de yuca, espinaca de agua,
ortópteros Gryllidae Teleogryllus testaceus Adulto grano usado, residuos de [67]
campo camboyano
la producción de brotes de
frijol mungo
En general, los principales macronutrientes requeridos para la producción masiva de insectos son (a) carbohidratos,
que sirven como reserva de energía pero también se requieren para la configuración de la quitina (exoesqueleto de los
artrópodos) [60], (b) lípidos (principalmente ácidos grasos poliinsaturados como como linoleico y linolénico), que son los
principales componentes estructurales de la membrana celular, y también almacenan y suministran energía metabólica
durante períodos de demandas sostenidas y ayudan a conservar el agua en la cutícula de los artrópodos [29,59,69], y (c) la
los aminoácidos leucina, isoleucina, valina, treonina, lisina, arginina, metionina, histidina, fenilalanina y triptófano, que los
insectos no pueden sintetizar [70], y tirosina, prolina, serina, cisteína, glicina, ácido aspártico y ácido glutámico, que los
insectos pueden sintetizar, pero en cantidades insuficientes con un alto consumo de energía [61,70]. Los micronutrientes
esenciales en la cría de insectos son (a) los esteroles, que los insectos no pueden sintetizar, (b) las vitaminas y (c) los
minerales [30].
Los requerimientos de nutrientes de los insectos comestibles en producción en masa se resumen en la Tabla 3.
112
Cuadro 3. Resumen de los requerimientos de nutrientes de los insectos comestibles (adaptado de [30,60]).
macronutrientes micronutrientes Minerales
carbohidratos lípidos Proteínas Esteroles *** vitaminas Elementos *****

Globulinas
Nucleoproteínas Hidrógeno
lipoproteínas Oxígeno
Proteínas insolubles Carbón
Aminoácidos: Nitrógeno
Leucina *** Calcio +
A: Retinol + α y β
Isoleucina *** Fósforo +++
caroteno (Ls)
Valina *** Cloro
B1: Tiamina (Ws)
Treonina *** potasio +++
Glucosa * B2: Riboflavina (Ws)
Fructosa * Lisina *** B3: Nicotinamida (Ws) Azufre
Arginina *** Colesterol sodio +++
Galactosa * B4: Colina (Ws)
Metionina *** Fitoesteroles Magnesio +++
Arabinosa ** Linoleico (Pfa) *** B5: ácido pantoténico
Histidina *** (βsitosterol, Hierro ++
ribosa ** Linolénico (Pfa) *** (Ws)
Fenilalanina *** campesterol, Cobre +++
Xilosa ** Fosfolípidos **** B6: Piridoxina (Ws)
Triptófano *** estigmasterol) cinc +++
Galactosa ** B12: Cobalamina (Ws)
Tirosina **** Ergosterol Silicona
Maltosa * C: Ácido ascórbico (Ls)
(componente principal de Yodo
sacarosa * D: colecalsiferol y
la esclerotina) Cobalto
Ergocalsiferol (Ls)
Prolina **** Manganeso +++
E: αtocoferol (Ls)
(importante durante Molibdeno
K: Filoquinona (Ls)
el inicio del vuelo) Flúor
Serina **** Estaño
Cisteína **** Cromo
Glicina **** Selenio
Ácido aspártico **** Vanadio
Ácido glutamico ****
*: Insectos capaces de absorber y metabolizar; **: Insectos capaces de absorber pero no metabolizar; Pfa: ácidos grasos
poliinsaturados; ***: Insectos incapaces de sintetizar; ****: Insectos capaces de sintetizar; Ws: soluble en agua; Ls: liposoluble; *****:
Enumerados en orden de importancia como esenciales para la materia viva (de arriba hacia abajo). Los minerales consisten en
combinaciones de cationes y aniones de elementos; +++: Importante para el crecimiento de insectos; ++: importante en las vías
enzimáticas, incluida la síntesis de ADN; +: Importante en menor medida, papel importante en la excitación muscular.
Los desechos orgánicos de la industria alimentaria se producen en grandes cantidades y pueden valorizarse para
diversos fines, por ejemplo, como biocombustibles, fertilizantes para cultivos, productos farmacéuticos, alimentos funcionales,
etc. [25]. Las mayores cantidades son generadas por las industrias de frutas, verduras, aceite de oliva, fermentación, lácteos,
carne y mariscos [23]. Los desechos de alimentos comprenden una mezcla de varios residuos de alimentos, por ejemplo, pan,
pasteles, fideos, arroz, patatas, carne y verduras [21].
Los insectos son mucho más eficientes para convertir el alimento en peso corporal que el ganado
convencional y pueden criarse en flujos de desechos orgánicos, transformándolos en alimentos y piensos de alto valor [31].
El uso de desechos de alimentos en la cría de insectos comestibles es un enfoque bastante nuevo y prometedor [7,11]. Para
ello , se han propuesto diversas dietas artificiales basadas en residuos alimentarios que cubren las necesidades nutricionales
de los insectos de cultivo , sin pretratamiento del biomaterial [28,31,67] (ver también Tabla 2).
La composición química y el valor nutricional de varios desechos que ya se han utilizado en insectos
crianza se resumen en la Tabla 4.
Cuadro 4. Resumen de la composición química de diversos materiales y desechos alimentarios que pueden utilizarse para
criar insectos comestibles (principalmente adaptado de la base de datos DTUFood [71]).
Alimento * Composición química Referencia
N total (2.560 %), proteínas (16,2 %), carbohidratos disponibles (24,6 %), fibra dietética (40,2 %),
grasas totales (5,3 %), cenizas (5,4 %), agua (8,4 %), vitaminas (C, E, K1, B1, B2, B3, B5, B6, B9),
minerales e inorgánicos (Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Cu, Zn, In, Mn, Cr, Se, Mo, Co, Ni , Cd, Pb), carbohidratos
(fructosa, glucosa, sacarosa), ácidos grasos saturados (C16:0, C18:0, C20:0), ácidos grasos
Salvado de trigo monoinsaturados (C16:1 n7, C18:1 n9, C20:1 n11), ácidos grasos poliinsaturados (C18:2 n6, [71,72]
C18:3 n3, C20:4 n6), aminoácidos (isoleucina, leucina, lisina, metionina, cisteína, fenilalanina,
tirosina , treonina, triptófano, valina, arginina, histidina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico,
glicina, prolina, serina)
113
Tabla 4. Cont.
grasas totales (22,2 %), cenizas (5,1 %), agua (5,1 %), vitaminas (A, βcaroteno, E, K1, B1,
B2, B3, B5, B6, B9), minerales e inorgánicos (Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Cu, Z, In, Mn, Cr, Se, Ni , Hg, Cd,
Pb), carbohidratos (sacarosa, almidón, exosas, pentosas, ácidos urónicos, celulosa, lignina), ácidos
grasos saturados (C12:0, C14:0, C16:0, C18:0, C20:0, C22:0), ácidos grasos monoinsaturados (C16:1
Harina de soja [71,73]
n7, C18:1 n9, C20:1 n11), ácidos grasos poliinsaturados (C18:2 n6, C18:3 n3), aminoácidos
(isoleucina, leucina, lisina, metionina, cisteína, fenilalanina, tirosina, treonina, triptófano, valina,
arginina, histidina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, prolina, serina)
N total (1.890%), proteína (11.0%), carbohidratos disponibles (64.3%), fibra dietética (8.5%), grasa
total (4.2%), agua (8.7%), vitaminas (B1, B2, B3, B6, B9, E), minerales e inorgánicos (Na, K, Ca, Mg,
P, Fe, Cu, Zn, In, Mn, Cr, Se, Mo, Co, Ni, Hg, Cd, Pb), aminoácidos ( isoleucina , leucina, lisina,
Grano gastado ([71,74]
metionina, fenilalanina, treonina, triptófano, valina, arginina, histidina, alanina, ácido aspártico,
ácido glutámico, glicina, prolina, serina)
N total (1.340%), % proteína (8.4 %), carbohidratos disponibles (12.7 %), fibra dietética (6.2 %), grasa
total (1.9 %), ceniza (1.8 %), agua (69.0 %), vitaminas (B1, E, B2, B3, B5, B6, B7, B9, C), minerales e
inorgánicos (Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Cu, Z, In, Mn, Se, Ni, Cd) , carbohidratos (manosa, β(1,3), (1,6)
glucano, α(1,4)glucano, quitina) ácidos grasos saturados (C12:0, C16:0, C18:0), ácidos
grasos monoinsaturados (C16:1 n7, C18:1 n9), ácidos grasos poliinsaturados (C18:2
levadura de cerveza gastada [71,75–77]
n6), aminoácidos (isoleucina, leucina, lisina, metionina, cisteína, fenilalanina, tirosina, treonina,
triptófano, valina, arginina, histidina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, prolina,
serina), ácidos nucleicos
grasas totales (4,3 %), cenizas (1,8 %), agua (33,9 %), vitaminas (E, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9),
minerales e inorgánicos (Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Cu, Z, In, Mn, Cr, Se, Ni, Hg, As, Cd , Pb), carbohidratos
(fructosa, glucosa, sacarosa), ácidos grasos saturados (C14:0, C16:0, C18:0, C20:0), ácidos grasos
restos de pan monoinsaturados (C16:1 n7, C18:1 n 9, C20:1 n11), ácidos grasos poliinsaturados (C18:2 n6, [71,78]
C18:3 n3), aminoácidos (isoleucina, leucina, lisina, metionina, cisteína, fenilalanina, tirosina, treonina,
triptófano, valina, arginina, histidina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, prolina, serina)
Almidón (25 %), polisacárido no amiláceo (30 %), lignina insoluble y soluble en ácido (20 %),
Peeling de patatas al vapor [71,79]
proteína (18 %), lípidos (1 %) y cenizas (6 %).
N total (0,324), proteínas (2,0 %), carbohidratos disponibles (15,9 %), grasas totales (0,3 %), fibra
dietética (1,4 %), cenizas (0,9 %), agua (79,5 %), vitaminas (A, B1 , B2, B3, B5, B6, B7, B9, C), minerales
e inorgánicos (Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Cu, Zn, In, Mn, Cr, Se, Ni, Hg, As, Cd, Pb), carbohidratos (fructosa,
glucosa, sacarosa, almidón, exosas, pentosas, ácidos urónicos, celulosa), ácidos grasos saturados
Papa (C16:0, C18:0), ácidos grasos monoinsaturados (C16:1 n7, C18 :1 n9), ácidos grasos poliinsaturados
[80]
(C18:2 n6, C18:3 n3), aminoácidos (isoleucina, leucina, lisina, metionina, cisteína, fenilalanina, tirosina,
treonina, triptófano , valina, arginina , histidina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina,
prolina, serina)
N total (13.200 %), proteínas (82,3 %), carbohidratos disponibles (6,8 %), fibra dietética (0,0 %), grasas
totales (0,0 %), cenizas (5,1 %), agua (5,8 %), vitaminas (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, D, E),
minerales e inorgánicos (Cl, Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Cu, Zn, In, Mn, Cr, Se) , aminoácidos (isoleucina,
claras de huevo secas leucina, lisina, metionina, cisteína, fenilalanina, tirosina, treonina, triptófano, valina, arginina, histidina, [71,81]
alanina, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, prolina, serina), colesterol (16 mg/100 g)
N total (2,24 %), proteínas (13,4 %), carbohidratos disponibles (28,7 %), fibra dietética (21,0 %),
grasas totales (0,0 %), cenizas (10,0 %), agua (6,1 %), vitaminas (B1, B2, B3), minerales e inorgánicos
Salvado de arroz
(Na, K, Ca, P, Fe), hidratos de carbono (fibra bruta 11,5%), aminoácidos (isoleucina, leucina, lisina,
[71,82]
metionina, cisteína, fenilalanina, tirosina, treonina, triptófano , valina , arginina, histidina, alanina, ácido
aspártico, ácido glutámico, glicina, prolina, serina)
114
Tabla 4. Cont.
N total (0,11 %), proteínas (0,7 %), carbohidratos disponibles (5,8 %), fibra dietética
(2,9 %), grasas totales (0,4 %), cenizas (0,7 %), agua (89,5 %), vitaminas (A, β
caroteno, E, K1, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, C), minerales e inorgánicos (Na, K, Ca,
Mg, P, Fe, Cu, Zn, In, Mn, Cr , Se, Ni, Hg, As, Cd, Pb), carbohidratos (fructosa,
glucosa, sacarosa, hexosas, pentosas, ácidos urónicos, celulosa, lignina), ácidos
Zanahoria [71,83]
grasos saturados (C16:0, C18:0), ácidos grasos monoinsaturados (C18:1
n9), ácidos grasos poliinsaturados (C18:2 n6, C18:3 n3, C20:4 n6), aminoácidos
(isoleucina, leucina, lisina, metionina, cisteína, fenilalanina, tirosina, treonina,
triptófano, valina, arginina, histidina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico,
N total (0,204 %), proteínas (1,3 %), carbohidratos disponibles (0,8 %), fibra
dietética (1,3 %), grasas totales (0,4 %), cenizas (0,8 %), agua (95,5 %),
vitaminas (A, βcaroteno, E, K1, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, C), minerales e
inorgánicos (Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Cu, Zn, In, Mn ), carbohidratos (fructosa, glucosa,
sacarosa, almidón, hexosas, pentosas, ácidos urónicos, celulosa, lignina), ácidos
Lechuga grasos saturados (C12:0, C16:0, C18:0), ácidos grasos monoinsaturados (C16:1 [71,84]
n7, C18:1 n9, C20:1 n11, C22:1 n9), ácidos grasos poliinsaturados (C18:2 n6,
C18:3 n3, C18:4 n3, C20: 4 n6, C20:5 n3, C22:5 n3, C22:6 n3), aminoácidos
(isoleucina, leucina, lisina, metionina, cisteína, fenilalanina, tirosina, treonina,
triptófano, valina , arginina , histidina, alanina, ácido aspártico, ácido glutámico,
N total (0,218 %), proteínas (1,4 %), carbohidratos disponibles (36,3 %), fibra
dietética (1,8 %), grasas totales (0,3 %), cenizas (0,6 %), agua (59,7 %),
vitaminas (A, βcaroteno, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, C), minerales e inorgánicos (Na,
K, Ca, Mg, P, Fe, Cu, Zn, In, Mn, Cr, Se, Ni , Hg, As, Cd, Pb), carbohidratos
(fructosa, glucosa, sacarosa, almidón, hexosas, pentosas, ácidos urónicos, celulosa,
planta de yuca [71,85]
lignina), ácidos grasos saturados (C16:0, C18:0), ácidos grasos monoinsaturados
(C16 :1 n7, C18:1 n9), ácidos grasos poliinsaturados (C18:2 n6, C18:3 n3,
C20:4 n6), aminoácidos (isoleucina, leucina, lisina, metionina , cisteína,
fenilalanina, tirosina, treonina, triptófano, valina, arginina, histidina, alanina, ácido
aspártico, ácido glutámico, glicina, prolina, serina)
N total (0,000 %), proteína (0,0 %), carbohidratos disponibles (27,5 %), fibra
dietética (0,0 %), grasa total (72,5 %), ceniza (0,0 %), agua (0,0 %),
vitaminas (E, γtocoferol), minerales e inorgánicos (Na, K, Ca, Mg, P, Fe, Cu,
Aceite de cacahuete [71,86]
Zn), ácidos grasos saturados (C16:0, C18:0, C20:0, C22:0, C24:0) , ácidos grasos
monoinsaturados (C16:1 n7, C18:1 n9, C20:1 n11), ácidos grasos poliinsaturados
(C18:2 n6, C18:3 n3, C22:6 n 3, otros ácidos grasos)
* Los datos se refieren a productos naturales que no han sido procesados ni pretratados.
4. Condiciones de cría y tecnologías de masa de insectos
La recolección silvestre puede conducir potencialmente al agotamiento de las especies de insectos naturales [3].
Para una industria sostenible de cultivo de insectos, se requieren tecnologías rentables de cría, cosecha y procesamiento [19].
La información necesaria para la producción en masa a escala industrial de insectos a partir de biorresiduos y residuos
orgánicos agrícolas para alimentos y piensos no está completa, pero se están realizando muchas investigaciones en este
campo y los datos recientes parecen muy prometedores [30] (ver también la Tabla 2). . La necesidad de recursos de nutrientes
sostenibles, más amigables con el medio ambiente y de menor costo para las tecnologías de masa de insectos aumentará a
medida que aumente el nivel de producción [30]. En este sentido, los residuos de biomasa alimentaria pueden constituir una
fuente potencial de ingredientes para dietas artificiales utilizadas en la producción industrial de insectos comestibles [7,11,54].
Las dietas artificiales utilizadas en la producción masiva de insectos varían de líquidas a sólidas, dependiendo
principalmente de (a) las necesidades nutricionales del insecto en cuestión en términos de macronutrientes, micronutrientes
y minerales (ver también la Tabla 3); (b) la adaptación alimentaria del insecto, es decir, la forma en que las piezas bucales
procesan los alimentos antes de la ingestión, ya que se adaptan para satisfacer las necesidades de alimentación. Las especies
de insectos que poseen piezas bucales succionadoras se alimentan de líquidos, las que poseen piezas bucales mordedoras
se alimentan de sólidos, y las que poseen piezas bucales succionadoras modificadas, los llamados insectos perforadores
succionadores, son capaces de perforar al huésped y succionar tejidos animales y/o vegetales licuados [ 30 , 60]; c) la
prefabricación de la dieta artificial. Las dietas líquidas se pueden utilizar después de la encapsulación utilizando diferentes materiales (parafina, PVC
115
polietileno, polipropileno) para imitar huevos artificiales, un paso de tratamiento necesario para su contención y
presentación [60], mientras que los líquidos y lodos se pueden secar y concentrar para disolverlos en agua o
mezclarlos con otros ingredientes. Los semilíquidos se utilizan en forma de gránulos o extruidos que pueden ser
ingeridos por insectos con aparato bucal mordedor y también por insectos con aparato bucal chupador [30]. Los
sólidos se presentan como un pienso macerado con trituración y mezcla de todas las materias primas, previa
granulación de diversas materias primas o por extrusión. Los sólidos también se pueden encapsular con tecnología
de coacervación compleja utilizando proteínas y polisacáridos [87].
El desarrollo de dietas comerciales de bajo costo es crucial para la producción de insectos comestibles a escala
industrial [19]. En la producción en masa, también se deben aplicar los equipos mecánicos necesarios en un proceso de
producción integrado, automatización, mecanización y tecnologías de monitoreo para criar, cosechar, procesar, empacar
y entregar insectos comestibles, a fin de reducir costos y producir productos alimenticios seguros en cantidades a gran
escala [5,19].
5. Composición nutricional, caracterización de ingredientes y propiedades funcionales de alimentos de especies
de insectos comestibles
Las condiciones de cultivo de insectos, la etapa de desarrollo del insecto, la dieta artificial seleccionada y los
métodos de preparación y procesamiento utilizados (p. ej., freír, hervir, secar) son factores que afectan la composición
nutricional de los insectos criados [11] . Se ha informado que diferentes dietas compuestas de varios desechos de
alimentos dan como resultado diferencias en el valor nutricional de las larvas del gusano de la harina [88]. Sin embargo,
la mayoría de los estudios previos no brindan detalles sobre las dietas artificiales y las condiciones utilizadas para la
cría de insectos o sobre las etapas de preparación y proceso [29,53,54].
Hasta la fecha, faltan los datos requeridos en las recomendaciones de INFOODS/EuroFIR sobre el valor nutricional
de los ingredientes de insectos comestibles más comunes [29]. Estos datos se refieren a proteínas, proteínas brutas,
lípidos brutos, carbohidratos disponibles, humedad, materia seca, energía, vitaminas y minerales.
El contenido de nutrientes de algunos de los insectos comestibles criados más comúnmente sobre desechos de
alimentos, en términos de proteínas crudas, lípidos crudos, carbohidratos disponibles, vitaminas y minerales, se resume
en la Tabla 5.
Cuadro 5. Valor nutricional de los insectos comestibles más comunes criados en materiales y desechos alimentarios.
Común De desarrollo Proteína cruda lípidos Carbohidratos,

especies de insectos Comentarios generales Referencia
Nombre Escenario (% Peso en seco) (% Peso en seco) Vitaminas, Minerales, etc.
La leucina, lisina, metionina+cisteína, treonina y
valina fueron los aminoácidos limitantes en
comparación con los requerimientos
Gusano de la FAO/OMS.
tenebrio molitor larvas 70–76% 612% alrededor del 10% [66]
amarillo Los principales ácidos grasos fueron ácido
linoleico (C18:2, 30–38 %), ácido oleico
(C18:1, 24–34 %) y ácido palmítico (C16:0,
14–17 %).
Las especies de gusanos de la harina se
pueden cultivar con éxito con dietas
compuestas de subproductos orgánicos.
La dieta afecta el crecimiento, el desarrollo
y la eficiencia de conversión
Gusano
tenebrio molitor larvas 46,9–48,6% 18,9–27,6%
alimenticia del gusano de la harina. [28]
amarillo
Las dietas ricas en proteínas derivadas de
levadura parecen
favorables con respecto a la reducción
del tiempo de desarrollo de las larvas,
la reducción de la mortalidad y el aumento de la ganancia de peso.
* Zofobas atratus Gusano de harina larvas 34,2–42,5% 32,8–42,5%

[28]
fabuloso
*Alphitobius Gusano de harina larvas 64,3–65,0% 13,4–21,8% [28]

diaperinus
Es posible, utilizando medios muy simples,
para criar grillos de campo locales a temperatura ambiente
Carbohidratos (como fibra
grillo de Temperatura en Camboya.
cruda): 13,2–28,9 %
*Acheta domesticus Adulto 10,2–28,6 % 2.2–12.0% Los subproductos de la industria agrícola [67]
la casa Minerales:
Vitaminas: y alimentaria probados aquí también tienen
potencial para su uso como alimento para grillos,
solos o en combinación.
116
Tabla 5. Cont.
Común De desarrollo Proteína cruda lípidos Carbohidratos,

especies de insectos Comentarios generales Referencia
Nombre Escenario (% Peso en seco) (% Peso en seco) Vitaminas, Minerales, etc.
Los grillos alimentados con
el filtrado sólido de los desechos de alimentos
procesados a escala industrial a través de
la digestión enzimática
grillo de pudieron alcanzar un tamaño cosechable y lograr
Acheta domesticus Adulto dieciséis% [41]
la casa eficiencias de alimentación y proteínas.
Los grillos criados en sustratos de desecho de
calidad suficiente podrían ser el camino más
prometedor para producir grillos de forma
económica
Carbohidratos:
Casa Minerales: Na, Fe, Zn, Los datos muestran considerable
Acheta domesticus Adulto 15,6% ± 8,1% 4,56% ± 2,15% [29]
Grillo Ca, yo variación dentro de las especies de insectos
Vitaminas: B12, B2
El campo de investigación relacionado con la caracterización de las propiedades funcionales de los alimentos de los insectos
comestibles más comunes (p. ej., composición de aminoácidos y lípidos, capacidad y estabilidad de la espuma, capacidad de absorción
de agua (WAC), capacidad de absorción de grasa (FAC), solubilidad de proteínas, microestructura y color , propiedades reológicas ,
etc.) es bastante nuevo. Hay algunos datos disponibles, principalmente para el gusano amarillo de la harina, el gusano de seda, el
grillo doméstico y la mosca doméstica [54,89–91].
Las propiedades funcionales de los alimentos caracterizadas para los insectos comestibles criados con mayor frecuencia se
resumen en la Tabla 6.
Tabla 6. Caracterización de ingredientes y propiedades funcionales de los alimentos de las especies de insectos comestibles
más comunes.
Nombre común De desarrollo Referencia

especies de insectos Caracterización de las propiedades de los alimentos
Escenario
Bombyx Mori Gusano de seda pupas Análisis de aminoácidos, determinación de lípidos [89]

Composición de aminoácidos (cromatografía de
intercambio iónico), calidad de la proteína (color, contenido de
tenebrio molitor Gusano amarillo larvas proteína y peso molecular), distribución del peso molecular de las

[90]
fracciones de proteína de insectos
(SDSPAGE), capacidad y estabilidad de la espuma,
propiedades reológicas
Composición de aminoácidos, capacidad de absorción de agua
tenebrio molitor Gusano amarillo larvas (WAC), capacidad de absorción de grasas (FAC), solubilidad

[91]
de proteínas, microestructura y color, propiedades reológicas
Composición de aminoácidos (cromatografía de
intercambio iónico), calidad de la proteína (color, contenido de
Acheta domesticus grillo de la casa Adulto proteína y peso molecular), distribución del peso molecular de las

[90]
fracciones de proteína de insectos
(SDSPAGE), capacidad y estabilidad de la espuma,
propiedades reológicas
Humedad, proteínas, grasas, cenizas, fibra detergente ácida
Musca domestica (FDA), fibra detergente neutro (FDN), minerales, aminoácidos,
Mosca doméstica pupas [92]
ácidos grasos, vitaminas y determinación de carotenoides
seleccionados
Determinación del contenido de agua, fibra cruda
Apis mellifera abeja Huevos, larvas, adulto (carbohidratos estructurales), grasas, extracto de nitrógeno libre y [93]
sales minerales, proteínas brutas, vitamina B2
Humedad, proteínas, grasas, cenizas, fibra detergente ácida
Hermetia illucens larvas (FDA), fibra detergente neutro (FDN), minerales, aminoácidos,

mosca soldado negro [92]
ácidos grasos, vitaminas y determinación de carotenoides
seleccionados
6. Proceso de fermentación en la producción de cadenas de insectos comestibles
El proceso de fermentación se aplica durante la producción de insectos comestibles en las siguientes etapas: (a) Valorización
de los desechos de alimentos mediante la fermentación y luego el uso de insectos comestibles, especialmente de la mosca
soldado negra (BSF) [94,95]. El uso de prefermentación se puede realizar para la estabilización de residuos y el aumento de la
seguridad alimentaria. Además, la prefermentación puede mejorar la digestibilidad y la biodisponibilidad de los nutrientes para las
larvas de insectos, ya que la mayoría de los nutrientes presentes en los residuos o subproductos agrícolas se encuentran en forma
insoluble [94]. Los residuos sólidos producidos por el procesamiento de los desechos de alimentos a través de la fermentación
microaeróbica (MF) y por las larvas de la mosca soldado negra (BSF) se han propuesto como fertilizantes del suelo para el crecimiento
de las plantas [95].
117
(b) Uso de subproductos de fermentación y desechos de alimentos como ingredientes de dietas artificiales utilizadas
para la producción de insectos comestibles. Las especies comestibles de gusanos de la harina Tenebrio molitor L., Zophobas
atratus Fab. y Alphitobius diaperinus Panzer se cultivaron con éxito en dietas compuestas de subproductos orgánicos que se
originaron en la elaboración de cerveza, el horneado de pan/galletas, el procesamiento de patatas y la producción de bioetanol
[28]. El insecto comestible Hermetia illucens, comúnmente llamado mosca soldado negra (BSF), se usó para la biodegradación
de residuos de cocina, pasto, lodos de depuradora y material sólido separado de plantas de biogás [68]. Los grillos domésticos
(Acheta domesticus) se han criado con dietas basadas en residuos de alimentos procesados a escala industrial mediante
digestión enzimática [41].
(c) Fermentación de las órdenes de insectos comestibles producidos para aumentar la vida útil del producto y minimizar
los riesgos microbianos para los consumidores asociados con el consumo de insectos comestibles [96,97].
La acidificación exitosa y la efectividad en la salvaguarda de la vida útil y la seguridad del producto se lograron mediante el
control de Enterobacterias y esporas bacterianas después de la fermentación láctica de mezclas de harina y agua con 10% o
20% de larvas de gusanos de la harina tostadas en polvo [97]. Técnicas como el secado, la acidificación y la fermentación
láctica pueden preservar insectos comestibles y productos derivados de insectos sin el uso de un refrigerador [16].
7. Legislación, seguridad alimentaria y peligros potenciales asociados con la cadena de producción de alimentos a alimentos
de insectos comestibles
La legislación relativa a los insectos comestibles para alimentos y piensos varía en todo el mundo. La legislación actual
de la UE es bastante estricta, con la aplicación de dos reglamentos: (a) El Reglamento 2015/2283 (Autoridad Europea de
Seguridad Alimentaria, EFSA) se refiere al uso de insectos comestibles como alimento. Dado que estos no se consumían en
la UE antes de marzo de 1997, inicialmente se consideraron 'nuevos alimentos' [98], mientras que en la normativa reformada
no se mencionan específicamente como nuevos alimentos [99]. Sin embargo, si están destinados a ser vendidos en el
mercado de la UE, requieren autorización de la EFSA. (b) El Reglamento UE 999/2001 se refiere al uso de insectos
comestibles como alimento [100]. Según la Plataforma Internacional de Insectos para Alimentos y Piensos (IPIFF, por sus
siglas en inglés), solo la grasa de insecto purificada y las proteínas de insectos hidrolizadas pueden usarse como alimento
para el ganado, mientras que las proteínas de insectos no hidrolizadas actualmente solo pueden usarse y venderse como
alimento para mascotas y para la alimentación de animales de peletería, mientras que las proteínas derivadas de insectos no
están permitidas para su uso en la alimentación de cerdos o aves [101]. El reciente reglamento de la UE n.º 2017/893
autoriza el uso de proteínas de insectos procedentes de siete especies de insectos: mosca doméstica común (Musca
domestica), mosca soldado negra (Hermetia illucens), gusano amarillo de la harina (Tenebrio molitor), gusano pequeño de la
harina (Alphitobius diaperinus), gusano doméstico Grillo (Acheta domesticus), grillo anillado (Gryllodes sigillatus) y grillo de
campo (Gryllus assimilis), como alimento en acuicultura [99].
A pesar del estricto marco regulatorio, algunos países de la UE están avanzando rápidamente hacia la aprobación de
insectos comestibles para alimentos y piensos [102]. Holanda tolera la venta de insectos comestibles incluidos en la 'Lista de
Insectos Comestibles del Mundo' [6], mientras que en Bélgica la Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaîne Alimentaire
(AFSCA) está llevando a cabo un análisis de riesgo sobre la venta de gusanos de la harina comestibles , grillos y langostas
como nuevos alimentos para el mercado belga [102,103]. En Alemania, la regulación de la UE que se refiere a las proteínas
animales procesadas (PAP) se interpreta de tal manera que las PAP de insectos no se permiten como alimento (ni siquiera
en la acuicultura), ya que los insectos no se sacrifican, pero esta prohibición de alimentos no se aplica a los insectos vivos.
Por lo tanto, se ha hecho una propuesta a Deutsche Landwirtschaftsgesellschaft (DLG) para incluir insectos vivos como
ingrediente directo en alimentos para animales [103]. En el Reino Unido, la ley es más laxa y permite que los insectos se
vendan como alimento, pero esto cambiará relativamente pronto con un procedimiento de solicitud obligatorio requerido para
la clasificación de productos alimenticios a base de insectos [103]. En Suiza, los insectos comestibles requieren la autorización
de la Oficina Federal de Seguridad Alimentaria y Servicios Veterinarios (FFSVO) si están destinados a venderse en el
mercado libre [103], pero recientemente la FFSVO siguió la política de Bélgica al permitir la venta de determinadas especies
de insectos por alimentos en el mercado suizo [102].
En EE. UU., la legislación sobre insectos comestibles también es estricta y más compleja. Las principales
autoridades son la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), que regula la industria y coordina
estrechamente con el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), y el Servicio de Inspección de
Sanidad Animal y Vegetal (APHIS) [102]. En cuanto a los productos alimenticios a base de insectos, estos deben ajustarse a la norma
118
prácticas de todos los demás alimentos de EE. UU., incluidas las pruebas de Salmonella y E. coli y, dado que los insectos comestibles
se consideran aditivos alimentarios, deben seguir las regulaciones de la FDA como se describe en la Ley Federal de Alimentos,
Medicamentos y Cosméticos (FFDCA) para aditivos alimentarios [104] . Todos los productores de productos de insectos comestibles
también deben cumplir con todos los procedimientos de fabricación de la FDA, conocidos como Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) ([103].
En Canadá, los alimentos a base de insectos se consideran 'novedosos' y la legislación es compleja, ya que la Agencia
Canadiense de Inspección de Alimentos (CFIA, por sus siglas en inglés), que pertenece a Health Canada, establece los
estándares de seguridad alimentaria y salud pública, mientras que las evaluaciones de seguridad alimentaria novedosa son
realizado bajo la Dirección de Alimentos [103]. En Australia y Nueva Zelanda, las normas de seguridad e higiene de los
alimentos las establece Food Standards Australia New Zealand (FSANZ), en la que los insectos comestibles se clasifican
como 'nuevos alimentos' (alimentos no tradicionales), como en las reglamentaciones de la UE, y requieren un evaluación de
temas de seguridad y salud pública antes de su comercialización, a menos que su venta esté prohibida [102,103].
En Asia, Tailandia parece ser un pionero y uno de los países más progresistas e innovadores en la producción,
recolección, procesamiento, transporte y comercialización de insectos comestibles en masa de grillos (la mayoría de las
granjas son empresas de mediana o gran escala) y picudo de la palma. larvas, pero también hormigas tejedoras, orugas de
bambú y saltamontes, que se recolectan de la naturaleza o se cosechan estacionalmente [38].
En China, a pesar de su crecimiento poblacional y económico, aún no se ha establecido la producción masiva de
insectos comestibles [102].
En África, se están desarrollando colaboraciones entre empresas africanas y europeas sobre el valor.
producción en cadena en la crianza, procesamiento, distribución y consumo de insectos comestibles [103].
La producción industrial en masa de insectos comestibles para alimentos y piensos está asociada con los peligros
involucrados en cualquier cadena de producción de alimentos, que se pueden clasificar principalmente en metales
pesados, micotoxinas, residuos de pesticidas y patógenos [16]. Durante los procesos relevantes en una cadena
alimentaria basada en insectos, los peligros relacionados con la inocuidad de los alimentos tienen dos orígenes: (a)
específicos de la especie y (b) relacionados con la cría, las prácticas de procesamiento, la conservación y/o las
condiciones de transporte. Se clasifican en (a) químicos, (b) físicos, (c) alérgenos y (d) microbianos [98,105].
Los datos sobre los peligros potenciales asociados con una cadena de producción de alimento a alimento basada
en los insectos comestibles más comunes se resumen en la Tabla 7.
Cuadro 7. Peligros asociados con la producción de insectos comestibles de alimento a alimento.
General
Peligro específico Sustancia Insecto Problema Referencia
Peligro
Plaguicidas organofosforados (malatión, Langosta
Pesticidas/fungicidas Tóxico, cancerígeno [106]
sumitión)
Contaminantes orgánicos Éter difenílico polibromado grillo de la casa Bioacumulativo y tóxico [107]
persistentes (PBDE)
Larvas de gusano de la harina
Cd Tóxico, cancerígeno [108–110]
(Tenebrio molitor)
Metales pesados Polilla Agrotis infusa
Como
Tóxico, cancerígeno [111]
(lepidópteros)
ld Grillo Tóxico, cancerígeno [105,112]
Pb, Zn, Cu, Cd Larvas de insectos (no especificado) Tóxico, cancerígeno
Uso prohibido en animales
antibióticos cloranfenicol Gusano de seda (Bombyx mori) [113]
producción
Sustancias tóxicas para insectos quinonas escarabajo bombardero
[105]
(para fines de defensa o Compuestos tóxicos
repelente, fabricado por
cianogénicos (linamarina o Mariposa [105]
el insecto mismo o lotaustralina)
acumulada por el insecto a través Proceso de melanización por Larvas de Galleria mellonella
[105]
de su entorno o alimento) aparición de productos tóxicos
Químico
infectadas por un hongo
Tenebriónidos:
Citotóxico contra la línea
Ulomoides dermesetoides,
harina celular epitelial de carcinoma
Compuestos fenólicos:
de pulmón humano A549, [98]
benzoquinona escarabajos (adultos)
Daño en el ADN,
Tribolium confusum y
Tribolium castaneum posible cancerígeno
Envenenamiento por vía dietética,
traumatismo intestinal por las
Veneno Las larvas de cerdas del insecto, colitis [105]
(con cerdas) coleópteros de Trogoderma spp.
ulcerosa
Ácido cianhídrico Escarabajo del ñame (Heteroligus meles) Anoxia, altamente tóxico [114]

Sustancias antinutricionales
Escarabajo del ñame (Heteroligus
meles), hormiga, termita, grillo,
taninos Precipitación de proteínas, tóxico [114–116]
Zonocerus variegatus
(saltamontes)
119
Tabla 7. Cont.
General
Peligro específico Sustancia Insecto Problema Referencia
Peligro
Materiales de los procesos como con
Asfixia, lesión, tóxico, dolor, alergia
Cuerpos extraños cualquier otro [105]
Físico
alimento procesado
Aguijón, rostros puntiagudos, pinos, Asfixia, asfixia, dolor, alergia
Partes de insectos [102]
pelos ásperos, cutículas, alas
Insectos cochinilla (Dactylopius Anafilaxia, urticaria, erupción
colorantes de insectos tinte carmín coco eritematosa [98]
Costa, Coccus cacti L.)
Proteínas de insectos Proteínas de plagas de lentejas Plagas de lentejas (Bruchus lentis) Infestación [117]
Proteínas de reacción cruzada:
tropomiosina y arginina quinasa Gusano de la harina (Tenebrio molitor L.) Choque alérgico [118]
alérgeno
Babeo, dificultad para
tragar, dolor y
enzimas de insectos Orugas (Lophocampa caryae) [98]
dificultad para respirar
Veneno Abeja, avispa, avispón Shock anafiláctico, dolor [105]

Alérgenos de insectos
quitina Varias especies de insectos comestibles Reacción alérgica [105]
Larvas de mosca soldado negro
Parásitos protozoarios humanos miasis intestinales [119]
parásitos (Hermetia illucens)
Enfermedades gastrointestinales,
Parásitos protozoarios humanos Cucarachas y algunos dípteros [120]
toxoplasmosis
Salmonela
Escarabajo amarillo de la harina
Salmonelosis
(Tenebrio molitor)
Shigella langosta del desierto
Vibrio spp. shigelosis
E. coli (Schistocerca gregaria) vibriosis
Polilla de seda
Microbiano bacterias yesrinia Diarrea [121–123]
enterocolítica (Bombyx mori) yesriniosis
Grillo
Campylobacter campilobacteriosis
(Acheta domesticus)
Listeria monocytogenes listeriosis
Langosta entera
Clostridium Mionecrosis por clostridios
(Locusta migratoria)
perfrigens
Aspergillus, Penicillium, Fusarium,
hongos micotoxinas [98,105]
Cladosporium, ficomicetos
Agentes transmisibles priones [105]
Pupas de Sarcophaga carnaria Scrapie en hamsters
no convencionales Scrapie (ovejas), enfermedad de las
Proteínas priónicas Larvas de mosca, ácaros [124]
(NCTA) vacas locas (bovinos)
8. Cría de insectos comestibles utilizando desechos de alimentos: hacia una gestión ecológica y sostenible de los
desechos de alimentos
Los desechos orgánicos generados en los procesos de la industria alimentaria son enormes en volumen y numerosos
en tipo [21,125]. Los flujos de alimentos domésticos también comprenden una cantidad significativa de desechos que no se
explotan sino que se depositan en vertederos, lo que causa daños ambientales [126]. En los últimos años, la gestión de los
residuos de alimentos ha atraído mucha atención, ya que estos productos de desecho pueden valorizarse con tecnologías
verdes de forma sostenible [127,128] para la producción de productos químicos renovables, biomateriales y biocombustibles [129].
En los últimos años, cada vez más consumidores de EE. UU. y varios países europeos, como
Holanda y Bélgica, adoptaron la tendencia de la entomofagia como aceptada [130,131].
La utilización de desechos de alimentos para la cría de insectos comestibles para alimentos y piensos parece un enfoque
prometedor [16] y algunos de los insectos comestibles más comunes ya se han criado sobre desechos de alimentos con
resultados alentadores (ver Tabla 2). Con respecto a los grillos criados en varios flujos de desechos de alimentos en un
invernadero de temperatura y humedad relativa controladas, con proporciones analizadas previamente de sustratos de
alimentación (contenido de humedad, N total, contenido de proteína cruda, contenido de fibra de detergente ácido, contenido de
grasa cruda, contenido de ceniza) en orden para evaluar la calidad de su alimentación, la acumulación de biomasa estuvo
fuertemente influenciada por la calidad de la dieta [41]. Con respecto a la cría de tres especies comestibles de gusanos de la
harina (Tenebrio molitor L., Zophobas atratus Fab. y Alphitobius diaperinus Panzer) en subproductos orgánicos de la industria
alimentaria, se determinaron los efectos de la composición de la dieta sobre la eficiencia de conversión alimenticia y el perfil de
ácidos grasos y proteína cruda del gusano de la harina . evaluado, lo que indica que el contenido de proteína de las larvas no se
vio afectado por la composición de la dieta, mientras que la composición de la grasa de las larvas se vio afectada por la dieta
utilizada hasta cierto punto [28]. La sustitución de dietas compuestas de granos mixtos con subproductos de la industria
agroalimentaria puede reducir el costo de la cría comercial de gusanos de la harina [64]. Durante un diseño experimental para la
cría de moscas soldado negras en diversos desechos de alimentos, se determinó la reducción de peso de los materiales de
desecho reposados, lo que indica la capacidad de la mosca soldado negra para degradar los alimentos y plantar desechos orgánicos [68].
Se evaluó el efecto de la densidad larvaria sobre la utilización del alimento durante la cría del gusano de la harina T.
molitor en una mezcla determinada de materiales alimenticios, lo que indica que, aunque las consideraciones de espacio en
120
la cría masiva de insectos es importante para reducir los costos de producción, el hacinamiento de larvas para ahorrar espacio
puede ser contraproducente. Además, se demostró que el aumento de la densidad de larvas tiene un impacto negativo en la
productividad, lo que resulta en una reducción lineal de la eficiencia de la conversión de alimentos, mayores gastos de
alimentos y una menor producción de biomasa [63].
Sin embargo, en los ensayos experimentales más actualizados, las dietas artificiales, las condiciones de crianza, el
valor nutricional de los insectos comestibles criados sobre los desechos de alimentos, el rendimiento (en términos de proteína,
contenido de grasa, quitina, etc.), no se determina la calidad ni la rentabilidad de cada técnica de cría.
Adicionalmente, en ninguna de las tecnologías referidas (ver Tabla 2) se presenta una evaluación técnica y económica .
Además de esto, los ensayos actualizados se han aplicado con mezclas de alimentos simples de desechos que, en muchos
casos, la proporción, la composición química de los materiales y desechos alimentarios utilizados y las condiciones del
sustrato de alimentación (temperatura, humedad, microbios). estabilidad, etc.) no son referidos, resultando así en un método
y tecnología de crianza masiva de insectos no estandarizados. Eso, en el caso de la valorización de los residuos alimentarios
domésticos es muy crítico ya que consisten en un sustrato heterogéneo de varios materiales alimentarios [41] y la compilación
de una dieta artificial estandarizada basada en esto parece complicada. La compilación de una dieta artificial basada en
mezclas de desechos más simples de la industria alimentaria (p. ej., grano gastado), parece más fácil y eficaz [28].
Finalmente, hasta ahora no se han realizado ensayos clínicos de insectos criados en materiales y desechos alimentarios en
humanos y animales.
9. Conclusiones
Los insectos comestibles podrían proporcionar una solución para satisfacer la creciente demanda futura de proteínas
de origen animal. Además, la sostenibilidad del sector de la industria alimentaria podría mejorarse mediante el uso de
desechos de alimentos como nuevos sustratos o componentes dietéticos en procesos a gran escala de cría de insectos
comestibles para la alimentación humana y animal. Esta bioconversión también podría contribuir significativamente a reducir
el cambio climático y los impactos ambientales de la producción de alimentos y piensos. Los primeros ensayos sobre la
alimentación de insectos con desechos de alimentos han producido resultados alentadores. Los posibles candidatos para
este propósito son la mosca soldado negra, que también ha sido probada para la gestión de residuos orgánicos municipales
con muy buenos resultados, los gusanos de la harina, las moscas domésticas y los grillos domésticos.
Aunque hay algunos resultados experimentales prometedores sobre la valorización de los desechos de alimentos
para la cría de insectos comestibles, se necesita más investigación sobre la creación de dietas artificiales basadas en
subproductos alimentarios para la producción en masa de insectos comestibles, el aislamiento y la caracterización del
contenido de nutrientes de los insectos criados . insectos, evaluación tecnoeconómica de la tecnología utilizada, evaluación
del control de la seguridad de la cadena alimentaria y evaluaciones del ciclo de vida de las especies de insectos cultivadas,
a fin de permitir el establecimiento de una industria alimentaria moderna basada en insectos. Además, el uso de diversos
subproductos de la fermentación (p. ej., levadura, bacterias, microalgas, etc.) como materiales potenciales para la cría de
insectos comestibles se ha estudiado poco y no lo suficiente, y la investigación adicional sobre la combinación de técnicas
de fermentación con tecnologías de cría de insectos comestibles.
Contribuciones de los autores: Redacción—Borrador original, preparación, creación y presentación del trabajo publicado, VV
Financiamiento: Esta investigación no recibió financiamiento externo
Conflictos de interés: Los autores declaran no tener conflicto de interés
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Azúcar consumida (%) Producir (%) D­LA (%)

Azúcar consumida (%) Producir (%) D­LA (%)

Producir Productividad D­LA

Almidón de arroz L. delbrueckii LD 0028 Salvado de arroz desgrasado SHF 0,70 1,55 97,5 [49]

Doble hidrógeno versus Δ Biomasa Δ Biomasa

Kluyvera ascorbata ATCC 33433 2,20 0,54 0

Hafnia alvei ATCC 51873 2,08 0,48 0

Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 2,05 0,45 0

Capnocytophaga sputigena ATCC 33612 2,05 0,43 0,21

Lactococcus garvieae ATCC 49156 2,05 −0,29 0,43

Trabulsiella guamensis ATCC 49490 2,01 0,42 0

Celulosimicrobium cellulans J36 2,01 0,37 0,28

Microorganismo Tipo de Proceso Enzimas Utilizadas Etanol (g/L) Productividad (g/L/h) Referencia

S. cerevisiae SHF amilasa, glucoamilasa 8.0 0.33 [32]

Ri (%) = 100 (mes − mi)/mes (1)

Lignina (%) 9,1 0,79

Celulosa (%) TC (%) TN (%) C/N TP (%) TK (%)

Pérdida de lignina (%) 0,457 ** 0,581 ** −0,377 ** 0,821 0,564 ** −0,265 * 0,164

Scer 12◦P Saccharomyces cerevisiae TUM 68 12 79 F.

Scer Scer Scer Scer Lodo Tdel Bbru Sfib

Día 0 Día 4 Día 8 Día 12

Control 0,63 ± 0,20 c,C 0,15 ± 0,05 c,A 4,17 ± 0,83 b,B 6,72 ± 0,70 a,C

Fermentación 2019, 5, 81; doi:10.3390/fermentación5030081 109 www.mdpi.com/journal/fermentación

Nombre común De desarrollo Fuente Referencia

Langosta Agricultura, Alimentos para humanos, alimentos para mascotas y

Hermetia illucens mosca soldado negro larvas Agricultura Alimentación humana, alimentación animal [50]

macronutrientes micronutrientes Minerales

carbohidratos lípidos Proteínas Esteroles *** vitaminas Elementos *****

Alimento * Composición química Referencia

Alimento * Composición química Referencia

Alimento * Composición química Referencia

Común De desarrollo Proteína cruda lípidos Carbohidratos,

* Zofobas atratus Gusano de harina larvas 34,2–42,5% 32,8–42,5% ­

*Alphitobius Gusano de harina larvas 64,3–65,0% 13,4–21,8% ­ [28]

Común De desarrollo Proteína cruda lípidos Carbohidratos,

Nombre común De desarrollo Referencia

Bombyx Mori Gusano de seda pupas Análisis de aminoácidos, determinación de lípidos [89]

tenebrio molitor Gusano amarillo larvas proteína y peso molecular), distribución del peso molecular de las

tenebrio molitor Gusano amarillo larvas (WAC), capacidad de absorción de grasas (FAC), solubilidad

Acheta domesticus grillo de la casa Adulto proteína y peso molecular), distribución del peso molecular de las

Hermetia illucens larvas (FDA), fibra detergente neutro (FDN), minerales, aminoácidos,

Ácido cianhídrico Escarabajo del ñame (Heteroligus meles) Anoxia, altamente tóxico [114]

Veneno Abeja, avispa, avispón Shock anafiláctico, dolor [105]

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Azúcar consumida (%) Producir (%) DLA (%)

Azúcar consumida (%) Producir (%) DLA (%)

Producir Productividad DLA

Pérdida de lignina (%) 0,457 0,581 −0,377 0,821 0,564 −0,265 * 0,164

carbohidratos lípidos Proteínas Esteroles * vitaminas Elementos ***

* Zofobas atratus Gusano de harina larvas 34,2–42,5% 32,8–42,5%

*Alphitobius Gusano de harina larvas 64,3–65,0% 13,4–21,8% [28]