UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO

INSTRUMENTACION BIOMEDICA II
Espectrofotometría

Ing. Teófilo M. Huablocho Pérez

huablocho.tm@pucp.edu.pe
teofilo@terra.com.pe
La Espectrofotometria puede ser
conceptuada como un procedimento
analítico a través del cual se determina la
concentracion de espécies químicas
mediante la absorcion de energia radiante
(luz).

La luz puede ser entendida como una

forma de energia, de naturaleza
ondulatória, y es caracterizada por los
diversos componentes de la onda 
(expresada en m o nm)
Una solucion cuando es iluminada por
luz blanca, presenta un color que es
resultante de la absorcion relativa de
varias longitudes de onda que lo
componen.

Esta absorcion, en cada longitud de

onda, depende de la naturaleza de la
sustancia, de esa concentracion y de
la espesura de la misma que es
atravesada por la luz.
Todas las sustancias pueden
absorber energía radiante,
incluido el vidrio que parece
ser completamente
transparente; absorbe
longitudes de onda que
pertenecen al espectro visible;
el agua absorbe fuertemente
en la región del infrarrojo.
La Ley Lambert Beer es un
medio matemático de expresar
cómo la materia absorbe la luz.
Esta ley afirma que la cantidad
de luz que sale de una muestra
es disminuida por tres
fenómenos físicos:
RANGO DEL ULTRAVIOLETA
465 a 400 nm VIOLETA
465 a 482 nm AZUL
482 a 487 nm AZUL VERDOSO
487 a 493 nm AZUL VERDE
493 a 498 nm VERDE AZULADO
498 a 530 nm VERDE
530 a 559 nm VERDE AMARILLO
576 a 580 nm AMARILLO
617 a 788 nm ROJO
RANGO DEL INFRAROJO
 Exit slit

Entrance slit Detector

Red I0 I
Readout
device

Prism
Violet Cuvette

I  I 010aLc
Light source Monochromator

I0= Fuerza de radiacion que llega a la cuveta

α = coeficiente de atenuacion o extincion de la energia
c = Concentration de absorcion de la sustancia
L = longitud de la cubeta
I = Energia Radiante que sale de la cuveta
De Jhon Webster & Mat Klein / Wisconsin University, 1,999
 LEYES DE LA
ESPECTROFOTOMETRÍA

Ley de Lambert : a cualquier

longitud de onda, la cantidad de
luz Monocromática transmitida es
proporcional a la intensidad de la
luz incidente. La absorción de luz
es una función exponencial del
espesor, o sea que la luz absorbida
es directamente proporcional al
espesor de la solución .
Ley de Beer: Cuando el objeto
coloreado es una solución, la
cantidad de luz absorbida es
directamente proporcional a la
concentración del soluto en
solución.
La Transmitancia se define como la
fracción de luz incidente que pasa a
través de una muestra:
T = I / I0
Sabiendo que la intensidad I:
 aLc
I  I 010
Si definimos Absorvancia A: αcl

Tendríamos: A = - Log T
La absorbancia es directamente
proporcional a la concentración de la
especie que absorbe la luz (ley de Beer)
A = a .C.L
La absorbancia es adimensional.
Si la concentración (C)se expresa en moles
por litro y la longitud de la cubeta (paso
óptico L) se expresa en cm, la absortividad
molar (a ) se expresa en litro/mol.cm.
Tramitancia, T = I / I0
% Tramitancia; %T = 100 T
Absorbancia o densidad Óptica:
A = log10 I0 / I entonces A = log10 1 / T
A = log10 100 / %T
A = log10 100 - log10 %T

A = 2 - log10 %T
De Jhon Webster & Mat Klein / Wisconsin University, 1,999
Ejemplo 1: Cual es la densidad óptica
A de una solución que absorbe los 2/3
de luz incidente ?

Respuesta:
T = (I /3) / I = 0.3333 & %T = 33.33%
0 0

aplicando formula:

A = 2 – log%T = 2 – 1.5258 = 0.4772

Ejemplo 2: Una muestra coloreada tiene una
tramitancia de 75% a una longitud de onda,
calcular la absorvancia o densidad óptica de la
muestra?
Respuesta:
Utilizando la ecuación anterior: A = 2 – log% T
Tendremos A = 2 – 1.8751 = 0.1249
ESQUEMA OPTICO DE UN
ESPECTROFOTOMETRO
 FOTODIODOS y
FOTOMULTIPLICADORES
 Fotomultiplicadores
Anodo
Dínodo
Fotocátodo

Radiación
incidente

Contactos
Encapsulado
de vidrio

© ITES-Paraninfo
 Tipos
Fotocátodo Fotocátodo

Ventana
Ventana lateral Ventana frontal

(a) Caja dínodo Rejilla

Jaula circular Caja y rejilla

Multiplicador

Enfocado linealmente Persiana veneciana

(b)
 Ganancia
108

14 Dínodos 12
107
Ganancia
© ITES-Paraninfo

10

106

8
105

104
1000 1350 1700 2050 2400

Tensión (V)
Acondicionamiento. Convertidor I-V
Cr

Fotomultiplicador
io Rr

C
Vo=Rrio

Capacidad de salida del

fotomultiplicador +
capacidades parásitas
del cableado y
amplificador

© ITES-Paraninfo
Amplificador de transimpedancia (I).

IS

Ie Vo
ZmOLIC (a)
CFA +
IF

SÍMBOLO

CIRCUITO EQUIVALENTE
IDEAL

CIRCUITO EQUIVALENTE REAL

Vo
+1 +1
(b)
+ Ie Ie
ZmOL
Vi
RB

RF
RG

© ITES-Paraninfo
 Amplificador de transimpedancia (II).
Ganancia = 1
Vcc = 15 V
Ri = 150 Ohm

Amplitud de la Salida, dB
Vi = 200 mV RMS
Vi +
Ro
RB Vo
Ie + ZmOLIC

RF THS 3001
TEXAS INSTRUMENTS

RG Frecuencia f, Hz

(a) (b)

vo RF
1
vi RG © ITES-Paraninfo
 Bibliografía
.- Medical instrumentation Webster
.- www.contec.com
.-Instrumentación Electrónica - ITES Paraninfo.
.-www.nonin.com
.-www.contec.com