Código: MITEAL03

MORFOLOGIA DE MICROORGANISMOS Vigencia: 28.08.09

Rev.: 01(marzo 2010)
Ramo: Microbiología de Alimentos TEA.
Facultad Tecnológica
Carrera: Tecnólogo en Alimentos
Depto. de Ciencias y Tecnología de los Alimentos UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
Elaborado por los profesores: Osvaldo Torres-Norma Castillo–Liliana Godoy–M. Angélica Ganga

PRACTICO 3
MORFOLOGIA DE MICROORGANISMOS

I. INTRODUCCION

Técnicas de tinción.
Las técnicas de tinción comprenden tres etapas que son fundamentales:
preparación del frotis, fijación y tinción propiamente tal

Extensión o frotis:

Extensión: consiste en preparar una fina capa de microorganismos. Con una

gota en el portaobjetos se hace una extensión (pasando los microorganismos
para que se "suspendan" sobre el portaobjetos).

Frotis: generalmente se utiliza este término para tejidos (p. ej.: sangre) o
esputos. En bacteriología, el frotis corresponde a una extensión delgada de la
suspensión de microorganismos sobre la superficie de un portaobjetos. La capa
de líquido debe ser uniforme, delgada, levemente turbia y sin que llegue a los
bordes de la lámina de virio, de 1 a 2 cm2.

Fijación
La fijación es el procedimiento de inmovilización de células y su estructura sobre
una superficie sólida, generalmente del portaobjetos. El propósito es adherir la
bacteria la lámina, conservar su estructura y aumentar su visibilidad. Este
procedimiento desnaturaliza proteínas del microorganismo permitiendo que los
grupos químicos (COO-, NH2; y SH) reaccionen con los colorantes. La fijación
mata a la bacteria, lo cual es una medida de seguridad.
Una buena fijación debe evitar el hinchamiento o contracción celular, la
solubilización de sustancias en los reactivos de tinción, dejar los materiales
celulares rígidos y evitar la formación de artefactos (pliegues, burbujas,
cristales, etc.).

Tinción
La tinción tiene como objetivo fijar el colorante a la bacteria, para dar un
contraste en color, respecto al medio circundante, aumentando la visibilidad.
Algunos colorantes sirven para evidenciar estructuras internas de las células,
que de otro modo serían invisibles al microscopio.
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Aunque las bacterias no aparecen al microscopio muy distintas del medio que las
rodean porque poseen una densidad óptica muy baja, difieren bastante
químicamente, siendo esta diferencia la que permite distinguirlas mediante
tinción, ya que el colorante reacciona con componentes químicos de la célula.
El mecanismo de tinción supone una reacción de intercambio de iones entre las
moléculas del colorante y los sitios químicos activos de la superficie o del interior
celular
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos, que tienen alguna
afinidad específica por los materiales celulares. Algunos son moléculas con carga
positiva (catiónico, acidófilos o básicos) y se combinan con constituyentes
químicos celulares cargados negativamente, como ácidos nucleicos, ribosomas y
polisacáridos ácidos. Colorantes de este tipo son el azul de metileno, violeta
cristal y safranina.
Otros colorantes son moléculas con carga negativa (aniónicos, basófilos o
ácidos) y se combinan con componentes celulares con carga positiva, como las
proteínas. Ejemplos de estos colorantes son la eosina, fucsina ácida y rojo
congo.
Otro grupo de colorantes son liposolubles (neutros, hidrofóbicosd9, que se
combinan con materiales lipídicos de la célula, como gotas de aceite. Por
ejemplo, Negro Sudán.
Es necesario que el agente de tinción sea coloreado y/o reaccione para generar
un producto coloreado y que la retención del colorante sea diferencial, es decir,
que tiña ciertas estructuras y otras menos, para generar contraste.
En algunos casos es necesario el agregado de un mordiente, esto es, una
sustancia química sin poder colorante, pero que actúa como sustancia puente
entre el colorante y la estructura a teñir, permitiendo su coloración. En otros,
altera su estructura celular, permitiendo su tinción (carga, estructura,
permeabilidad, etc.). Los más utilizados son: ácido fénico, ácido tánico y lugol
(este último es una solución de yodo -insoluble- con yoduro potásico -soluble-).

Tipos de tinciones
Las tinciones se pueden clasificar como:
1. Simples, sencillas
2. directas
3. Indirectas
4. Compuestas
5. Diferenciales
6. Negativas
7. Metacromáticas
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8. Por impregnación
9. Vitales

1. Tinciones simples: se colorean las bacterias por la aplicación de una

solución colorante simple, sobre un frotis fijado. El frotis se cubre con la solución
de tinción durante un tiempo determinado, luego se lava con agua y se seca a
temperatura media.
En la tinción con colorantes básicos se puede usar azul de metileno, cristal
violeta o fucsina fenicada. El azul de metileno tarda entre 30 y 60 segundos
para teñir bien una preparación. El cristal violeta es más reactivo y tarda unos
10 segundos. La fucsina fenicada es muy reactiva y puede teñir excesivamente
las preparaciones que presentan mucha materia orgánica y residuos

2. Tinción directa: consiste en una tinción por simple inmersión en el

colorante.

3. Tinción indirecta: aquélla en la que es necesario el uso de un mordiente

4. Tinción compuesta: intervienen dos o más colorantes. Las más comunes

usan dos colorantes

5. Tinción diferencial: utiliza una combinación de colorantes a fin de

evidenciar diferencias entre células bacterianas o entre estructuras bacterianas.

6. Tinción negativa: Consiste en agregar un colorante como eosina, en forma

de eosinato sódico, que no se une a la bacteria, sino que se deposita alrededor
de ella, quedando la célula incolora sobre un fondo teñido. La tinción negativa o
de fondo se usa para la observación de cápsula bacteriana, usándose tinta china
para teñir el fondo, safranina para teñir la célula, quedando la cápsula incolora.

7. Tinción metacromática: al combinarse el colorante con la estructura a

distinguir, se produce un cambio de color en la molécula del colorante,
generando un color distinto al original.

8. Tinción por impregnación: precipita sales orgánicas sobre las células,

confiriéndoles un contraste.

9. Tinción vital: se aplica colorante, pero sin fijación (para la observación de

células vivas, por ejemplo, protozoos).
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Tinción de Gram

Es el procedimiento de tinción más empleado en bacteriología. Se basa en la

aplicación de un colorante trifenilmetano (violeta cristal o violeta de genciana),
seguido de la aplicación de un mordiente (yodo). Luego se aplica un solvente
decolorante (alcohol-cetona) y finalmente, fucsina o safranina como colorante
de contraste.
Luego del procedimiento, las bacterias pueden ser diferenciadas por su
capacidad de retener o no el colorante básico. Se denominan Gram positivas si
retienen el colorante básico, presentando una coloración violeta, o Gram
negativas, si pierden el colorante básico y sólo se colorean con el colorante de
contraste, quedando de color rojizo.

La explicación más probable de la reacción de Gram considera diferencias de

estructura y composición de la pared externa de las bacterias.

El solvente decolorante tiene un efecto deshidratante en la pared de

péptidoglucano de las bacterias Gram positivas, lo cual cierra los poros,
aumentando su impermeabilidad, quedando retenido el complejo violeta-yodo.
En las bacterias Gram negativas, la pared es mucho más delgada y con menor
entrecruzamiento, de modo que el alcohol extrae los lípidos, arrastrando el
complejo colorante, destiñendo las células, pero que luego se tiñen con el
colorante rojo de contraste.

Por otro lado, la denominación Gram positivo o Gram negativo, hace referencia
a la diferencia de arquitectura de las capas externas de las bacterias. Por esto,
el carácter Gram no posee relación con la patogenicidad de las bacterias. Tanto
en las bacterias Gram positivas como en las Gram negativas, se presentan
especies patógenas y no patógenas. Además, varias bacterias que carecen de
pared son patógenas.

Aunque los microorganismos Gram negativos son constantes en su respuesta

frente a la tinción de Gram, los Gram positivos pueden variar en su respuesta.
Por ejemplo, los cultivos en fase estacionaria o de muerte pueden perder la
capacidad para retener el colorante violeta, debido a alteraciones de la pared.
Algunas bacterias pueden retener parcialmente el colorante, y se denominan
Gram lábiles (respuesta variable a la tinción).
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Para obtener resultados confiables es importante considerar las siguientes

precauciones:
 Los cultivos a teñir deben ser frescos – incubados en caldo o medio sólido
hasta que el crecimiento sea justo visible (no más de 12 a 18 horas de
incubación en lo posible). Los cultivos viejos de bacterias Gram positivas
aparecen Gram negativos. Esto es bien cierto para bacterias formadoras
de esporas, como algunas especies del género Bacillus.
Si es posible, los cultivos los cultivos a teñir deben haber crecido en un medio
sin azúcares. Varios organismos producen cantidades significativas de material
capsular o viscoso en presencia de ciertos carbohidratos. Esto puede interferir
con la decoloración, y ciertos organismos Gram negativos tales como Klebsiella
pueden aparecer como una mezcla de células rosadas y violetas.

II. OBJETIVOS.

 Aplicar métodos de tinción de microorganismos para su diferenciación

III. ACTIVIDADES

III.1 Preparación del frotis

1. Depositar con un asa una muestra de crecimiento en sólido (colonia en

agar o crecimiento en agar tendido) sobre una gota discreta de agua en el
centro de un portaobjetos limpio y desengrasado
2. Con el asa dispersar y esparcir la mezcla completamente sobre la mitad
del área total del portaobjetos
3. Fijar el frotis con calor, pasando el portaobjetos con el frotis hacia arriba,
sobre la llama suave de un mechero mediante movimientos circulares, sin
estacionar sobre la llama.
4. Enfriar al aire. El frotis estará listo, entonces para el procedimiento de
tinción

III.2 Tinción de Gram

1. Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos.

2. Preparar un frotis fijado de los microorganismos indicados por el docente.
3. Cubrir completamente el frotis fijado FRÍO con la solución del colorante
cristal violeta. Dejar en contacto 2 minutos.
4. Eliminar el colorante. Cubrir con 2-3 gotas de solución de lugol de Gram.
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Dejar en contacto durante 30 segundos.

5. Decolorar con alcohol-acetona 1 o 2 veces. Lavar con agua.
6. Cubrir con safranina (colorante de contraste). Dejar en contacto 1
minuto. Lavar con agua.
7. Secar a la llama suave de un mechero y enfriar, o con papel absorbente.
8. Observar al microscopio óptico con objetivo 10x, 40x y de inmersión.
9. Informar el agrupamiento, forma y coloración.
 
III.3 Tinción de esporas.
 
1. Preparar un frotis fijado de la bacteria en estudio, según procedimiento
descrito.
2. Colocar el portaobjetos sobre la boca de un vaso conteniendo solución de
verde malaquita en caliente
3. Cubrir completamente el frotis con el colorante caliente y mantener
durante 3-5 minutos, sin que se seque el colorante. Si esto ocurriera,
agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta
cubrirlo nuevamente.
4. Eliminar el colorante y lavar con agua
5. Cubrir con solución de Safranina. Dejar actuar 30 segundos.
6. Lavar con agua, secar, enfriar
7. Observar con objetivo de inmersión.
8. Informar: morfología, color y tipo de espora.

III.4 Tinción negativa para cápsula

 
1. Colocar una pequeña gota de tinta china en la parte central del
portaobjetos.
2. Utilizando el asa, colocar una gota de la suspensión de microorganismos
sobre la tinta china.
3. Colocar sobre el preparado otro portaobjetos y desplazarlo
longitudinalmente para que se forme una película delgada de preparación
(tinta-cultivo)
4. Fijar a la llama suave del mechero.
5. Enfriar totalmente
6. Cubrir totalmente la preparación con safranina o fucsina durante 1
minuto.
7. Eliminar cuidadosamente el colorante para no desprender la tinta china y
lavar con chorro muy fino de agua.
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8. Secar a la llama y enfriar

9. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

IV. BIBILOGRAFIA

1. Duncan F. “Applied Microbiology Laboratory Manual” Fourth Edition. 2005

2. Goldman, E. & Green, L. (Editores). “Practical Handbook of Microbiology”. 2ª Ed. CRC Press. Boca
Ratón, USA. 2009

3. Kaiser, G. “BIOL 230 Microbiology Lab Manual. Student.ccbcmd.edu. 2007.

4. Madigan, M., Martinko, J. & Parker, J. “Biología de los Microorganismos”. 10ª Edición. Prentice Hall
Hispanoamericana. Mexico. 2004.

5. Pacarynuk, l. & Danyk, H. “Principes of Microbiology: Laboratory Manual” University of Lethbridge.

2005

6. Pelczar, Reid y Chan “Microbiología”, varias ediciones. Ed. Mc. Graw Hill, Mexico.

7. Prescott, L.M. “Microbiology”. 5th Edition. The McGraw-Hill Companies, USA. 2002

8. Refay, MK."Análisis para el control de calidad de los alimentos. Parte IV: Análisis microbiológicos, FAO.
Roma. 1994.

9. Stanier, R.Y, Ingraham, J.l., Wheelis, J.L. y Painter, P.R. “Microbiología”, Ed. Reverté, S.A., Barcelona
España, 2003.

10. USDA/FSIS “Microbiological Laboratory Guidebook: Media and Reagents”, 3rd Edition. USA.2008

11. Woodland, J. “Laboratory Procedures Manual Part 5 Bacteriology”. Second Edition. University of
Washington. USA 2004

12. http://biology.unm.edu/ccouncil/Biology_203/Homework/Labs/Bacteriology.pdf