Resumen

El poliomavirus humano JC (JCV), agente etiológico de la enfermedad

leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), afecta a pacientes
inmunodeprimidos, en particular a los enfermos de SIDA. Los estudios in vitro de
la infección por JCV se ven obstaculizados por la falta de pruebas sensibles de
cuantificación del JCV. Aunque el ensayo de hemaglutinación (HA) se ha
empleado de forma rutinaria para la cuantificación in vitro del VJC, su sensibilidad
es muy limitada. Hemos empleado un ensayo de PCR en tiempo real que se
compara favorablemente con el ensayo HA para la cuantificación in vitro del VJC.
El JCV(Mad1), propagado en células gliales fetales humanas primarias (PHFG) en
dos laboratorios independientes, se purificó y cuantificó mediante el ensayo HA. A
continuación, ambos lotes de JCV(Mad1) purificado se diluyeron en serie en medio
Eagle modificado de Dulbecco para obtener títulos de HA que oscilaban entre 64 y
0,001 unidades de HA (HAU) por 100 μL de suspensión de virus. El ADN se
extrajo de 100 μL de suspensión de virus y se eluyó en 50 μL de tampón, y la
amplificación y cuantificación del ADN se realizaron en el sistema de detección de
PCR en tiempo real Bio-Rad iCycler iQ Multicolor utilizando el antígeno T como
gen diana. La PCR en tiempo real para la cuantificación del VJC fue sensible y
detectó de forma consistente 1,8 × 101 copias de ADN del VJC, y tan bajo como
0,001 HAU equivalente de VJC. Además, hubo una fuerte correlación lineal entre
el ensayo HA y el número de copias de ADN de JCV(Mad1). Los coeficientes de
variación intra e inter-run para la curva estándar del JCV fueron del 0,06% al 4,8%
y del 2,6% al 5,2%, respectivamente. Basándose en estos datos, la PCR en
tiempo real puede sustituir al ensayo HA, menos sensible, para la detección,
cuantificación y monitorización fiables de la replicación in vitro del VJC.

Hallazgos
El poliomavirus humano JC (JCV), un virus pequeño, sin envoltura, con un
genoma circular cerrado de ADN de doble cadena, es ubicuo en la naturaleza, con
una seroprevalencia de hasta el 80% entre poblaciones geográficamente aisladas
[1-3]. El VJC se aisló por primera vez en 1971 en el cerebro de un paciente con
leucoencefalopatía mulifocal progresiva (LMP) [4]. La mayoría de las infecciones
primarias por el VJC se producen durante la infancia [3] y son subclínicas. Sin
embargo, el VJC permanece latente de por vida y puede causar una enfermedad
desmielinizante mortal, la LMP, en pacientes inmunodeprimidos [5]. La LMP sigue
siendo una complicación frecuente y potencialmente mortal de la infección por VIH
y alrededor del 3-5% de los pacientes con SIDA desarrollan esta enfermedad [6,
7]. Los factores que influyen en la patogénesis de la LMP, incluyendo los modos
de transmisión del VJC, su diseminación desde el lugar o lugares de la infección
inicial, el mecanismo o mecanismos de reactivación del VJC, la susceptibilidad
celular, el tráfico a través de la barrera hematoencefálica y la infección lítica de los
oligodendrocitos, aún no están claros. Los esfuerzos por comprender la
patogénesis de la LMP se han visto obstaculizados por la falta de métodos
estándar para la detección y cuantificación del VJC.
La principal proteína de la cápside del VJC, VP-1, es responsable de la
aglutinación de los glóbulos rojos (GR) y, tradicionalmente, los ensayos de
hemaglutinación (HA) y de inhibición de HA (HAI) se han empleado para la
cuantificación del VJC [8-14]. Sin embargo, el ensayo HA es poco sensible y la
cuantificación in vitro de la carga viral JC por HA es a menudo imposible. Además,
el ensayo HA no puede emplearse eficazmente para estudiar la replicación del
VJC en diversos entornos experimentales, incluidos los experimentos que
emplean placas de microtitulación y transwell. Recientemente se han desarrollado
y empleado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) semicuantitativa y la
PCR cuantitativa en tiempo real para la detección y cuantificación del VJC [15-19].
En muestras clínicas, la PCR en tiempo real ha demostrado ser un método
importante para monitorizar la carga viral del VJC, [15, 20] y es un marcador fiable
para el pronóstico de la LMP [21]. Sin embargo, no está claro cómo los cambios
en los niveles de ADN viral se correlacionan con los niveles de viriones/carga viral
y no se ha hecho ningún esfuerzo para estandarizar el equivalente en número de
copias del JCV requerido en experimentos in vitro relacionados con la replicación
del JCV. Para avanzar en nuestro conocimiento de la patogénesis de la LMP, son
esenciales técnicas de detección y cuantificación uniformemente controladas para
la monitorización in vitro de la replicación del JCV. En este estudio, investigamos
la relación entre la PCR en tiempo real y los ensayos de HA para la determinación
de la carga viral del JCV.

El JCV(Mad1) se propagó en células gliales fetales humanas primarias (PHFG) y

se purificó en el laboratorio del Dr. Duard Walker (I) [4, 22, 23] o en el Laboratorio
de Investigación en Retrovirología (RRL) (II) de la Universidad de Hawai [13, 24].
Las células PHFG, infectadas con JCV(Mad1) en el RRL se cosecharon el día 30
después de la infección, se sometieron a tres ciclos de congelación-
descongelación, se disgregaron por sonicación a 100 vatios durante 1 minuto en
hielo utilizando un procesador ultrasónico de alta intensidad de la serie Autotune, y
se incubaron con ácido desoxicólico al 0,25% a 37°C durante 1 hora. Los restos
celulares se eliminaron mediante centrifugación a 5.000 rpm (1.960 × g) durante
30 min y el sobrenadante se cubrió con un 30% de sacarosa (p/p) y se centrifugó a
35.000 rpm en un rotor Beckman SW 55Ti utilizando una ultracentrífuga Beckman
LE-80K (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA). El sobrenadante se decantó y el
precipitado se suspendió en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y se
almacenó a -80°C. Los títulos de JCV se determinaron mediante el ensayo HA
como se describe en otro lugar [3, 10]. Brevemente, la sangre humana tipo O fue
centrifugada a 2.500 rpm durante 10 min a 4°C. A continuación, los glóbulos rojos
se lavaron dos veces y se suspendieron en tampón de Alsever (citrato sódico 20
mM, NaCl 72 mM, glucosa 100 mM, pH 6,5 ajustado con ácido acético) a una
concentración final del 0,5%. Se prepararon diluciones dobles seriadas de
suspensiones víricas en tampón Alsever y se añadieron 50 μL de suspensión
vírica y un volumen igual de glóbulos rojos en cada pocillo de una placa de
microtitulación de 96 pocillos con fondo en "U" y se incubaron a 4°C durante 3-6
horas. El título de HA fue el recíproco de la dilución final de la suspensión vírica
que aglutinó los GR. La dilución del punto final se consideró 1 unidad de
hemaglutinación (UAH).

Ambos lotes de JCV(Mad1) (I y II) se diluyeron en serie dos veces (64 UA a 1 UA)
y luego 10 veces (1 UA a 0,001 UA) en DMEM, para obtener títulos de UA que
oscilaban entre 64 UA y 0,001 UA por 100 μL de la suspensión. El ADN se extrajo
de 100 μL de la suspensión anterior que contenía HAU conocidas de JCV
utilizando el kit QIAprep® Spin Miniprep (Cat No. 27106), de acuerdo con las
instrucciones del fabricante y el ADN se eluyó en 50 μL de tampón de elución [25].
La amplificación y cuantificación del ADN del JCV se realizaron en el sistema de
detección de PCR en tiempo real multicolor Bio-Rad iCycler iQ™ utilizando 2 μL
de ADN molde diluido 1:10, la supermezcla Bio-Rad 2X iQ™ SYBER® Green y 12.
5 pmol cada uno de cebadores directo e inverso específicos para el gen del
antígeno T del VJC [JCT-1 (directo: 5' AGA GTG TTG GGA TCC TGT GTT TT 3';
JCT-2 (inverso) 5' GAG AAG TGG GAT GAA GAC CTG TTT 3'] (GeneBank
Accession No. J02226) [15] en un volumen de reacción final de 20 μL. El ciclo
térmico se inició con un primer paso de desnaturalización de 10 min a 95 °C,
seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 15 s, y la fluorescencia
de amplificación se leyó a 60 °C al final del ciclo. Los datos de amplificación de la
PCR en tiempo real se analizaron utilizando el software del sistema óptico de PCR
en tiempo real multicolor Bio-Rad iCycler iQ™ versión 3.1. Se construyó una curva
estándar para la cuantificación del JCV utilizando diluciones seriadas del plásmido
JCV(Mad1) linealizado. El rango dinámico de detección se determinó preparando
diluciones seriadas de 10 veces el plásmido del JCV en el rango de 10 pg a 1 fg,
que representaban de 1,8 × 105 a 1,8 × 101 copias de ADN del JCV,
respectivamente. Todos los experimentos se hicieron dos veces y las muestras se
analizaron por triplicado cada vez. Las copias de ADN del VJC en las muestras
experimentales se calcularon a partir de la curva estándar y se expresaron como
copias de ADN vírico por 100 μL de suspensión vírica. La fiabilidad de la PCR en
tiempo real se definió calculando los coeficientes de variación de los valores Ct de
las réplicas de las diluciones de la curva estándar [21, 26].

En primer lugar, examinamos la fidelidad de la PCR cuantitativa en tiempo real

para detectar y cuantificar las secuencias del gen del antígeno T del VJC a partir
de muestras clínicas. La PCR cuantitativa en tiempo real demostró ser una técnica
apropiada para la detección del ADN del VJC. La curva estándar del gen del
antígeno T del VJC fue altamente reproducible y precisa (Fig 1B). Los coeficientes
de variación intra e inter-run para la curva estándar variaron de 0,06% a 4,8% y de
2,6% a 5,2%, respectivamente, y por lo tanto parecían ser consistentes para
detectar y cuantificar el número de copias del genoma del JCV. Además, la
reextracción de ADN de 100 μL de suspensión de JCV, con HAU conocida,
produjo menos de una variación de dos veces en el número de copias de ADN de
JCV. Nuestro ensayo JCV demostró un amplio rango lineal y fue capaz de detectar
tan bajo como 1,8 × 101 copias de ADN JCV presentes en la plantilla (Fig 1A) y
0,001 HAU equivalente de JCV en 100 μL de la suspensión del virus (datos no
mostrados).
Así pues, la PCR en tiempo real fue al menos 1.000 veces más sensible que el
ensayo tradicional de HA para detectar el VJC.
Hubo una fuerte correlación lineal entre el ensayo HA y el número de copias de
ADN de JCV(Mad1) propagado por el Dr. Walker (I, r2 = 1,0) o propagado en el
RRL (II, r2 = 0,95) (Fig 1C). El JCV(Mad1) obtenido de dos fuentes diferentes
arrojó números de copias del gen del antígeno T del ADN muy similares a partir de
muestras que contenían la misma HAU de JCV. Sin embargo, la diferencia fue
más pronunciada cuando la suspensión contenía menos de 4 HAU de JCV. Esta
diferencia podría deberse a la presencia de diferentes proporciones de viriones
vacíos o de ADN desnudo. La proporción de viriones vacíos y de ADN desnudo
del JCV presente en la suspensión del virus puede verse afectada por varios
factores, entre ellos la cepa del virus, el tipo de célula utilizada para propagar el
JCV, los procedimientos de aislamiento del virus, así como el momento de la
recolección de las células infectadas. Además, la diferencia de menos de dos
veces en el número de copias del VJC en dos fuentes de virus puede ser
simplemente el resultado del ensayo HA menos sensible. El ensayo HA produjo
resultados similares cuando los viriones en dos muestras cualesquiera diferían en
menos de dos veces.

Nuestros datos demuestran que la PCR en tiempo real es un método sensible y

fiable para la cuantificación in vitro del VJC. La medición in vitro de los niveles de
ADN del VJC fue altamente reproducible en un amplio rango dinámico, y la PCR
en tiempo real fue más fiable que el ensayo HA para el cálculo in vitro del inóculo
inicial de virus y del virus replicado. En el futuro, la PCR cuantitativa en tiempo real
puede emplearse para estudiar la eficacia in vitro de varios agentes terapéuticos
potenciales contra el VJC, así como para cuantificar el tráfico del VJC a través de
la barrera hematoencefálica utilizando un modelo in vitro. La PCR en tiempo real
detecta hasta 0,001 HAU equivalentes de VJC, elimina la variabilidad
tradicionalmente asociada con el ensayo de HA y, por tanto, podría sustituir de
forma fiable al ensayo de HA empleado para la replicación del VJC en estudios de
patogénesis in vitro.
Pasos del estudio
Se propagó en células gliales fetales humanas primarias y se purificó en el
laboratorio
Las células infectadas se cosecharon el día 30 después de la infección
se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación
se disgregaron por sonicación a 100 vatios durante 1 minuto en hielo
se incubaron con ácido desoxicólico al 0,25% a 37°C durante 1 hora.
Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 5.000 rpm durante
30min
el sobrenadante se cubrió con un 30% de sacarosa se centrifugó a 35.000 rpm
El sobrenadante se decantó
El precipitado se suspendió en medio de Eagle y se almacenó a -80°C.
Los títulos de JCV se determinaron mediante el ensayo HA

Brevemente, la sangre humana tipo O fue centrifugada a 2.500 rpm durante 10

min a 4°C
los glóbulos rojos se lavaron dos veces y se suspendieron en tampón de Alsever
al 0,5%
Se prepararon diluciones dobles seriadas de suspensiones víricas en tampón
Alsever
en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos
se añadieron 50 μL de suspensión vírica y un volumen igual de glóbulos rojos
Se incubaron a 4°C durante 3-6 horas.
Ambos lotes de JCV se diluyeron en serie dos veces y luego 10 veces
El ADN se extrajo de 100 μL de la suspensión anterior que contenía HAU
conocidas de JCV
el ADN se eluyó en 50 μL de tampón de elución
La amplificación y cuantificación del ADN del JCV se realizaron en el sistema de
detección de qPCR en tiempo real multicolor
utilizando 2 μL de ADN molde diluido 1:10, mezcla madre de syber Green y
12,5pmol de primers forward y reverse específicos para el gen del antígeno T del
VJC en un volumen de reacción final de 20 μL
El ciclo térmico se inició con un primer paso de desnaturalización de 10 min a 95
°C,
40 ciclos de 95 °C durante 10 s y 60 °C durante 15 s
la amplificación se leyó a 60 °C al final del ciclo
Se construyó una curva estándar para la cuantificación del JCV utilizando
diluciones seriadas del plásmido JCV(Mad1) linealizado
* Todos los experimentos se hicieron dos veces y las muestras se analizaron por
triplicado cada vez

Equipos
procesador ultrasónico de alta intensidad de la serie Autotune
rotor Beckman SW 55Ti
Beckman LE-80K
Bio-Rad iCycler iQ™

Reactivos
tampón de Alsever (citrato sódico 20 mM, NaCl 72 mM, glucosa 100 mM, pH 6,5
ajustado con ácido acético)
ácido desoxicólico
sacarosa
medio de Eagle modificado de Dulbecco
QIAprep® Spin Miniprep
Bio-Rad 2X iQ™ SYBER® Green