Manual de Lab Bioquímica

CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO
4° SEMESTRE
ENERO-JUNIO 2023
PROFESORA: Dra. en C. Guilda Guzmán Colis

TÉCNICO: Alejandro Organista Esparza
Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/09
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CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

BIOQUÍMICA I
ÍNDICE DE PRÁCTICAS
No. NOMBRE DE LA PRÁCTICA PÁG.

1 Seguridad en el Laboratorio de Bioquímica y formatos en los reportes de las 2
prácticas de laboratorio.
2 Medición de la actividad del ión hidrógeno (pH) en soluciones acuosas. 12
3 Determinación del pKa. 19
4 Preparación de un buffer y su acción amortiguadora. 22
5 Separación de aminoácidos por cromatografía en papel. 25
6 Propiedades físicas y químicas de las proteínas. 27
7 Determinación de proteínas por el método de Biuret. 30
8 Efecto del pH, temperatura y agentes químicos sobre la solubilidad de las 32

proteínas de la leche.
9 Propiedades químicas de carbohidratos. 34
10 Aislamiento de glucógeno hepático. 36
11 Preparación de una curva patrón de glucosa. 38
12 Propiedades químicas de los lípidos y su separación por cromatografía en capa 41

fina.
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PRÁCTICA No. 1
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA Y
FORMATOS EN LOS REPORTES DE LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO
OBJETIVOS
Revisar información importante sobre seguridad en el laboratorio de bioquímica, y sobre la forma de

hacer los reportes de laboratorio, incluyendo la recolección, organización y presentación de datos
experimentales, búsqueda y utilización de la bibliografía pertinente, y contenido esperado de las
diferentes secciones de los reportes de las prácticas de laboratorio.
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Reglas de Seguridad y Organización en el Laboratorio de Bioquímica

Un objetivo clave del presente Curso de Laboratorio de Bioquímica I es proporcionar a los estudiantes el
ambiente apropiado para que lleven a cabo prácticas de laboratorio formativas y en un ambiente de
seguridad que salvaguarde su integridad física. En el documento titulado “Lineamientos de los Laboratorios
del Departamento de Química”, que aparece en las primeras páginas de este manual, se enlistan las reglas
que deberán conocer y acatar los estudiantes, profesores y técnicos para evitar accidentes en el
Laboratorio de Bioquímica. Como ya sabemos, un laboratorio de química puede ser un lugar peligroso.
Muchos compuestos químicos son corrosivos y/o venenosos y/o inflamables. Aunque ya han sido probadas
con anticipación, algunas de las prácticas a realizar pueden ser riesgosas a menos de que estemos
conscientes de la naturaleza de los materiales utilizados y de que tengamos cuidado al manipularlos.
Una precaución excelente y básica que podemos tomar contra los accidentes es prepararnos para cada
práctica con anticipación, de modo que tengamos una idea clara de las operaciones y procesos que vamos
a realizar. Otra precaución obligatoria es la de usar bata y lentes de seguridad en todo momento durante
las prácticas, además de guantes, tapabocas o cualquier otro equipo de protección cuando manejemos
materiales que así lo ameriten. Además, deberemos mantener nuestra mesa de laboratorio limpia y
ordenada. Se deberá poner atención en lo que se está haciendo en todo momento, sin estar jugando o
distraídos. Deberemos conocer el significado de los símbolos de seguridad que aparecen impresos en los
contenedores y recipientes de los materiales y reactivos químicos.
A fin de lograr una operación sin interrupciones de nuestras prácticas, hay varias reglas y procedimientos
que deberemos seguir. En relación a los reactivos y muestras biológicas, si contaminamos o desechamos
algún reactivo o muestra biológica podríamos arruinar la práctica no sólo para nuestros compañeros de
equipo, sino para los demás estudiantes. Para evitar contaminar los reactivos, tome solamente la cantidad
mínima de reactivo requerida del frasco o contenedor original en que se encuentre. Transfiera reactivos
líquidos de la botella o contenedor original hacia un tubo de ensaye o vaso de precipitado o matraz limpio
y seco. Los sólidos deben transferirse a un vaso pequeño o a un vidrio de reloj. Pipetee líquidos a partir de
la muestra obtenida del frasco original: nunca sumerja una pipeta directamente en el frasco de reactivo
original. Nunca regrese reactivos que no fueron usados hacia sus contenedores originales. Mantenga los
tapones y tapas de los frascos de reactivos limpios y reemplácelos después de usarlos. El abasto de agua
destilada siempre es limitado, no la desperdicie. Use agua destilada para hacer soluciones de reactivos y
para el enjuague final del material de vidrio y plástico.
Los residuos peligrosos (RP) y residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI) generados en la práctica
deberán ser desechados en recipientes y bolsas especiales, no en las tarjas ni en el piso ni en el bote de
basura ni dejados en la mesa. El profesor y los técnicos del laboratorio darán instrucciones específicas al
respecto cuando haya que disponer de RP y RPBI. Más adelante en esta práctica veremos que el acopio,
almacenamiento temporal, etiquetado, transporte y disposición final de RP y RPBI está estrictamente
regulado en la Universidad Autónoma de Aguascalientes a través del Sistema de Gestión Ambiental.
Etiquetas y Pictogramas de Seguridad de los Materiales Químicos

Existen toda una variedad de etiquetas, placas, pictogramas y números de identificación relativos a la
clasificación, transporte y manejo seguro de los materiales químicos. Una de las más conocidas es la
etiqueta NFPA (National Fire Protection Association: Asociación Nacional de Protección contra el Fuego,
http://www.nfpa.org). La Norma NFPA 704 explica el "diamante de materiales peligrosos" utilizado para
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comunicar los riesgos de los materiales peligrosos. Es importante para ayudar a mantener el uso seguro
de productos químicos. Se emplea para el transporte de productos envasados y a granel, y no para el
almacenamiento estacionario. Las cuatro divisiones del diamante tienen colores asociados con un
significado. El azul hace referencia a los peligros para la salud, el rojo indica la amenaza de inflamabilidad
y el amarillo el peligro por reactividad, es decir, la inestabilidad del producto. A estas tres divisiones se les
asigna un número de 0 (sin peligro) a 4 (peligro máximo). Por su parte, en la sección blanca puede haber
indicaciones especiales para algunos materiales, indicando que son oxidantes, corrosivos, reactivos con
agua o radiactivos (Figura 1; http://parquearvi.org/wp-content/uploads/2016/11/Norma-NFPA-704.pdf).
Figura 1. El diamante de materiales peligrosos de la NFPA.
Los pictogramas de riesgo del Sistema Globalmente Armonizado para la Clasificación y Etiquetado de
Agentes Químicos (del inglés: Globally Harmonized System of Classification and Labeling of Chemicals,
GHS) también son muy conocidos y utilizados para etiquetar y transportar productos químicos (Figura 2;
https://en.wikipedia.org/wiki/GHS_hazard_pictograms).
Figura 2. Pictogramas de riesgo del Sistema Globalmente Armonizado para la

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Clasificación y Etiquetado de Agentes Químicos.
Otros pictogramas comunes son los de clasificación de riesgos según WHMIS (del inglés: Workplace
Hazardous Materials Information System / Sistema de Información sobre Materiales Peligrosos en el
Lugar de Trabajo; Figura 3).
Figura 3. Pictogramas de clasificación de riesgos según WHMIS.
En ocasiones, las placas y etiquetas de materiales químicos peligrosos contienen, además de pictogramas
y colores especiales, números de identificación de los materiales. Entre los números más utilizados están
los números UN (del inglés: United Nations / Naciones Unidas), también conocidos como números ONU
(Organización de las Naciones Unidas). Los números UN son números de cuatro dígitos usados para
identificar sustancias o materiales peligrosos (como explosivos, líquidos inflamables, sustancias tóxicas,
etc.) en el marco del transporte internacional. Es una plataforma que lucha contra la contaminación al medio
ambiente y algunas de estas sustancias peligrosas tienen sus propios números UN (como la acrilamida
que tiene el UN2074), mientras que algunos grupos de químicos o productos con propiedades similares
reciben un número UN particular. Un químico en su estado sólido puede tener un número UN diferente que
cuando se encuentra en estado líquido, si sus propiedades de peligrosidad difieren significativamente; las
sustancias con diferentes niveles de pureza o concentración en solución también pueden tener distintos
números UN. El rango de números UN va desde UN0001 hasta alrededor de UN3500, no son asignados a
sustancias que no son peligrosas (esas simplemente no tiene número UN), y no poseen un mecanismo
para deducir los clases de peligros de una sustancia con sólo ver su número UN; tienen que ser buscados
en una tabla. Son asignados por el Comité de Expertos en el Transporte de Bienes Peligrosos de la
Organización de las Naciones Unidas y están publicados en sus Recomendaciones Relativas al Transporte
de Mercancías Peligrosas
(https://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/unrec/rev17/Spanish/Rev17_Volume1.pdf)
Estas recomendaciones son adoptadas por la organización reguladora responsable de los diferentes
medios de transporte.
Por otro lado, los números NA (Norte América), también conocidos como números DOT (Department of
Transportation) son emitidos por el Departamento de Transporte de los Estados Unidos y son idénticos a
los números UN, excepto que algunas sustancias sin números UN pueden tener un número NA.
(http://www.ilpi.com/msds/ref/unna.html).
Fichas de Datos de Seguridad (FDS / MSDS)
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Una ficha de datos de seguridad (en inglés: MSDS: Material Safety Data Sheet / Hojas de Datos de
Seguridad de los Materiales) es un documento que indica las particularidades y propiedades de una
determinada sustancia para su uso más adecuado. El principal objetivo de esta ficha es proteger la
integridad física del operador durante la manipulación de la sustancia. La ficha contiene las instrucciones
detalladas para su manejo y persigue reducir los riesgos laborales y medioambientales. Está pensada para
indicar los procedimientos ordenadamente para trabajar con las sustancias de una manera segura. Las
fichas contienen información física del producto tales como su punto de fusión, punto de ebullición, etc.;
también incluyen su toxicidad, efectos a la salud, primeros auxilios, reactividad, almacenamiento,
disposición, protección necesaria y, en definitiva, todos aquellos cuidados necesarios para manejar los
productos peligrosos con seguridad. El formato de estas fichas puede variar dependiendo de su fabricante
o según las legislaciones de los diferentes países.
Muchos productos incluyen obligatoriamente su ficha de seguridad en la propia etiqueta. Estas también
incluyen, además de los riesgos a la salud, los riesgos medioambientales. Las etiquetas contienen diversos
símbolos de peligro estandarizados para su rápida identificación y frases de riesgo y seguridad según las
convenciones locales. Las fichas de seguridad no están tanto pensadas para un consumidor general
puntual como para los riesgos en el trabajo, ya que hay muchos productos que son utilizados diariamente
por profesionales. Esto origina que los riesgos aumenten considerablemente
(https://es.wikipedia.org/wiki/Ficha_de_datos_de_seguridad). Las FDS o MSDS por lo general están
disponibles en internet, de donde se pueden descargar de manera libre y gratuita. Basta con teclear en su
buscador favorito el nombre del compuesto químico (en español o en inglés) seguido por las siglas “MSDS”
o la frase “hoja de seguridad”, para poder encontrar la ficha correspondiente al compuesto buscado. Es
muy importante que los estudiantes y profesores sepan de su existencia y de su uso. Es crucial que todo
laboratorio que maneja sustancias químicas tenga un acervo de FDS o MSDS (tanto en material digital
como impreso) de todos los compuestos químicos en existencia y uso.
Sistema de Gestión Ambiental (SGA, ISO 14001:2004) de la Universidad Autónoma de

Aguascalientes (UAA)
La UAA tiene como política ambiental “asumir el compromiso de contribuir al cuidado del medio ambiente
en la búsqueda de la sustentabilidad mediante la gestión eficaz de su infraestructura para el desarrollo de
la Docencia, Investigación y Extensión, previniendo la contaminación, optimizando el empleo de sus
recursos materiales y energéticos, cumpliendo con la legislación aplicable y mejorando continuamente su
desempeño ambiental” (Aprobada por la CEU el 8 de Abril de 2013; código de documento MGA-AN-02).
Entre los aspectos ambientales significativos contemplados en esta política, están la generación, manejo y
disposición de residuos peligrosos (RP) y residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI).
La información detallada al respecto está contenida en el documento “NI-090400-03 Normatividad para el
Manejo de Residuos Peligrosos (R.P.’s) y Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos (R.P.B.I.’s)” del
Sistema de Gestión de Calidad de la UAA.
Dicha normatividad describe en detalle la separación, envasado, registro, recolección, almacenamiento
temporal y disposición de los residuos mencionados, con lo cual se busca dar cumplimiento con lo
establecido en la última versión oficial vigente de las siguientes Normas Oficiales Mexicanas:
❖ NOM-052-SEMARNAT-2005 donde se establecen las características, el procedimiento de
identificación, clasificación y los listados de los residuos peligrosos.
❖ NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002 donde se establecen aspectos de Protección Ambiental, Salud
Ambiental, Residuos Peligrosos Biológico-Infecciosos, Clasificación y especificaciones de manejo.
Así como con las disposiciones para manejo, recolección y entrega de residuos peligrosos descritas en la
normatividad con apoyo en lo establecido en los trípticos y/o carteles sobre el Manejo de R.P.B.I’s y de
R.P.’s.
Las áreas generadoras de residuos peligrosos (entre ellas nuestro Laboratorio de Bioquímica I) se
encargarán de la identificación, separación, envasado y almacenamiento temporal de sus residuos
generados de acuerdo a lo establecido en la Normatividad y a las disposiciones emitidas por la Dirección
General de Infraestructura Universitaria.
Las fases de manejo de los R.P.’s y R.P.B.I.’s se muestran en la Figura 4.
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Figura 4. Fases de manejo de los residuos peligrosos.
Las áreas generadoras de residuos peligrosos se encargarán de la identificación y separación de los

residuos de acuerdo con el diagrama de la Figura 5.
Figura 5. Diagrama para la identificación de R.P.’s y R.P.B.I.’s.

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Habiendo identificado / clasificado los residuos, estos deberán ser envasados en los contenedores
especiales correspondientes, etiquetados adecuadamente, almacenados in situ temporalmente y
registrados en una bitácora. El envasado de residuos se realiza con apoyo en lo establecido en los trípticos
y/o carteles sobre el Manejo de R.P.B.I’s y de R.P.’s.
La Dirección General de Infraestructura Universitaria recolectará los R.P.’s y R.P.B.I.’s que cumplan con
los requisitos de separación, envasado y etiquetado descritos en la normatividad. Luego serán
transportados internamente en la UAA para ser almacenados temporalmente en un lugar especial antes de
su disposición final.
FORMATOS EN LOS REPORTES DE LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO
Cifras Significativas y Redondeo en el Reporte de Datos Experimentales

Es importante que seamos honestos cuando reportamos una medición, de modo que ésta no parezca ser
más exacta que lo que permite el equipo usado para hacer la medición. Podemos lograr esto controlando
el número de dígitos, o cifras significativas, usadas para reportar la medición.
El número de cifras significativas de una cantidad numérica resultante de una medición, como por ejemplo
2.531, es igual al número de dígitos que son conocidos con cierto grado de confianza (2, 5 y 3) más el
último dígito (1) que es incierto ya que es un estimado o aproximación. A medida que mejoramos la
sensibilidad del equipo usado para hacer una medición, el número de cifras significativas aumenta (Tabla
1).
Tabla 1. Efecto de la sensibilidad de diferentes balanzas sobre el número de cifras significativas
de las masas medidas.
Tipo de balanza Sensibilidad Medición Número de cifras
(g) (g) significativas
Báscula de carnicero 1 3 1
Balanza granataria 0.01 2.52 3
Balanza analítica 0.0001 2.5213 5
Adaptado de: http://chemed.chem.purdue.edu/genchem/topicreview/bp/ch1/sigfigs.html
Se pueden usar las siguientes reglas para asignar el número correcto de cifras significativas a un número:
1. Los números cuyos valores se hallan establecidos por definición o que se usan para contar son exactos
y pueden considerarse que tienen un número infinito de cifras significativas. Por ejemplo: π (pi), ½, el
número de personas en una habitación, y 1 g = 1000 mg exactamente. Sin embargo, en algunos de
estos casos, puede ser difícil decidir qué cifras son significativas, sin una más detallada información.
Por ejemplo, el número 186,000,000 puede tener 3, 4, 5,…9 cifras significativas. Si se sabe que tiene 5
cifras significativas, sería preferible registrar el número como 186.00 millones o 1.8600 x 10 8.
2. Los ceros que se encuentran entre dígitos diferentes de cero siempre son significativos. Por lo tanto,
reportar el número 19.02 implica que tiene 4 cifras significativas. También 4308 tiene 4 cifras
significativas.
3. Los ceros a la izquierda del primer dígito diferente de cero nunca son significativos. Simplemente sirven
para localizar el punto decimal. Por lo tanto 0.007 sólo tiene una cifra significativa. En otro ejemplo,
0.0018 = 1.8 x 10-3 tiene 2 cifras significativas.
4. Los ceros a la derecha del último dígito diferente de cero pueden ser significativos o pueden ser usados
solamente para colocar el punto decimal en el número. Para eliminar cualquier duda, el número deberá
ser expresado en notación científica (exponencial). Por lo tanto, 3100 podría tener 2, 3 o 4 cifras
significativas, pero 3.10 x 103 claramente tiene tres cifras significativas.
Una vez que se ha determinado el número correcto de cifras significativas para un valor, el número deberá
ser redondeado a ese número de dígitos. Las reglas para el redondeo son:
1. Elimine todos los dígitos en exceso simultáneamente, no uno a la vez.
2. Si las cifras que siguen al último número que ha de ser retenido son 4999… o menores, se descartan y
el último número se deja sin cambio, o sea, redondee hacia abajo. Por ejemplo: 3.624 es 3.62
redondeado a 3 cifras significativas. Otro ejemplo: 72.8146 redondeado al número decimal con dos
decimales será 72.81, puesto que 72.8146 está más cerca de 72.81 que de 72.82.
3. Si las cifras que siguen al último número que ha de ser retenido son 5000… o mayores, se descartan y
el último número se aumenta en uno, o sea se redondea hacia arriba. Por ejemplo: 7.635 se vuelve 7.64
si hay 3 cifras significativas. Otro ejemplo: 28.7257 se convierte en 28.726 al redondear a 5 cifras
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significativas. Otro ejemplo: el resultado de redondear 72.8 al entero más próximo es 73 puesto que
72.8 está más cerca de 73 que de 72.
4. En el redondeo de 72.465 a un decimal con aproximación de centésimas, nos encontramos con el dilema
de que 72.465 está justamente a la mitad del recorrido entre 72.46 y 72.47. Se acostumbra en tales
casos redondear al número par más próximo que antecede al 5. Así, 72.465 se redondea a 72.46;
183.575 se redondea a 183.58; redondeando 116, 500,000 con aproximación de millones será 116,
000,000. Esta práctica es especialmente útil al minimizar la acumulación de errores de redondeo cuando
se abarca un número grande de operaciones.
El cálculo del resultado de un experimento a menudo requiere llevar a cabo operaciones matemáticas con
cantidades (términos de una ecuación, por ejemplo) que tienen precisiones ampliamente diferentes. La
precisión del resultado depende de la precisión de cada cantidad, pero por lo general se ve afectada
principalmente por la cantidad de precisión más baja (con el mayor error). Al discutir un experimento, el
estudiante siempre deberá tratar de señalar cuál de las cantidades que entran al resultado final tiene la
precisión más baja (el error más alto), ya que es la medición de esta cantidad, el “eslabón más débil” de
todo el experimento, sobre la que deberá enfocarse la atención al tratar de mejorar el método. Hay
varias estrategias para determinar la precisión del resultado. La estrategia más simple es determinar el
número de cifras significativas para el resultado calculado aplicando las siguientes reglas:
1. Para multiplicación, división y extracción de raíces de números, el número de cifras significativas en el
resultado es el mismo que en la medición con menor precisión (con menor número de cifras
significativas). Por lo tanto, el resultado de (22.4)(1.528)4.6 deberá reportarse con dos cifras
significativas, o sea 7.4. Otro ejemplo: (73.24)(4.52) = 331. Otro ejemplo: 1.6480.023 = 72. Otro
ejemplo: Raíz cuadrada de 38.7 = 6.22. Otro ejemplo: (8.416)(50) = 420.8, si 50 es exacto.
2. Para adición y sustracción, los números primero deben alinearse por sus puntos decimales. Luego el
resultado no podrá contener más cifras significativas a la derecha del punto decimal que las que hay en
el número sumado o restado con menor número de ellas después del punto decimal. Por lo tanto,
12.23+135 podrá ser correctamente expresado como 147, en vista de que ningún dígito a la derecha
del cinco en 135 es significativo. Otro ejemplo: 3.16+2.7 = 5.9. Otro ejemplo: 83.42-72 = 11. Otro
ejemplo: 47.816-25 = 22.816, si 25 es exacto.
3. El logaritmo de un número tiene el mismo número de cifras significativas en la mantisa del logaritmo que
el número de cifras significativas en el número: log 2.05 = 0.312, log 20.5 = 1.312. Las características,
0 y 1 respectivamente, del logaritmo sirven solamente para localizar el punto decimal, y ambos
logaritmos tienen la misma mantisa.
4. En los pasos intermedios de cualquier cálculo, deberá mantenerse una cifra más que el número correcto
de cifras significativas, y redondear sólo el resultado final.
Símbolos del Sistema Internacional de Unidades

Una cantidad medida se reporta en forma de un número seguido por una unidad o dimensión asociada. En
este curso usaremos un sistema de unidades de medición basado en la convención del Système
International d’Unités (o Sistema Internacional de Unidades, SI). Las siete unidades básicas se muestran
a continuación en la Tabla 2.
Tabla 2. Unidades Básicas del Sistema Internacional de Unidades.

Nombre Símbolo Cantidad física
Ampere o amperio A Corriente eléctrica
Candela cd Intensidad luminosa
Kelvin K Temperatura termodinámica
Kilogramo kg Masa
Metro m Longitud
Mol mol Cantidad de sustancia
Segundo s Tiempo
Adaptado de: Dodd (1997).
Además, se usa un sistema de prefijos para expresar fracciones decimales y múltiplos de dichas
unidades básicas. Los más comunes se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Prefijos multiplicativos de las unidades del SI.
Factor Prefijo Símbolo Factor Prefijo Símbolo
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10-30 vendeko v 101 deca da
10-27 xenno x 102 hecto h
10-24 yocto y 103 kilo k
10-21 zepto z 106 mega M
10-18 atto a 109 giga G
10-15 femto f 1012 tera T
10-12 pico p 1015 peta P
10-9 nano n 1018 exa E
10-6 micro μ 1021 zetta Z
10-3 mili m 1024 yotta Y
10-2 centi c 1027 xenna X
10-1 deci d 1030 vendeca V
Además, varias otras unidades de medición que no pertenecen al SI son de uso tan común en química,
que deberemos aprendernos sus definiciones y uso. Las más comunes se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Otras unidades de medición usadas en Química que no pertenecen al SI.

Nombre Símbolo Cantidad Valor en unidades SI
Angstrom Å Distancia 1 Å = 10-10 m = 0.1 nm
Bar bar Presión 1 bar = 105 Pa = 100 kPa = 0.1 MPa
Dalton Da Masa atómica 1 Da = 1.660540 x 10-27 kg
Día día Tiempo 1 día = 24 h = 86400 s
Grado Celsius °C Temperatura Los intervalos de temperatura en kelvins y
grados Celsius son idénticos, sin embargo,
la temperatura en kelvins es igual a la
temperatura en grados Celsius más 273.15.
Hora h Tiempo 1 h = 60 min = 3600 s
Litro L Volumen 1 L = 1 dm3 = 10-3 m3
Minuto min Tiempo 1 min = 60 s
Unidad de masa u Masa atómica 1 u = 1.660540 x 10-27 kg
atómica unificada La unidad de masa atómica unificada es
igual a 1/12 de la masa de un átomo del
núclido 12C. Es igual que el Dalton (Da).
Molar M Concentración molar 1 M = 1 mol/L. El símbolo M no es una
unidad SI, pero expresiones tales como 0.1
M, queriendo decir una solución con
concentración de 0.1 mol/L, son aceptables.
Formatos de Citas Bibliográficas

No existe un formato único o universal para citar una fuente bibliográfica en un texto, tabla o figura.
Normalmente, cada casa editorial tiene sus propias reglas al respecto. Lo importante es la consistencia: o
sea adoptar un solo formato de citas y utilizarlo sin variaciones en todo el trabajo. Por lo general, en las
citas no se menciona ni los nombres ni las iniciales de los nombres de los autores. Solamente se mencionan
apellidos de los autores y año de publicación de la fuente. Algunas de las formas más utilizadas para citar
una fuente de información en un texto son las que se muestran a continuación. Ejemplos:
Cuando la fuente bibliográfica tiene un solo autor:

“El aceite refinado de maíz contiene trazas de ceras que producen la turbidez del aceite cuando se enfría
a bajas temperaturas (Bailey, 1984)”. O alternativamente: “Bailey (1984) reportó que el aceite refinado de
maíz contiene trazas de ceras que producen la turbidez del aceite cuando se enfría a bajas temperaturas.”
Cuando la fuente bibliográfica tiene dos autores:

“El efecto antioxidante puede ser fácilmente evaluado siguiendo el decremento de la absorbancia (Moon y
Shibamoto, 2009).” O alternativamente: “Moon y Shibamoto (2009) mencionaron que el efecto antioxidante
puede ser fácilmente evaluado siguiendo el decremento de la absorbancia.”
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Cuando la fuente bibliográfica tiene tres o más autores:

“Este método, desarrollado por Brand-Williams y col. (1995), se basa en la reducción de la absorbancia
medida a 515 nm del radical DPPH• por antioxidantes.” O alternativamente: “Este método se basa en la
reducción de la absorbancia medida a 515 nm del radical DPPH• por antioxidantes (Brand-Williams y col.,
1995).”
Obsérvese que en este último caso, sólo se mencionan los apellidos del primer autor y el año; los demás
autores se sustituyen con la frase “y col.” (y colaboradores). En lugar de esta frase, también es común usar
“et al.” (Abreviatura del latín et alles que significa “y otros”).
Formatos de Tablas y Figuras

Las tablas pueden contener datos numéricos, textos breves, y en ocasiones hasta imágenes. En cualquier
caso siguen llamándose tablas o cuadros. Al igual que con las citas bibliográficas, no existe un formato
universal para las tablas o cuadros, aunque sí hay formatos que son más comunes. Como ejemplo, observe
las Tablas 3 y 4 que aparecen en párrafos anteriores. Lo más común es colocar la leyenda (título) de la
tabla en la parte superior, dejando la parte inferior para el pie de tabla, donde se pueden hacer aclaraciones,
así como citar las fuentes bibliográficas de la información mostrada. La leyenda de la tabla debe ser breve
pero suficientemente descriptiva del contenido; no debe contener descripciones abundantes o discusiones
de los resultados.
Las figuras por lo general contienen gráficos de resultados, esquemas e imágenes, aunque también pueden
contener textos breves y datos numéricos. Las leyendas de las figuras comúnmente se colocan al pie
(debajo) de la figura. Las notas aclaratorias o definiciones de abreviaturas o siglas se colocan también al
pie de la figura, justo después de la leyenda. Igualmente, la leyenda de figura deberá ser breve y concreta
pero suficientemente descriptiva del contenido. Dicha leyenda no debe contener descripciones abundantes
o discusiones de los resultados. Las tablas y figuras deberán ser numeradas consecutivamente con
números arábigos, y deberán ser citadas en el texto al menos una vez y justo antes del lugar donde aparece
la tabla o figura. Al igual que con las citas bibliográficas, con los formatos de las tablas y figuras lo importante
es la consistencia: o sea adoptar un solo formato y utilizarlo sin variaciones en todo el trabajo.
Formatos de Referencias Bibliográficas

Tampoco existe un formato universal para las referencias bibliográficas, aunque sí hay formatos más
comúnmente usados. También aquí, lo importante es la consistencia: o sea adoptar un solo formato y
utilizarlo sin variaciones en todo el trabajo. Como ejemplo, en las listas de referencias de los reportes finales
de estas prácticas de laboratorio podrán utilizarse los formatos sugeridos a continuación:
➢ Para libros se reporta de este modo:

Autor (primer apellido completo, iniciales de nombres). Año. Título. Edición. Editorial. Lugar de publicación.
Páginas consultadas. Nota: Datos separados con puntos.
Ejemplo:
Nussbaum, R.L.; McInnes, R.R.; Willard, H.F. 2008. Thompson & Thompson: Genética en Medicina. 7ª ed.
Elsevier-Masson. Barcelona. pp. 340-346.
➢ Para artículos de revistas se reporta de este modo:
Autor(es) (primer apellido completo, iniciales de nombres). Año. Título del Artículo. Nombre de la revista.
Volumen: páginas.
Ejemplo:
Lanzuolo, C.; Orlando, V. 2007. The function of the epigenome in cell reprogramming. Cellular and
Molecular Life Sciences. 64:1043-1062.
➢ Para sitios de Internet se reporta de este modo:
Nombre del sitio (Visitado por última vez: DD/MM/AA) Dirección URL de la página web.
Ejemplo:
PubMed (Visitado por última vez: 21/07/09) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez
CUESTIONARIO
Se proporcionará en la sesión de laboratorio por el profesor.
10 Código: FO-121500-20
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PRÁCTICA No. 2
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL IÓN HIDRÓGENO (pH) EN SOLUCIONES ACUOSAS
OBJETIVOS
1. Conocer y aplicar algunos métodos para la determinación de pH.

2. Determinar el pH de varias soluciones problema.
INTRODUCCIÓN
Concepto de pH
Para poder comprender qué es pH, es necesario revisar antes algunos conceptos, tales como: ácido,
base, disociación, ionización y concentración. Por otra parte, resulta indispensable tener una idea precisa
acerca de los logaritmos.
Disociación. La disociación es el proceso de separación de uno o más elementos de una molécula

compuesta, que da como resultado fragmentos más simples: átomos, radicales libres, iones.
En los sistemas biológicos, el agua es el disolvente en el que se encuentran disueltos los compuestos
disociados. Cuando una molécula se separa dando iones positivos (cationes) e iones negativos (aniones),
el proceso de disociación puede ser también llamado ionización.
Ácido y base. Se define como ácido a una sustancia capaz de ceder protones (H +) en solución. El grado
de acidez dependerá del número de protones o hidrogeniones libres.
En general, se consideran dos tipos de ácidos: fuertes y débiles. Un ácido fuerte es el que se disocia
casi por completo y, por tanto, deja libres a prácticamente todos los hidrogeniones que posee. Un ácido
débil es aquél que se disocia parcialmente, de tal manera que la mayoría de los protones se encuentran
unidos al anión (base conjugada) y sólo una pequeña proporción de ellos están libres.
Una base o álcali es una sustancia capaz de aceptar o combinarse con protones y/o capaz de
-
incrementar la concentración de iones oxhidrilo (OH ) en solución.
Los ácidos y las bases se neutralizan mutuamente, molécula a molécula, ya que las bases aceptan los
protones de los ácidos cuando ambos son mezclados. Como resultado, se establece un equilibrio entre las
cargas del ácido y las de la base y, por consiguiente, la ausencia de protones libres.
Las substancias que pueden actuar indistintamente como ácidos o como bases son conocidas como
anfotéricas.
Grado de acidez o alcalinidad. Para poder valorar el grado de acidez o alcalinidad de una sustancia,
se ideó una escala basada en la concentración de hidrogeniones libres obtenidos por la disociación del
agua. La cantidad de moléculas de agua disociadas puede variar conforme a su pureza y a la temperatura,
pero la relación entre la concentración de moléculas de agua disociadas y la concentración de moléculas
de agua no disociadas permanece constante. A esta constante se le denomina constante de disociación
del agua (KD).
KD = [H+][ OH-]/[H2O] (1)
El agua pura, a 25 C, tiene una [H+] = [OH-] = 1.0 x 10-7 M. La [H2O] = 55.555 M y, para fines prácticos,
se puede considerar que permanece constante ante el evento de disociación. Por lo tanto, la ecuación (1)
puede rearreglarse definiendo una nueva constante, la KW o constante del producto iónico del agua, la cual
tiene un valor numérico, a 25 C, de 1.0 x 10-14 (¿por qué?).
[H2O] KD = KW = [H+][ OH-] = 1.0 x 10-14 (2)
El danés Sörensen inventó una manera abreviada para referirse a la concentración de protones libres en
solución, que denominó pH, el cual se define como:
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pH = log 1/[ H+] = - log [H+] (3)
De manera análoga, podría definirse pOH como:
pOH = log 1/[ OH-] = - log [OH-] (4)
Generalizando, pKa = log 1/Ka = - log Ka (5)
Así pues, el pH del agua pura a 25 C es igual a 7.0, y el pOH = 7.0 (¿por qué?).
Si se aplican logaritmos negativos a cada uno de los miembros de la ecuación (2), se obtiene la
relación siguiente:
pKw = pH + pOH = 14 (6)
En consecuencia, el valor mínimo de pH es 0 y su valor máximo es 14. Asimismo, pOH puede tener un
valor mínimo de 0 y un valor máximo de 14. De la ecuación (6) también se deduce que al aumentar el valor
de pH, disminuye el valor de pOH y viceversa.
pOH
14 7 0
Ácido Neutro Básico (alcalino)
0 7 14
pH
Se dice que el pH = 7 es neutro, ya que en dicha situación [ H +] = [OH-]. Un pH menor que 7 es ácido,
pues predominan los protones sobre los oxhidrilos libres. Finalmente, un pH mayor que 7 es básico o
alcalino, ya que predominan los oxhidrilos sobre los protones libres en solución.
Escala de pH.
H+ pH Solución pOH OH− 
1 0 Ácida 14 1 x 10-14
1 x 10-1 1 Ácida 13 1 x 10-13
1 x 10-2 2 Ácida 12 1 x 10-12
1 x 10-3 3 Ácida 11 1 x 10-11
1 x 10-4 4 Ácida 10 1 x 10-10
1 x 10-5 5 Ácida 9 1 x 10-9
1 x 10-6 6 Ácida 8 1 x 10-8
1 x 10-7 7 NEUTRA 7 1 x 10-7
1 x 10-8 8 Alcalina 6 1 x 10-6
1 x 10-9 9 Alcalina 5 1 x 10-5
1 x 10-10 10 Alcalina 4 1 x 10-4
1 x 10-11 11 Alcalina 3 1 x 10-3
1 x 10-12 12 Alcalina 2 1 x 10-2
1 x 10-13 13 Alcalina 1 1 x 10-1
1 x 10-14 14 Alcalina 0 1
*Concentraciones en moles/litro a 25 C.
Indicadores de pH
Existen varios colorantes orgánicos, sintéticos o de origen natural, que cambian de color cuando varía
el pH de la solución en la que se encuentran disueltos. Ya que la mayoría de los ácidos y las bases
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empleados en el laboratorio son incoloros, los indicadores son útiles al hacer posible que los cambios de
pH sean observables por las variaciones en la coloración de las soluciones.
Los indicadores de pH son usualmente ácidos o bases débiles. En el caso de un ácido, su disociación
puede representarse como sigue:
HInd H+ + Ind-
Cuando se agrega una base a la forma ácida del indicador (HInd), aquélla reacciona con él para obtener la
forma básica del indicador (Ind-). Se forma de este modo un sistema amortiguador y, por lo tanto, su pH se
puede calcular de la misma forma que en otras soluciones amortiguadoras.
En el caso de algunos indicadores, su color es determinado por la disociación de la sustancia, como
sucede con el rojo de metilo. La forma ácida (no disociada) es roja; la forma básica es amarilla.
Dependiendo de la proporción que guarden las concentraciones de ambas formas, se pueden observar
todas las tonalidades intermedias entre estos colores extremos. En otros casos, como el de la fenolftaleína,
una forma del indicador es incolora y la otra es coloreada (roja). El color final de la solución depende de la
cantidad presente de la forma coloreada.
Los indicadores pueden usarse para determinar el pH de alguna solución, mediante la comparación
entre el color del indicador en una solución de pH conocido y el color del indicador en la solución problema.
Algunos Indicadores de pH de Uso Frecuente
Nombre vulgar pKa Color y zona útil de pH

Azul de timol 1.7 Rojo 1.2 Amarillo 2.8
Anaranjado de metilo 3.5 Rojo 3.1 Amarillo 4.4
Verde de bromocresol 4.7 Amarillo 3.8 Azul 5.5
Azul de bromofenol 4.0 Amarillo 3.0 Azul 4.6
Rojo de metilo 5.1 Rojo 4.2 Amarillo 6.3
Rojo de clorofenol 6.0 Amarillo 5.1 Rojo 6.7
Púrpura de bromocresol 6.2 Amarillo 5.4 Púrpura 7.0
Azul de bromotimol 7.0 Amarillo 6.0 Azul 7.6
Rojo de fenol 7.9 Amarillo 6.8 Rojo 8.4
Rojo de cresol 8.3 Amarillo 7.2 Rojo 8.8
Azul de timol 8.9 Amarillo 8.0 Azul 9.6
Fenolftaleína 9.7 Incoloro 8.3 Rojo 10.0
Timolftaleína 9.9 Amarillo 9.3 Azul 10.5
Rojo Congo 4.1 Azul 3.0 Rojo 5.0
Rojo de alizarina S --- Amarillo 4.6 Rojo 6.0
Tornasol --- Rojo 4.5 Azul 8.5
Rojo neutro --- Rojo 6.8 Ámbar 8.0
Preparación de una Escala Colorimétrica de pH Mediante el Uso de Buffers e Indicadores

Este método de estimar el pH se basa en el hecho de que un indicador ácido-base existe en solución
como dos especies de diferente color en un intervalo de pH alrededor de su pKa.
Los indicadores son ácidos débiles cuyas formas no disociadas (HInd) y disociada (Ind-) tienen color
diferente. Por medio de la preparación de una serie de soluciones amortiguadoras cuyos valores de pH son
conocidos y se agrupan alrededor del pKa del ácido indicador, y que contienen la misma concentración del
mismo, se obtiene una escala colorida estándar en la que la tonalidad de cada solución depende de su
valor de pH particularmente añadiendo la misma concentración de indicador que la presente en las
soluciones estándar. El color de la solución problema es entonces comparado visual o colorimétricamente
con los colores de la serie de los buffers estándar. De esta manera es posible conocer el pH de una solución
con una aproximación de 0.2 unidades de pH.
Este procedimiento está sujeto a errores. A menudo las soluciones que contienen proteínas muestran
grandes variaciones de pH debido a que las proteínas pueden unirse a una u otra forma del indicador, por
lo que ocurre un desplazamiento en el equilibrio de su disociación. Un segundo error es causado por la
presencia de otras sustancias coloridas en la solución. Este puede cancelarse, si la interferencia no es muy
grande, mediante el empleo de un tubo “blanco” de la sustancia colorida en el que el indicador está ausente.
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Uso del Potenciómetro

El pH es formalmente definido como el logaritmo negativo de la actividad del ión hidrógeno. Algunas
aproximaciones a la verdadera actividad del ión hidrógeno pueden ser medidas por medio del electrodo de
hidrógeno. Este consiste en un electrodo platinado sumergido en la solución que va a ser probada. Se hace
pasar gas hidrógeno a través de la solución. La media celda así formada consiste de H 2 gaseoso en
equilibrio con iones H+, generándose un potencial eléctrico medible.
El potencial medido con un electrodo de hidrógeno, a una atmósfera de presión y en una solución que
contiene la unidad de actividad del ión hidrógeno, es considerado igual a cero a todas las temperaturas.
Este es el estándar. En ocasiones, el pH determinado con el electrodo de hidrógeno es arbitrario, y se han
adoptado algunas conversiones para la relación entre el pH y el potencial eléctrico, de manera que los
valores de pH determinados por otros procedimientos y en diferentes laboratorios pueden ser comparados.
En todos los casos, la solución estándar usada para relacionar el pH a la fuerza electromotriz deberá
especificarse.
Como el electrodo de hidrógeno no es adecuado para estimar el pH de soluciones que contienen
substancias reductoras, es necesario usar otro método para dichas soluciones. Uno conveniente emplea
el electrodo de vidrio.
El electrodo de vidrio es una membrana delgada de un vidrio especial. Esta membrana encierra una
media celda delgada de plata-cloruro de plata (Ag-AgCl). La otra mitad de la celda es un electrodo de
calomel formado por cloruro de mercurio (HgCl2) sobre mercurio sólido. En el interior de la celda de vidrio
que contiene el electrodo de calomel hay ácido clorhídrico 0.1 M, solución que establece un pH constante
y conocido en un lado de la membrana de vidrio. Un puente de KCl conecta la solución de pH desconocido
con la media celda.
MATERIAL Y EQUIPO REACTIVOS
15 tubos de ensaye de 18 x 150 mm. CH3COOH 0.2 M.

1 gradilla para tubos de ensaye. CH3COONa 0.2 M.
2 pipetas de 10 mL. KH2PO4 0.1 M.
4 pipetas de 5 mL. NaOH 0.1 M.
Potenciómetro con electrodo de vidrio Ácido bórico-KCl 0.1 M.
previamente calibrado.
INDICADORES:
Anaranjado de metilo.
Rojo de metilo.
Azul de bromotimol.
Rojo de cresol.
Fenolftaleína.
Azul de timol.
Soluciones problema de pH desconocido.
PROCEDIMIENTO
A. Preparación de Escala Colorimétrica de pH Utilizando Indicadores

1. Para realizar la escala de pH en un intervalo de 3.6 - 10, se dividirá el grupo en 3 equipos cada uno de
los equipos preparará una serie de pH, en donde tendrán once valores de pH diferentes, a cada equipo
corresponde preparar lo siguiente:
Equipo No. 1 (Escala No. 1)

No. DE TUBO pH A PREPARAR CH3COOH 0.2 M CH3COONa 0.2 M
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ADICIONAR PRIMERO ADICIONAR
DESPUÉS
1 3.6 9.3 mL 0.7 mL
2 3.8 8.8 mL 1.2 mL
3 4.0 8.2 mL 1.8 mL
4 4.2 7.3 mL 2.7 mL
5 4.4 6.3 mL 3.7 mL
6 4.6 5.1 mL 4.9 mL
7 4.8 4.0 mL 6.0 mL
8 5.0 2.9 mL 7.1 mL
9 5.2 2.1 mL 7.9 mL
10 5.4 1.4 mL 8.6 mL
11 5.6 0.9 mL 9.1 mL
2. Después agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones:

A la primera serie de 5 tubos (tubos del 1 al 5) adicionar 5 gotas del indicador anaranjado de metilo y
agitar cada tubo. A los tubos 6 al 11 adicionar 5 gotas del indicador rojo de metilo y agitar los tubos.
Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores de pH obtenidos.
Ya preparados sus tubos colóquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos restantes terminen
de preparar sus tubos, para poder realizar la comparación de colores con sus problemas.

No. DE TUBO pH A PREPARAR KH2PO4 0.1 M NaOH 0.1 M H2O DESTILADA
ADICIONAR EN ADICIONAR EN ADICIONAR EN
1º LUGAR 2º LUGAR 3º LUGAR
12 6.0 5 mL 0.6 mL 4.4 mL
13 6.2 5 mL 0.8 mL 4.2 mL
14 6.4 5 mL 1.2 mL 3.8 mL
15 6.6 5 mL 1.7 mL 3.3 mL
16 6.8 5 mL 2.3 mL 2.7 mL
17 7.0 5 mL 2.9 mL 2.1 mL
18 7.2 5 mL 3.4 mL 1.6 mL
19 7.4 5 mL 3.9 mL 1.1 mL
20 7.6 5 mL 4.2 mL 0.8 mL
21 7.8 5 mL 4.5 mL 0.5 mL
22 8.0 5 mL 4.6 mL 0.4 mL

A los tubos del 12 al 18 adicionar 5 gotas del indicador azul de bromotimol y del 19 al 22 rojo de cresol,
y agitar los tubos. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores de
pH obtenidos.
Ya preparados sus tubos colóquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos restantes terminen
de preparar sus tubos, para poder realizar la comparación con sus problemas.
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No. DE TUBO pH A PREPARAR ÁC. BÓRICO-KCl NaOH 0.1 M H2O DEST.
0.1 M
ADICIONAR EN ADICIONAR EN ADICIONAR EN
1º LUGAR 2º LUGAR 3º LUGAR
23 8.2 5 mL 0.6 mL 4.4 mL
24 8.4 5 mL 0.8 mL 4.2 mL
25 8.6 5 mL 1.2 mL 3.8 mL
26 8.8 5 mL 1.6 mL 3.4 mL
27 9.0 5 mL 2.1 mL 2.9 mL
28 9.2 5 mL 2.7 mL 2.3 mL
29 9.4 5 mL 3.2 mL 1.8 mL
30 9.6 5 mL 3.7 mL 1.3 mL
31 9.8 5 mL 4.1 mL 0.9 mL
32 10.0 5 mL 4.4 mL 0.6 mL

A los tubos del 23 al 26 adicionar 5 gotas del indicador azul de timol y agitar cada tubo.
A los tubos del 27 al 32 adicionar 5 gotas del indicador fenolftaleína y agitar los tubos.
5. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores de pH obtenidos.
6. Ya preparados sus tubos colóquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos restantes terminen
de preparar sus tubos, para poder realizar la comparación con sus problemas.
7. Reúnanse los 3 equipos con las series de tubos que prepararon para llevar a cabo la determinación de
pH de sus problemas, primero mediante el potenciómetro y después por comparación visual con las
escalas colorimétricas preparadas, como se describe a continuación.
B. Medición del pH de las Soluciones Problema Usando el Potenciómetro
1. Mida el pH de la solución problema que le tocó a su equipo, usando el potenciómetro (previamente

calibrado) como se describe a continuación.
2. Con cuidado, saque el electrodo de vidrio del potenciómetro de la solución en que se encuentre
sumergido y enjuáguelo con agua destilada, recibiendo el enjuague en un vaso designado para
desechos.
3. Seque suavemente el agua en exceso del electrodo usando un pedazo de papel suave (papel sanitario).
4. Sumerja el electrodo en la solución problema y agite suavemente, con cuidado de no golpear la punta
del electrodo, hasta que la lectura de pH en la pantalla se estabilice. Anote el pH de la solución problema.
5. Con cuidado, saque el electrodo de la solución problema y enjuáguelo con agua destilada, recibiendo el
enjuague en el vaso de desechos.
6. Seque suavemente el agua en exceso del electrodo usando papel sanitario.
7. Sumerja el electrodo en un vaso con agua destilada para que enseguida lo usen sus demás compañeros.
C. Medición del pH de las Soluciones Problema Usando las Escalas Colorimétricas
1. Determine el pH de la solución problema que te tocó a su equipo, por medio de comparación visual con
las escalas colorimétricas, como se describe a continuación.
2. Tome 10 mL de la solución problema y colóquela en un tubo de ensaye.
3. Añada 5 gotas del indicador adecuado al valor de pH obtenido con el potenciómetro para ese problema.
Revise las tablas de preparación de las escalas colorimétricas que aparecen arriba, para saber cuál
indicador agregar a su problema. Agite por inversión.
4. Compare la coloración de la solución problema con la escala colorimétrica de pH adecuada de acuerdo
al valor de pH obtenido con el potenciómetro. No necesariamente será la escala colorimétrica que le
tocó preparar a su propio equipo. Anote el pH del tubo cuyo color más se parece al color de su solución
problema y anótelo en la tabla que aparece abajo.
RESULTADOS (HOJA DE TRABAJO Y REPORTE FINAL)

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Emisión: 16/06/2009
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1. Observe, describa, dibuje y/o tome fotografías de los distintos tonos que adquieren los indicadores en
cada uno de los valores de pH obtenidos.
2. Reportar los valores de pH obtenidos por ambos métodos en la siguiente tabla:
PROBLEMA pH POTENCIÓMETRO pH ESCALA

COLORIMÉTRICA
1
3. Establezca diferencias y similitudes entre los dos métodos empleados en esta práctica. ¿Qué tanto se
parecen los valores de pH obtenidos por cada técnica? ¿Cuál es más exacto y por qué? ¿Por qué no
salieron idénticos los valores?
CUESTIONARIO POST-PRÁCTICA
17 Código: FO-121500-20
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Emisión: 16/06/2009
18
PRÁCTICA No. 3
DETERMINACIÓN DEL pKa
OBJETIVOS
1. Caracterizar hasta donde sea posible varios ácidos débiles problema mediante la determinación de su
peso equivalente y su pKa.
2. Realizar la titulación potenciométrica de un ácido débil (ácido láctico), y elaborar su curva de titulación.
INTRODUCCIÓN
Sorensen (1909) adoptó el término de pH como una medida de la concentración de iones hidrógeno, y
lo definió como el logaritmo negativo (base 10) de la concentración de iones hidrógeno, expresada ésta
en moles por litro.
pH = log10 1/H+
pH = - log10 H+
Los ácidos débiles se ionizan ligeramente en solución, obteniéndose de esta forma un verdadero
equilibrio entre el ácido y su base conjugada. Si HA representa a un ácido débil monoprótico, entonces:
HA H+ + A-
De acuerdo con la Ley de Acción de Masas, la constante de disociación Ka se define como:
Ka = H+A-/HA
Despejando H+, y aplicando logaritmos negativos, se obtiene la llamada ecuación de Henderson-

Hasselbalch para dicho ácido débil:
pH = pKa + log A-/HA
Esta ecuación es especialmente útil para un intervalo de pH entre 4 y 10.

El pKa de un ácido es el logaritmo negativo de la constante de disociación de un ácido débil (Ka), y
por lo tanto también es una constante, con un valor característico para cada ácido. Otra forma de definir
pKa sería el valor de pH en el cual las concentraciones del ácido y de la base conjugada son iguales, o el
valor del pH obtenido cuando se ha titulado la mitad del ácido.
Valores de pKa de algunos ácidos.

Ácido Peso Molecular pKa
Salicílico 138.12 2.98
Mandélico 152.15 3.36
Hipúrico 179.10 3.64
Láctico 90.08 3.86
Barbitúrico 128.09 3.98
Benzoico 122.12 4.20
Acético 60.06 4.76
Hidroxilamina 34.0 6.03
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Emisión: 16/06/2009
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MATERIAL REACTIVOS
3 Pipetas volumétricas de 10 mL Hidróxido de potasio 0.02 N (500 mL)

1 Pipeta de 1mL Fenolftaleína
1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL Ácido láctico 0.14% (p/v) (10 mL por equipo)
1 Bureta Buffer de referencia pH 7
2 Vasos de precipitados de 50 mL Tres soluciones problema de ácido al 0.14%
1 Soporte (p/v) (15 mL de uno de los ácidos por equipo)
1 Pinzas para bureta
1 Probeta de 50 mL
1 Potenciómetro calibrado
PROCEDIMIENTO
A. Determinación del pKa

1. Tomar 20 mL de ácido problema y colocarlos en un matraz Erlenmeyer de 125 mL. Añadir 3 gotas de
indicador (fenolftaleína).
2. Titular con álcali diluido (KOH 0.02 N) agitando constantemente, hasta que se observe el vire del
indicador. El vire del indicador significa la aparición del primer color rosa-rojo que persista durante 3
segundos; no espere más tiempo a que el color rosa-rojo desaparezca, ya que después de más tiempo
en agitación sí desaparecerá. Esto se debe a que el CO 2 del aire forma H2CO3 al disolverse y reaccionar
con el agua, acidificando el medio y haciendo que el color rosa-rojo de la fenolftaleína se torne incoloro.
3. Calcular el peso equivalente de los ácidos titulados.
4. Medir otros 20 mL de cada ácido problema y colocarlo en un vaso de precipitados de 50 mL. Agregar a
cada ácido la mitad del volumen de álcali que se gastó en su titulación total.
5. Medir el pH de cada solución con el potenciómetro. Haga esta operación lo más rápido posible, ya que,
como se explicó en el punto 2, el medio tiende a acidificarse con el CO 2 del aire. Esta lectura de pH es
igual al pKa del ácido.
6. Comparando los datos experimentales con los de la tabla de la página anterior, se identificará el ácido
hasta donde sea posible.
B. Titulación Potenciométrica del Ácido Láctico con una Base Fuerte

1. Medir 8 mL de ácido láctico 0.14% y colocarlos en un vaso de precipitados de 50 mL.
2. Titular con KOH 0.02 N. Para titular se agregará el KOH en volúmenes de 0.5 mL. Cada que se agregue
0.5 mL de KOH 0.02 N con la bureta, agitar el vaso y medir el pH de esta solución.
3. Realizar la gráfica de la titulación potenciométrica (pH vs. equivalentes de KOH agregados).
A. Determinación del pKa
Tabular los resultados obtenidos para cada uno de los ácidos problema.
Problema mL de KOH pH del ácido Peso Nombre del

utilizados igual al pKa Equivalente ácido problema
1
B. Titulación Potenciométrica del Ácido Láctico con una Base Fuerte

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Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
20
En el siguiente cuadro, tabular los resultados obtenidos, y en una hoja de papel milimétrico o en
computadora (Excel) realizar la gráfica de la titulación potenciométrica (pH vs. equivalentes de KOH
agregados).
Compare la gráfica experimental obtenida en esta práctica, con la curva de titulación teórica del ácido
láctico obtenida de la literatura. Discuta las causas de las diferencias y similitudes.
Volumen de KOH 0.02 N Eje X Eje Y

añadido (mL) Equivalentes de KOH pH
0.0 0.0000
0.5 0.0625
1.0 0.1250
1.5 0.1875
2.0 0.2500
2.5 0.3125
3.0 0.3750
3.5 0.4375
4.0 0.5000
4.5 0.5625
5.0 0.6250
5.5 0.6875
6.0 0.7500
6.5 0.8125
7.0 0.8750
7.5 0.9375
8.0 1.0000
20 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
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PRÁCTICA No. 4
PREPARACIÓN DE UN BUFFER Y SU ACCIÓN AMORTIGUADORA
OBJETIVO
Preparar una solución buffer y observar su acción amortiguadora en comparación con la de un material
biológico.
INTRODUCCIÓN
La definición más general de una solución amortiguadora o buffer es que son soluciones que resisten
mucho los cambios de pH cuando se les añaden ácidos o bases. Casi siempre están formadas por ácidos
débiles y sus sales (bases conjugadas).
Al agregar iones hidrógeno en forma de un ácido fuerte a una solución amortiguadora, se descompone
la sal de la solución buffer y se forma un ácido débil que se disocia muy poco y por lo tanto no modifica el
pH en forma significativa. Cuando se añade a la misma solución amortiguadora iones OH - en forma de una
base fuerte, dichos iones reaccionan con el ácido de la solución buffer y se forma agua y una sal disociada,
que tampoco ejerce una notable variación del pH.
Ejemplo:
Se tiene una solución amortiguadora formada por un ácido débil (ácido acético) y una de sus sales
(acetato de sodio) en solución; el ácido acético está débilmente ionizado y el acetato de sodio está
fuertemente ionizado:
+ -
CH3COOH H + CH3COO
+ -
CH3COONa Na + CH3COO
-
La mayor parte de los iones CH3COO provienen del acetato de sodio; si se le añade un ácido fuerte,
por ejemplo HCl, la reacción que ocurre es la siguiente:
- + - -
CH3COO + H + Cl CH3COOH + Cl
Si a ese sistema se le añade una base fuerte, por ejemplo NaOH, se da la siguiente reacción:
+ - - +
CH3COOH + Na + OH CH3COO + Na + H2 O
Por lo que los cambios de pH son mínimos en ambos casos.
El pH de cualquier sistema amortiguador puede calcularse con la ecuación de Henderson-

Hasselbalch.
-
pH = pKa + log [CH3COO ] / [CH3COOH]
Las sustancias amortiguadoras o buffers tienen un papel importante para la regulación del pH en los
medios biológicos celulares y extracelulares. Su función es reducir al mínimo los cambios en la
concentración de iones hidrógeno y, por lo tanto, también en la concentración de iones hidróxido, cuando
se agregan pequeñas cantidades de ácidos o bases.
Para describir un sistema amortiguador se requieren dos parámetros:
1. El pH de la solución amortiguadora: El cual indica la región de concentración del ión hidrógeno en el cual
se realiza el efecto amortiguador (alrededor de +/- una unidad de pH amortiguador).
21 Código: FO-121500-20
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2. La capacidad amortiguadora: Es decir, la capacidad de resistir la adición de ácido o base con poco
cambio de pH, lo que se relaciona de manera directa con la concentración de todos los constituyentes
del amortiguador.
Para que los procesos bioquímicos se produzcan en forma adecuada es necesario que la concentración
de iones hidrógeno se controle con extrema precisión. Por ejemplo, el pH de la sangre se encuentra dentro
de los límites de 7.3 - 7.5 gracias en buena parte al sistema amortiguador bicarbonato / ácido carbónico.
Otro sistema importante son los grupos laterales de la histidina en la hemoglobina. En la saliva el sistema
ácido carbónico / bicarbonato y fosfato son primordiales.
Algunos amortiguadores y los rangos de pH en que actúan.

Ácido débil Base conjugada pH aproximado
Ácido fosfórico Fosfato diácido 1.8 – 3.8
Ácido acético Acetato de sodio 3.6 – 5.6
Ftalato ácido de potasio Ftalato de potasio 4.0 – 6.0
Fosfato diácido Fosfato monoácido 5.8 – 7.8
Ácido bórico Borato diácido 7.5 – 9.5
Fosfato monoácido Fosfato 10.5 – 12.0
4 vasos de precipitado de 100 mL Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) sólido

2 pipetas de 10 mL Fosfato monoácido de sodio (Na2HPO4) sólido.
4 pipetas de 5 mL NaOH 1 M y 0.1 M
6 vasos de precipitados de 50 mL HCl 1 M y 0.1 M
2 pipetas Pasteur con bulbo Albúmina de huevo al 2%, 75 mL por equipo.
1 Vaso de precipitados de 250 mL Agua destilada
1 Potenciómetro previamente calibrado
PROCEDIMIENTO
Experimento A. Preparación de la Solución Buffer de Fosfatos.

1. Realice los cálculos necesarios para preparar 250 mL de solución buffer de fosfatos 0.15 M pH 7.0.
Utilice la ecuación de Henderson-Hasselbalch para hacer dichos cálculos.
2. Pese las cantidades adecuadas de KH2PO4 sólido y de Na2HPO4 sólido y disuélvalos en un vaso de
precipitados de 250 mL con aproximadamente 200 mL de agua destilada.
2. Mida con el potenciómetro el pH de la solución preparada hasta obtener un pH de 7.0. Si fuera
necesario ajustar el pH, utilice HCl o NaOH 1 M y 0.1 M para lograr el pH solicitado. Una vez ajustado
el pH a 7.0, afore a 250 mL con agua destilada. Guarde su solución buffer para el Experimento B.
Experimento B. Acción Amortiguadora del Buffer Preparado y un Buffer Biológico.

1. Numerar una serie de vasos de precipitados de 50 mL del 1 al 6, y seguir con las indicaciones dadas
por la siguiente tabla:
VASO pH
SOLUCIÓN A COLOCAR ADICIONAR pH FINAL
No. INICIAL
1 20 mL H2O destilada 8 gotas HCl 0.1 N
2 20 mL solución buffer preparada 8 gotas HCl 0.1 N
3 20 mL albúmina de huevo 8 gotas HCl 0.1 N
4 20 mL H2O destilada 8 gotas de NaOH 0.1 N
5 20 mL solución buffer preparada 8 gotas de NaOH 0.1 N
6 20 mL de albúmina de huevo 8 gotas de NaOH 0.1 N
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1. Realizar primero la medición del pH de las soluciones que se indican en el vaso 1 al 6 antes de agregar
el HCl y el NaOH.
2. Después con el mismo potenciómetro determinar la capacidad amortiguadora de cada solución
midiendo el pH final después de la adición del ácido y la base fuerte.
1. Del experimento A, reportar el pH inicial (sin ajustar) y el pH final obtenido (ajustado) para la solución
buffer preparada. Explique la discrepancia, en caso de haberla.
2. Del experimento B, reportar en la tabla anterior el pH inicial y final obtenido para cada tubo y explicar
sus resultados obtenidos.
23 Código: FO-121500-20
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PRÁCTICA No. 5
SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
OBJETIVO
Separar una mezcla de compuestos químicamente semejantes para su identificación.
INTRODUCCIÓN
En 1903, el botánico ruso Mikhail Tswett elaboró la primera técnica para separar distintos componentes
coloreados de un extracto vegetal. A esta técnica se la ha dado el nombre de cromatografía debido a que
la separación de las sustancias da diferentes colores.
Existen diferentes tipos de cromatografía. La cromatografía en papel es una forma sencilla que ha
llegado a ser un instrumento analítico extraordinariamente valioso para el químico orgánico y para el
bioquímico. En esta técnica se emplea papel filtro, una gota de solución que contiene la muestra y que se
coloca en cierto punto sobre el papel de donde hay una migración como resultado de flujo por una fase
móvil. El movimiento de la fase móvil es causado por fuerzas capilares. La gravedad también contribuye al
movimiento.
Puede decirse que la cromatografía en papel es un tipo de cromatografía por partición en el que la fase
estacionaria es agua absorbida sobre la superficie hidrofílica del papel. Un disolvente orgánico actúa como
fase móvil. Por tratamiento apropiado del papel, el agua puede ser sustituida por una fase líquida
estacionaria no polar; pueden usarse soluciones acuosas como reveladores. En otra variación, el papel es
impregnado con sílice anhidra o una resina de intercambio de iones.
La trayectoria de una muestra se puede describir en función de su factor de retardo o relación de frentes
que se define como:
Factor de retardo = Rf = Distancia del movimiento del soluto

Distancia del movimiento del solvente
Para compensar las variables no controladas, la distancia recorrida por un soluto se compara
frecuentemente con la de una sustancia estándar en idénticas condiciones.
La cromatografía presta valiosa ayuda en el análisis de sustancias complejas muy diversas, tales como
aminoácidos, proteínas, carbohidratos, ácidos grasos, compuestos fenólicos, fármacos, etc.
MATERIAL REACTIVOS
2 Tiras de papel filtro (fase estacionaria) Fase móvil: mezcla de butanol: ácido acético:
2 Frascos con fase móvil y tapa agua (4:1:1, v/v/v)
1 Parrilla eléctrica Soluciones de aminoácidos recientemente
preparadas: leucina y ácido aspártico
Solución reveladora de ninhidrina
(recientemente preparada).
PROCEDIMIENTO
1. En un extremo del papel filtro, hacer dos pequeñas marcas con lápiz a un extremo del borde y
separarlas entre sí una distancia de un centímetro.
2. Poner una gota en una de las marcas señaladas del aminoácido No. 1.
3. Repetir la operación con una gota del aminoácido No. 2.
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4. En otro papel repetir lo mismo de los pasos anteriores pero colocando primero una gota del aminoácido
No. 1 y sobre ella una gota del aminoácido No. 2.
5. Introduzca las tiras de papel filtro en un frasco o vaso que contenga la fase móvil (utilice un frasco para
cada tira).
6. Deje avanzar el frente de la fase móvil hasta aproximadamente 1 cm antes de que llegue al borde
superior.
7. El profesor del curso mostrará al grupo algunos videos sobre la cromatografía líquida de alta resolución
y la cromatografía de gases durante el tiempo de desarrollo de la cromatografía de aminoácidos en
papel.
8. Una vez que la fase móvil haya alcanzado la movilidad deseada, saque las tiras de papel filtro de los
frascos y séquelas al aire en la campana de extracción de humos. Tenga cuidado de que el viento que
se genera en el interior de la campana no arrastre y se lleve el papel filtro (sujételo con masking tape).
Una vez seco el papel, rociar con solución de ninhidrina (revelador específico para aminoácidos). Dejar
secar nuevamente.
9. Calentar las hojas de papel filtro en una parrilla eléctrica o en un horno de secado (tener cuidado de no
quemarlas) hasta la aparición de manchas coloreadas. Ellas representan el sitio donde se encuentran
los aminoácidos que reaccionaron con la ninhidrina.
1. Medir la distancia desde el punto de colocación de la solución de los aminoácidos al centro de las
manchas (d).
2. Medir la distancia del sitio de colocación de los aminoácidos al sitio donde llegó el solvente (D).
3. Calcular el Rf para cada aminoácido, de acuerdo a la siguiente fórmula:
Rf = d/D
4. El Rf se calculará para cada uno de los aminoácidos individuales y para la mezcla.
5. Identificar cada aminoácido.
6. ¿Cuál corrió más y por qué?
25 Código: FO-121500-20
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PRÁCTICA No. 6
PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS
OBJETIVOS
1. Demostrar algunas propiedades de las proteínas por medio de algunas pruebas cualitativas.
2. Verificar comportamiento en reacciones de precipitación y desnaturalización.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son las moléculas orgánicas más abundantes en el interior de las células, pues
constituyen el 50% o más de su peso seco. Son fundamentales en todos los aspectos de la estructura
celular y de su función puesto que constituyen los instrumentos moleculares mediante los cuales se expresa
la información genética. Las proteínas contienen carbono, hidrógeno, nitrógeno y oxígeno y casi todas
también azufre; hay proteínas que contienen elementos adicionales tales como fósforo, hierro, zinc y cobre.
Su peso molecular es desde 10,000 hasta más de 1 millón de daltones (unidades de masa atómica); el
límite superior del peso molecular de las proteínas sólo puede ser establecido arbitrariamente ya que
depende de la definición de los términos proteína y molécula, como veremos adelante. Las proteínas por
hidrólisis dan aminoácidos.
Las proteínas dan reacciones de color con algunos reactivos. Estos colores no son específicos de la
mismas, sino de algunos de los aminoácidos que las constituyen. Las proteínas forman precipitados con
sales de metales pesados, así como con algunos ácidos inorgánicos y con algunos colorantes; lo anterior
se debe en parte a la formación de complejos y en parte a las propiedades coloidales de las mismas.
Las proteínas son sustancias anfotéricas, combinándose tanto con ácidos como con bases, dando como
resultado sales ionizables. Generalmente son insolubles en su punto isoeléctrico y algunas son coagulables
por el calor, ácidos inorgánicos y alcohol etílico.
Las reacciones para la identificación de las proteínas se dividen en dos grandes grupos:
1. Reacciones de coloración
2. Reacciones de precipitación
1. Reacciones de Coloración
a) Reacción de Millon: Esta reacción emplea el reactivo del mismo nombre, que es una solución de nitratos
mercúrico y mercuroso. Este reactivo nos da un precipitado color blanco que por la acción del calor toma
un color rosado. Es positiva para todas aquellas proteínas o péptidos que contengan tirosina y fenoles.
b) Reacción Xantoproteica: Esta prueba consiste en tratar la proteína con ácido nítrico concentrado y
calentar. El precipitado toma un color amarillo que por la acción del amoníaco pasa a color naranja; esta
reacción es positiva para todos aquellas proteínas que contienen en su molécula núcleos aromáticos.
c) Reacción de Biuret: Se trata la proteína con solución concentrada de sosa para alcalinizar fuertemente;
luego se agregan unas dos o tres gotas de solución diluida de sulfato de cobre; el líquido toma una
coloración violeta. Esta reacción es positiva para los péptidos o proteínas que contienen los siguientes
radicales: -CO-NH2;CH2-NH2-;-C(NH)NH2.
d) Reacción de Ninhidrina: Este es un revelador de aminoácidos. Las soluciones con aminoácidos

presentan coloración morada al agregar ninhidrina y calentar. Reacción específica para el grupo amino que
debe ser alfa respecto al grupo carboxilo.
2. Reacción de Precipitación
a) Desnaturalización: Muchas moléculas proteicas sólo retienen su actividad biológica dentro de una
fluctuación muy limitada de temperatura y de pH. La exposición de proteínas solubles o globulares a pH
extremos, o a temperaturas elevadas, les hace experimentar un cambio conocido como desnaturalización.
La consecuencia más significativa de la desnaturalización es que las proteínas pierden su actividad
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Emisión: 16/06/2009
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biológica característica. Algunos agentes desnaturalizantes son la temperatura, los ácidos y bases fuertes,
el etanol y iones de metales pesados.
MATERIAL REACTIVOS
1 Gradilla Reactivo de Millon

18 Tubos de ensaye de 13 x 100 mm Ácido nítrico concentrado
2 Pipetas de 10 mL Hidróxido de sodio 0.1 M
3 Pipetas de 5 mL Hidróxido de sodio 1 M
2 Pipetas Pasteur con bulbo Hidróxido de amonio concentrado
1 Perilla Sulfato de cobre saturado (Fehling A)
1 Recipiente para baño María Solución de ninhidrina 0.1% (recién preparada)
1 Vaso de precipitados de 250 mL Ácido clorhídrico concentrado
1 Parrilla Solución de acetato de plomo al 1% (p/v)
Latas para calentar tubos a baño María Ácido clorhídrico 0.1 N
Alcohol etílico absoluto
Solución de gelatina al 2%
Solución diluida de albúmina de huevo
Agua destilada
Ácido tricloroacético al 20% (p/v)
Sulfato de amonio en cristales
Fenol al 20% (p/v)
PROCEDIMIENTO
A. Pruebas de Coloración
1) Prueba con Reactivo de Millon: Coloque en tres tubos de ensaye las siguientes soluciones:
Tubo 1 Solución de albúmina (1 mL)

Tubo 2 Solución de gelatina (1 mL)
Tubo 3 Agua destilada (control) (1 mL)
Después adicione 5 gotas del reactivo de Million a cada uno de los tubos. Caliente la mezcla en baño
térmico. Observar y anotar cualquier cambio observado. La reacción es positiva con la aparición de un
precipitado blanco que por acción del calor toma un color rosado.
2) Reacción Xantoproteica: Coloque en tres tubos de ensaye las siguientes soluciones:

Es necesario calentar los tres tubos a baño María por 3 min; luego se agrega a cada uno 0.3 mL de
ácido nítrico concentrado (dejándolo resbalar por las paredes del tubo con cuidado). Enfríe los tubos y
agregue cuidadosamente gota a gota la solución de hidróxido de amonio concentrado, observar y anotar
cualquier cambio observado. La reacción positiva consiste en la formación de un precipitado amarillo
que por acción del amoníaco pasa a color anaranjado.
3) Reacción de Biuret: Coloque en tres tubos de ensaye las siguientes soluciones:

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Agregar a cada tubo 0.3 mL de hidróxido de sodio 1 M; mezclar y adicionar gota a gota solución de
sulfato de cobre. Observe y anote cualquier cambio observado. La reacción positiva es la formación
de una coloración violeta.
4) Prueba de la Ninhidrina: Coloque en tres tubos las siguientes soluciones:

Agregar a cada tubo 0.3 mL de solución de ninhidrina y calentar en baño María hirviente. Anote
cualquier cambio observado. La reacción positiva es la formación de una coloración violeta.
2. Prueba de Precipitación, Coagulación y Desnaturalización
Prepare seis tubos de ensaye de acuerdo a las siguientes indicaciones:
Sustancia a adicionar Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6

Solución de albúmina 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Agua destilada --- --- 0.5 mL --- --- ---
HCl 0.1 M 0.5 mL --- --- --- --- ---
NaOH 0.1 M --- 0.5 mL --- --- --- ---
Ácido tricloroacético 20% --- --- --- 0.5 mL --- ---
Sulfato de amonio cristales --- --- --- --- 0.5 g ---
Fenol al 20% 0.5 mL
¿En qué tubo aparece precipitado? A los tubos 1 y 2 adicione 2 mL de solución de acetato de plomo.
Anote los resultados observados. Después coloque los 6 tubos en baño María hirviente durante 15 min
y, después de este lapso de tiempo, enfríe a temperatura ambiente. ¿En qué tubo aparece precipitado?
1. Describa con dibujos, figuras, diagramas, fotografías y texto todo lo observado en la práctica.
2. Consulte y escriba todas las reacciones de todas las pruebas efectuadas en la práctica. En base a
estas reacciones, explique en detalle lo observado en la práctica.
28 Código: FO-121500-20
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PRÁCTICA No. 7
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BIURET
OBJETIVO
Determinar espectrofotométricamente la concentración de proteína de una solución problema, usando

una curva estándar (curva patrón o de calibración).
INTRODUCCIÓN
Cuando un compuesto que contiene dos o más grupos carbamino, unidos directamente o separados
por un solo átomo de C o N, es colocado en una solución alcalina con sales de cobre, se forma un complejo
de color violeta. Esta reacción constituye la base del método cuantitativo de Biuret para determinación de
proteína. Esta determinación debe hacerse en ausencia del ión NH 4+, el cual produce un color que causa
interferencia.
MATERIAL REACTIVOS
8 Tubos de ensaye de 18 x 150 mm Solución patrón de proteína (10 mg de

1 Gradilla para tubos de ensaye albúmina/mL)
1 Pinzas para tubo de ensaye
1 Baño María a 50 °C Solución de NaCl al 0.9% (p/v)
1 Pipeta de 1 mL
1 Pipeta de 5 mL Reactivo de Biuret
1 Celdilla de plástico, de 3.5 mL
1 Espectrofotómetro a 540 nm Solución problema
PROCEDIMIENTO
1. Prepare 8 tubos de ensayo de la manera siguiente:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8
Blanco Problema
Problema 0 0 0 0 0 0 0 1.0
(mL)
Solución 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 0
patrón de
proteína
(mL)
Sol. NaCl 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 2.0
0.9% (mL)
Reactivo de 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Biuret (mL)
Conc. de 0 2 4 6 8 10 12 ¿?
proteína
(mg/mL)
2. Caliente los tubos en el baño María (50 ºC) durante 10 min.

3. Enfríe los tubos en agua corriente.
4. Calibre el espectrofotómetro a cero de absorbancia a 540 nm usando el tubo blanco (tubo # 1).
5. Enseguida proceda a determinar la absorbancia a 540 nm de cada uno de los tubos que contienen
concentraciones conocidas de proteína (estándares, tubos # 2 al 7).
29 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
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6. Finalmente determine la absorbancia a 540 nm del tubo problema (tubo # 8).
7. Tabule las concentraciones de proteína (mg/mL) de los tubos # 2 al 7 contra sus respectivas
absorbancias.
1. En base a la tabla de resultados, dibuje la curva patrón (concentración de proteína vs. absorbancia), ya
sea en papel milimétrico o grafíquela en la computadora (Microsoft Excel).
2. Determine la concentración de proteína (mg/mL) de la solución problema interpolando gráficamente la

curva patrón.
3. Usando el material proporcionado por el profesor, calcule los coeficientes de regresión de la ecuación
de la línea recta que mejor se ajusta a todos los puntos experimentales, determinada por el método de
mínimos cuadrados. Calcule también el coeficiente de correlación. ¿Qué tan bueno fue el ajuste entre
la recta y los puntos experimentales? Utilice el coeficiente de correlación como criterio para seleccionar
el conjunto de puntos experimentales que dan una recta teórica con la mejor bondad de ajuste a dichos
puntos, determinando así el rango útil de su curva de calibración.
4. En una misma gráfica (papel milimétrico o Excel), represente los puntos experimentales obtenidos (sin
unirlos con líneas) y la recta teórica de mejor ajuste, mostrando su ecuación.
5. Calcule la concentración de proteína del problema usando la ecuación anteriormente mencionada. ¿Qué
tanto se parece a la concentración de proteína interpolada gráficamente? Explique en detalle las
discrepancias y/o similitudes.
30 Código: FO-121500-20
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Emisión: 16/06/2009
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PRÁCTICA No. 8
EFECTO DEL pH, TEMPERATURA Y AGENTES QUÍMICOS SOBRE LA SOLUBILIDAD
DE LAS PROTEÍNAS DE LA LECHE
OBJETIVO
Analizar la influencia del pH (punto isoeléctrico), la temperatura y diversos agentes químicos sobre la
solubilidad de las proteínas de la leche.
INTRODUCCIÓN
El punto isoeléctrico es el pH en el cual la carga neta de los grupos disociables (carboxilo y amino, entre
otros) es igual a cero. Como las fuerzas de repulsión en este punto son mínimas, las proteínas tienden a
agregarse con una consecuente precipitación final. Este punto es útil para separar e identificar proteínas y
péptidos.
Cabe aclarar que no todas las proteínas son insolubles en el punto isoeléctrico.
Cuando los valores de pH están por encima o por debajo del punto isoeléctrico, todas las moléculas de
proteína poseen una carga eléctrica, lo que impide que formen agregados insolubles, haciéndose reversible
la precipitación por punto isoeléctrico.
MATERIALES REACTIVOS
1 Probeta graduada de 50 ó 100 mL Leche descremada (aprox. 2 g de grasa/L).

1 Vaso de precipitados de 100 mL Ácido acético al 50% (v/v)
1 Matraz Erlenmeyer de 50 mL NaOH 0.1 M
Agitador de vidrio HCl 0.1 M
9 tubos de microcentrífuga de 2 mL (por equipo) Ácido tricloroacético al 80% (p/v)
1 Micropipeta de volumen variable de 100-1000 μL Etanol absoluto
Puntas de micropipeta azules (de 1 mL)
Palillos de plástico
1 Termómetro
1 Pipeta Pasteur de plástico
Tirillas de papel indicador de pH
1 Gradilla para tubos de microcentrífuga
1 Baño de agua hirviendo (vaso de 250 mL ó lata)
1 Microcentrífuga
1 Parrilla de calentamiento
PROCEDIMIENTOS
Experimento A. Precipitación de la Caseína de la Leche por pH Isoeléctrico

1. Mida 50 mL de leche descremada y colóquelos en un vaso de precipitados de 100 mL. Añadiendo
lentamente gota a gota y agitando ácido acético al 50%, ajuste el pH de la leche a pH 4.5 (éste es
aproximadamente el punto isoeléctrico de la caseína). Es importante que la adición de ácido acético sea
lenta (gota a gota) ya que esto promueve la formación de pocos núcleos de proteína precipitada y por
lo tanto la subsecuente formación de un precipitado de tamaño de partícula grande, fácilmente
precipitable.
2. Caliente hasta 40 ºC y deje reposar por 10 min. El reposo es importante para que se forme el precipitado.
Registre sus observaciones y discútalas en su reporte complementario en la sección de Discusiones.
3. Coloque 1.5 mL de la suspensión en cada uno de 3 tubos de microcentrífuga de 2 mL y centrifugue a
velocidad máxima (aprox. 12,000 rpm) por 3 min. Marque el nivel de la proteína precipitada con un
plumón indeleble en el tubito.
4. Transfiera los 3 sobrenadantes a un matraz Erlenmeyer de 50 mL limpio. Esta solución sobrenadante
será utilizada en el Experimento B.
5. Añada 1.5 mL de NaOH 0.1 M a la proteína precipitada en uno de los tubos de microcentrífuga y 1.5 mL
de HCl 0.1 M a la proteína precipitada en otro de los tubitos. Agite con palillo de plástico ambos tubos
para mezclar y agite por inversión ambos tubitos por 5 min. Centrifugue ambos tubos a velocidad
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Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
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máxima (aprox. 12,000 rpm) por 3 min. Vuelva a marcar el nivel de la proteína precipitada con un plumón
indeleble en los tubitos.
6. Comparando las marcas hechas en los tubos (tamaños de los precipitados), observe y registre si la
proteína se disolvió o no y estime cuánto se disolvió en cada tubo. Mida con papel indicador el pH
aproximado de cada solución sobrenadante. Explique sus observaciones en la sección de Discusiones.
Experimento B. Efecto de la Temperatura y de Agentes Químicos sobre la Solubilidad de las

Proteínas de la Leche
1. Coloque 1 mL del sobrenadante obtenido en el paso 4 del Experimento A en cada uno de 2 tubos de
microcentrífuga de 2 mL. Márquelos con los números 1 y 2.
2. Coloque 1 mL de leche descremada en cada uno de 2 tubos de microcentrífuga de 2 mL. Márquelos
con los números 3 y 4.
3. Trate los 4 tubos como sigue:
Tubos 1 y 3) Caliente en baño de agua hirviendo por 5 min. Enfríe los tubos en el chorro de agua de la
llave; centrifugue ambos tubos a velocidad máxima (aprox. 12,000 rpm) por 3 min. y registre si hubo
precipitación o no.
Tubos 2 y 4) USANDO LENTES DE SEGURIDAD Y GUANTES DE LATEX, añada 200 μL de ácido

tricloroacético al 80% a cada tubo. Agite por inversión por 1 min y centrifugue ambos tubos a velocidad
máxima (aprox. 12,000 rpm) por 3 min. Observe y registre si hubo precipitación o no.
4. Coloque 0.5 mL del sobrenadante obtenido en el paso 4 del Experimento A en un tubo de microcentrífuga
de 2 mL y márquelo con el número 5. Coloque 0.5 mL de leche descremada en un tubo de
microcentrífuga de 2 mL y márquelo con el número 6.
5. Añada 1 mL de etanol absoluto a cada tubo y agite suavemente por inversión por 1 min para mezclar.
Centrifugue ambos tubos a velocidad máxima (aprox. 12,000 rpm) por 3 min. Observe y registre si hubo
precipitación o no.
4) Explique sus observaciones en la sección de Discusiones.
1. Registre y reporte con detalles todas las observaciones y cambios observados en la práctica.
2. Explique y discuta las razones (fundamentos) por las cuales ocurrieron los cambios observados.
3. ¿Qué le pasa a la caseína precipitada por pH isoeléctrico al adicionársele NaOH 0.1 M ó HCl 0.1 M?
CUESTIONARIO
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PRÁCTICA No. 9
PROPIEDADES QUÍMICAS DE CARBOHIDRATOS
OBJETIVO
Caracterizar un carbohidrato problema, hasta donde sea posible, mediante algunas pruebas químicas
cualitativas.
INTRODUCCIÓN
Los azúcares se comportan como ácidos débiles y tienen las características químicas de aldehídos Por
ello, los álcalis aumentan la ionización de los azúcares.
La tautomerización es una reacción típica de los azúcares, los cuales contienen un grupo aldehído libre
o un grupo cetónico. En ausencia de álcali existe un equilibrio entre las formas enólicas y cetónicas,
predominando estas últimas. Cuando se les añade álcali, los enoles ácidos forman una sal y, por efecto de
la acción de masas, se desplaza el equilibrio hacia la derecha. La adición de ácido a una mezcla en
equilibrio alcalino, reestablece el equilibrio tautomérico hacia la forma cetónica.
Otra reacción importante es la que ocurre entre el grupo carbonilo y un alcohol, formando enlaces
hemiacetales y acetales.
Un monosácarido posee ambos grupos funcionales (carbonilo y alcohol) en su molécula y pueden
reaccionar con otros azúcares. La reacción puede ocurrir dentro de una misma molécula de azúcar, dando
paso a la formación de hemiacetales cíclicos. Ahora bien, muchas de las propiedades de los azúcares
simples sólo pueden ser explicadas suponiendo la formación del anillo, siendo ésta la formación del anillo
al favorecer la formación de la sal enólica.
MATERIAL REACTIVOS
1 Gradilla Reactivo de Molisch (solución de alfa-naftol en

16 Tubos de ensaye etanol.
3 Pipetas de 1 mL H2SO4 concentrado.
3 Pipetas de 5 mL Solución de Benedict (contiene sulfato cúprico,
4 Pipetas Pasteur con bulbo carbonato de sodio y citrato de sodio).
1 Baño María Reactivo de Barfoed (sulfato cúprico y ácido
1 Soporte completo láctico disueltos en agua).
1 Mechero y ligas Reactivo de ácido fosfomolíbdico.
Reactivo de Seliwanoff (resorcinol en ácido
clorhídrico).
Soluciones de: glucosa, fructosa, galactosa,
maltosa, lactosa, sacarosa, almidón e inulina
(1% p/v).
PROCEDIMIENTO
A. Prueba de Molisch (presencia de carbohidratos)

La acción depende de la formación de furfural y sus derivados por la acción deshidratante del ácido
concentrado sobre un carbohidrato. El furfural se combina con alfa-naftol para formar un compuesto
colorido violeta/morado. Aunque no es una prueba específica para carbohidratos, un resultado negativo
(ausencia de color) sugiere la ausencia de estos compuestos.
1. A 0.5 mL de cada solución, añadir una gota de reactivo de Molisch; agitar muy bien.
2. Incubar los tubos en baño María hirviendo por 5 min.
3. Añadir, muy cuidadosamente por las paredes, gota a gota y sin agitar para que se formen dos capas,
ácido sulfúrico concentrado (aprox. 0.5 a 1.0 mL) hasta obtener un cambio de color en la interfase entre las
dos capas.
33 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
34
B. Prueba de Benedict (azúcares reductores)

1. A la solución de Benedict (1.5 mL), añada exactamente 0.25 mL de cada una de las soluciones que
van a ser probadas.
2. Sumerja los tubos en un baño de agua hirviente durante 10 min.
3. Luego, permita que se enfríen lentamente.
4. Observe color y si se formó un precipitado rojo ladrillo.
5. Un cambio en el color de una solución no indica un resultado positivo.
6. Deberá producirse un precipitado (o turbidez) de color naranja o rojo ladrillo.
7. Anote sus resultados.
C. Prueba de Barfoed (monosacáridos)

La prueba sirve para detectar monosácaridos en presencia de disacáridos. La reacción de Barfoed
difiere de la de Benedict en que la reducción ocurre en medio ácido.
IMPORTANTE: Los disacáridos también responderán a la prueba si la solución de azúcar es hervida
durante el tiempo suficiente para producir hidrólisis.
1. Añada a 0.25 mL de cada una de las soluciones de carbohidratos, 0.25 mL del reactivo de Barfoed.
2. Hacer un tubo control: 0.25 mL de agua + 0.25 mL de la solución de Barfoed.
3. Agite los tubos y póngalos en baño de agua hirviendo por 10 min o hasta que haya cambio de color.
4. Añadir a cada tubo 0.5 mL de reactivo de ácido fosfomolíbdico. Agitar.
5. Un color azul oscuro es indicativo de la presencia de monosacáridos.
D. Prueba de Seliwanoff (cetosas)

Esta prueba depende de la formación del 4-hidroximetil-furfural y de su reacción posterior con el
resorcinol (1,3-dihidroxi-benceno), de la que resulta un compuesto de color rojo cereza.
En general la prueba es específica para cetosas; sin embargo, grandes cantidades de glucosa u otros
azúcares pueden interferir produciendo compuestos de color similar.
1. A 0.5 mL del reactivo de Seliwanoff añadir 3 gotas de las soluciones que se van a probar.
2. Calentar en baño de agua hirviendo hasta que haya cambio de color (aprox. 10 min).
3. Observar el color desarrollado.
1. Registrar todos los resultados y observaciones en una tabla.

2. Incluir en la tabla los resultados obtenidos para la solución problema.
3. Discutir, para cada una de las soluciones problema:
a) ¿Contiene carbohidratos?
Si la respuesta es afirmativa:
b) ¿Se trata de un carbohidrato reductor?
c) ¿Es un monosacárido?
d) ¿Es una cetosa?
4. Hacer una lista de todos los carbohidratos posibles. Revisar una a una las pruebas, y dependiendo de si
dio positivo o no, tomando en cuenta para qué sirve cada prueba, ir eliminando las opciones que no
pueden ser. Al final mencionar qué posible(s) carbohidrato(s) había en cada una de las muestras
problema.
34 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
35
PRÁCTICA No. 10
AISLAMIENTO DE GLUCÓGENO HEPÁTICO
OBJETIVOS
1. Aislar glucógeno mediante digestión alcalina y precipitación alcohólica, a partir de hígados de rata
alimentada normalmente y de rata en ayuno.
2. Llevar a cabo la hidrólisis ácida del glucógeno aislado para el posterior análisis de la glucosa, en la
práctica siguiente.
3. Determinar el efecto del estado de alimentación o ayuno de las ratas sobre la concentración de
glucógeno en hígado.
INTRODUCCIÓN
Los seres vivos almacenan hidratos de carbono en forma de polisacáridos, que sirven como materiales de
reserva. El almidón, la inulina y otros glicanos en los vegetales superiores, y el glucógeno en los animales.
El glucógeno consta de unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa(1-4) y cada 8 ó 10
unidades de glucosa se ramifica mediante un enlace glicosídico alfa(1-6).
El glucógeno es especialmente abundante en el hígado y en músculo, donde su concentración está
determinada por el estado de alimentación del animal, su actividad física, y otros factores. El glucógeno
puede ser aislado de dichos tejidos por digestión con álcalis fuertes y concentrados, en virtud de la
estabilidad de los enlaces glicosídicos a dichas condiciones, para luego ser precipitado con etanol.
Esta práctica consiste en el aislamiento de glucógeno hepático de rata por digestión alcalina, seguido por
precipitación etanólica e hidrólisis ácida que despolimeriza al glucógeno y genera una disolución ácida de
glucosa (hidrolizado). El hidrolizado obtenido será analizado en la siguiente práctica para cuantificar la
glucosa liberada, y determinar el efecto del estado de alimentación de las ratas de donde se obtuvo el
glucógeno.

Una rata alimentada ad libitum KOH al 30%
Una rata en ayuno durante 24 horas Na2SO4 al 15%
Equipo y material de disección Etanol absoluto
2 Tubos graduados de 14 mL, de plástico H2SO4 5 N
1 Gradilla y 1 pinzas para tubos Agua destilada
2 Pipetas Pasteur con bulbos de látex Fenolftaleína
1 Pipeta de 1 mL y 1 de 5 mL NaOH 5 N
Papel indicador de pH de 1-14 H2SO4 1 N
Balanza analítica Buffer de fosfatos 0.2 M, pH 7
Baño de agua hirviendo
Campana de extracción de humos
Centrífuga clínica
Baño de hielo
PROCEDIMIENTO
I. Extracción del glucógeno de una muestra hepática

1. Pesar aproximadamente 1 g de hígado de rata (alimentada o en ayuno) en una balanza analítica. En
el caso del hígado de rata en ayuno, se cuidará que el peso sea de aprox. 1.5 g.
Dato Nº 1: PESO EXACTO DE LA MUESTRA DE HÍGADO (gramos)
2. Se coloca la muestra en un tubo de ensayo de 10-14 mL, de vidrio o de plástico translúcido. Usando
guantes de látex y lentes de seguridad, añadir 2 mL de KOH al 30% y calentar en un baño de agua
hirviendo durante 10 min con agitación ocasional, en una campana de extracción de humos, hasta
la completa digestión del tejido (que no queden partículas en suspensión).
35 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
36
3. Centrifugar 5 min a 3000 rpm en una centrífuga clínica o en una microcentrífuga, para eliminar los restos
de tejido no digerido.
4. Pasar cuidadosamente el sobrenadante por decantación, a un tubo de plástico graduado, al que se le
añaden 0.2 mL de Na2SO4 al 15%, y 4 mL de etanol absoluto. Agitar cuidadosamente la mezcla para
poner en contacto a todos los componentes. Dejar reposar el tubo en baño de hielo por 10 min, para
provocar la precipitación del glucógeno extraído.
5. Centrifugar 5 min a 3000 rpm para sedimentar el glucógeno. Desechar con sumo cuidado el
sobrenadante y retener el precipitado o sedimento de color marrón-blanco, puesto que esto es el
glucógeno.
Nota.- La purificación completa del glucógeno implicaría tres o cuatro precipitaciones alcohólicas y una
precipitación ácida, pero en esta práctica haremos sólo una precipitación alcohólica.
II. Hidrólisis ácida del sedimento de glucógeno

1. Al sedimento de glucógeno obtenido en el tubo graduado, se le añade 1 mL de H2SO4 5 N (usar guantes
y lentes de seguridad) para proceder a su hidrólisis ácida y para ello se calienta la disolución
cuidadosamente a 100°C durante 45 min, en una campana de extracción de humos. Como el ácido
puede saltar en la ebullición, es conveniente poner en la parte superior del tubo papel filtro enrollado,
para que absorba el ácido si éste salta y evitar riesgos. Tener en cuenta que en este tratamiento es
donde se está obteniendo la glucosa que después se va a valorar, por lo cual no conviene perder
muestra.
2. Aforar a 2 mL con agua destilada y añadir 3 gotas de fenolftaleína para que actúe de indicador en la
posterior neutralización.
3. NEUTRALIZACIÓN: Usando guantes y lentes de seguridad, añadir gota a gota 0.8 a 1 mL máximo
de NaOH 5 N y agitar bien hasta que aparezca un color rosa, indicativo de un pH próximo a 10. Es
posible que el color rosa de la fenolftaleína no aparezca y que sin embargo el pH sea mayor a 10. En
este punto, cheque el pH de la suspensión con una tirilla de papel indicador de pH. Si el pH es menor a
10, añada una gota más de NaOH 5 N hasta que el pH sea mayor a 10. Si el pH es mayor a 10, añadir
entonces, gota a gota H2SO4 1 N, agitando después de cada adición, hasta que aparezca y/o se pierda
el color rosa de la fenolftaleína, lo que indicará que la muestra está neutralizada, a pH próximo a 7. Aquí
se debe comprobar nuevamente el pH de la muestra con papel indicador.
4. A continuación se añade 1 mL de buffer de fosfatos 0.2 M, pH 7. Aquí se debe de anotar el volumen de
la disolución (hidrolizado de glucógeno), puesto que es la disolución problema donde se va a determinar
la concentración de glucosa proveniente del glucógeno extraído.
5. Guardar los hidrolizados en el congelador hasta su análisis en la próxima práctica.
Dato Nº 2: VOLUMEN DE LA SOLUCIÓN PROBLEMA (mL)

1. Describa sus observaciones de cada paso de la obtención del glucógeno, anotando apariencia y color
de las muestras, hidrolizados, precipitados, etc.
2. Reporte el peso exacto de hígado utilizado, si fue de rata alimentada o en ayuno, y el volumen final de
hidrolizado de glucógeno.
36 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
37
PRÁCTICA No. 11
PREPARACIÓN DE UNA CURVA PATRÓN PARA GLUCOSA
OBJETIVOS
1. Preparar una curva patrón para glucosa.

2. Determinar la concentración de glucosa de una solución problema, interpolando la curva patrón.
INTRODUCCIÓN
Una curva patrón se construye al graficar valores conocidos de concentración de una sustancia de
interés contra las unidades obtenidas al aplicar a dicha sustancia un método químico cuantitativo. Por
ejemplo, en un medio alcalino la glucosa reduce al cobre cúprico, para formar óxido cuproso insoluble el
cual, a su vez, puede reducir al fosfomolibdato formándose un ión colorido. La intensidad del color depende
de la cantidad de glucosa presente; la absorbancia de dicha solución puede determinarse
colorimétricamente. Al graficar la absorbancia medida versus concentraciones conocidas de glucosa se
construye de una curva patrón. Ahora bien, si se tiene una solución problema de glucosa se le puede
someter al mismo procedimiento que a las soluciones de concentración conocida. Posteriormente, la
absorbancia de la solución problema puede interpolarse en la curva patrón para determinar su
concentración.
Bases químicas:
Al hacer reaccionar glucosa (agente reductor) con sulfato cúprico en medio alcalino, se forma óxido
cuproso (color rojo). El óxido cuproso es insoluble y se precipita, por lo que no puede valorarse
colorimétricamente. Cuando se añade a esta solución fosfomolibdato, éste se reduce a un ión de color azul
cuya absorbancia puede medirse con un colorímetro.
GLUCOSA (agente reductor)

+
Reactivo de cobre (Cu2+)
incubación e-
Óxido cuproso
+
Fosfomolibdato
Compuesto colorido en proporción a la concentración

a la concentración (medible colorimétricamente)
+
agua destilada
Compuesto colorido con volumen

adecuado para medición colorimétrica a 540 nm.
37 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
38
MATERIAL REACTIVOS
6 Tubos de Folin-Wu de 25 mL (afore a 12.5 mL) Solución patrón de glucosa (500 µg /mL).
1 Gradilla para tubos de ensaye Reactivo de cobre estabilizado en medio
1 Pinzas para tubo de ensaye alcalino.
1 Baño María en ebullición Reactivo de fosfomolibdato.
1 Pipeta de 1 mL Solución de glucosa de concentración
1 Pipeta de 10 mL desconocida (problema).
1 Celdilla de plástico, de 3.5 mL.
1 Espectrofotómetro a 540 nm
PROCEDIMIENTO
1. Disponga los 6 tubos de Folin-Wu de la manera siguiente:
TUBO 1 2 3 4 5 6
Blanco Problema
Patrón de 0 0.25 0.50 0.75 1.0 0
glucosa (mL)
Agua destilada 1.0 0.75 0.50 0.25 0 Ver NOTA
(mL) abajo
Reactivo de 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
cobre (mL)
Sol. problema 0 0 0 0 0 Ver NOTA
(mL) abajo
NOTA: Para el hígado de rata alimentada, usar 800 µL de una dilución 1:5 del hidrolizado de
glucógeno obtenido en la práctica anterior. La dilución se hace con agua destilada. Para el
hígado de rata en ayuno de 24 h, usar 500 µL del hidrolizado de glucógeno sin diluir. Completar
estos volúmenes a 1.0 mL con agua destilada.
2. Agitar e incubar durante 20 minutos a ebullición. Luego permita que los tubos se enfríen.
Reactivo de 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

fosfomolibdato
(mL)
Agua destilada 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5 9.5
(mL)
Conc. de 0 125 250 375 500 ¿?
glucosa
(µg/mL).
3. Agite bien los tubos.

4. Calibre el espectrofotómetro a cero de absorbancia a 540 nm usando el tubo blanco (tubo # 1).
5. Enseguida proceda a determinar la absorbancia a 540 nm de cada uno de los tubos que contienen
concentraciones conocidas de glucosa (estándares, tubos # 2 al 5).
6. Finalmente determine la absorbancia a 540 nm del tubo problema (tubo # 6).
7. Tabule las concentraciones de glucosa (g/mL) de los tubos # 2 al 5 contra sus respectivas absorbancias.
1. En base a la tabla de resultados, dibuje la curva patrón (concentración de glucosa vs. absorbancia), ya
sea en papel milimétrico o grafíquela en la computadora (Microsoft Excel).
38 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
39
2. Determine la concentración de glucosa (g/mL) de la solución problema interpolando gráficamente la
curva patrón.
3. Usando el material proporcionado por el profesor, calcule los coeficientes de regresión de la ecuación
de la línea recta que mejor se ajusta a los datos experimentales, determinada por el método de
mínimos cuadrados. Calcule también el coeficiente de correlación. ¿Qué tan bueno fue el ajuste entre
la recta y los datos experimentales?
4. En una misma gráfica (papel milimétrico o Excel), represente los puntos experimentales obtenidos (sin
unirlos con líneas) y la recta teórica de mejor ajuste, mostrando su ecuación.
5. Calcule la concentración de glucosa del problema usando la ecuación anteriormente mencionada.

¿Qué tanto se parece a la concentración de glucosa interpolada gráficamente? Explique en detalle las
discrepancias y/o similitudes.
39 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
40
PRÁCTICA No. 12
PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS LÍPIDOS Y SU
SEPARACIÓN POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
OBJETIVO
1. Realizar pruebas generales para identificar algunas propiedades de los lípidos.
2. Separar mediante cromatografía en capa delgada los componentes de una mezcla de lípidos.
INTRODUCCIÓN
Los lípidos son moléculas orgánicas que se caracterizan generalmente por ser insolubles en agua y
muy solubles en disolventes orgánicos. Esta propiedad física refleja la naturaleza hidrofóbica de su
estructura hidrocarbonada. En esta práctica se van a realizar una serie de pruebas cualitativas para poner
de manifiesto algunas propiedades de los lípidos como son: solubilidad, detección de peróxidos y
saponificación.
La cromatografía de adsorción se refiere al uso de una fase estacionaria, tal como una resina de
intercambio iónico que tiene un número finito de sitios de unión para las moléculas de la muestra a separar.
El uso de una fase estacionaria sólida dispuesta en forma de película sobre la superficie de una base
firme (vidrio o plástico) constituye el método llamado cromatografía en capa delgada o capa fina. La fase
sólida puede funcionar como adsorbente (por lo común de sílice), como intercambiador iónico (materiales
de celulosa modificada) o como criba molecular (geles porosos como el de poliacrilamida). Esta técnica
tiene gran aceptación porque combina las siguientes características: la resolución del soluto y la posibilidad
de reproducir los resultados se consideran de buenas a excelentes; casi todas las separaciones se
efectuaran con rapidez; puede usarse para el análisis de casi todo tipo de solutos y por último, pero no
menos importante, se trata de un procedimiento económico y de fácil ejecución.
La cromatografía de capa fina junto con la cromatografía de papel se clasifican como cromatografías de
partición. Este es la distribución de un soluto entre dos fases líquidas. Esto puede involucrar la extracción
directa utilizando dos líquidos que debe tener características de ser inertes.
La separación de lípidos basados en procedimientos clásicos de cristalización, destilación y extracción
por solventes, han sido en gran parte reemplazados por procedimientos cromatográficos. La cromatografía
en capa fina es de utilidad para la separación de diversas clases de lípidos y para la separación de ácidos
grasos individuales. En la cromatografía gas-líquido, los lípidos de los tejidos húmedos primero se extraen
por un sistema de solventes basado en la mezcla de cloroformo-metanol de 2 a 1, antes de llevar a cabo
la separación cromatográfica.
Para reconocer la separación cromatográfica se utilizan sustancias llamadas reveladores, estos son:
Universales: H2SO4, I2.
Específicos: ninhidrina (aminoácidos), radaína B (lípidos), ftalato de anilina.
MATERIAL REACTIVOS
12 Tubos de ensaye de 13x100 mm Aceite vegetal
2 Pipetas de 1 mL Aceite de linaza
4 Pipetas de 2 mL Manteca de cerdo
Parrilla de calentamiento Agua
Baño María en ebullición (lata o vaso) Etanol
Gradilla Eter etílico
Tubos capilares Hexano
Frasco con tapón de rosca Mezcla de ácido acético y cloroformo
Placa de cromatografía de 10 x 10 cm con KI al 5% (p/v)
Sílica Gel 60 como fase estacionaria NaOH al 20% (p/v)
Cuba cromatográfica Fase móvil: Mezcla de éter de petróleo, éter
Horno calibrado a 100 °C. etílico y ácido acético, en una proporción
90:10:1 (v/v/v).
Patrones de lípidos recientemente preparados:
soluciones al 5% (p/v) de aceite vegetal, aceite
de linaza, otros aceites vegetales, manteca de
cerdo y colesterol en cloroformo.
Ácido sulfúrico al 5% (v/v) como revelador
universal.
40 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
41
PROCEDIMIENTOS
Experimento A: Propiedades Químicas de los Lípidos

A. Pruebas de Solubilidad
1. Enumere cuatro tubos de ensaye y prepárelos de la siguiente forma:
Tubo # 1 2 3 4
Aceite vegetal 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Agua 2 mL
Etanol 2 mL
Hexano 2 mL
Éter etílico 2 mL
2. Observe el grado de solubilidad y anote los resultados.
B. Detección de Peróxidos
1. Coloque por separado en tubos de ensaye 1 mL de aceite vegetal, 1 mL de manteca de cerdo y 1 mL
de aceite de linaza; añada a cada uno 2 mL de mezcla de ácido acético y cloroformo.
2. Agite fuerte y agregue 2 gotas de KI al 5%; agite nuevamente.
3. Espere 10 min y observe los cambios.
C. Saponificación
1. Coloque por separado 0.5 mL de aceite vegetal y 0.5 mL de manteca de cerdo en tubos de ensaye.
2. Agregue 3 mL de NaOH al 20%.
3. Agite para formar una emulsión.
4. Caliente en Baño María de agua hirviendo durante 15 min.
5. Agite el tubo y observe los cambios (formación de espuma de jabón).
Experimento B: Separación de Lípidos por Cromatografía en Capa Fina
1. Usando un lápiz suave y sin raspar la sílica gel de la placa de cromatografía, dibuje suavemente una
línea recta a aprox. 1.5 cm de una de las orillas de la placa (siga las instrucciones del profesor). Dicha
línea se llama línea origen y sobre ella se aplicarán las muestras. Tenga cuidado de no tocar la sílica
gel con los dedos. Divida la línea dibujada en un número de diferentes puntos equidistantes, de acuerdo
al número de muestras de lípidos que se vayan a aplicar y analizar.
2. Con una pipeta Pasteur o un microcapilar, depositar en la placa de cromatografía, sobre la línea origen
y en uno de los puntos dibujados, una pequeña gota de la solución del aceite vegetal o patrón de
colesterol que le haya tocado a su equipo.
3. Colocar la fase móvil en la cuba cromatográfica. Introducir la placa cromatográfica con las muestras ya
aplicadas, de modo que el extremo de la sílica gel donde están aplicadas las muestras quede sumergido
en la mezcla de solventes (fase móvil), cuidando que las muestras aplicadas no queden sumergidas en
ella, y recargando la placa sobre la pared de la cuba. Tapar ésta y observar el ascenso del solvente por
el gel de sílice, sacándolo cuando falte aproximadamente 1 cm para que llegue al extremo superior de
la fase estacionaria.
4. Dejar evaporar el solvente de la capa de sílica de la placa, colocando ésta sobre un par de hojas de
papel absorbente en la campana de extracción de humos. Una vez seca, rociar la placa con ácido
sulfúrico al 5%, el cual actuará como revelador universal. Dejar secar el ácido sulfúrico en la campana
de extracción de humos. Colocar la placa en el horno previamente calentado a 100 °C. Observar la
aparición de manchas obscuras, correspondientes a los lípidos separados que fueron carbonizados por
el ácido sulfúrico.
NOTA: Todas las mezclas de solventes empleadas son inflamables, por lo que deberán mantenerse
alejadas del fuego y de fuentes de chispas, y en lo posible deberán manejarse en la campana de
extracción de humos.
41 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009
42
1. Reporte todos los cambios observados en las pruebas químicas realizadas, usando una tabla por
prueba.
2. Explique y discuta el grado de solubilidad de los lípidos probados en los disolventes probados.
3. Explique y discuta los cambios observados en la prueba de detección de peróxidos.
4. Explique y discuta los cambios observados en la prueba de saponificación.
5. Medir la distancia desde el punto de colocación de las soluciones de lípidos al centro de las manchas
(d).
6. Medir la distancia del sitio de colocación de los lípidos al sitio donde llegó la fase móvil (D).
7. Calcular el Rf para cada mancha (lípido), de acuerdo a la siguiente fórmula:
Rf = d/D
8. El Rf se calculará para cada uno de los lípidos individuales.

9. Identificar cada lípido.
10. Reportar en una tabla los Rf de cada mancha y la identificación de los lípidos.
11. Discutir detalladamente cuál lípido corrió más y por qué. Para esto, tendrá que describir en esta
sección del reporte las relaciones entre la estructura bioquímica de cada lípido, su polaridad y su
movilidad cromatográfica en el sistema utilizado en esta práctica.
42 Código: FO-121500-20
Revisión: 00
Emisión: 16/06/2009

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CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO

PROFESORA: Dra. en C. Guilda Guzmán Colis

CENTRO DE CIENCIAS BÁSICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

No. NOMBRE DE LA PRÁCTICA PÁG.

3 Determinación del pKa. 19

4 Preparación de un buffer y su acción amortiguadora. 22

5 Separación de aminoácidos por cromatografía en papel. 25

6 Propiedades físicas y químicas de las proteínas. 27

7 Determinación de proteínas por el método de Biuret. 30

8 Efecto del pH, temperatura y agentes químicos sobre la solubilidad de las 32

10 Aislamiento de glucógeno hepático. 36

11 Preparación de una curva patrón de glucosa. 38

12 Propiedades químicas de los lípidos y su separación por cromatografía en capa 41

Revisar información importante sobre seguridad en el laboratorio de bioquímica, y sobre la forma de

SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

Reglas de Seguridad y Organización en el Laboratorio de Bioquímica

Etiquetas y Pictogramas de Seguridad de los Materiales Químicos

Figura 1. El diamante de materiales peligrosos de la NFPA.

Figura 2. Pictogramas de riesgo del Sistema Globalmente Armonizado para la

Figura 3. Pictogramas de clasificación de riesgos según WHMIS.

Fichas de Datos de Seguridad (FDS / MSDS)

Sistema de Gestión Ambiental (SGA, ISO 14001:2004) de la Universidad Autónoma de

Figura 4. Fases de manejo de los residuos peligrosos.

Las áreas generadoras de residuos peligrosos se encargarán de la identificación y separación de los

Figura 5. Diagrama para la identificación de R.P.’s y R.P.B.I.’s.

FORMATOS EN LOS REPORTES DE LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO

Cifras Significativas y Redondeo en el Reporte de Datos Experimentales

Símbolos del Sistema Internacional de Unidades

Tabla 2. Unidades Básicas del Sistema Internacional de Unidades.

Tabla 4. Otras unidades de medición usadas en Química que no pertenecen al SI.

Formatos de Citas Bibliográficas

Cuando la fuente bibliográfica tiene un solo autor:

Cuando la fuente bibliográfica tiene dos autores:

Cuando la fuente bibliográfica tiene tres o más autores:

Formatos de Tablas y Figuras

Formatos de Referencias Bibliográficas

➢ Para libros se reporta de este modo:

Se proporcionará en la sesión de laboratorio por el profesor.

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD DEL IÓN HIDRÓGENO (pH) EN SOLUCIONES ACUOSAS

1. Conocer y aplicar algunos métodos para la determinación de pH.

Disociación. La disociación es el proceso de separación de uno o más elementos de una molécula

KD = [H+][ OH-]/[H2O] (1)

[H2O] KD = KW = [H+][ OH-] = 1.0 x 10-14 (2)

De manera análoga, podría definirse pOH como:

pOH = log 1/[ OH-] = - log [OH-] (4)

Generalizando, pKa = log 1/Ka = - log Ka (5)

Ácido Neutro Básico (alcalino)

Algunos Indicadores de pH de Uso Frecuente

Nombre vulgar pKa Color y zona útil de pH

Preparación de una Escala Colorimétrica de pH Mediante el Uso de Buffers e Indicadores

Uso del Potenciómetro

MATERIAL Y EQUIPO REACTIVOS

15 tubos de ensaye de 18 x 150 mm. CH3COOH 0.2 M.

A. Preparación de Escala Colorimétrica de pH Utilizando Indicadores

Equipo No. 1 (Escala No. 1)

2. Después agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones:

Equipo No. 2 (Escala No. 2)

3. Después agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones:

Equipo No. 3 (Escala No. 3)

4. Después agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones:

B. Medición del pH de las Soluciones Problema Usando el Potenciómetro

1. Mida el pH de la solución problema que le tocó a su equipo, usando el potenciómetro (previamente