CATEDRA DE BIOQUIMICA FACULTAD DE MEDICINA UNNE.

APOPTOSIS
AUTORES: SOSA, RICARDO DANIEL Profesor, Ctedra de Oncologa. Facultad de Medicina. UNNE.

Brandan, Nora. Profesora Titular. Ctedra de Bioqumica. Facultad de Medicina. UNNE Jerz, Javier. Ayudante Alumno por concurso. Ctedra de Bioqumica. Facultad de Medicina. UNNE

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APOPTOSIS
1. Introduccin
La muerte celular, particularmente la apoptosis, probablemente sea uno de los tpicos ms estudiados entre los bilogos celulares. Entender la apoptosis en condiciones de enfermedad es muy importante, ya que no slo puede ensear la patognesis de la enfermedad sino tambin da pistas de cmo puede ser tratada la enfermedad; por ejemplo, en el cncer hay una prdida de balance entre las clulas en divisin y la muerte celular, y las clulas que deberan morir no reciben las seales para hacerlo. El problema puede surgir en cualquier etapa en la va de la apoptosis. Un ejemplo es el downregulation del p53, un gen supresor de tumor, que resulta en menos apoptosis y mayor crecimiento y desarrollo tumoral, y la inactivacin del p53, independientemente del mecanismo, se lo ha vinculado a muchos cnceres humanos.

2. Apoptosis
El trmino apoptosis deriva del griego y que significa cada y se refiere a la cada de las hojas de los rboles en otoo. Se lo usa en contraste con necrosis para describir la situacin en el cual una clula persigue de forma activa un camino hacia la muerte, a partir de recibir ciertos estmulos. Desde que fue descripta la apoptosis por Kerr et al en 1970, es uno de los procesos ms investigados en la biologa. Al ser un proceso altamente selectivo, es importante tanto en condiciones fisiolgicas como patolgicas. En situaciones fisiolgicas tales como la destruccin programada en el desarrollo embrionario para terminar de formar los tejidos, la involucin fisiolgica tales como el desprendimiento del endometrio o la regresin de la mama luego de la lactancia, la destruccin normal de las clulas acompaadas por nueva proliferacin como en el tracto digestivo, la involucin del timo a edad temprana. Y en condiciones patolgicas como la muerte celular inducida por un quimioterpico en el cncer, la muerte y deplecin progresiva de los CD4 en el SIDA, algunas formas de muerte celular inducidas por virus como en las hepatitis B o C, la atrofia patolgica de rganos y tejidos como resultado de retirar un estmulo como la atrofia de la prstata luego de una orquiectoma, etc. En resumen, la muerte celular programada hace referencia a situaciones en las cuales las clulas activan un programa letal que se encuentra codificado en el genoma, que en un momento preciso, selecciona determinadas clulas para morir. La apoptosis tiene como funcin biolgica principal mantener la homeostasis en distintas poblaciones celulares. La desregulacin de este proceso puede conducir a estados patolgicos que involucran a enfermedades con excesiva acumulacin celular (falta apoptosis) o con excesiva prdida celular (sobra apoptosis).

Diferencias entre Apoptosis y Necrosis

Las clulas que sufren apoptosis muestras rasgos morfolgicos y bioqumicos caractersticos que las diferencian de las clulas necrticas. NECROSIS APOPTOSIS Rasgos Morfolgicos Rasgos Morfolgicos Prdida de la integridad de las Formacin de ampollas en las membranas. membranas sin prdida de la integridad. Floculacin de la cromatina. Agregacin de la cromatina sobre la membrana nuclear. Hinchazn de la clula. Condensacin citoplasmtica y nuclear. Lisis completa, sin formacin de vesculas. Formacin de vesculas rodeadas de membranas. Desintegracin de las organelas, con formacin de ampollas. No hay desintegracin de organelas.

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Rasgos Bioqumicos Rasgos Bioqumicos. Prdida de la regulacin de la Proceso finamente regulado que homeostasis inica. involucra pasos de activacin, sntesis y etapas. Proceso pasivo que no requiere de energa. Proceso activo, dependiente de ATP. No requiere sntesis de cidos nucleicos Requiere sntesis de macromolculas. y protenas. Transcripcin de genes de novo. Digestin del DNA al azar. Fragmentacin especfica del DNA. Fragmentacin post-ltica del DNA. Fragmentacin pre-ltica del DNA. Significado Fisiolgico/Fisiopatolgico Muerte masiva de clulas. Provocada por disturbios no fisiolgicos. Fagocitosis por macrfagos. Con respuesta inflamatoria importante Significado Fisiolgico/Fisiopatolgico Muerte de clulas individuales. Inducida por estmulos fisiolgicos, aunque tambin patolgicos. Fagocitosis por clulas adyacentes o macrfagos. Sin respuesta inflamatoria.

2.1. Cambios morfolgicos en la apoptosis

Las alteraciones morfolgicas de la muerte celular apopttica que importan tanto al ncleo como al citoplasma, son remarcablemente similares en todos los tipos celulares y especies. Generalmente se requieren slo algunas horas desde la iniciacin de la muerte celular hasta el final de la fragmentacin celular. Sin embargo, el tiempo que toma depende del tipo celular, el estmulo y la va apopttica. Los contrastes morfolgicos de la apoptosis en el ncleo son la condensacin de la cromatina y la fragmentacin nuclear, que se acompaan de un redondeamiento o balonamiento de la clula, reduccin del volumen celular (picnosis) y retraccin de los pseudpodos. La condensacin de la cromatina comienza en la periferia de la membrana nuclear, formando una estructura tipo anillo. La cromatina, adems se condensa hasta que comienza a romperse dentro de la clula pero siempre con una membrana celular intacta, una caracterstica descripta como cariorrexis. La membrana plasmtica tambin est intacta y durante todo el proceso. En el estadio final de la apoptosis, se agregan algunas otras caractersticas tales como un blebbing de la membrana (se forman como burbujas llamadas blebs), modificaciones ultraestructurales de las organelas citoplasmticas y prdida, finalmente, de la integridad de la membrana. Generalmente, las clulas fagocticas engullen a las clulas apoptticas antes que ocurran estos cuerpos apoptticos. Esta es la razn por el cual, la apoptosis fue descubierta tardamente en la historia de la biologa celular, y los cuerpos apoptoticos slo pueden verse in vitro y bajo condiciones muy especiales. Si los remanente de las clulas apoptticas no son fagocitadas como en el caso de un cultivo celular artificial, sufrirn un proceso de degradacin que remeda a la necrosis y esta condicin se llama necrosis secundaria.

2.2. Cambios bioqumicos en la apoptosis

A grandes rasgos, existen tres tipos principales de cambios bioqumicos que pueden verse en la apoptosis, 1) activacin de las caspasas, 2) rotura de DNA y otras protenas y 3) cambios de la membrana y reconocimientos por parte de las clulas fagocticas. Al principio de la apoptosis, hay expresin de fosfatidilserina (PS) en las capas externas de la membrana celular, que han hecho un flipped out desde las capas ms internas. Esto permite el reconocimiento temprano de clulas muertas por los macrfagos, lo que resulta en fagocitosis sin liberacin de componentes celulares pro-inflamatorios. Esto es seguido de una rotura caracterstica del DNA en piezas grandes de 50 a 300 kilobases. Ms tarde, hay un clivaje internucleosomal del DNA en oligonucleosomas formados por mltiplos de 180 a 200 pares de bases, por parte de las endonucleasas. Esto hace que en la corrida electrofortica en el gel, aparezca la caracterstica escalera de SOSA, Ricardo Daniel Pgina 3

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DNA. Otra caracterstica especfica de la apoptosis es la activacin de un grupo de enzimas que pertenecen a la familia de la cistena-proteasas, denomindas caspasas. La c de caspasa se refiere a la Cisteinaproteasa, en tanto el aspasa se refiere a la propiedad nica de la enzima de clivar siempre despus de residuos asprticos. Las caspasas activadas, clivan muchas protenas celulares vitales y rompen el andamiaje nuclear y el citoesqueleto. Tambin activan a las DNAsas, que adems degradan al DNA nuclear. Aunque los cambios bioqumicos explican en parte algunos de los cambios morfolgicos de la apoptosis, es importante notar que el anlisis bioqumico de la fragmentacin del DNA o la activacin de las caspasas no deberan ser usados para definir a un proceso apopttico, ya que puede ocurrir apoptosis sin fragmentacin olignonucleosomal del DNA y puede ser caspasa-independiente. El Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD) ha propuesto que la clasificacin de las modalidades de muerte celular se basen exclusivamente en criterios morfolgicos, ya que no hay una clara equivalencia entre cambios ultraestructurales y bioqumicos que deriven de la muerte celular.

2.3 Mecanismos de apoptosis

Entender los mecanismos de apoptosis es crucial y ayuda a entender la patognesis de condiciones que resultan de una apoptosis desordenada. Esto, a su vez, puede ayudar al desarrollo de drogas que hagan blanco en ciertos genes apoptticos o vas de la misma. Las caspasas son centrales al mecanismo de la apoptosis ya que son tanto iniciadoras como ejecutoras del proceso. Hay tres vas por el cual las caspasas pueden ser activadas. Las dos comnmente descriptas vas de iniciacin son la va intrnseca (o mitocondrial) y la va extrnseca (o del receptor de muerte). Ambas vas finalmente llevan a una va comn o fase de ejecucin de la apoptosis. Una tercera va de iniciacin, menos conocida, es la va del retculo endoplsmico intrnseca. 2.3.1 La va extrnseca del receptor de muerte La va extrnseca del receptor de muerte, como su nombre lo indica, comienza cuando los ligandos de muerte se unen a un receptor de muerte. Aunque se han descripto varios receptores de muerte, los ms conocidos receptores de muerte son el receptor de TNF tipo 1 (TNFR1), y una protena relacionada llamada Fas (CD95) y sus ligandos, TNF y Fas ligando (FasL), respectivamente. Estos receptores de muerte tienen un dominio de muerte intracelular que recluta a protenas adaptadoras tales como el dominio de muerte asociado al receptor TNF (TRADD) y al dominio de muerte asociado a Fas (FADD), as como a cistena-proteasas como las caspasas. La unin de un ligando de muerte a un receptor de muerte, resulta en la formacin de un sitio de unin para una protena adaptadora y el complejo completo de ligando-receptor-adaptador se conoce como DISC (complejo de sealizacin que induce muerte). El DISC entonces, inicia el ensamblaje y activacin de la pro-caspasa 8. La forma activada de la enzima, la caspasa 8, es una caspasa iniciadora, que inicia la apoptosis clivando otras caspasas ejecutoras o de ro abajo. 2.3.2 La va intrnseca mitocondrial Como su nombre lo indica, la va intrnseca se inicia dentro de la clula. Los estmulos internos, tales como un dao gentico irreparable, la hipoxia, concentraciones extremadamente altas de calcio citoslico y un stress oxidativo severo, son todos disparadores de la iniciacin de la va mitocondrial intrnseca. Independientemente del estmulo, esta va es el resultado de una permeabilidad mitocondrial aumentada y de la liberacin de molculas proapoptticas tales como la citocromo-c hacia el citoplasma. Esta va est estrechamente regulada por un grupo de protenas que pertenecen a la familia Bcl-2. Hay dos grupos principales de protenas Bcl-2, especficamente las protenas pro-apoptticas (Bax, Bak, Bad, Bcl-Xs, Bid, Bik, Bim y Hrk) y las anti-apoptticas (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, Bfl-1 y Mcl-1) En tanto las protenas anti-apoptticas frenan la apoptosis bloqueando la liberacin mitocondrial de citocromo-c, las protenas pro-apoptticas actan promovieron la liberacin de citocromo-c desde la mitocondria hacia el citoplasma. No es la cantidad absoluta, sino el balance entre las protenas pro- y anti-apoptticas lo que determina si se va a iniciar o no la apoptosis. Otros factores apoptticos que se liberan desde el espacio intermembranoso mitocondrial hacia el citoplasma incluyen al factor inductor de apoptosis (AIF), al segundo activador de caspasa derivado de mitocondria (Smarc), a la protena de unin al IAP directo con bajo ph (DIABLO) y la protena A de requerimiento de alta temperatura /Omi (HtrA2). La liberacin citoplasmtica de citocromo-c activa a la SOSA, Ricardo Daniel Pgina 4

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caspasa 3 por medio de la formacin de complejo conocido como apoptosoma, que est conformado de citocromo-c, Apaf-1 y caspasa 9. Por otro lado, el Smac/DIABLO o la Omi/HtrA2, promueven la activacin de la caspasa unindose al inhibidor de las protenas de apoptosis (IAPs) que posteriormente lleva a la disrupcin en la interaccin de los IAPs con la caspasa 3 o 9. 2.3.3 La va comn La fase de ejecucin de la apoptosis involucra la activacin de una serie de caspasas. Las caspasas que est hacia arriba (ro arriba) de la va intrnseca es la caspasa 9, en tanto la de la va intrnseca es la capasa 8. Las vas intrnseca y extrnseca convergen en la caspasa 3. La caspasa 3, as, cliva al inhibidor de la desoxiribonucleasa activada por caspasa, que es responsable de la apoptosis nuclear. Adems, las caspasas que estn rio abajo, inducen el clivaje de las proten-kinasas, protenas del citoesqueleto, protenas de reparacin del DNA y subunidades inhibitorias de la familia de las endonucleasas. Tienen tambin un efecto sobre el citoesqueleto, el ciclo celular y las vas de sealizacin, los cuales, todos juntos, contribuyen a los cambios morfolgicos tpicos de la apoptosis. El hecho de que los precursores de las caspasas estn expresados constitutivamente en las clulas vivas, y que la apoptosis pueda inducirse rpidamente en ellas, probaran la alta sofisticacin y eficiencia del proceso de regulacin de las caspasas. En la actualidad existen varios modelos que explican el modo en que se regulara la actividad de estas proteasas: 1) Activacin de las caspasas efectoras: una seal pro-apopttica culmina en una caspasa iniciadora que, posteriormente, activa a las efectoras provocando el desensamblaje celular. 2) Activacin de las caspasas iniciadoras: las caspasas iniciadoras se activaran por unin a cofactores especficos. As, en el caso de la pro-caspasa 8 se requerira la unin con su cofactor FADD para su activacin. La pro-caspasa 9, en cambio, se activa al unirse a Apaf-1, pero requiere del citocromo-c y del ATP para conformar el apoptosoma. Esto indica que la activacin de estas proteasas puede requerir de mltiples cofactores, habiendo surgido distintos modelos para explicar cmo podra producirse la activacin a travs de ellos. 3) Los inhibidores como reguladores: las IAPs actuaran bloqueando la apoptosis a travs de la inhibicin de caspasas efectoras, sin embargo, tambin previenen la activacin de estas enzimas cuando hay sobreexpresin, sugiriendo que los blancos reales en las clulas son la pro-caspasas efectoras y otras protenas involucradas en la activacin. 2.3.4 La va del retculo endoplasmtico intrnseco. Esta va del retculo endoplsmico intrnseco es una tercera va y la menos conocida. Se cree que depende de la caspasa 12 y es independiente de la mitocondria. Cuando el RE se injuria por stress celular como hipoxia, radicales libres o falta prolongada de glucosa, hay un desplegamiento de protenas y una sntesis reducida de protenas en la clula, y una protena adaptadora conocida como factor 2 asociado al receptor TNF (TRAF2), se disocia de la pro-caspasa 12, resultando en la activacin de la misma.

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CATEDRA DE BIOQUIMICA- APOPTOSIS. Protenas de la familia Bcl-2

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La familia de protenas Bcl-2, est comprendida por protenas pro-apoptticas y anti-apoptticas, que juegan un rol importantsimo en la regulacin de la apoptosis, especialmente en la va intrnseca, ya que son previas al dao celular irreversible y actan principalmente a nivel mitocondrial. Todos los miembros Bcl-2 estn localizados en la membrana mitocondrial externa. Son dmeros responsables de la permeabilidad de esta membrana, sea en la forma de canal inico o a travs de la creacin de poros. Segn su funcin y los dominios de homologa Bcl-2 (BH = Bcl-2 Homology), los miembros de esta familia se dividen en tres grupos. El primer grupo son las protenas anti-apoptticas que contienen los cuatro dominios BH y protegen a la clula de cualquier estmulo apopttico. Algunos ejemplos son el Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, A1/Bfl-1 y Bcl-B/Bcl2L10. El segundo grupo est conformado de protenas slo con dominio BH-3, llamadas as en comparacin a los otros miembros, y estn restringidas al dominio BH3. Ejemplos de este grupo incluyen al Bid, Bim, Puma, Noxa, Bad, Bmf, Hrk y Bik. En momentos de mucho stress celular, tal como dao al DNA, deprivacin de algn factor de crecimiento, se activan las protenas slo-BH3, que son iniciadoras de la apoptosis. Por lo tanto, son pro-apoptticas. Los miembros del tercer grupo contienen tambin los cuatro dominios BH y tambin son pro-apoptticas. Algunos ejemplos incluyen al Bax, Bak y Bok/Mtd. Cuando hay disrupcin en el balance de miembros de la familia Bcl-2 anti-apoptticos y proapoptticos, el resultado es una apoptosis desregulada en las clulas afectadas. Esto puede deberse a una sobreexpresin de una o ms protenas anti-apoptticas o a una sub-expresin de una o ms protenas proapoptticas o a una combinacin de ambas cosas. Por ejemplo, se demostr que la sobreexpresin de Bcl-2 (anti-apopttica) protege a las clulas del cncer de prstata de la apoptosis; tambin se demostr que la sobreexpresin de Bcl-2 lleva a la inhibicin de la apoptosis inducida por TRAIL en los neuroblastomas y en las clulas de cncer de mama.

p53
La protena p53, tambin llamada protena tumoral 53 (o TP 53), es uno de las protenas supresoras de tumores mejor conocidos, codificado por el gen supresor de tumor TP53, localizado en el brazo corto del cromosoma 17 (17p). Se los denomina por su peso molecular, es decir 53 kDa. Esta protena no solo est involucrada en la induccin de la apoptosis sino tambin tiene un papel clave en la regulacin del ciclo celular, diferenciacin, desarrollo, amplificacin gnica, recombinacin del DNA, segregacin cromosmica y senescencia celular, por lo que es llamada guardian del genoma.

Inhibidor de protenas de la apoptosis (IAPs)

El inhibidor de protenas de la apoptosis son un grupo de protenas estructural y funcionalmente similares que regulan la apoptosis, citoquinesis y transduccin de seales. Se caracterizan por la presencia de un dominio proteico de repeticin (BIR). A la fecha, se han identificado ocho IAPs. Los IAPs son inhibidores endgenos de las caspasas y pueden inhibir la actividad de las caspasas uniendo sus dominios BIR conservados a los sitios activos de las caspasas, promoviendo la degradacin o manteniendo a las caspasas lejos de sus sustratos.

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