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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
El alojamiento enriquecido reduce la

susceptibilidad a la enfermedad por coinfección
con el virus respiratorio y reproductivo porcino
(PRRSV) yActinobacillus pleuropneumoniae (A.
pleuropneumoniae)en Cerdos Jóvenes
Ingrid DE van Dixhoorn1*, Inonge Reimert2, Jenny Middelkoop2, J. Elizabeth Bolhuis2, Henk J.
Wisselink3, Peter WG Groot Koerkamp4, Bas Kemp2, Norbert Stockhofe-Zurwieden3
a11111
1Investigación sobre Ganadería, Universidad y Centro de Investigación de Wageningen, Wageningen, Países Bajos, 2
Grupo de Fisiología de la Adaptación, Universidad y Centro de Investigación de Wageningen, Wageningen, Países
Bajos,3Instituto Veterinario Central, Universidad y Centro de Investigación de Wageningen, Lelystad, Países Bajos,4
Grupo de Tecnología Agrícola, Universidad y Centro de Investigación de Wageningen, Wageningen, Países Bajos
* ingrid.vandixhoorn@wur.nl
ACCESO ABIERTO
Citación:van Dixhoorn IDE, Reimert I, Middelkoop J,

Bolhuis JE, Wisselink HJ, Groot Koerkamp PWG, et al.
(2016) Vivienda enriquecida reduce la susceptibilidad a la
Abstracto
enfermedad a la coinfección con porcino
Hasta el día de hoy, los fármacos antimicrobianos han sido la terapia de elección para combatir las enfermedades
Virus Reproductivo y Respiratorio (PRRSV) y
Actinobacillus pleuropneumoniae (A. bacterianas. La resistencia a los antibióticos es motivo de creciente preocupación en el hombre y los animales. El
pleuropneumoniae)en Cerdos Jóvenes. PLoS ONE estrés, causado por condiciones ambientales exigentes, puede reducir la protección inmunológica en el huésped,
11(9): e0161832. doi:10.1371/journal.pone.0161832
lo que influye en la aparición y el resultado de enfermedades infecciosas. Por lo tanto, la intervención
Editor:Srinand Sreevatsan, Universidad de Minnesota, psiconeuroinmunológica puede resultar un enfoque exitoso para disminuir el impacto de las enfermedades y el
ESTADOS UNIDOS
uso de antibióticos. Este estudio fue diseñado para investigar el efecto del enriquecimiento social y ambiental
Recibió:15 de diciembre de 2015 sobre el impacto de la enfermedad, denominada "susceptibilidad a la enfermedad", en cerdos utilizando un
Aceptado:12 de agosto de 2016 modelo de coinfección de PRRSV yA. pleuropneumoniae.Veintiocho cerdos se criaron en cuatro corrales en
condiciones estériles y otros veintiocho cerdos se criaron en cuatro corrales en condiciones enriquecidas. En los
Publicado:8 de septiembre de 2016
corrales enriquecidos se introdujo una combinación de factores de enriquecimiento social y ambiental

Derechos de autor:© 2016 van Dixhoorn et al. Este es un artículo
establecidos. Dos corrales de cerdos estériles (BH) y dos corrales de cerdos alojados enriquecidos (EH) se
de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de
atribución de Creative Commons , que permite el uso, la infectaron con PRRSV seguido deA. pleuropneumoniae,los otros dos corrales en cada tratamiento de alojamiento
distribución y la reproducción sin restricciones en cualquier sirvieron como grupos de control. Probamos si las diferencias en la susceptibilidad a la enfermedad en términos
medio, siempre que se acredite el autor original y la fuente.
de resultados patológicos y clínicos estaban relacionadas con los diferentes regímenes de alojamiento y si esto se
reflejaba en las diferencias en los estados inmunológicos y de comportamiento de los animales. Los cerdos
Declaración de disponibilidad de datos:Los datos estarán
alojados enriquecidos mostraron una eliminación más rápida del ARN viral de PRRSV en el suero sanguíneo (p =
disponibles en Figshare,https://figshare.com/articles/
Enriched_ housing_reduces_disesase_susceptibility_xlsx/
0,014) e histológicamente 2,8 veces menos signos de neumonía intersticial en los pulmones (p = 0,014). Más
3491726 . cerdos alojados estériles que alojados enriquecidos desarrollaron lesiones en los pulmones (OR = 19,2, p = 0,048) y
Fondos:Este trabajo fue financiado por el Ministerio

las lesiones en los cerdos alojados estériles mostraron una puntuación de daño tisular patológico total más alta
Holandés de Asuntos Económicos. (p<0,001) que las de los cerdos alojados enriquecidos. Los cerdos EH mostraron un comportamiento menos
Conflicto de intereses:Los autores han declarado que relacionado con el estrés y difirieron
no existen intereses contrapuestos.
PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 1 / 24

El alojamiento enriquecido reduce la susceptibilidad a las enfermedades en los cerdos
Abreviaturas:PRRSV, virus del síndrome respiratorio y inmunológica y clínicamente de cerdos BH. Concluimos que la gestión de vivienda enriquecida reduce la
reproductivo porcino;A. pleuropneumoniae, Actinobacillus
susceptibilidad a la enfermedad a la coinfección de PRRSV yA. pleuropneumoniaeen cerdos El enriquecimiento
pleuropneumoniae;PRDC, Complejo de Enfermedades
influye positivamente en el estado de comportamiento, la respuesta inmunológica y el resultado clínico en los
Respiratorias Porcinas; eje HPA, eje hipotálamo-pituitario-
suprarrenal; BH, estéril alojado; EH, alojamiento enriquecido; cerdos.

BHI, estéril alojado infectado; EHI, Infectados Alojados
Enriquecidos; ID1 t/m ID11, Día de la infección; HEPA, aire
Introducción
particulado de alta eficiencia; placa SB, placa de agar sangre de
carnero; placa NAD, placa de dinucleótido de nicotinamida y
adenina (NAD); CFU, unidades formadoras de colonias; BALF, El estrés psicosocial en el hombre y los animales altera la susceptibilidad a las enfermedades frente a los agentes
Líquido de lavado broncoalveolar; HE, hematoxilina-eosina; ARN,
infecciosos.1 –4 ]. Los factores sociales, el medio ambiente y el estrés están asociados con la susceptibilidad a la
ácido ribonucleico; PCR, reacción en cadena de la polimerasa;
enfermedad y, por lo tanto, se sugieren como cofactores en la patogénesis de las enfermedades infecciosas.1 ,5 ]. La
TCID50, Dosis infecciosa en cultivo tisular; EDTA,
terapia con fármacos antimicrobianos se ha utilizado contra enfermedades bacterianas infecciosas, pero la resistencia de
Ácido etilendiaminotetraacético; glóbulos blancos, glóbulos las bacterias a los antibióticos es motivo de creciente preocupación. Por lo tanto, la intervención psiconeuroinmunológica
blancos; FCM, citometría de flujo; FACS, clasificador de células se ha propuesto como una estrategia potencial para disminuir la aparición y el resultado de enfermedades infecciosas. Sin
activado por fluorescencia; FCV, dispersión frontal; SSC, embargo, quedan muchas incertidumbres con respecto a la efectividad de esta estrategia [1 ].
dispersión lateral; NK, célula asesina natural; MFI, intensidad de
En los cerdos, los efectos adversos de las condiciones de alojamiento deficientes en estímulos y el estrés social sobre el
fluorescencia media; CD, Cluster de diferenciación; mAb,
comportamiento, la (re)actividad del eje hipotálamo-pituitario-suprarrenal (HPA) y el estado de ánimo (pesimista versus
anticuerpo monoclonal; SLA, antígeno leucocitario porcino; TLR,
receptor tipo Toll; GLM, modelo lineal general; SEM, Error

optimista) están bien establecidos [6–20]. La provisión de sustratos de enriquecimiento adecuados, como paja o turba,
estándar de la media; LPS, lipopolisacárido; LBP, proteína de satisface mejor las necesidades de comportamiento de los cerdos y mejora su bienestar, pero a menudo se asocia con
unión a LPS. desventajas en costos, mano de obra e higiene y es incompatible con el manejo del estiércol basado en purines que se
aplica generalmente [21 ]. Por lo tanto, los cerdos criados comercialmente a menudo se crían en condiciones de
alojamiento estériles y con pocos estímulos [22 ]. Los estudios sobre la asociación entre el uso de materiales naturales,
como la paja, como sustratos de enriquecimiento y el riesgo de enfermedades infecciosas en cerdos son equívocos [21 ,23
–26 ]. Los cerdos criados en condiciones de enriquecimiento exhibieron menos días de diarrea después del destete y
menos lesiones gástricas en el sacrificio en comparación con los cerdos criados estériles [6 ,27 –32 ]. Sin embargo, hasta el
momento no se han establecido pruebas directas de un efecto de los procedimientos de alojamiento y manejo que
estimulan el comportamiento natural (social) en los cerdos sobre el desarrollo de enfermedades, a las que se hace
referencia en este documento como "susceptibilidad a las enfermedades" [5 ,21 , 33 ]. Por lo tanto, en el estudio actual
comparamos el desarrollo de la enfermedad después de la coinfección con el virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino (PRRSV) yA. pleuropneumoniae entre cerdos criados en corrales ambiental y socialmente
enriquecidos y cerdos criados en condiciones de alojamiento estériles y con pocos estímulos. Presumimos una
susceptibilidad reducida de la enfermedad a la coinfección, expresada por signos clínicos reducidos, en los cerdos alojados
enriquecidos.
Utilizamos este modelo de coinfección con patógenos virulentos leves en condiciones experimentales para obtener una
variación medible en los síntomas clínicos y la patología en los animales. Cuando se aplican por separado, estos patógenos
no inducen signos clínicos o patología evidentes, pero en combinación, probablemente debido al efecto inmunosupresor
del PRRSV, se produce una mayor incidencia de infecciones bacterianas secundarias.34 ]. Además, PRRSV yA.
pleuropneumoniaeson patógenos frecuentemente involucrados en el complejo de enfermedades respiratorias porcinas
(PRDC) en cerdos. PRDC causa graves problemas de salud y bienestar, es difícil de controlar y, debido a la morbilidad y las
tasas de crecimiento reducidas en los animales sobrevivientes, genera una carga financiera significativa para los
agricultores. Aunque se han desarrollado vacunas contra el PRRSV, ninguna de las vacunas actuales puede prevenir por
completo la infección respiratoria. Además, lamentablemente las estrategias de control actuales no logran proporcionar un
control sostenible de la enfermedad.35 ]. Las condiciones de vivienda enriquecidas posiblemente pueden contribuir al
control sostenible de enfermedades [34 –36 ].
Materiales y métodos
En este estudio se cumplieron los principios establecidos del uso de animales de laboratorio y las leyes
holandesas y de la UE relacionadas con los experimentos con animales. El Comité de Uso y Cuidado de Animales
de la Universidad de Wageningen (Departamento de Lelystad) aprobó el experimento con el número 2013181.

Diseño experimental, animales y alojamiento.

Para el experimento se utilizaron 56 lechones machos y hembras (línea Topigs 20, de origen Great
Yorkshire x Landrace) (8 camadas de 7 lechones). Los lechones eran descendientes de ocho cerdas
multíparas obtenidas de un PRRSV yA. pleuropneumoniae-rebaño libre. Las cerdas fueron inseminadas el
mismo día y el día esperado del parto se definió como el día 0 para todos los lechones. Desde dos
semanas antes del parto, las cerdas se alojaron en jaulas de parto en el centro de investigación A de
Wageningen UR Livestock Research, Lelystad, Países Bajos.
Las 8 camadas fueron sometidas desde el primer día de vida en adelante a alojamiento estéril (alojamiento estéril: BH)
o alojamiento enriquecido (alojamiento enriquecido: EH) (tabla 1 ). Los lechones BH se alojaron de acuerdo con los
requisitos legales vigentes para cerdos de granja en alojamientos convencionales de 5 m.2Corrales estériles con suelo
100% enrejado y suelo de goma maciza de 100x45cm. Los lechones EH se alojaron en 10m2
Corrales enriquecidos con piso parcialmente enrejado (40%) y parcialmente sólido (60%).
En los corrales baldíos se añadieron como enriquecimiento dos cadenas con tacos. En los corrales
enriquecidos se proporcionó sustrato de enraizamiento que consistió en 1 kg de paja, 160 L de turba húmeda y
180 L de viruta de madera. En estos corrales se añadieron dos sacos de yute y ramas de escoba, así como las
mismas dos cadenas con tacos que en los corrales baldíos. Se reponía diariamente paja y viruta de madera (0,5
kg/día de paja, 23 L/día de viruta de madera), y semanalmente se añadían a los corrales enriquecidos nuevas
ramas de escoba, nuevos sacos de yute y 20 L de turba. Todos los corrales se limpiaron diariamente eliminando
las heces y enjuagando los suelos de rejilla con agua. Todos los materiales para todos los corrales, incluido el
enriquecimiento de sustrato y los alimentos, fueron irradiados con γ (irradiación de 9 kGy; Synergy Health Ede BV,
Países Bajos). Se proporcionó una lámpara de calefacción para los lechones en cada corral durante la primera
semana después del nacimiento. El día 3, los lechones recibieron una marca en la oreja y fueron tratados con
ironject120% + B12 (Dopharma, Raamsdonksveer, Países Bajos) según procedimientos estándar. Las colas se
mantuvieron intactas y los lechones machos no se castraron.
Todos los corrales enriquecidos y estériles disponían de dos bebederos, uno para la cerda y otro para los lechones. Las
cerdas fueron alimentadas con una dieta comercial estándar dos veces al día a las 8:00 am y las 3:15 pm. Los lechones
recibieron alimento sólido.ad libitum,a partir del día 3. Las luces estaban encendidas entre las 6:00 am y las 6:00 pm. La
temperatura se mantuvo a 25°C durante la primera semana después del nacimiento y se disminuyó 1°C cada semana hasta
llegar a 22°C, la semana anterior al destete.

Desde el día 13 hasta el destete, se quitaron los paneles entre dos corrales EH adyacentes, lo que permitió que los
lechones de dos camadas EH diferentes se mezclaran. Así, los cuatro corrales individuales enriquecidos de 10m2se
transformaron temporalmente en dos corrales de 20m2para permitir la interacción social temprana entre las camadas de
EH.
El día 17 todos los lechones fueron sometidos individualmente al backtest, para evaluar su estrategia de afrontamiento
[37 ]. Durante el backtest, los lechones se mantuvieron en posición supina durante 1 minuto y el número
Tabla 1. Configuración experimental y nombres de grupos.
Alojamiento Grupos ante contagios Grupos después de infecciones Número de cerdos Infección Número de bolígrafos
Estéril BH BHI 14 PRRSV / Aplicación 2

Estéril BH BHC 7 Simulacro de infección (Control) 1
Estéril BH BHC 7 Sin infección (Control) 1
Enriquecido eh EHI 14 PRRSV / Aplicación 2
Enriquecido eh EHC 7 Simulacro de infección (Control) 1
Enriquecido eh EHC 7 Sin infección (Control) 1
aplicación:A. pleuropneumoniae
BH: Alojamiento estéril, BHI: Infectado alojado estéril, BHC: Control alojado estéril EH: Alojamiento
enriquecido, EHI: Infectado alojado enriquecido, EHC: Control alojado enriquecido
doi:10.1371/journal.pone.0161832.t001

de luchas, latencia a la primera lucha, número de vocalizaciones y latencia a la primera

vocalización se registraron [38 ].
El día 31, las cerdas se retiraron de los corrales estériles y enriquecidos (es decir, el día del destete) y se
seleccionaron siete lechones por camada. La selección se realizó teniendo en cuenta el género, el peso corporal y
la estrategia de afrontamiento para obtener lechones con características comparables en cada subgrupo
experimental. Los lechones seleccionados se reagruparon en ocho nuevos grupos de siete lechones por grupo.
Todos los lechones se mezclaron por igual y se formaron nuevos grupos con composiciones comparables. Los
nuevos grupos BH incluyeron solo lechones provenientes de camadas BH y los grupos EH incluyeron solo lechones
provenientes de camadas EH, lo que significa que el tratamiento de estabulación se mantuvo igual que antes del
destete. Los lechones por grupo fueron etiquetados individualmente usando un marcador animal para su
identificación.
El día 39, todos los lechones fueron transportados 4,5 km hasta la instalación B de Wageningen UR Livestock Research.
La estructura del grupo, el enriquecimiento de la vivienda, el tamaño de los corrales y el acceso a alimentos y agua se
mantuvieron igual que antes del transporte. Los cerdos de dos corrales estériles y dos enriquecidos se alojaron en salas
separadas para animales filtradas con aire de partículas de alta eficiencia (HEPA) para evitar la distribución de patógenos
por aire. Los cerdos de los otros dos corrales estériles y los dos enriquecidos sirvieron como controles negativos y se
mantuvieron en condiciones acordes a sus condiciones de alojamiento en corrales separados dentro de una habitación
grande en la instalación B sin medidas de bioseguridad adicionales con respecto al aire saliente (cerdos infectados
referidos a como cerdos BHI y EHI, controles como cerdos BHC y EHC,tabla 1 ).
La temperatura al destete el día 31 fue de 28°C y se disminuyó 2°C cada semana hasta alcanzar los
22°C. Se mantuvo a 22°C desde el día 42 hasta el día 55.
El día 55 los cerdos fueron sacrificados mediante la inyección de pentobarbital (Euthasol 40%, AST Farma) en
la vena auricular, mientras se inmovilizaban y posteriormente se desangraban.
Observaciones de comportamiento y lesiones cutáneas.
Frecuencias de los comportamientos enumerados en el etograma (Tabla 2 , adaptado de [39 ,40 ]) se registraron
antes y después del destete (día 30 y día 32) y antes y después del transporte a la instalación B (día 38 y día 40). En
cada día de observación, todos los corrales se observaron durante 4 períodos de diez minutos, dos veces por la
mañana (entre las 8:00 y las 11:00 a. m.) y dos veces por la tarde (entre las 13:00 y las 16:00 a. m.) en un orden
equilibrado para vivienda. Los comportamientos se promediaron por corral y por día y se expresaron como
frecuencias por cerdo por diez minutos. Se anotó un nuevo combate cuando el cerdo detuvo el comportamiento
durante más de 2 segundos.
En los mismos días, las lesiones cutáneas en la parte delantera (cabeza, cuello, hombros y patas delanteras), medias
(flancos y espalda) y traseras (rabadilla, patas traseras, cola) se contaron y clasificaron como indicadores de
comportamiento agresivo.41 ]. Para cada región del cuerpo, el número y la gravedad de las lesiones se diferenció usando
puntajes de 0 a 4 de la siguiente manera (modificado de [42 ]):0:Sin lesiones;1: <5 lesiones superficiales;2:5-10 lesiones
superficiales o < 5 lesiones profundas;3:10-15 lesiones superficiales o 5-10 lesiones profundas;4: >15 lesiones superficiales
o > 10 lesiones profundas. Las puntuaciones de las lesiones se promediaron por corral y por día.
Tabla 2. Etograma.
Comportamiento Descripción
Comportamiento social Tocar u oler cualquier parte del cuerpo de un compañero de corral (frecuentemente la región de la cabeza)
Agresión Lucha uni o bilateral persiguiendo, golpeando la cabeza (con o sin morder) y/o empujando
manipular cerdo Mordisquear, chupar o masticar cualquier parte del cuerpo del lechón o la cerda, o la nariz del vientre
manipular pluma Mordisquear, chupar o masticar los componentes del bolígrafo
Jugando Correr rápido alrededor del corral (galopar), rodar y sacudir objetos
Montaje De pie sobre las patas traseras con las patas delanteras en compañero de pluma

Procedimiento de infección
El día 44 (de ahora en adelante referido como día de infección 0: ID0), los cerdos BHI y EHI fueron
inoculados con la cepa LV-Ter Huurne de serotipo 1 de PRRSV europeo levemente virulento. Esta cepa de
PRRSV se aisló durante la epizootia de 1991 de un caso clínico de PRRS en los Países Bajos y se usó en el 7el
pasaje en macrófagos alveolares porcinos (PAM) [43 ]. Los cerdos se infectaron por vía intranasal con 1,5
ml de inóculo que contenía 5 log10Dosis infecciosa de cultivo tisular al 50 % (TCID50). Este tratamiento fue
seguido por una infección por aerosol en el día 52 (ID8) conA. pleuropneumoniae serotipo 2. El inóculo de
A. pleuropneumoniaeserotipo 2 cepa 17415 (cepa de referencia) se preparó como se describió
anteriormente [44 ]. En resumen, se descongeló una alícuota de la cepa de referencia, que se conservó a –
70 °C, y la suspensión se cultivó durante la noche a 37 °C en condiciones microaerófilas en placas de agar
sangre de carnero (placas SB) con nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) . A la mañana siguiente, las
colonias se transfirieron a placas SB + NAD nuevas y se cultivaron durante 6 horas. Posteriormente, las
colonias se enjuagaron de las placas y se almacenaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS-13).
El número de unidades formadoras de colonias (CFU) en la suspensión se determinó durante la noche y el
inóculo se diluyó para lograr una concentración de 9 log10UFCA. pleuropneumoniae/ml de suspensión.
Grupos de dos a tres cerdos fueron expuestos simultáneamente en una cámara de aerosol de acero
inoxidable (110 x 45 x 90 cm). El aerosol se administró utilizando el nebulizador de aerosol Aeroneb Pro
(EMKA Technologies, París, Francia). Se administró una cantidad de 5 ml de la suspensión del inóculo
durante un período de 20 min. Los procedimientos se han descrito previamente [45 ,46 ].
La mitad de los cerdos BHC y EHC no fueron inoculados (controles negativos) y no sufrieron
manipulaciones adicionales. La otra mitad de los cerdos BHC y EHC se sometieron a los mismos
procedimientos que los animales infectados (control simulado) en ID0 e ID8 (tabla 1 ), sin embargo, en
lugar del inóculo de PRRSV, se utilizaron 1,5 ml de medio RPMI y en lugar delA. pleuropneumoniaeinóculo,
se utilizaron 5 ml de PBS.
Comportamiento de enfermedad
Se colocaron cámaras en todos los corrales de la instalación B. En los días ID-1, ID3, ID6 e ID9, las posturas y las actividades de
comportamiento de los cerdos se calificaron con un muestreo de escaneo instantáneo de 10 minutos desde las 7:00 am hasta las
6:00 pm usando el Observador. XT 10.0 que da como resultado 66 escaneos por cerdo por día (Noldus Information Technology BV,
Wageningen, Países Bajos). A partir de estas observaciones, tanto el 'comportamiento de mentira' (es decir, la proporción de
escaneos que mienten), como la 'actividad conductual' (es decir, la proporción de escaneos durante los cuales los cerdos mostraron
comportamientos activos, como comer, beber, comportamientos sociales, manipulación del corral o compañeros de corral y
agresión ) y se calculó el "comportamiento de beber y comer" (es decir, la proporción de escaneos durante los cuales los cerdos
estaban (aparentemente) bebiendo y comiendo).
Temperatura rectal, examen clínico, crecimiento

La temperatura rectal se evaluó una vez en ID-2 y desde ID0 hasta ID11 dos veces al día (la primera
medición entre las 8 y las 11 a. m. y la segunda medición entre las 3 y las 4 p. m., denominadas IDX(1) e
IDX(2), respectivamente). En los días de las infecciones, se midió la temperatura antes del procedimiento
de infección y exactamente 4 horas después de que tuviera lugar el procedimiento de infección. Se
utilizaron termómetros digitales Microlife con una resolución de 0,1°C. Los termómetros se calibraron
antes del experimento.
Todos los lechones fueron observados e inspeccionados en busca de síntomas respiratorios (tos, problemas
respiratorios, estornudos) dos veces al día (a las 9:00 am y a las 4:00 pm) desde ID0 hasta el final del experimento
(ID11). El peso corporal de los lechones se midió semanalmente desde el día del parto hasta el final del
experimento. El crecimiento diario promedio se calculó de ID0 a ID8 para el período posterior a PRRSV y de ID8 a
ID12 para el período posterior a PRRSV.A. pleuropneumoniaeinfección.

Fenotipado de glóbulos blancos y poblaciones de células broncoalveolares

Se tomaron muestras de sangre (suero, sangre EDTA) por punción de la vena yugular en 7 días
diferentes (ID0, ID2, ID4, ID8, ID9, ID10 y ID11). El conteo total de glóbulos blancos (WBC) y un
conteo diferencial de linfocitos, granulocitos y monocitos se realizaron con un analizador de
hematología (blood cell counter Sysmex pocH-100iV diff, Kobe, Japón).
Se usaron muestras de sangre heparinizada recién aisladas (100 μl) para cuantificar diferentes
fenotipos de WBC por citometría de flujo (FCM). Brevemente, las células sanguíneas se incubaron
con una mezcla de anticuerpos monoclonales (mAb) primarios contra CD3, CD4, CD8 para marcaje
triple o para marcaje único con mAb contra CD172a o CD21 (Tabla 3 ). Se utilizaron los siguientes
controles de isotipos no relacionados (Southern Biotech) para las diferentes clases de Ig: IgG1
(clon 15H6), IgG2a (clon HOPC-1), IgG2b (clon A-1) e IgM (clon 11E10).
En el siguiente paso, FACS™Se añadió solución de lisis (BD Biosciences) durante 10 minutos. Después
de lavar las células en PBS suplementado con suero de cerdo al 1% (v/v) y azida de sodio al 0,1% (p/v), las
células se incubaron con anticuerpos secundarios específicos de isotipo (IgG1-APC de cabra anti-ratón,
IgG2b-FITC e IgG2a -PE, fuente Southern Biotech).
Para el fenotipado de la población de células alveolares, se obtuvo líquido de lavado broncoalveolar
(BALF) del lóbulo pulmonar craneal derecho durante la necropsia. Se insertó un catéter en el bronquio
local y se lavó el lóbulo con 30 ml de PBS y ca. Se recogieron 15 ml de PBS insertado. Las células en el BALF
se aislaron y conservaron inmediatamente como se describió anteriormente [47 ]. Para la caracterización
fenotípica de linfocitos, granulocitos y monocitos/macrófagos intraalveolares, se descongelaron células
BALF, se transfirieron a placas de microtitulación y se tiñeron triplemente con mAb dirigido hacia CD3,
CD4, CD8a para cuantificar los diversos fenotipos linfocíticos o se tiñeron dos veces con mAb contra
CD172a en combinación con mAb contra cualquiera
Tabla 3. Paneles de anticuerpos para FACS.
Antígeno Clon isotipo fluorocromo Etiquetado Fuente de anticuerpo

células blancas de la sangre Triple tinción
CD3 PPT3 IgG1 APC Secundario1 biotecnología del sur
CD4 74-12-4 IgG2b FITC Secundario1 biotecnología del sur
CD8α 76-2-11 IgG2a EDUCACIÓN FÍSICA Secundario1 biotecnología del sur
tinción única
CD172a 74-22-15 IgG2b FITC Secundario1 VMRD
CD21 B6-11C9 IgG1 APC Secundario1 biotecnología del sur
Células BALF Triple tinción

CD3 PPT3 IgG1 APC Secundario1 biotecnología del sur
CD4 74-12-4 IgG2b FITC Secundario1 biotecnología del sur
CD8α 76-2-11 IgG2a EDUCACIÓN FÍSICA Secundario1 biotecnología del sur
Tinción doble
CD172a 74-22-15 IgG2b EDUCACIÓN FÍSICA Secundario1 VMRD
CD172a 74-22-15 IgG1 EDUCACIÓN FÍSICA Secundario1 Beckman Coulter
disco 14 MIL2 IgG2b FITC Primario BioFuente
SLAII-DR 2E9/13 IgG2b FITC Primario Serotec
CD163 2a10/11 IgG1 FITC Primario Serotec
TLR4 IgM FITC Secundario1 Obsequio de J. Domínguez
tinción única
Granulocitos 2B2 IgG1 FITC Serotec
1: Para el marcaje secundario, las células se incubaron con anticuerpos secundarios específicos de isotipo (anti-ratón de cabra, fuente Southern Biotech)

CD14 o SLAII o CD163 o TLR4+o tinción simple con mAb contra granulocitos porcinos (Tabla
3 ).
Los análisis del citómetro de flujo se realizaron con el citómetro de flujo FACS (Cyan ADP, Beckman Coulter) y
se evaluaron con el software Cyan ADP Summit 4.3. Los glóbulos se seleccionaron primero sobre la base del
diagrama de dispersión frontal (FCS) versus dispersión lateral (SSC) como se describe [48 ] y luego se analizaron de
acuerdo con su perfil de marcador de antígeno. Sobre la base de los recuentos de glóbulos blancos en sangre
realizados por el contador automático de glóbulos, se evaluaron los números absolutos de los diferentes
fenotipos. Los granulocitos fueron identificados en sangre por un SSCaltoCD172a+perfil y en BALF por el uso del
marcador de granulocitos. Las células T se distinguieron en la puerta de linfocitos por las siguientes
combinaciones de marcadores: células T auxiliares vírgenes/no activadas: CD3+CD4+CD8-, células T citotóxicas: CD3
+CD4-CD8+, memoria/células T colaboradoras activadas: CD3+CD4+CD8+y células asesinas naturales (NK): CD3-CD4-
CD8+[48 ,49 ]. Los monocitos se identificaron en sangre por baja granularidad, es decir, SSCbajoCD172a+. Los
macrófagos en BALF fueron analizados por su CD172a+(y CD14) en combinación con la coexpresión y los niveles de
expresión de sus marcadores diferenciadores, es decir, la intensidad de fluorescencia media (MFI). Las poblaciones
de células alveolares se presentan como porcentaje de la población celular total en el BALF. Los marcadores de
macrófagos se presentan como porcentaje de la población celular total en BALF y como MFI.
Detección de ARN viral en suero

Se realizó una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) en ARN
aislado de suero sanguíneo, muestreado en ID0, ID4, ID8, ID10 e ID11. Se realizó una qRT-PCR de un tubo
con el instrumento Applied Biosystem 7500 Fast System utilizando el kit Quantitect Probe RT-PCR de
Qiagen. La mezcla de reacción (25 μl) contenía 0,25 μl de enzima suministrada por el kit, 12,5 μl de
Quantitect Mix, 15 μM de cada cebador (Fw: 5'- GAT GAC RTC CGG CAY C -3', Rev: 5'- CAG TTC CTG CGC CTT
GAT -3') y 10μM de sonda (5'- Fam-TGC AAT CGA TCC AGA CGG CTT-Tamra- 3')[50 ]. La RT-PCR se realizó a
los 30 min a 50 °C y a los 15 min a 95 °C, seguida de un protocolo de ciclos de dos pasos: 94 °C durante 20
s y 55 °C durante 45 s durante 40 ciclos. El análisis se realizó con 7500 Software v2.0.6 (Applied
Biosystems). Concentración de ARN viral (expresada como TCID50equivalentes por g) de cada muestra de
suero se calculó utilizando una curva estándar, construida mediante la extracción de ARN de cinco
diluciones decimales de medio enriquecido con concentraciones conocidas de virus infeccioso [51 ].
Detección de típicoA. pleuropneumoniaelesiones y evaluación

histológica de los pulmones
Después de sacrificar a los cerdos, se prestó especial atención durante la necropsia a los cambios
patomorfológicos en el tracto respiratorio. El tipo y tamaño de las lesiones pulmonares se registraron en
un dibujo pulmonar y se calcularon las proporciones de la superficie pulmonar afectada. Lesiones
necrohemorrágicas, típicas deA. pleuropneumoniae,fueron detectados macroscópicamente y confirmados
histológicamente. Se contó el número total de cerdos con estas lesiones y se presentó como número total
y porcentaje de cerdos con lesiones típicas.A. pleuropneumoniaelesiones
Para la evaluación histológica de los pulmones, 6 muestras de tejido por cerdo de ubicaciones predefinidas en
los pulmones (lóbulo craneal, cardial y caudal del lóbulo izquierdo y derecho) se fijaron en formalina, se
procesaron y se incluyeron en parafina. Las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE) y una
evaluación histopatológica semicuantitativa de los portaobjetos teñidos con HE abarcó la extensión de la
neumonía en las ubicaciones predefinidas de los pulmones. La evaluación anatomopatológica incluyó 4
características: (1) la presencia de alteraciones focales o difusas con neumonía o atelectasia intersticial o catarral,
(2) la extensión de la infiltración de septos alveolares con células mononucleares (3) la extensión de la infiltración
de células mononucleares en el perivascular/

área peribronquiolar y (4) pleuritis. Se utilizó una puntuación histológica de 0 a 3 para describir la gravedad de los
cambios por característica (es decir, 0 = ningún hallazgo, 1 = manifestación focal leve, 2 = manifestación multifocal
moderada o manifestación difusa, 3 = manifestación difusa grave). Durante el examen histológico, el patólogo
estaba cegado con respecto al tratamiento (Alojamiento e Infección). Se sumaron las puntuaciones de los 6
portaobjetos por pulmón para obtener unapuntaje histológico general, que podría sumar un máximo de 72
puntos por cerdo (6 portaobjetos por cerdo, 4 características histológicas y una puntuación máxima de 3 por
característica). Elpuntuación total de los componentes intersticialespor cerdo también se calculó y presentó por
separado, ya que se considera que estos cambios en los pulmones están relacionados con la infección por PRRSV [
52 –55 ]. Esta puntuación podría alcanzar un máximo de 18 (6 portaobjetos por pulmón, 1 característica histológica
y puntuación máxima de 3).
Re-aislamiento deA. pleuropneumoniae

Para el reaislamiento deA. pleuropneumoniae,Se tomaron dos muestras de tejido pulmonar de ubicaciones
pulmonares predefinidas (lóbulo craneal, lóbulo dorsal caudal) y muestras de ganglios linfáticos bronquiales.
Cuando se presentaba una lesión pulmonar macroscópicamente visible en una localización diferente a las
descritas anteriormente, se tomaba una tercera muestra. Los tejidos pulmonares y de ganglios linfáticos
bronquiales recogidos se prepararon, se trituraron y se sembraron en placas SB+NAD como se describe en [56 ,57
]. Para confirmar que las colonias eranA. pleuropneumoniaeserotipo 2, la dependencia de NAD se probó
comparando el crecimiento, en placas SB y SB+NAD seguido de aglutinación con antisuero de conejo hiperinmune
específico de serotipo 2 [57 ].
análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con SAS (SAS 9.3, SAS Institute Inc.). El experimento fue diseñado
principalmente para probar el efecto de la gestión de viviendas (enriquecidas versus estériles) sobre la
susceptibilidad a enfermedades. Los controles con infección simulada se usaron para asegurarse de que los
procedimientos para infectar a los cerdos por sí solos no causaran ninguna diferencia. El análisis estadístico
preliminar (modelo lineal general, GLM) no mostró diferencias en el resultado (patología, temperatura rectal,
crecimiento y variables BALF) entre los cerdos con infección simulada y los controles negativos. Por lo tanto,
estos grupos se combinaron y se denominaron "grupo de control".
Para todos los datos, excepto la aparición de lesiones pulmonares (ver más abajo), se utilizaron modelos lineales mixtos. El
comportamiento y las lesiones cutáneas se analizaron con el corral como unidad de observación, ya que los comportamientos y las
lesiones cutáneas de los cerdos individuales dentro de un grupo no son independientes. Todas las demás variables se analizaron con
el cerdo anidado en el régimen de estabulación como unidad de observación.
Las diferencias entre las variables en un momento específico (es decir, el comportamiento y las lesiones cutáneas el
día anterior al destete, el crecimiento, las puntuaciones histológicas y las células BALF) se analizaron con el alojamiento y,
si correspondía, con la infección y la interacción entre el alojamiento y la infección como efectos fijos. y sembrar como
efecto aleatorio.
Las diferencias entre las variables dependientes del tiempo (es decir, comportamiento y lesiones cutáneas después del
destete, comportamiento de enfermedad, ARN viral, leucocitos, temperatura rectal) se analizaron con el día como efecto
repetido usando la declaración repetida de SAS (SAS 9.3, SAS Institute Inc.) con el autorregresivo estructura de covarianza.
Se utilizaron como efectos fijos el día, el alojamiento y, en su caso, la infección y sus interacciones y la siembra como efecto
aleatorio.
Los efectos del alojamiento sobre el comportamiento y las lesiones cutáneas se analizaron por separado para el día
anterior al destete, porque los cerdos se mezclaron en otros grupos después del destete, lo que dio lugar a una
composición de grupo diferente para el día posterior al destete, el día anterior al transporte y el día posterior al
transporte. Si fue necesario, las variables se transformaron en raíces cuadradas para obtener residuos normalmente
distribuidos. En caso de que el efecto de interacción para una variable fuera significativo, se utilizó la prueba post-hoc con
ajuste de Bonferroni.

Diferencias entre cerdos BHI y EHI en la aparición deA. pleuropneumoniae lesiones pulmonares (es
decir, lesiones pulmonares presentes o ausentes) y en caso de reaislamientoA. pleuropneumoniaefueron
analizados con un modelo lineal mixto generalizado (procedimiento GLIMMIX en SAS), con enlace logit y
distribución binaria con vivienda como efecto fijo y cerda como efecto aleatorio. Aquí, se presentan
razones de probabilidad (OR) para indicar el alcance del efecto.
Resultados
Comportamiento y lesiones cutáneas antes de la coinfección
Antes del destete, los cerdos BH mostraron 2,3 veces más manipulación oral de otros cerdos (es decir, cerdas y
lechones), 2,5 veces más montajes y 5,4 veces más manipulación de los accesorios del corral que los cerdos en
estabulación enriquecida (EH) (Fig. 1A, 1B y 1D ). agresión (Figura 1C ), comportamiento social (0,61
Fig 1. Comportamiento de cerdos BH y EH (frecuencias/cerdo/10min, media±Error estándar). (A) Manipulación oral. (B) Montaje. (C) Agresión.
(D) Pluma de manipulación. Barras azules: cerdos BH, barras rojas: cerdos EH. W-1 y W+1: días antes y después del destete. T-1 y T+1: días
antes y después del transporte. La línea vertical punteada negra indica el análisis estadístico separado del día anterior al destete. HxD: efecto
de interacción vivienda-día. Los efectos de día se indican como 'a'-'c', las barras sin un superíndice común difieren significativamente (p<0,05).
(A) Comparación post hoc del efecto vivienda en T-1, ***: p<0,001.
doi:10.1371/journal.pone.0161832.g001

±0,07 vs. 0,56±0,13 veces/cerdo/10 min, p = 0,72) y jugar (0,35±0,18 vs. 0,50±0,20 veces/
cerdo/10 min, p = 0,59) no difirió entre cerdos BH y EH antes del destete .
Después del destete, la manipulación oral se vio afectada por el alojamiento, el día y su interacción (Figura 1A ). En
general, los cerdos BH mostraron más manipulación oral en comparación con los cerdos EH. El análisis post hoc reveló que
los cerdos BH mostraron una frecuencia 5,6 veces mayor de manipulación oral el día antes del transporte (Figura 1A ). La
monta también se vio afectada por el alojamiento, con frecuencias más altas para los cerdos BH que para los EH, y el día (
Figura 1B ). La manipulación del corral se vio afectada por el alojamiento con frecuencias más altas para los cerdos BH que
para los EH, y el día (Figura 1D ). El comportamiento social se vio afectado por el día (p = 0,02), pero no por el alojamiento
(BH: 0,19±0,05 vs EH: 0,15±0,03 veces/cerdo/10 min, p = 0,41) o la interacción (p = 0,32). El alojamiento (p = 0,60) y el día (p
= 0,18) no afectaron significativamente el comportamiento de juego (BH: 0,18±0,09 vs. EH: 0,13±0,05 veces/cerdo/10 min).
Antes del destete, las puntuaciones de las lesiones cutáneas no difirieron significativamente entre los cerdos BH y EH (Figura
2 ). Después del destete, las puntuaciones de las lesiones cutáneas en la parte frontal del cuerpo solo se vieron afectadas por el
día (Figura 2A ). Los cerdos BH tenían más lesiones en la piel en la parte media y trasera de sus cuerpos después del destete que
los cerdos EH (Fig. 2B y 2C ).
ARN viral en suero

ARN viral expresado como log10 TCID50eq/ml se vio afectado por el día y la interacción vivienda x día (Fig. 3 ). El
análisis post hoc reveló que 4 días después de la infección por PRRSV (ID4), la cantidad de ARN viral aumentó por
igual en los cerdos BHI y EHI en comparación con el día ID0, mientras que en ID8 el ARN viral fue
significativamente menor en los cerdos EHI en comparación con los cerdos BHI (Fig. 3 ). No se encontraron
diferencias en la carga viral entre los dos grupos en ID10 e ID11 (Fig. 3 ).
lesiones pulmonares
El resultado más destacable fue el impacto del tratamiento en el alojamiento sobre el número de
cerdos conA. pleuropneumoniaelesiones Estas lesiones se caracterizaron por una pleuroneumonía
necrohemorrágica (multi)focal, que se observó macroscópicamente y se confirmó histológicamente.
Más cerdos BHI (8 de 14, 57 %) que cerdos EHI (1 de 14, 7,1 %) desarrollaron lesiones (OR = 19,2, p =
0,048). En 5 cerdos BHI y 1 cerdo EHI,A. pleuropneumoniaese volvió a aislar con éxito, pero esta
diferencia no fue significativa (p>0.10).
Para abordar aún más el alcance de la coinfección en la morfología pulmonar, se realizó una evaluación histológica
más amplia de las muestras de pulmón. En los cerdos BHI, la puntuación de tejido pulmonar anatomopatológico (es decir,
la puntuación histológica general) fue significativamente mayor (2,1 veces,Figura 4A ), lo que significa que la extensión del
tejido alterado fue mayor y que se observaron más exudados catarral-purulentos en los alvéolos, cambios fibrinosos o
necrohemorrágicos y pleuritis fibrinosa en comparación con los cerdos EHI. Además, los cambios intersticiales (es decir, la
puntuación total de los componentes intersticiales) con un aumento de la infiltración de células linfomonocíticas
peribronquiolares y perivasculares aumentaron significativamente en los pulmones de los cerdos BHI en comparación con
los cerdos EHI (2,8 veces,Figura 4B ).
Comportamiento de enfermedad
Durante las inspecciones diarias a lo largo del experimento, no se detectaron problemas respiratorios o de tos en ninguno
de los grupos que indicaran la aparición de problemas respiratorios. El comportamiento de enfermedad se abordó
analizando el comportamiento activo, acostado y de comer y beber de los animales. Se observó un efecto de vivienda
general para la actividad, pero no para los niveles de descanso o el comportamiento de comer y beber, como se muestra
enFigura 5A–5C . Se observó una interacción día-vivienda en la actividad y la conducta de acostarse, pero no para la
conducta de comer y beber. Se observó un efecto de día en todos los comportamientos (Figura 5A–5C ), lo que indica la
diferencia de comportamiento en ID9 en comparación con los otros días. Las comparaciones post hoc revelaron que los
cerdos BHI eran menos activos y pasaban más tiempo

Fig. 2. Puntuaciones de lesiones cutáneas (media de una escala de cuatro puntos)±Error estándar). (A) Frente. (B) Medio. (C) Parte trasera del cuerpo.
Barras azules: cerdos BH, barras rojas: cerdos EH. W-1 y W+1: días antes y después del destete. T-1 y T+1: días antes y después del transporte. La línea
vertical punteada negra indica el análisis estadístico separado del día anterior al destete. HxD: efecto de interacción vivienda-día. Los efectos de día se
indican como 'a' y 'b', las barras sin superíndice común difieren significativamente (p<0,05).
mintiendo que cerdos EHI al día siguienteA. pleuropneumoniaeinfección (ID9) (Fig. 5A y 5B ). Todos los cerdos
pasaron menos tiempo visitando el bebedero y el comedero al día siguiente.A. pleuropneumoniae infección
(ID9) en comparación con los otros tres días, como se muestra enFigura 5C .

Fig 3. PRRSV qRT-PCR en suero de cerdos BHI y EHI (medias±Error estándar).Infecciones en ID0 e ID8 con PRRSV yA. pleuropneumoniae
se indican como líneas verticales negras. HxD: efecto de interacción vivienda-día.* Comparación post hoc del efecto vivienda en ID8
(p<0,05).
Temperatura rectal y crecimiento

El alojamiento, el día y su interacción afectaron las temperaturas rectales de los cerdos infectados (higo 6 ). Las
comparaciones post hoc mostraron un aumento en la temperatura rectal (de 0,7 °C en promedio) después de la infección
por PRRSV en cerdos BHI y EHI (promedio de 39,5 °C en ID0 a 40,2 °C en ID2(2),higo 6 ). La temperatura rectal promedio
disminuyó nuevamente en ID3 en ambos grupos de manera similar. DespuésA. pleuropneumoniaeinfección (en ID8(1)) de
nuevo, los cerdos BHI y EHI mostraron una temperatura máxima similar a las 4 horas después de la infección (ID8(2)). En
los cerdos BHI, la temperatura rectal permaneció elevada durante 24 horas, mientras que en los cerdos EHI, la temperatura
rectal disminuyó más rápido (en 12 horas) (higo 6 ). En los grupos de control, las temperaturas generales fueron en
promedio 0,16 °C más altas en los cerdos BHC en comparación con los cerdos EHC (p = 0,002).

Fig. 4. Histología global (A) y puntuación del componente intersticial total (B).El cuadro azul central indica el límite inferior y superior en el
cuantil 25%/75% de los datos. La línea roja central indica la mediana de los datos. Dos líneas verticales que se extienden desde el cuadro
central indican los datos restantes fuera del cuadro central que no se consideran valores atípicos. Los valores atípicos se indican como cruces
rojas. ***: p<0,001; *: p<0,05.
Los cerdos BHI y EHI mostraron una menor tasa de crecimiento (p<0,001) en el período posterior a la
infección por PRRSV (BHI: 538,8 ± 48,3 g/día; EHI: 594,9 ± 49,3 g/día) en comparación con los grupos
control (BHC: 714,2 ± 33,7 g/día; EHC: 715,3 ± 35,0 g/día). Tasa de crecimiento en el período posteriorA.
pleuropneumoniaela infección también fue menor en los cerdos infectados (BHI: cerdos 371 ± 29,8 g/día
vs BHC: cerdos 725 ± 79,4 g/día y EHI cerdos: 447,6 ± 43,9 g/día vs EHC cerdos: 775 ± 64,6 g/día ;p<0,001).

Fig 5. Comportamiento de enfermedad (media (% de exploraciones)±error estándar) de cerdos BHI y EHI. (A) Actividad. (B)
Comportamiento mentiroso. (C) Comer y beber. PRRSV (ID0) yA. pleuropneumoniae (ID8) las infecciones se indican como líneas
verticales negras. HxD: efecto de interacción vivienda-día. Los efectos de los días se indican como 'a' y 'b', los días sin un
superíndice común difieren significativamente (C) (p<0,05). Comparación post hoc en ID9, ***: p<0,001 (A), **: p<0,01 (B).

Fig 6. Temperatura rectal (media±error estándar) de cerdos BHI y EHI.Los días de infección (ID0 e ID8) se indican como líneas
verticales negras. HxD: efecto de interacción vivienda-día. 'a' indica temperaturas más altas en ID2(2) e ID8(2) en comparación con
otros días (ambos p<0,001). Comparación post hoc en ID9(1) e ID9(2): **: p<0,01 y *: p<0,05.
Recuentos de glóbulos blancos
Los recuentos totales de glóbulos blancos (WBC) y linfocitos fueron significativamente elevados en el suero de los cerdos
EHI en comparación con los cerdos BHI, pero este efecto de alojamiento general no se observó en las otras poblaciones
celulares (figura 7 , no se muestran los resultados de la memoria y las células T vírgenes). Todas las poblaciones celulares
mostraron un efecto de día global. Para granulocitos, monocitos y células T de memoria también se encontró un efecto de
interacción entre el alojamiento y el día. Las comparaciones por pares post hoc mostraron que los recuentos de
granulocitos aumentaron significativamente en los cerdos BHI entre ID8 e ID9 (p<0,001,Figura 7C ), pero no en cerdos EHI.
Poblaciones de células broncoalveolares

La vivienda afectó profundamente la composición celular del BALF en cerdos infectados. Se midió un
aumento en el porcentaje de granulocitos (1,7 veces) y linfocitos T (6 veces) en el líquido pulmonar en
ambos grupos infectados (cerdos BHI y EHI) en comparación con sus respectivos grupos de control (BHC y
EHC,Tabla 4 ). Especialmente la cantidad relativa de CD8+CD4-(células T citotóxicas, 11,5 veces) y CD4+CD8+
(células T activadas/de memoria, 8,7 veces) aumentó en comparación con los cerdos de control, mientras
que una disminución relativa de CD14+se observaron macrófagos (1,2 veces) (Tabla 4 ). También un
cambio significativo en la expresión (MFI) de los marcadores fenotípicos CD14 (arriba), CD163 (abajo) y
TLR4+(abajo) se midió después de la infección en ambos grupos (Tabla 4 ).
Se observó un efecto de alojamiento general para CD172a+/TLR4+macrófagos (p = 0,02). El análisis del efecto
de alojamiento en animales infectados y de control por separado mostró que los cerdos BHC tenían porcentajes
más altos de TLR4+y CD172a+/TLR4+macrófagos en comparación con cerdos EHC (Tabla 4 , p = 0,02 y p = 0,01
respectivamente).
Discusión
El uso del enriquecimiento ambiental se ha propuesto repetidamente para mejorar el bienestar de los animales de granja.6 ,8 ,21 ].
Nuestro estudio confirma una disminución del comportamiento relacionado con el estrés y una disminución de las puntuaciones
de lesiones cutáneas en cerdos que recibieron materiales de enriquecimiento, lo que indica una mejora

Fig. 7. Números absolutos de recuentos de células sanguíneas en cerdos BHI y EHI (promedio±Error estándar). (A) CMB. (B) Linfocitos. (C)
Granulocitos. (D) Monocitos. (E) Células T citotóxicas. (F) Células NK. Los momentos de contagio se representan como líneas verticales negras.
HxD: interacción vivienda-día. 'a' indica un aumento significativo entre ID8 e ID9 en cerdos BHI (comparación post hoc, p<0,05).
bienestar, y simultáneamente muestra que la vivienda enriquecida reduce significativamente la susceptibilidad a la

enfermedad a la coinfección con PRRSV yA. pleuroneumonía,expresado como una reducción de los signos clínicos
e histopatológicos, de los cuales la diferencia de ocho veces en el porcentaje de cerdos con

Tabla 4. Marcadores fenotípicos de células BALF (porcentajes medios y MFI±Error estándar).

tipos de células fenotipo BHI EHI BHC EHC Efecto de infección
% % % %
Granulocitos Granulocitos 2.45±0.54 2.44±0.36 1.42±0.29 1.49±0.22 0.004
linfocitos
Células T T citotóxicas auxiliares T CD3+ 11.87±1.74 11.51±1.08 2.15±0.18 1.78±0.26 <0.001
CD4+CD8- 2.76±0.48 2.49±0.26 1.21±0.13 0.85±0.12 <0.001
CD8+CD4- 7.53±1.62 7.43±0.84 0.78±0.08 0.52±0.06 <0.001
Memoria T CD4+CD8+ 0.3±0.07 0.22±0.03 0.04±0.01 0.02±0 <0.001
NK CD3-CD8+ 0.21±0.04 0.19±0.03 0.08±0.01 0.05±0.01 <0.001
Macrófagos % % % % %
CD14+ 67.76±4.21 74.76±2.72 89.38±0,92 88.56±0.97 <0.001
CD172a+ 68.7±4.21 74.96±2.72 88.7±0,92 88.14±0.89 <0.001
SLA II-RD+ 63.62±5.01 68.89±3.21 88.63±0.88 88.39±0.86 <0.001
CD163+ 56.46±5.97 65.06±2.87 87.34±0.94 86.38±0,95 <0.001
TLR4+ 51.27±4.48 47.75±2.76 62.07±3.48 50.8±2.73 0.05
CD172a+/TLR4+ 41.83±4.31 37.97±2.15 54.98±6.56 42.74±2.35 0.01
Macrófagos IMF IMF IMF IMF IMF
CD14+ 165.22±10.74 172.15±6.38 150.34±6.69 143.67±4.29 0.01
CD172a+ 377.44±41.34 325.22±17.36 400.72±35.06 355.41±13.19 0.30
SLA II-RD+ 274.74±25.36 263.15±26.23 339.34±47.47 284.96±16.04 0.10
CD163+ 750.32±82.29 775.58±59.62 940.35±66.42 895.18±68.8 0.01
TLR4+ 456.79±51.45 452.3±48.25 738.73±77.88 707.51±62.54 <0.001
MFI: Intensidad media de fluorescencia; BALF: Líquido de lavado broncoalveolar
lesiones pulmonares fue la más notable. La mayoría de los estudios sobre la relación entre el estrés y la aparición de los síntomas de
la enfermedad utilizan condiciones que aumentan el estrés, como el calor o el frío, el hacinamiento, el ejercicio forzado, el estrés
social, el transporte, la restricción/inmovilización, el aprendizaje por evitación, el aislamiento u otras situaciones estresantes (a
menudo a corto plazo). ) eventos de la vida [1 ]. En este estudio utilizamos el enriquecimiento social y ambiental, aplicado desde el
nacimiento en adelante, para facilitar de forma duradera el desarrollo y la exhibición de un comportamiento natural (social) en
contraste con las 'condiciones de los sistemas de cría convencionales' donde las necesidades de comportamiento de los cerdos no se
satisfacen adecuadamente.
En nuestro experimento, garantizamos una carga patógena fecal constante mediante la eliminación diaria de las heces
de todos los corrales. También se excluyó la contaminación con otros patógenos ya que todos los materiales que servían
como enriquecimiento se reponían diariamente y se eliminaban los gérmenes mediante irradiación γ. Entonces, a pesar de
las mismas dosis infecciosas de ambos patógenos, los cerdos en el régimen de alojamiento enriquecido fueron mejores en
la prevención de la manifestación clínica de la coinfección, lo que resultó en mucho menos cerdos con lesiones pulmonares
y daño tisular patológico menos severo en los pulmones, en comparación con los cerdos BHI. . El daño histopatológico más
severo en los pulmones de los cerdos BHI también coincidió con las lecturas clínicas más pronunciadas en estos cerdos en
términos de temperatura rectal, comportamiento de enfermedad, así como la reacción inflamatoria más pronunciada de
diferentes recuentos de células sanguíneas despuésA. pleuropneumoniaeinfección. En el BALF, el aumento relativo de las
poblaciones de granulocitos y linfocitos y la disminución de los macrófagos después de la infección fue similar en los
cerdos BHI y EHI, lo que indica que el alojamiento no causó diferencias en las respuestas inmunológicas dentro del lóbulo
pulmonar craneal derecho, en el que no detectamos las típicas.A. pleuropneumoniaelesiones
Otro hallazgo notable fue la eliminación viral más rápida en los cerdos EHI en comparación con los cerdos BHI. Tanto
los cerdos BHI como los EHI mostraron un aumento similar del ARN viral en el suero 4 días después de la infección, lo que
concuerda con otros estudios en cerdos infectados con las cepas LV-Ter Huurne del serotipo 1 de PRRSV.

[51 ]. Esto indica que la infección por PRRSV inicialmente afectó a ambos grupos de manera similar. La curva de suero de
ARN viral de cerdos BHI siguió a las descritas anteriormente [51 ], mientras que los cerdos EHI pudieron reducir el ARN
viral en suero más rápido, con un nivel estadísticamente más bajo 8 días después de la infección por PRRSV. Entonces, en el
momento deA. pleuropneumoniaeinfección Los cerdos BHI todavía tenían niveles séricos virales más altos de PRRSV,
mientras que en los cerdos EHI ya estaban reducidos. El impacto inflamatorio de PRRSV en los pulmones de los cerdos BHI
también fue mayor. La infección por PRRSV en los pulmones se caracteriza histológicamente por engrosamiento septal por
macrófagos y manguitos perivasculares.53 ,54 ]. Los cerdos BHI mostraron puntajes más altos de infiltrados
peribronquiolares y perivasculares en comparación con los cerdos EHI después de la muerte, lo que representa la
contención más efectiva de la infección por PRRSV por parte de los cerdos EHI, que sin embargo no resultó en diferencias
en el nivel de temperatura o el comportamiento de la enfermedad el período entre PRRSV yA. pleuropneumoniaeinfección
(ID1-ID8).
Se supone que PRRSV amortigua las respuestas inmunitarias tanto innatas como específicas, ya que la
infección por PRRSV altera la producción de citoquinas de macrófagos y células dendríticas derivadas de
monocitos, y modifica la expresión de moléculas involucradas en la presentación de antígenos.34 ,54 ,55 ]. Como
consecuencia, la activación de las células NK y la movilización de las células del brazo adquirido del sistema
inmunitario se retrasan.34 ]. La eliminación más rápida de PRRSV en cerdos EHI podría haber disminuido el
impacto de la infección secundaria por A.pleuropneumoniaeinfección que siguió en ID8 en nuestro experimento.
Además, encontramos niveles generales más altos de glóbulos blancos, así como niveles más altos de linfocitos en cerdos EHI
en comparación con cerdos BHI. Se ha descubierto previamente que la ropa de cama de paja profunda influye en las variables
relacionadas con la inmunidad (innata), así como con la fisiología del estrés, en comparación con una vivienda relativamente estéril.
33 ]. Las diferencias en las variables relacionadas con la inmunidad posiblemente influyan en el estado de salud y las respuestas a las
infecciones en los cerdos. En contraste con nuestros resultados, los cerdos alojados enriquecidos en este estudio anterior tenían
WBC más bajos que los cerdos alojados estériles [33 ]. Una posible explicación para el resultado contrastante en comparación con el
estudio anterior puede relacionarse con las diferencias en el punto de partida y la duración del enriquecimiento proporcionado, la
edad a la que se probaron los animales y el tipo de enriquecimiento utilizado. En nuestro estudio, la diferencia en la crianza de los
cerdos BH y EH comenzó directamente después del nacimiento e incluyó también el enriquecimiento social, es decir, la mezcla con
otra camada en una etapa temprana de la vida. No consideramos que el nivel general de glóbulos blancos más alto sea el resultado
de una infección, pero no podemos excluir que los cerdos EHI hayan sido desafiados con microbios ambientales, aunque todos los
materiales de enriquecimiento se descontaminaron. Las posibles explicaciones de nuestras diferencias encontradas en los niveles
generales y las respuestas después de las infecciones de los recuentos de glóbulos blancos siguen siendo desconocidas en este
momento.
Se considera que las células T citotóxicas y las células NK desempeñan un papel en la eliminación viral.58 ]. Se sugiere
que las respuestas inmunitarias mejoradas después de la infección por PRRSV pueden conducir a una enfermedad clínica
más grave y una patología macroscópica, pero también respaldan una mayor eliminación viral.51 ,58 –60 ]. Sin embargo,
no encontramos diferencias en los hallazgos clínicos o las respuestas inmunológicas entre los cerdos alojados estériles y
los cerdos alojados enriquecidos directamente después de PRRSV (ID1 a ID8).

La disminución relativa de macrófagos pulmonares en BALF en los grupos EHI y BHI probablemente se deba a
la entrada de linfocitos y granulocitos, pero también está en consonancia con el efecto destructivo propuesto a
menudo del PRRSV sobre los macrófagos pulmonares. Se sugiere que este efecto destructivo de los macrófagos
haría que los pulmones fueran más susceptibles a infecciones secundarias.61 ].
Los cerdos de control alojados estériles mostraron porcentajes más altos de TLR4+y CD172a+/TLR4+
macrófagos en comparación con los cerdos EHC. Los animales de control se refieren a diferencias en el
régimen de alojamiento sin infección, oa la situación previa a la infección. TLR4+es una parte esencial del
complejo de unión al receptor LPS (lipopolisacárido) [62 ]. Otros componentes de este complejo son la
proteína de unión a CD14 y LPS (LBP). TLR4+es estimulado por LPS de bacterias gramnegativas y proteína
de fusión (F) del virus respiratorio sincitial (RSV) [63 ] y se une al complejo CD14-LPS formado
anteriormente [64 ]. Estimulación de TLR4+puede inducir respuestas potentes como

daño inducido por sepsis e inflamación por liberación de citocinas proinflamatorias. El menor porcentaje de
macrófagos con TLR4+marcadores en cerdos EHC, puede estar relacionado con una menor sensibilidad de los
macrófagos alveolares para LPS en los cerdos EH en comparación con los cerdos BH. Esto puede ser de interés al
estudiar las vías complejas que se encuentran detrás de las diferentes respuestas clínicas a la coinfección de los
dos regímenes de alojamiento.
Nuestra observación del comportamiento demuestra que una combinación de sustrato de enraizamiento,
enriquecimiento social y un tamaño de corral más grande disminuye el comportamiento relacionado con el estrés, como el
comportamiento de montaje y las manipulaciones orales dirigidas a los compañeros de corral y al corral en sí, lo cual está
en línea con nuestras expectativas y como se describe en párrafos anteriores. estudios [6,19,54,57–61 ]. Aunque se
considera que la ocurrencia de actividades manipulativas dirigidas a los compañeros de corral refleja una limitación en la
realización de conductas exploratorias normales, como hozar, masticar sustrato o buscar comida.54,57,61], también podría
considerarse como una estrategia para hacer frente al estrés [62 ]. Las diferencias de comportamiento entre los cerdos BH
y EH en este estudio también fueron indicadas por las puntuaciones de las lesiones cutáneas. Se ha descubierto
previamente que la participación en peleas recíprocas produce lesiones en el tercio anterior del cuerpo, mientras que
recibir intimidación (por ejemplo, peleas unilaterales) provoca lesiones en el tercio caudal del cuerpo [sesenta y cinco ]. En
general, se observó un mayor montaje y manipulación de otros cerdos en cerdos estériles alojados, y puntuaciones más
altas de lesiones en la piel, especialmente en la parte media y trasera del cuerpo después del destete, lo que indica más
intimidación [53 ]. El tamaño más pequeño del corral podría haber inhibido la retirada de los cerdos acosados
(posibilidades limitadas de huir para evitar batallas jerárquicas), causando más lesiones en la piel en los cerdos BH,
especialmente en la parte media y posterior. Los cerdos EH en nuestro estudio también podrían haber desarrollado
mejores habilidades sociales, como una reacción más adecuada a la amenaza, más flexibilidad en el uso de la agresión en
los conflictos y el desarrollo de comportamientos sumisos.66 ] durante el período de mezcla previo al destete en
comparación con cerdos BH que se enfrentaron con cerdos totalmente nuevos después del destete. Otros estudios han
demostrado que las diferencias de comportamiento entre cerdos en condiciones de alojamiento estériles y enriquecidas
también se reflejan en las mediciones de la fisiología del estrés, como la (re)actividad del eje HPA [9 ,11 ,33 ], lo que indica
que los cerdos BH probablemente también estaban más desafiados (estrés) fisiológicamente.
En nuestro estudio, el enriquecimiento estimuló psicológicamente a los cerdos EH de manera diferente en comparación
con los cerdos alojados estériles y disminuyó el estrés (crónico) en los animales. El estrés crónico en general se considera
un factor de influencia potencial en la susceptibilidad a la enfermedad, sin embargo, las vías complejas que median los
efectos del estrés en las enfermedades infecciosas no se comprenden completamente.1 ]. El mejor estado psicofisiológico e
inmunológico de los cerdos EH probablemente afectó positivamente sus respuestas inmunitarias e inflamatorias [67 –71 ],
y de esta manera, disminuyó la manifestación clínica. Nuestros resultados también están en línea con la creciente evidencia
epidemiológica en humanos y otras especies de que las adaptaciones inducidas por el medio ambiente, que ocurren en
etapas cruciales de la vida, pueden cambiar potencialmente el comportamiento, la susceptibilidad a la enfermedad y la
supervivencia, también conocidos como los "orígenes tempranos de la susceptibilidad a la enfermedad del adulto".
hipótesis [4 ,72 ].
En conclusión, la crianza enriquecida conduce a un inicio y resultado menos severos de un PRRSVA.

pleuropneumoniaeco-infección. Los cerdos alojados enriquecidos mostraron un impacto de infección
notablemente reducido y eran menos propensos a desarrollar signos clínicos de enfermedad. Encontramos más
apoyo para la implementación de estrategias de intervención psiconeuroinmunológica para reducir el impacto
de las enfermedades infecciosas y, por lo tanto, reducir el uso de antibióticos. La investigación futura debe
investigar las posibles vías fisiopatológicas explicativas involucradas.
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a Rob Zwart por realizar el análisis FACS, a Pieter Roskam y Ralf Kok
por ayudar en el examen patológico, a Conny van Solt-Smits por ayudar en los exámenes
bacteriológicos, a Ditta Popma-de Graaf por ayudar en los exámenes virológicos, a Dirk

Anjema por ayudar en los procedimientos de infección experimental, a todos los cuidadores de
animales del departamento de Tecnología Animal de CVI, Mieneke van Dixhoorn, Annemarie Rebel y
Johanna Motteram por revisar críticamente y corregir el manuscrito.
Contribuciones de autor
Conceptualización:ID BK JEB PGK NSZ.
Análisis formal:DNI IR JEB JM.
Adquisición de fondos:Identificación NSZ.
Investigación:Identificación JM HW NSZ.
Metodología:ID JEB BK PGK NSZ.
Administración de proyecto:Identificación NSZ.
Recursos:NSZ HW.
Supervisión:ID NSZ PGK BK.
Visualización:identificación IR.
Redacción – borrador original:ID IR JEB JM NSZ.
Redacción – revisión y edición:ID IR JEB HW BK PGK NSZ.
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NEJMra0708473 IDPM:18596274

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El alojamiento enriquecido reduce la

Citación:van Dixhoorn IDE, Reimert I, Middelkoop J,

corrales enriquecidos se introdujo una combinación de factores de enriquecimiento social y ambiental

Fondos:Este trabajo fue financiado por el Ministerio

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 1 / 24

suprarrenal; BH, estéril alojado; EH, alojamiento enriquecido; cerdos.

Enriquecidos; ID1 t/m ID11, Día de la infección; HEPA, aire

carnero; placa NAD, placa de dinucleótido de nicotinamida y

receptor tipo Toll; GLM, modelo lineal general; SEM, Error

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 2 / 24

Diseño experimental, animales y alojamiento.

llegar a 22°C, la semana anterior al destete.

Tabla 1. Configuración experimental y nombres de grupos.

Estéril BH BHI 14 PRRSV / Aplicación 2

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 3 / 24

de luchas, latencia a la primera lucha, número de vocalizaciones y latencia a la primera

Observaciones de comportamiento y lesiones cutáneas.

manipular pluma Mordisquear, chupar o masticar los componentes del bolígrafo

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 4 / 24

estaban (aparentemente) bebiendo y comiendo).

Temperatura rectal, examen clínico, crecimiento

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 5 / 24

Fenotipado de glóbulos blancos y poblaciones de células broncoalveolares

Tabla 3. Paneles de anticuerpos para FACS.

Antígeno Clon isotipo fluorocromo Etiquetado Fuente de anticuerpo

CD4 74-12-4 IgG2b FITC Secundario1 biotecnología del sur

CD8α 76-2-11 IgG2a EDUCACIÓN FÍSICA Secundario1 biotecnología del sur

Células BALF Triple tinción

CD4 74-12-4 IgG2b FITC Secundario1 biotecnología del sur

CD8α 76-2-11 IgG2a EDUCACIÓN FÍSICA Secundario1 biotecnología del sur

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 6 / 24

Detección de ARN viral en suero

Detección de típicoA. pleuropneumoniaelesiones y evaluación

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 7 / 24

Re-aislamiento deA. pleuropneumoniae

el cerdo anidado en el régimen de estabulación como unidad de observación.

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 8 / 24

Comportamiento y lesiones cutáneas antes de la coinfección

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 9 / 24

los cerdos EH (Fig. 2B y 2C ).

ARN viral en suero

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 10 / 24

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 11 / 24

Temperatura rectal y crecimiento

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 12 / 24

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 13 / 24

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 14 / 24

Recuentos de glóbulos blancos

Poblaciones de células broncoalveolares

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 15 / 24

bienestar, y simultáneamente muestra que la vivienda enriquecida reduce significativamente la susceptibilidad a la

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Tabla 4. Marcadores fenotípicos de células BALF (porcentajes medios y MFI±Error estándar).

MFI: Intensidad media de fluorescencia; BALF: Líquido de lavado broncoalveolar

pulmonar craneal derecho, en el que no detectamos las típicas.A. pleuropneumoniaelesiones

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 17 / 24

los cerdos alojados enriquecidos directamente después de PRRSV (ID1 a ID8).

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 18 / 24

etapas cruciales de la vida, pueden cambiar potencialmente el comportamiento, la susceptibilidad a la enfermedad y la

En conclusión, la crianza enriquecida conduce a un inicio y resultado menos severos de un PRRSVA.

PLOS UNO | DOI:10.1371/journal.pone.0161832 8 de septiembre de 2016 19 / 24

Análisis formal:DNI IR JEB JM.