Aplicaciones forenses de rodizonaato de sodio y ácido clorhídrico:

una nueva técnica histológica para la detección de residuos de

disparos
ABSTRACT: La demostración de la presencia de residuos de plomo derivados del disparo
en la piel y los tejidos subyacentes es fundamental para el correcto análisis forense de
numerosos casos judiciales. La microscopía óptica sigue siendo la técnica de diagnóstico
más rápida y barata, aunque su sensibilidad y especificidad son deficientes debido a la
escasa cantidad de tejido histológico que se puede examinar y la posible contaminación
ambiental por plomo. Para confirmar la presencia de plomo procedente de residuos de
disparos, aplicamos a cortes histológicos de piel humana una técnica propuesta por
Owens y George en 1991 para la detección macroscópica de plomo en la ropa de las
víctimas de disparos, que implica una reacción con rodizonaato de sodio y posterior
confirmación por color. cambio en la aplicación de HCl. Nuestros resultados demuestran la
posibilidad técnica de utilizar esta técnica macroscópica incluso en muestras histológicas y
apoyan la necesidad de realizar más estudios sobre una serie mayor de casos
correlacionados con el tipo de munición y la distancia de disparo.

La demostración de residuos de arma de fuego (GSR) en lesiones por arma de fuego es de

primordial importancia en la ciencia forense. Tanto la comprensión de la verdadera
naturaleza de la lesión como la información sobre la dirección del disparo son esenciales
para el análisis del testigo experto y deben demostrarse claramente en la sala del tribunal
para ilustrar los efectos del disparo. Encontrar métodos sencillos y fiables para conseguir
estos objetivos, especialmente cuando se trabaja con materiales orgánicos que ya han
comenzado a descomponerse, es por tanto un objetivo constante.
Los numerosos estudios histoquímicos de estos problemas han producido resultados
variables. Varios de ellos han examinado el uso de rodizonaato de sodio (NaR), con un
grado variable de confiabilidad en la identificación de residuos de plomo en GSR (1–5).
Para maximizar la claridad de los resultados y la solidez de la evidencia ofrecida por
cualquier hallazgo, aplicamos una técnica propuesta por Owens y George para el estudio
de la ropa de las víctimas de disparos (6) a preparaciones histológicas de tejidos humanos .
Esta técnica (NaR-HCl) se basa en el tratamiento de muestras con ácido acético, seguido
de una solución de NaR y una solución tampón de pH 2.8, seguida de una solución de HCl
al 5%. A continuación, las muestras positivas se analizan mediante la prueba de Griess
modificada para detectar residuos de nitrito.
El objetivo de nuestro estudio piloto es verificar la practicidad técnica de esta técnica
macroscópica incluso en cortes histológicos de piel humana fijados en formalina e
incrustados en parafina.

MATERIALES Y MÉTODOS
Se tomaron en consideración seis casos de homicidio ocurridos durante un período de 4
años y sometidos a autopsia en el Instituto de Medicina Forense de la Universidad de
Milán. Todos los casos involucraron múltiples disparos a corta distancia de un arma de
fuego de un solo disparo sobre la piel desnuda, con GSR visible macroscópico (Fig. 1); la
muerte ocurrió no más de 48 h antes del momento de la autopsia. Para cada uno de estos
casos se seleccionaron varias heridas perforantes cuya reconstrucción patológica
demostró el punto de entrada y, en la medida de lo posible, la trayectoria y el punto de
salida del proyectil mediante la extracción del tejido en varias zonas de cada herida. La
Tabla 1 informa los sitios de tejido recolectados y el número de muestras histológicas
preparadas. Se examinaron un total de 88 muestras de diferentes órganos de los seis
casos en estudio. Para cada uno de estos se prepararon tres secciones: una teñida con
hematoxilina-eosina, una con la técnica de NaR y una con la técnica de NaR-HCl al 5%
descrita por Owens y George.
Las muestras de tejido de 5 a 10 mm de espesor se fijaron en formalina tamponada neutra
al 10% durante 48 h. Luego, los bloques se deshidrataron en un procesador automático
(duración del proceso: 24-36 h) y se embebieron en parafina con un alto punto de fusión
(60 ° C). A continuación, se cortaron con micrótomo secciones de 5-7 lm de espesor;
después del secado, las secciones se tiñeron por desparafinación y luego se rehidrataron
con agua destilada.
Una o dos horas antes de su uso, se preparó una solución de NaR (sal disódica del ácido
rodizonico al 97% Ò; Sigma-Aldrich, Basel, CH) disolviendo 0.3 g en 100 mL de agua
destilada y una solución de ácido tartárico (ácido l-tartárico 99.5 % Ò; Sigma-Aldrich) se
preparó disolviendo 1 g en 100 mL de agua destilada. Estas soluciones no se pueden
almacenar (7).
A continuación, los cortes histológicos se tiñeron humedeciéndolos con una solución
compuesta por cinco gotas de NaR y una gota de ácido tartárico hasta cubrirlos por
completo. El tiempo de reacción fue de 1 min, tras lo cual las secciones presentaron un
color de fondo marrón claro débil. Luego se enjuagaron en agua destilada hasta que
desapareció el color de fondo. En este punto, se reveló la primera reacción Pb-NaR,
presentando un color marrón rojizo. Los portaobjetos ahora se pueden secar y montar.
Para el tratamiento con HCl, las secciones ya teñidas con NaR se lavaron con agua
destilada, se sumergieron en HCl al 5% durante 30 a 60 segundos, se agitaron y luego se
secaron con secador de pelo. Luego se aclararon con xilol o un producto similar y se
montaron de forma normal.
El secado después del tratamiento con HCl y antes de la clarificación es un paso
importante, que debe realizarse con un secador de pelo normal: se ha encontrado que el
secado en horno a 60 ° y la deshidratación con una serie de alcohol convencional
provocan la pérdida del azul violeta de los granos de plomo. coloración y debe evitarse.

RESULTADOS

La Tabla 2 reporta los resultados positivos, indicando el sitio de muestreo y el número de

muestras positivas con las diferentes técnicas contra el total de muestras examinadas.
Los GSR se tiñen de color rosa-marrón con la técnica NaR y se vuelven de un azul violeta
más obvio con el tratamiento con HCl. Con ambas técnicas, los residuos se manifiestan
como granos finos esencialmente regulares de tamaño variable (Figs. 2-4). En áreas más
concentradas, donde hay una mayor acumulación de residuos, las características de los
granos individuales solo se pueden ver en los bordes del depósito.
Solo un caso dio positivo con NaR y negativo con NaR-HCl. En dos casos, los resultados
positivos fueron similares tanto para NaR como para NaR-HCl en términos de número de
muestras y sitio de residuos. En tres casos, se encontró reactividad con NaR-HCl en un
número menor de preparaciones, aunque el sitio del residuo correspondía.
Cabe señalar que después de 6 meses desde la tinción, los portaobjetos aún eran
evaluables pero mostraban una decoloración notable. En casos forenses, siempre
sugerimos tomar muestras fotográficas de los resultados poco tiempo después de la
tinción.

FIG.2- A: residuo de plomo teñido de rojo con rodizonaato de sodio (NaR) en la superficie
de la piel en el borde del orificio de entrada del proyectil. B: confirmación de la presencia
de plomo tras el cambio de color a azul con ácido clorhídrico (A: NaR; B: NaR-HCl 200 ·)

FIG. 3 - Residuos de plomo a lo largo de la trayectoria del proyectil a través de la dermis /

tejido adiposo subcutáneo (A: rodizonaato de sodio [NaR]; B: NaR-HCl 100 ·).

FIG.4: Residuos de plomo en el tejido adiposo subcutáneo; la diferencia cuantitativa entre

los residuos se debe a la pérdida de material después de la preparación de la serie de
secciones (A: rodizonaato de sodio [NaR]; B: NaR-HCl 200 ·).

DISCUSIÓN
En 1991, Owens y George describieron un método rápido para detectar la presencia de
plomo en GSR en la ropa por reacción con NaR y HCl. Sus muestras se trataron con ácido
acético al 15% seguido de la aplicación de una solución de NaR y una solución tampón de
pH 2,8. Las áreas que contienen residuos de plomo presentan un color marrón rosado. El
tratamiento posterior con HCl al 5% confirmó la presencia de plomo por cambio de color a
azul violeta. Los casos que dieron positivo luego se sometieron a la prueba de Griess
modificada para nitritos (6). La química reactiva de NaR y NaR + HCl ha sido ampliamente
discutida en la literatura (7). Estos resultados nos llevaron a probar la técnica en tejido
humano con fines médicos y forenses.
El rodizonaato de sodio ha sido probado y propuesto para la detección histoquímica de
GSR en tejidos humanos en una serie de estudios patológicos forenses relacionados con el
diagnóstico de lesiones por arma de fuego, distancia de disparo y diagnóstico diferencial
entre las heridas de entrada y salida de las heridas perforantes. Es importante destacar
que la técnica también ha resultado útil cuando se aplica a tejidos en un estado avanzado
de descomposición (1-5). Se sabe que NaR tiene una especificidad relativamente baja para
el plomo y, por lo tanto, no es suficiente en sí mismo para proporcionar pruebas sólidas en
los tribunales. De hecho, también reacciona positivamente a las sales de bario, cadmio,
estaño, plata (8) y estroncio, así como a las estructuras queratínicas de los folículos pilosos
y las papilas linguales (9). Por tanto, una técnica de confirmación que proporcione una
demostración más clara sería una herramienta forense útil.
Nuestro estudio ha demostrado que el HCl diluido es una técnica fácil de usar que se
prepara rápidamente y se puede aplicar a los tejidos humanos sin ningún esfuerzo
significativo. La fase de fijación e inclusión en parafina es similar a la que se utiliza en la
mayoría de los laboratorios equipados con incorporadores automáticos: la fijación
prolongada de tejidos en formalina tamponada no afecta los resultados de la reacción,
incluso después de varios años. Como ya se señaló, el secado de las secciones histológicas
después del tratamiento con HCl y antes de la clarificación con xilol o similar es muy
importante: el uso de un secador de pelo normal evita la necesidad de utilizar una serie de
alcohol convencional o el secado en horno a 60 ° C. , que han provocado la pérdida del
color azul violeta de los granos de plomo.
En lugar de una mancha que proporcione un contraste muy intenso de tejido conectivo,
una mancha que dé un contraste débil o incluso nulo es preferible: de hecho, en el caso de
áreas escasas o pequeñas de residuos (especialmente cuando el proyectil ha pasado a
través de otros objetos antes de llegar al tejido humano), el color de contraste puede
enmascarar o cambiar el color de los granos, proporcionando un tono intermedio debido a
la superposición entre el color del NaR y el agente de contraste.
Para fines de diagnóstico, la aplicación de las dos técnicas (NaR y NaR + HCl) resultó ser de
gran utilidad en la confirmación y demostración morfológica de la presencia y área de
residuos de plomo. En un caso de lesión a corta distancia en la cabeza, encontramos una
reacción positiva al plomo en la herida de entrada y en la duramadre. Cuando se prueba
una serie de secciones adyacentes para GSR, las dos técnicas proporcionan una excelente
vista tridimensional cualitativa y cuantitativa. Por lo tanto, consideramos que se trata de
una técnica de detección útil, que en algunos casos puede ser definitiva y en otras
circunstancias podría confirmar la necesidad de proceder con métodos demostrativos más
precisos, pero también más costosos, (análisis químico o SEM-EDS) (10, 11).
En este estudio, la correspondencia entre la reactividad de NaR y de NaR-HCl fue
excelente en cinco de los seis casos, identificando una morfología de residuo idéntica,
aunque la identificación más clara y mejor, y por lo tanto la más útil para fines médico-
legales, fue proporcionada por NaR. -HCl.
En tres de los cinco casos, menos muestras dieron positivo con NaR-HCl. Esto
probablemente se deba a la falta de material reactivo después de la preparación de una
serie múltiple de secciones del bloque de parafina. De hecho, como el protocolo de
preparación consistió en una serie numerada de secciones teñidas primero con
hematoxilina-eosina, luego con NaR y finalmente con NaR-HCl, es probable que los
residuos se hubieran agotado en el momento de las preparaciones finales. Esto también
se aplicaría al único caso positivo con NaR y negativo con NaR-HCl.
A diferencia de NaR-HCl, la tinción con hematoxilina-eosina no es específica de GSR, que
aparece como depósitos negruzcos genéricos de tamaño y forma variables. Por tanto, este
no es un método de control válido.
En conclusión, la técnica macroscópica de NaR-HCl de Owens y George ha demostrado ser
aplicable incluso a cortes histológicos de tejido humano y, según los autores (6), puede
confirmar la presencia de plomo en GSR. La técnica es simple, de bajo costo y accesible
para todos los laboratorios histológicos como prueba de cribado, por lo que se pueden
utilizar técnicas más específicas y sensibles (SEM, análisis químico) en casos histológicos
negativos.
Además, el uso de la técnica de NaR-HCl mejoró los resultados de la vista macroscópica de
la piel y la tinción simple de hematoxilina-eosina: de hecho, la tinción de hematoxilina-
eosina solo puede mostrar residuos negros en la piel sin permitir la evaluación de
partículas de plomo, lo que requiere un análisis especial. técnica que se encuentra.
Sin embargo, debido a que todas las técnicas histológicas y ultraestructurales (incluida la
SEM) adolecen de posibles malas interpretaciones debido a la escasez de muestras de
material que se pueden examinar o la contaminación ambiental, nuestros resultados
apoyan la necesidad de realizar más estudios sobre una serie mayor de casos
correlacionados con la tipo de munición, distancia de disparo y comparación con el
análisis SEM para confirmar la utilidad de esta técnica histológica en casos forenses de
rutina.

FIG 1. Herida de entrada, caso núm. 2

(cortes histológicos correspondientes en la figura 2).

TABLA 1 — Número de muestras histológicas preparadas por sitio de recolección por

caso.

CASO 1 CASO 2 CASO 3 CASO 4 CASO 5 CASO 6

Piel, 4 4 4 2
herida de
entrada
Piel, 3 2
herida de
salida
Hueso 5
craneal
Cerebro 4
Cerebelo 3
Dura 2 1
 madre
Pulmón 5
Paladar
Estomago 2
Corazon
Riñon
Lengua
TABLA 2 — Muestras positivas, comparación de tinción con rodizonaato de sodio (NaR) y
NaR-HCl.

Caso numero Sitio positivo para NaR (muestras NaR-HCl (muestras

residuos de positivas / todas las positivas ⁄ todas las
disparos muestras) muestras)
1 Dura madre ½ Negativo
2 Piel, herida de 4/4 ¾
entrada
Dura madre 1/1 1/1
3 Piel, herida de 4/4 ¾
entrada
4 Piel, herida de ½ ½
entrada
5 Paladar 2/2 ½
6 Lengua 1/6 1/6

FIGURA. 2 — A: residuo de plomo teñido de rojo con rodizonaato de sodio (NaR) en la

superficie de la piel en el borde del orificio de entrada del proyectil. B: confirmación de la
presencia de plomo tras el cambio de color a azul con ácido clorhídrico (A: NaR; B: NaR-
HCl 200 ·).
FIGURA. 3 - Residuos de plomo a lo largo de la trayectoria del proyectil a través de la
dermis / tejido adiposo subcutáneo (A: rodizonaato de sodio [NaR]; B: NaR-HCl 100 ·).

FIGURA. 4 — Residuos de plomo en el tejido adiposo subcutáneo; la diferencia

cuantitativa entre los residuos se debe a la pérdida de material después de la preparación
de la serie de secciones (A: rodizonaato de sodio [NaR]; B: NaR-HCl 200 ·).