CAPÍTULO 12

Producción de ácido cítrico

12.1 INTRODUCCIÓN

El ácido cítrico es un compuesto orgánico intermedio en el ciclo del ácido tricarboxílico

(ATC), que se encuentra naturalmente en los cítricos, las piñas, las peras y cristalizado como
citrato de calcio. Es un

importante sustancia química utilizada en medicamentos, extractos aromatizantes,

alimentos y dulces, y la fabricación de tinta y tintes. El ácido cítrico es un ácido tricarboxílico
de seis carbonos, que primero se aisló del jugo de limón. Se utiliza en la industria de
alimentos y bebidas para diversos fines,

como productos farmacéuticos y para otros usos industriales. Es un ácido carboxílico

orgánico, puede ser

extraído del jugo de los cítricos mediante la adición de óxido de calcio (cal) para formar
citrato de calcio, que es un precipitado insoluble que puede ser recogido por filtración; el
ácido cítrico puede

se recuperará de su sal cálcica añadiendo ácido sulfúrico. El ácido cítrico se produce

principalmente

por fermentación. Hay muchos microorganismos potentes incluyendo hongos, levaduras y

bacterias que son capaces de producir ácido cítrico por fermentación. Se obtiene también
por fermentación

de glucosa con la ayuda del moho Aspergillus niger. El ácido cítrico se utiliza en refrescos y
aditivos alimentarios. Sus sales, los citratos, tienen muchos usos: por ejemplo, el citrato de
amonio férrico se utiliza en la fabricación de papel de impresión azul. La sal agria, utilizada
en la cocina, es ácido cítrico. La mayoría del ácido cítrico se produce por fermentación
fúngica (A. niger). La síntesis química de ácido cítrico es posible pero no es más barata que
la fermentación fúngica. Sin embargo, una pequeña cantidad de ácido cítrico todavía se
produce a partir de los cítricos en México y América del Sur, donde están disponibles
económicamente. Hay básicamente tres tipos diferentes de proceso de fermentación por
lotes utilizados en la industria. Hay dos procesos de fermentación muy comunes y prácticos
utilizados: el cultivo de superficie líquida y el proceso de fermentación sumergida. El
segundo proceso, la cultura sumergida es más popular. La fermentación continua se ha
estudiado a escala de laboratorio.

12.2 PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO EN BIORREACTOR POR LOTES

La fermentación con ácido cítrico de la melaza de caña es por fermentación sumergida en
un biostato de 2 l

(B. Braun) fermentador agitado. Una cepa de Aspergillus niger es la más ampliamente
utilizada para la producción comercial. A. niger también es muy recomendable en el
presente estudio, que puede

obtenido de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. Melaza

de azúcar de caña se utilizan con la adición de metales traza en la concentración deseada.

Las fuentes de azúcar y el pH inicial de los medios desempeñan un papel importante en la

producción de ácido cítrico. Los cultivos sumergidos y superficiales se utilizan habitualmente
con fuentes de azúcares baratas pero purificadas y de alta concentración.

12.2.1 Microorganismos

Aspergillus niger ATCC 11414 se puede utilizar para la fermentación de ácido cítrico. Se debe
pedir al ATCC. El cultivo se mantuvo en melaza esterilizada al 10,0% obtenida de Central
Sugar SDN BHD, pH 5,8. Los cultivos madre inclinados de A. niger se almacenarán a 5 C en el
refrigerador. Todos los medios de cultivo, a menos que se indique lo contrario, se esterilizan
a 121 C (15 psig de presión) durante 15 minutos.

A. niger utiliza melaza de remolacha, fructosa, glucosa e hidrolizados de almidón como

sustratos para la fermentación. La inoculación procede introduciendo el inóculo activo en su
etapa óptima.
El sustrato se utiliza en una concentración de 10-15%. La etapa de producción suele durar 5
días y tiene lugar en fermentadores aireados agitados a 30 C. La agitación está en el rango
medio, a unas 200 rpm.

La regulación de la concentración de oxígeno disuelto en el medio se realiza por el

suministro de aire, aire presurizado y velocidad del impulsor, la regulación del valor de pH y
la regulación del nivel de hexocianofoto de potasio libre en el medio. El hexacianofoto de
potasio de metales traza se utiliza para la fermentación superficial en la producción de ácido
cítrico.
Aunque A. niger se ha utilizado principalmente en la producción de ácido cítrico, otras cepas
de hongos, varios tipos de levadura y algunas bacterias se sabe que acumulan ácido cítrico
en el medio. Las razones para elegir A. niger sobre otros organismos potenciales
productores de citrato son que las materias primas baratas (melaza) se pueden utilizar como
sustrato, y un producto alto

rendimiento se puede obtener. Hay acuerdo general en la literatura que la forma granulada
es deseable para la producción de ácido. Se forma una configuración de pellet ideal, de
1,2-2,5 mm de diámetro después de cinco días. La forma de pellet es una espora favorable.
Los cultivos de pellets tienen baja viscosa
En el caso de los cultivos compuestos principalmente de formas filamentosas, las
condiciones de aireación y el consumo de oxígeno han mejorado. Además, los problemas de
crecimiento de la pared y
el bloqueo de tuberías se reducen y la separación de la biomasa del líquido de cultivo por
filtración se mejora considerablemente por la forma de pellet.

12.3 FACTORES QUE AFECTAN AL CRECIMIENTO DEL MOHO

PROCESO DE FERMENTACIÓN

La nutrición con oligoelementos es uno de los factores más importantes que afectan los
rendimientos (gramos de ácido cítrico por gramo de azúcar) de la fermentación con ácido
cítrico. En particular, los niveles de manganeso, hierro, cobre y zinc son bastante críticos. Si
los niveles de estos oligoelementos son correctos, otros factores tienen efectos menos
pronunciados. Por el contrario, el medio no permitirá una producción alta a menos que el
contenido de oligoelementos se controle cuidadosamente. Manganeso (iones Mn2)
en el medio nutritivo juega un papel clave en la acumulación de grandes cantidades de
citrato por A. niger. Cuando la concentración de Mn2 se mantiene por debajo de 0,02 mM
(lo que no afecta a la tasa de crecimiento ni al rendimiento de la biomasa), se producen
grandes cantidades de ácido cítrico. Ha sido

encontró 1 que hasta 0,5 mg de hierro por litro de medio es esencial para los altos
rendimientos de ácido cítrico por A. niger mientras el organismo utiliza sacarosa en el
cultivo sumergido. Los medios con 40% de sacarosa se purificó con un intercambiador de
iones; la resistencia midió 3,5 M, y fue diluido al 14,2% de contenido de azúcar. La
composición del medio fue KH2PO4, 0,014%; MgSO47H2O, 0,1%; (NH4)2CO3, 0,2%; FeCl3,
0,05% y añadir HCl a pH 2,6. Exceso de Fe3 puede reducir drásticamente el rendimiento de
ácido cítrico de 88% a 39%. El efecto de los iones de hierro en el rendimiento del ácido
cítrico se muestra en la figura 12.1. A. niger produce normalmente muchos metabolitos
secundarios útiles; ácidos cítricos y oxálicos son declarados como los productos dominantes.
Limitación de fosfato y ciertos metales como cobre, hierro y manganeso resulta en un
rendimiento predominante de ácido cítrico. El hierro adicional puede actuar como un
cofactor para una enzima que utiliza ácido cítrico como sustrato en el ciclo del ATC; como
Como resultado, se forman intermediarios del ciclo del ATC. La presencia de exceso de
hierro favorece la producción de ácido oxálico. Los iones de cobre juegan un papel
importante en la reducción del efecto nocivo del hierro en la producción de ácido cítrico.
También ha se ha informado de que los iones de cobre pueden contrarrestar con éxito la
adición de manganeso a los cítricos medios de fermentación ácida y son inhibidores de la
absorción celular de manganeso. Se encontró que cobre es un requisito esencial para la
producción de ácido cítrico. Una concentración óptima de Cu2 es de 40 ppm para altos
rendimientos. Bajas concentraciones de zinc en el medio de fermentación son generalmente
favorecido en la mayoría de los medios para la producción de ácido cítrico. Se informó que
el promover la producción de ácido cítrico. El ion zinc juega un papel en la regulación del
crecimiento y la acumulación de citrato. A altos niveles de zinc (alrededor de 2M) los
cultivos se mantienen en la fase de crecimiento, pero cuando el medio se vuelve deficiente
de zinc (por debajo de 0,2 millones), el crecimiento es
termina y comienza la acumulación de ácido cítrico. Adición de zinc a la acumulación de
citrato cultivos resulta en su reversión a la fase de crecimiento. Desde melaza (remolacha o
caña) con-contiene cantidades inhibidoras de iones metálicos como zinc, hierro y cobre, es
absolutamente necesario ya sea para eliminar estos iones o para hacerlos ineficaces por
pretratamiento.La mayoría com-
métodos de pretratamiento monly utilizados son la adición de ferro o ferricianuro para
precipitar hierro, zinc, cobre y manganeso, disminuyendo el contenido de manganeso
disponible a menos 0.002 ppm o pasando el medio sobre resina de intercambio iónico.

12.4 ARRANQUE O SIEMBRA DE UN INÓCULO

Desde el comienzo del experimento Petri placas de nutrientes se preparan con un medio
composición de: glucosa, 50 g; KH2PO4, 2 g; MgSO47H2O, 1 g; peptona, 8 g, extracto de
levadura, 2 g; agar 20 g y agua destilada 1000 ml. Los medios de comunicación y las placas
de Petri se esterilizan por separado.
Se recomienda cada placa de Petri se envuelve por separado en papel de aluminio.
Distribución de medios de comunicación deben hacerse en presencia de una llama. El
cultivo de stock se transfiere a la
plato para el cultivo. Los conidios se cosechan y luego se transfieren a los medios definidos
para A. níger. Además, el cultivo se puede hacer en una cabeza de algodón obstruida de un
matraz con medios en un agitador para una buena aireación. Después de 18 horas de
crecimiento, mycelia en forma de corto
y hifas de grasa conocidas como pequeñas bolitas se desarrollan. Si se utilizan placas de
Petri, debe esperar
2 días para la formación de esporas. Los conidios se lavan con solución salina al 1% (NaCl 10
gl 1)y recogido en un matraz Erlenmeyer en medios esterilizados. Se requiere
transformación aséptica.

12.5 CULTIVO DE SEMILLAS

Se prepara un cultivo de semillas como medio estéril, y se induce el cultivo madre para
esporas mation. Ferrocianuro [K4Fe(CN)6 200 ppm] en un medio que contenga 100 gl
1 azúcar es empleado como medio de fermentación basal. La solución de azúcar debe ser
pretratada y y pasó a través de una columna de intercambio catiónico y aniónico. Después
de la determinación de medios, inocular los medios estériles. Las condiciones de cultivo son
típicamente: ture (30 C), pH inicial (6.0), suministro de aire de 1-2 dm3/min. (0.5 a 1.0 vvm),
intención de agitación sity (200 rpm) y el tiempo de experimento por lotes de unos 3-5 días.
El rendimiento de ácido cítrico es de aproximadamente 67-70%. El pH cae gradualmente a
una condición ácida, que causa que el proceso sea retardado. Desde que se ha demostrado
que la naturaleza y la cantidad de oligometales, carbono y

fuente de nitrógeno, suministro de aire y medios de pH son muy importantes para el éxito
de fer ácido cítrico-mentación, todos estos factores se consideran en el curso de la
fermentación. Medios estándarpara las levaduras y los hongos. La composición figura en el
cuadro 12.1.

PRODUCCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO

Fermentación de ácido cítrico de melaza de caña mediante fermentación sumergida en 2 l B.

Braun fermentador agitado (volumen de trabajo 2 l) se realiza. Una cepa de A. niger ATCC
11414 es

utilizado en el presente estudio, obtenido de la American Type Culture Collection.

Melaza tratada con ferrocianuro [K4Fe(CN)6 200 ppm] medio que contiene 100 gl
1 azúcar es utilizado como medio de fermentación basal. Diferentes condiciones culturales
como la incubación temperatura (30 C), pH inicial (6.0), suministro de aire (1.0 l1 l1min),
intensidad de agitación (200 rpm) y el tiempo de incubación (unos 5 días) se optimizarán
para mejorar la producción de ácido cítrico-ción. Una cantidad máxima de ácido cítrico
anhidro con 100 gl 1 de sustrato está en el rango71-88 gl 1. Si el producto se elimina a
medida que se forma, el rendimiento puede maximizarse. PH final y el peso seco celular es
de aproximadamente 2.1 y 10 gl 1, respectivamente. A. niger sigue siendo el organismo
elegido para la producción de ácido cítrico. Sumergido fermentador, ya sea aire comprimido
purificado o oxígeno y agitación se utilizan. Melaza son una materia prima deseable para la
fermentación del ácido cítrico debido a su disponibilidad y precio muy bajo.La temperatura
de incubación juega un papel importante en la producción de ácido cítrico.Las temperaturas
entre 25 y 30 C se emplean generalmente para el cultivo de A. niger, pero por encima de 35
C formación de ácido cítrico se inhibe debido al aumento de la producción de subproductos

ácidos del producto y la inhibición del desarrollo del cultivo. Producción de ácido cítrico por
A. Niger es sensible al pH inicial del medio de fermentación. La producción máxima de

El ácido ric (6,5%) se obtuvo a pH 5,4 en el medio de melaza. El pH adecuado es importante

para el progreso y la finalización exitosa de la fermentación. El pro-producido por A. niger es
extremadamente sensible a los metales traza presentes en la melaza. Trace met-als tales
como hierro, zinc, cobre y manganeso presentan un problema crítico en sumergido
fermentación. Los organismos necesitan elementos importantes como carbono, nitrógeno,
fósforo y azufre, además de diversos oligoelementos para el crecimiento y la producción de
ácido cítrico.4,5

12.7 MÉTODO ANALÍTICO

Peso seco de la célula 12.7.1 Las células, esporas y micelias se filtran (0,45 m), el filtro se
seca en un horno a 80 C, y el peso seco de la célula se determina según el procedimiento
explicado en el anterior bio-

módulo de proceso.
12.7.2 Hidratos de carbono.

Los azúcares se estiman con la reducción de reactivo DNS, basado en el método

colorimétrico devel-
en un módulo anterior. Las muestras se determinan por el color desarrollado, que es

detectado por un espectrofotómetro a una longitud de onda de 540 nm. En operaciones a

gran escala,
Los micelios están separados por un filtro de tambor rotatorio.

12.7.3 Ácido cítrico

El ácido cítrico obtenido de la fermentación se elimina del cultivo por precipitación.

La precipitación está formada por la adición de Ca(OH)2 200 gl
1, a 70 C. El pH de solu-
se ajusta a 7.2. Tetrahidrato de citrato tri-calcio se recoge por filtración. El tri-
citrato de calcio como torta de filtro se disuelve en H2SO4 a 60 C con un exceso de 0,1%, el
sólido se conserva CaSO4 y se obtiene el ácido cítrico libre. La concentración libre de ácido
cítrico se determina con un kit enzimático disponible de Merck. GC/HPLC se recomienda
para alta precisión de cualquier trabajo de investigación.5

12.8 EJECUCIÓN EXPERIMENTAL

Sobre la base de la discusión anterior, ahora estamos listos para comenzar un experimento
real.Melaza transferido de la industria azucarera y mantenido en una habitación fría. El
orden de cultivo ATCC ha
llegado e hidratado. Se preparó el cultivo madre y la transferencia aséptica se realizó con
éxito. Preparar esporas, conidios fúngicos/bolitas pequeñas en recipiente de Petri o matraz
de algodón, para 48
horas. Recoger la espora en un matraz separado con medios de propagación. Una vez en el
recipiente separado
frasco la concentración de esporas ha llegado a unos 3 millones por litro. Ahora está listo
se transferirá a un fermentador de biostato B. Braun de 2 l. El volumen mínimo de cosecha
esporas en el matraz es de 300 ml. Los medios deben prepararse sobre la base de una
fuente de carbono suficiente con azúcar de 10 gl 1, fuentes de nitrógeno y oligometales,
como se explicó anteriormente y se define en
Cuadro 12.1. Se suministra aire u oxígeno puro para garantizar la disponibilidad de oxígeno
suficienteaireación. Los datos experimentales obtenidos se presentan en la tabla 12.2.