1.

INTRODUCCION
En la industria farmacéutica es necesario usar métodos analíticos confiables, que
permitan la cuantificación de los principios activos que se emplean para la
elaboración y formulación de medicamentos. Para así asegurar la confiabilidad de
los métodos analíticos, estos se deben someter a un proceso de validación o
verificación, mediante este proceso se comprueba si el método es lo suficiente
confiable para su uso.
La validación y verificación de métodos analíticos es parte fundamental del
desarrollo de una nueva formulación y de la técnica de análisis de control de
calidad, ya que, durante esta secuencia de pruebas y análisis, en donde el químico
se da cuenta si el estudio, el cual está siendo evaluado sistemáticamente, cumple
con los propósitos para los cuales fue diseñado. [1]
Es parte fundamental de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM), sin la
confiabilidad de los resultados analíticos obtenidos no se pueden asegurar que los
medicamentos cumplen con sus especificaciones, y que en su requisito de las
Buenas Prácticas para Laboratorio de Control de Calidad de productos
farmacéuticos. Por lo que se debe cumplir con los requerimientos establecidos por
la NOM-059-SSA-2015. ¨Cuando se utilizan métodos farmacopeicos, se debe
demostrar la aplicabilidad al producto, bajo las condiciones de operación del
laboratorio y en función del método analítico deseado¨.
En el presente trabajo se realizará la verificación del método analítico de Piroxicam
tableta por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). El desarrollo del
proyecto se realizó dentro de las instalaciones del Laboratorio de Instrumentación
del área de Control Químico de BRULUAGSA, S.A DE C.V.
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Uno de los objetivos más importantes de toda empresa es asegurar la calidad de
sus productos, dentro de la industria farmacéutica se debe garantizar la fiabilidad
de datos obtenidos mediante los análisis, ya que a partir del resultado obtenido se
tomarán decisiones futuras con respecto al producto.
Se determinará si la metodología para cuantificación de impurezas orgánicas del
priroxicam por cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), es reproducible en
el laboratorio de control químico.
3. OBJETIVOS
3.1 GENERAL
 Verificar la aplicabilidad del método analítico del piroxicam para la
cuantificación del activo.

3.2 ESPECÍFICOS

 Desarrollar los parámetros de desempeño: especificidad del método,

tolerancia del método, linealidad del sistema, límite de cuantificación, límite
de detención, exactitud del método y estabilidad de la muestra.

 Verificar el método analítico por cromatografía de líquidos de alta resolución

(HPLC) para ser utilizado en la determinación de valoración química para
Piroxicam y cumplir con los lineamientos requeridos establecidos por la
NOM-059-SSA1-2015.

 Proveer la evidencia documentada que el método analítico cumple con los

propósitos reales de uso y es aplicable a las condiciones de operación.

4. JUSTIFICACIÓN
La verificación de los métodos analíticos es el proceso por el cual se demuestra,
por estudios de laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos
para la aplicación analítica deseada; es decir cumple con su propósito.
Uno de los análisis más importantes y de mayor cuidado son los análisis de
cuantificación de principios activos ya que usualmente son técnicas complejas y
que requieren mayor dedicación de tiempo, es así que para constatar que el
producto cumple con la concentración especificada se necesita una técnica
analítica que sea capaz de proporcionar resultados confiables, la técnica a
utilizarse debe ser capaz de separar el principio activo de los excipientes para así
poder obtener los resultados de cuantificación. La separación de un analito es de
vital importancia en los procedimientos analíticos, actualmente se realiza en la
mayoría de los casos por cromatografía siendo lo más adecuado una técnica por
Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) debido a su sensibilidad y su
fácil adaptación a determinaciones cuantitativas exactas.
Las razones de preferencia de esta técnica son su sensibilidad, fácil adaptación a
determinaciones cuantitativas, de acuerdo con las características del principio
activo este puede ser cuantificado por cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC).
El propósito del presente trabajo de investigación es verificar la aplicabilidad del
método analítico de Piroxicam, mediante cromatografía de alta resolución (HPLC).
5. ALCANCES
Con el presente trabajo se pretende demostrar la verificación de la aplicabilidad
del método analítico. Considerando la metodología analítica y la concentración de
trabajo, para el proceso de verificación de la determinación de valoración química
del método analítico para Piroxicam.
6. CARACTERIZACION DEL AREA DONDE SE DESARROLLO EL PROYECTO
El laboratorio Bruluagsa S.A. De C.V. se encuentra ubicado en la Av. Ingeniero
Sánchez Colín No. 10043, Atlacomulco, C.P. 20458, Atlacomulco, México. El
trabajo de investigación se realizará, en el Departamento de Control de Calidad,
Laboratorio de Control Químico.

7. FUNDAMENTO TERIORICO

Cada validación debe contar con un protocolo y reporte de validación los cuales deben
ser elaborados por el químico analista debe de llevar un numero consecutivo con forme
se valla elaborando¨.
La validación es la confirmación mediante la aportación de evidencia de que se ha
cumplido los requisitos especificados. La conformación puede comprender acciones
tales como la realización de ensayos, pruebas y demostraciones.
La verificación de un método es el proceso que establece, mediante estudios de
laboratorio; que las características de desempeño del método satisfacen los requisitos
para su aplicación analítica.
El proceso de validación de los métodos analíticos pueda comprender, pero no está
limitado al estudio de las características de desempeño que se describen en la tabla 1.

Verificacion del sistema

Presicion del sistema
Linealidad del sistema
Especificidad/Selectividad del método
Exactitud del método
Linealidad e intervalo del método
Limite de cuantificación del método
Robustez del método
Tolerancia del método

Tabla 1. Características de desempeño analítico

recomendadas en la valoración de métodos
analíticos.
Los métodos analíticos para fines de validación se clasifican en cuatro categorías, ya
que requieren de diferentes esquemas de estudio.
Categoría I: Métodos analíticos para cuantificar a un componente especifico en
muestras de producto terminado o en pruebas de estabilidad, ya sea en fármacos,
aditivos o preparados farmacopeicos, u otros analitos de interés (conservadores,
solventes, etc.).
Categoría II: métodos analíticos para la determinación de impurezas (productos de
degradación, sustancias relacionadas, isómeros ópticos, etc.) en muestras de
fármacos, preparados farmacéuticos y aditivos. Estos métodos pueden incluir
determinaciones cuantitativas o pruebas límite. En estos últimos, el interés es
establecer si el analito, excede o no, un valor límite, los métodos de pureza quedan
incluidos en esta categoría.
Categoría III: Métodos analíticos utilizados en la determinación de un analito en una
muestra con el objetivo de evaluar una característica de desempeño del preparado
farmacéutico (disolución en capsulas, liberación controlada en tabletas, entre otras).
Categoria IV: Pruebas de identificación de un analito en muestras de fármacos, aditivos
o preparados farmacéuticos, cuyo propósito es establecer la presencia del analito de
interés.

7.1 Cromatografía
La cromatografía es una técnica desarrollada a principios del siglo XX, que permite
la separación de sustancias que se encuentran en una mezcla. El nombre
cromatografía (Kromos: color, graphos: descripción) se debe a que las primeras
separaciones se llevaron a cabo con pigmentos de plantas, los cuales se observan
como bandas coloridas. En general, la cromatografía es un proceso de migración
diferencial en el cual los componentes de una mezcla son trasportados por una
fase móvil (gas, líquido), y retenidos selectivamente por una fase estacionaria que
puede ser un líquido o un sólido.[1]

7.2 Interpretación de un Cromatógrama

Un cromatógrama es una gráfica que representa la variación de la respuesta del
detector acoplado al cromatógrafo, en función del tiempo. La figura 1.1 representa
un cromatógrama típico de elución de dos sustancias 1 y 2; h y h/2 son la altura
total y la mitad de la altura del pico desde el ápice hasta la línea base; W h/2 es el
ancho del pico a la mitad de la altura y W1 y W2 son los anchos de la base de los
picos 1 y 2, respectivamente. El pico del aire es característico de los cronogramas
obtenidos con detector de conductividad térmica y puede aparecer antes o
coincidir con el pico del disolvente (en el caso de la cromatografía de gases); t0 es
el tiempo muerto y corresponde al tiempo de retención para una sustancia que no
es retenida por la columna.

Figura 1.1 Separación de cromatográfica de dos sustancias

7.3 Buenas prácticas cromatográficas

7.3.1 Retención cromatográfica
Ya que la función de la cromatografía es separar los componentes de una mezcla,
es necesario garantizar que existe una adecuada retención de los compuestos a
separar con la fase estacionaria, para que se logre dicha separación.
Un parámetro que mide la calidad de dicha interacción es el factor de capacidad
cromatográfico (K´), el cual se calcula con la siguiente formula:
 𝐾. = (𝑡𝛼 − 𝑡0)/𝑡0

Donde:
tα: Tiempo de retención del primer pico de eluir.
t0: Tiempo muerto de la columna (corregido por la velocidad de flujo de trabajo).
Se recomienda que para métodos farmacopeicos K´ >1.5.

7.3.2 Factor de coleo

Algunas veces es útil establecer un factor de coleo para limitar el máximo
permisible con relación a la asimetría del pico (véase en la figura 1.2). Para
propósitos farmacopeicos, el factor de coleo T, se define como la relación de la
distancia del pico, W 0.05, dividiendo entre 2f divido entre dos veces la distancia, f,
del máximo del pico hacia el lado izquierdo del pico. Estas distancias deben
medirse a un punto que corresponda a un 5% de la altura partiendo de la line
base.
Para un pico simétrico el factor de coleo es la unidad y el valor de T aumenta
conforme el coleo va siendo más pronunciado. El cálculo se expresa por la formula
y la figura 1.2.
Factor de coleo = T = W0.05/2f

Donde:
W0.05 = Relación de la distancia del ancho del pico.
f = Distancia del máximo del pico hacia el lado izquierdo del pico.

Figura 1.2 Pico cromatográfico asimétrico.

7.4 Verificación del sistema
El buen funcionamiento de un sistema cromatográfico (líquido-gas) se verá
reflejado en la calidad del análisis. Es necesario considerar por esta razón todos
los componentes del sistema (columna, velocidad de flujo, flujo del gas
transportador, temperatura de operación, entre otros) para obtener resultados
óptimos.
Es conveniente preparar una curva de calibración a concentraciones adecuadas, a
las condiciones especificadas para el fármaco en análisis, así como inyectar
blancos para poder detectar alguna posible interferencia. Las especificaciones de
la columna y los parámetros del instrumento en la monografía correspondiente no
excluyen otras condiciones de operación adecuadas.
Las variaciones normales en el equipo y en los materiales pueden requerir ajustes
de las condiciones experimentales para obtener una operación aceptable.
Se pueden obtener datos específicos de inyecciones repetidas (no menos de seis
inyecciones) de una preparación ya sea de la muestra, de la SRef o del estándar
interno.
Estos datos pueden ser comprobados con valores máximos y mínimos
especificados tales como eficiencia, precisión interna, resolución, tiempo de
retención, naturaleza de la curva de calibración, respuesta y cobros (entre otros
parámetros), de acuerdo con lo especificado en las monografías individuales.
El parámetro más útil es la reproductibilidad de inyecciones repetidas de la
solución analítica mezclada con la solución de estándar interno, preparadas a
partir de la SRef como se indica en la monografía individual. La reproductibilidad
de las inyecciones repetidas se expresa como el coeficiente de variación de
acuerdo con la siguiente formula:

𝑛
10 ∑ (𝑥1 −
𝐶𝑉 = 0 𝑥2)
√ 𝑖=1
𝑋 𝑛−1

Donde:
CV= Coeficiente de variación expresado en %.
X= Media de una serie de n determinaciones.
Xi= Media individual.
Cuando se utiliza el estándar interno la X, usualmente se refiere a la medida del
área relativa (As):
𝑋𝑖 = 𝐴𝑆 = 𝑎𝑟/𝑎𝑖

Donde:
ar = Área del pico correspondiente a la sustancia problema.
ai= Área del pico correspondiente al estándar interno.

Cuando se utiliza la altura del pico para cuantificación, la muestra xi, utiliza la
siguiente formula:

𝑋𝑖 = 𝐻𝑆 = ℎ𝑟/ℎ𝑖
Donde:
Hs= altura relativa.
hr= altura del pico correspondiente a la sustancia problema.
hi= altura del pico correspondiente a la referencia interna.

7.5 Cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR) 5

Esta técnica es conocida también como Cromatografía de Líquidos de Alta Presión

(CLAP).
El éxito en la aplicación de la CLAR para la separación de una mezcla
determinada depende de la combinación correcta de las condiciones de operación,
es decir, la preparación de la muestra, características de la columna, de la fase
móvil, el tipo de detención, el algoritmo de integración, etc.
La migración diferencial en la CLAR es resultado del equilibrio de distribución de
los componentes de una mezcla entre la fase estacionaria y la fase móvil. Dichos
compontes se separan en la columna y al salir de esta son conducidos por la fase
móvil en el orden en que emergieron, hacia un detector donde se registra una
respuesta proporcional a su cantidad sus concentraciones y sus tiempos de
retención en la columna. El cronograma resultante muestra cada compuesto que
sale de la columna en forma de picos simétricos con un tiempo de retención
característico por lo que este tiempo puede emplearse para identificar el
compuesto.
Este tiempo de retención (tr) se mide desde el momento de la inyección muestra
hasta el momento en que aparece el máximo del pico en el cronograma.
La separación entre dos picos, o resolución, depende tanto de la selectividad
como de la eficiencia cromatográfica.
La selectividad es una función de la retención que la molécula tiene a lo largo del
proceso de separación, y está reflejado por el factor de capacidad (k´). La
selectividad de una columna, también referida como retención relativa o
separación entre picos (α), es la relación entre los factores de capacidad (K´) de
dos picos adyacentes:

𝛼 = (𝑡2 − 𝑡0)/= (𝑡1 − 𝑡0)

Donde:
α = Selectividad.
t2= Tiempo de retención del segundo pico.
t1= tiempo de retención del primer pico.
t0= tiempo muerto de la columna.

Por su parte, la eficiencia es un indicador del ensanchamiento de un pico durante

su separación, y está reflejada por el número de platos teóricos (N) de la columna
en donde se realiza el proceso cromatográfico.
Por lo anterior, la resolución (R) puede expresarse en términos de selectividad y
eficiencia de la siguiente manera:

𝑁
𝑅 = ( ) (𝛼 − 1)[𝐾/(1 + 𝑘´)]
4

Donde:
K= promedio de K´𝐾´1 𝑌 𝐾´2.
α = Factor de selectividad.
N= Eficiencia de la columna.
k´= Factor de capacidad.

Esta ecuación permite controlar la resolución (R) variando el factor de selectividad

(a), la eficiencia de la columna (N), o bien, el factor de capacidad ( k´).
La resolución se optimiza modificando la composición de la fase móvil (pH y
proporción orgánica/acuosa) y/o la fase estacionaria (longitud de cadena alifática o
grupos sustituyentes). La eficiencia se varía con cambios en la longitud de
columna, en la velocidad de flujo del disolvente y tamaño de partícula, y el factor
de capacidad se modifica con cambios en la fuerza alotrópica del disolvente.
Los mecanismos o procesos de separación que dan como resultado la retención
de las moléculas de una muestra por parte de la fase estacionaria da lugar a los
diferentes métodos de cromatografía liquida:

a) Fase reversa. El proceso fisicoquímico predomínate es el reparto (o

partición) entre la fase estacionaria altamente lipofilica y la fase móvil de
naturaleza, más polar. Las moléculas de la muestra se distribuyen entre
ambas fases como sucedería en una extracción liquido-liquido.

b) Fase normal. Esta es una cromatografía líquido-sólido o de adsorción,

incluye partículas de gran área superficial donde las moléculas son atraídas
y retenidas normalmente por interacciones tipo puentes de hidrogeno, y la
fase móvil posee características totalmente orgánicas.

c) Hidrofílica-lipofílica. Es una combinación de las dos anteriores, en donde

la superficie de la fase estacionaria presenta grupos polares capaces de
retener moléculas hidrofílicas, empleando fases móviles de características
semejantes a la fase reversa.

d) De intercambio iónico. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria

contiene grupos iónicos fijos como −𝑆𝑂3, junto con iones de carga opuesta
(contraion). Estos últimos están presentes en la fase móvil en forma de
sales. De esta manera las moléculas de muestras iónicas son retenidas en
la columna por el intercambio iónico, como lo muestra el siguiente ejemplo:

𝑅 − 𝑆𝑂3𝑁𝑎+ + 𝑋+ ⇌ 𝑅 − 𝑆𝑂3𝑋+ + 𝑁𝑎+

 e) De exclusión molecular. En la cual el empaque es un material poroso
donde el tamaño del poro está bien definido. De esta manera, las moléculas
que son demasiado grandes para el poro fluyen entre las partículas y salen
rápidamente de la columna, mientras que las que son pequeñas penetran
en los poros aumentando su recorrido y prolongando su tiempo de elución.
Este tipo de cromatografía es muy empleado para separar compuestos por
su tamaño molecular.

8. METODOLOGIA
PROCEDIMIENTO Y CARACTERIZACION DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS

Verificación del método analítico en la determinación de valoración química para

piroxicam.
7.6 VALORACION QUIMICA DE PIROXICAM
 Cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).
 Condiciones cromatografías.
 Equipar un cromatografo de líquidos con un detector espectrofotométrico
ajustado a una longitud de onda de 254 nm.
 Solución amortiguadora metanol (55:45:).
 Velocidad de flujo: 1.2 mL/min
 Temperatura del automuestreador: 4°C
 Volumen de inyección: 25µL.
 Medio de disolución: ácido clorhídrico 0.01
 Temperatura de la columna: 25°C
 Columna cromatográfica: XTerra® RP18, 4.6mm x 250mm, 5µm (L1).
7.7 SOLUCION AMORTIGUADORA
Disolver 7.72g de ácido crítico anhidro en 400mL de agua, disolver por separado
5.35g de fosfato de sodio dibásico en 100mL de agua. Agregar la solución de
fosfato a la solución de ácido crítico, diluir a 1000 mL con agua y mezclar.
7.8 PREPARACION DE REFERENCIA
Preparar una solución de la SRef de piroxicam en solución metanólica de ácido
clorhídrico 0.01 M que contenga 0.25 mg/mL de piroxicam. Pasar una alícuota de
10 ml. de esta solución a un matraz volumétrico de 50 mL, agregar 25 mL de
solución metanólica de ácido clorhídrico 0.01M y 10 ml. de agua, llevar al aforo con
solución metanólica de ácido clorhídrico 0.01M y mezclar. Esta solución contiene
0.05 mg/mL de piroxicam.
7.9 PREPARACION DE SOLIUCION ESTANDAR
Proceder como se indica en la preparación de solución de adecuabilidad del
sistema.
7.10 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.
Pesar no menos de 20 tabletas y obtener su peso promedio, triturar hasta polvo
fino, Pesar una cantidad del polvo equivalente a 50 mg de piroxicam, pasar a un
matraz volumétrico de 100 mL. Agregar 70 mL de solución metanólica de ácido
clorhídrico 0.01M y agitar mecánicamente durante 30 min, llevar al aforo con el
mismo disolvente, mezclar y centrifugar. Transferir 10 mL de esta solución a un
matraz volumétrico de 100 mL, adicionar 50 ml de solución metanólica de ácido
clorhídrico 0.01M y 20 mL de agua, llevar al aforo con solución metanólica de ácido
clorhídrico 0.01M y mezclar.
7.11 CONDICIONES DEL EQUIPO.
Columna de 3.9 mm x 30 cm, empacada con L1; detector UV a una longitud de
onda de 254 nm, velocidad de flujo de 1.2 mL/min.
7.12 APTUTUD DEL SISTEMA CROMATOGRAFICO
El tiempo de retención para piroxicam 5.2 ± 1.0 minuto. El coeficiente de variación
no es más de 2.0, para inyecciones repetidas. El factor de coleo debe no ser
mayor de 1.5
7.13 PRUEBAS DE ROBUSTEZ DEL MÉTODO
Evaluar la adecuabilidad del sistema cromatográfico, para cada variación indicada
a continuación, realizando un cambio a la vez, manteniendo los demás parámetros
del método acorde al método analítico, de acuerdo con la siguiente tabla:

CONDICIÓN ORIGINAL VARIACIÓN

20 °C
Temperatura de 23 °C
25 °C
la columna 30 °C
35 °C
1.0 mL/min
Flujo 1.2 mL/min 1.1 mL/min
1.3 mL/min
1.4 mL/min
Solución A : Acetona
Composición de Solución A : Metanol (450 : 550)
fase móvil (550 : 450) Solución A : Acetonitrilo
(650 : 350)
Inicial 3 días
 Tiempo de
estancia de fase 7 días
móvil
Tabla 3.1 Pruebas de robustez.

8.8.1 Criterios de aceptación.

El método es robusto si los resultados obtenidos en la evaluación del sistema
cromatográfico con cada cambio probado cumplen con los criterios de
adecuabilidad de sistema cromatográfico indicados en el método analítico.