Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Química
Fisicoquímica de mezclas líquidas
Calorimetría de titulación isotérmica
Chavana Salcedo Elizabeth, Contreras Ordaz Maximiliano, García Hernández Nadia

Calorimetría de titulación isotérmica.

La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es una técnica que se utiliza en los estudios
cuantitativos de una amplia variedad de interacciones biomoleculares. Funciona mediante
la medición directa del calor que se libera o absorbe durante un evento de enlace
biomolecular. 

ITC es la única técnica que puede determinar simultáneamente todos los parámetros de
enlace en un solo experimento. Sin necesidad de modificar los componentes del enlace, ya
sea con marcadores fluorescentes o por medio de inmovilización, ITC mide la afinidad de
los componentes del enlace en sus estados nativos.

La medición de la transferencia de calor durante el enlace permite la determinación exacta

de las constantes de enlace (KD), la estequiometria de la reacción (n), la entalpía (∆H) y la
entropía (∆S). Esto proporciona un perfil termodinámico completo de la interacción
molecular. ITC va más allá de las afinidades de enlace y puede dilucidar los mecanismos
subyacentes en las interacciones moleculares. Esta comprensión más profunda de las
relaciones entre estructura y función permite que se tomen decisiones más confiables para
la selección y optimización de componentes prometedores.

1. Principio del método

La calorimetría de titulación isotérmica se utiliza para medir las reacciones entre

biomoléculas. La metodología permite la determinación de la afinidad de enlace, la
estequiometria y la entropía y entalpía de la reacción de enlace en solución, sin necesidad
del uso de marcadores.
Cuando se produce el enlace, el calor se absorbe o se libera, y esto se mide con un
calorímetro sensible durante la titulación gradual del ligando en la celda de la muestra que
contiene la biomolécula de interés.
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El conjunto de técnicas utilizadas en la determinación de propiedades termodinámicas de

las sustancias, a través de la medición directa de la cantidad de calor asociada a un proceso
o reacción química, constituyen la calorimetría.

La calorimetría se basa en dos principios básicos fundamentales que son: El principio de las
transformaciones inversas : el cual establece que las cantidades de calor intercambiadas al
interior de un mismo sistema son de la misma magnitud pero inversas entre sí, y el
principio de calores intercambiados, el cual explica que en un sistema aislado
adiabáticamente, la cantidad de calor que se transfiere a una parte del sistema es igual a la
cantidad cedida por otra y este efecto es debido exclusivamente a una diferencia de
temperaturas.

Funcionamiento: El núcleo térmico. En el microcalorímetro hay dos celdas, una de las

cuales contienen agua y actúa como celda de referencia, y otra que contiene la muestra. El
microcalorímetro necesita mantener estas dos celdas exactamente a la misma temperatura.
Los dispositivos de detección de calor detectan la diferencia de temperatura entre las celdas
cuando se produce el enlace y retroalimentan a los calentadores, que compensan esta
diferencia y devuelven las celdas a la misma temperatura.

Realización de la medición: La celda de referencia y la celda de la muestra se ajustan a la

temperatura experimental deseada. El ligando se carga en una jeringa, que se encuentra en
un dispositivo de inyección muy preciso. El dispositivo de inyección se inserta en la celda
de la muestra que contiene la proteína de interés. Una serie de pequeñas alícuotas de
ligando se inyecta en la solución de proteínas. Si hay un enlace del ligando a la proteína, se
detectan y se miden los cambios de calor de unas pocas millonésimas de grado centígrado.

Cuando se hace la primera inyección, el microcalorímetro mide todo el calor liberado hasta
que la reacción de enlace alcanza el equilibrio. La cantidad de calor medida es
directamente proporcional a la cantidad de enlace.
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2. Instrumentación

Un calorímetro es un instrumento que sirve para medir la cantidad de calor que libera o
absorbe una muestra en la que ocurre algún evento que refleja las interacciones moleculares
presentes entre los componentes de la muestra. Éste puede ser la unión de una molécula
pequeña (ligando) a una macromolécula (proteína), una reacción química o el cambio
estructural que sufre una proteína cuando se calienta.

Todos los calorímetros constan de los mismos elementos básicos en su diseño y operan con
los mismos principios. Las diferencias entre ellos están en la cantidad de muestra que
requieren y en su precisión.

Figura 1. El Calorímetro de Titulación Isotérmica (CTI) consta de dos

celdas idénticas, la de referencia R que se llena de agua pura y la de la
muestra M que se llena de una solución de proteína P. En la celda M
se coloca una jeringa que contiene una solución de una sustancia L
cuya interacción con la proteína se desea estudiar. El calorímetro
establece una diferencia de temperatura ΔT entre ambas celdas que se
encuentra aisladas del exterior por una chaqueta térmica.

Los elementos básicos de un calorímetro: Un calorímetro de titulación isotérmica tiene dos

celdas idénticas, una de referencia (R) que se llena de agua pura y otra que contiene la
muestra (M). Ambas están colocadas dentro de una “chaqueta térmica” que las aísla del
exterior, evitando así pérdida o ganancia de energía desde el entorno. El calorímetro
establece una diferencia de temperatura (ΔT) muy pequeña, aproximadamente de 0.0001
grados o menos, de tal manera que la medición se realiza a temperatura constante, y de ahí
el empleo de la palabra isotérmico en el nombre del calorímetro. En la celda M se coloca la
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punta de una jeringa que permite inyectar pequeñas cantidades de su contenido.

Típicamente, en la celda M se sitúa una solución de una proteína (P) y en la jeringa una
solución de una sustancia (L) cuya interacción con la proteína se desea estudiar.

Al realizar una primera inyección o titulación, L y P entran

en contacto dentro de la celda M e interaccionan entre sí,
liberando o absorbiendo calor. Así, la celda M se calienta o
se enfría y el ΔT original cambia. El CTI entonces
proporciona energía a la celda que esté a menor
temperatura para recuperar el ΔT original. Esto lo hace a
través de unos dispositivos llamados termopares. De hecho,
lo que el CTI realmente mide no es el cambio de temperatura ΔT sino la potencia (corriente
y voltaje) proporcionada a través de estos dispositivos.

La cantidad de energía que hay que proporcionar para recobrar el ΔT original es igual a la
cantidad de energía que se liberó o absorbió debido a la interacción o unión entre P y L en
esa primera inyección. En subsecuentes titulaciones, la cantidad de energía debida a la
unión de L a P disminuye, ya que la cantidad de P libre en la celda (sin tener a L unido) es
cada vez menor.

Es decir, las áreas de los picos van decreciendo. En un

experimento exitoso, en las últimas titulaciones esta energía
es muy cercana a cero, ya que todas las moléculas de proteína
tienen unido a L. Con un CTI, entonces, la medición se
realiza a temperatura constante, variando la concentración de
la sustancia que esté colocada en la jeringa
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Figura 2. (A) Titulaciones sucesivas de L en la solución de proteína P; (B) cantidad de

energía debida a la interacción entre L y P a diferentes razones molares L/P.

3. Factores que afectan la medición

Este enfoque presenta dos desventajas principales para las técnicas espectroscópicas.
Primero, por razones prácticas en la medición de la constante de asociación, no siempre es
posible cubrir un amplio rango de temperaturas. Segundo, aunque la entalpía y la entropía
son fuertemente dependientes de la temperatura, la dependencia de la energía de Gibbs
usualmente es débil sobre el rango accesible experimentalmente.

Por otra parte el hecho de que el calor es una señal universal también tiene como
consecuencia la debilidad de la técnica de ITC: no proporciona información directa sobre el
mecanismo del proceso de formación del complejo supramolecular a nivel molecular. Así
mismo se debe tener extremo cuidado en la preparación de muestras, la conducción de
experimentos, el análisis de información y la discusión de resultados, ya que cualquier
proceso de generación de calor adicional (calor de dilución, calor de protonación-
desprotonación, entre otros) contribuirá a los datos experimentales de salida
4. Calibración
La mayor parte de los calorímetros son diseñados de forma que se minimice la transferencia
de calor entre el sistema y los alrededores. La calibración del calorímetro consiste en
determinar la capacidad calorífica que presenta el conjunto de materiales que forman las
distintas partes del calorímetro (vaso calorimétrico, sistema de agitación, dispositivos de
medida de temperatura, recipientes contenedores de reactivos, etc.) y que van a absorber
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una parte de la energía térmica suministrada al sistema. Aceptando que las partes físicas del
calorímetro son siempre las mismas, la capacidad calorífica del calorímetro será una
constante propia de cada instrumento. En general, el calibrar el calorímetro es una
operación necesaria para poder evaluar los cambios energéticos de un proceso o las
capacidades caloríficas de los sistemas, toda vez que los cambios de temperatura asociados
a los procesos vendrán determinados por la naturaleza y cantidad de materia.
5. Avances del método
La calorimetría entró en su época de oro a principios de los años noventa, cuando debido a
los avances tecnológicos y metodológicos, fue posible la medición de pequeñas cantidades
de calor asociadas a interacciones no covalentes entre las moléculas biológicas

6. Usos

ITC es una de las últimas técnicas que se utiliza para caracterizar la afinidad de unión de
los ligandos por las proteínas. ITC es particularmente útil ya que proporciona no solo la
afinidad de unión, sino también la termodinámica de la unión. Esta caracterización
termodinámica permite una mayor optimización de los compuestos.

ITC se utiliza ampliamente en las áreas de descubrimiento y desarrollo de medicamentos

para:

 Cuantificación de la afinidad de enlace

 Selección y optimización de candidatos
 Medición de la termodinámica y la concentración activa
 Caracterización del mecanismo de acción
 Confirmación de objetivos de enlace previstos en el descubrimiento de
medicamentos de pequeñas moléculas
 Determinación de la especificidad y estequiometria del enlace
 Medición de la cinética enzimática
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Referencias.

-Reconocimiento molecular enzimático-

http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/19990/Capitulo1.pdf
-Calor y proteínas-
http://www.revista.unam.mx/vol.16/num1/art02/art02.pdf
-Calorimetría-
https://tesis.ipn.mx/jspui/bitstream/123456789/17744/1/25-1-16777.pdf
. Calorimetría de titulación isotérmica -
https://es.qaz.wiki/wiki/Isothermal_titration_calorimetry