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INVESTIGACION ORIGINAL
publicado: 17 de agosto de 2017
doi: 10.3389/fmolb.2017.00057

Transcriptoma de secuenciación profunda

Análisis de la curación de heridas murinas:
Efectos de un multicomponente,
Producto Natural Multiobjetivo
TerapiaTr14
Georges St. Laurent III 1, 2, Bernd Seilheimer 3 , Michael Tackett 1
, Jianhua Zhou1, 4 ,
Dmitri Shtokalo1, 5, 6, Yuri Vyatkin1, 6, Maxim Ri 1, 6, Ian , dan jones
3
y
Toma4 Timoteo A. McCa7 *ffrey
1
Instituto St. Laurent, Vancouver, WA, Estados Unidos, 2
SeqLL, Inc. Woburn, MA, Estados Unidos, 3
Tacón Biologische Heilmittel
GmbH, BadenBaden, Alemania, 4
Universidad de Nantong, Nantong, China, 5
Instituto APErshov de Sistemas Informáticos,
Novosibirsk, Rusia,
6 AcademGene LLC, Novosibirsk, Rusia, 7
División de Medicina Genómica, The George Washington
Universidad, Washington, DC, Estados Unidos

La cicatrización de heridas implica una respuesta orquestada que involucra múltiples procesos, como la
Editado por: hemostasia, la migración celular, la síntesis de matriz extracelular y, en particular, la inflamación. Utilizando un
José Curran,
modelo murino de reparación de heridas cutáneas, el transcriptoma se cartografió desde 12 horas hasta 8 días
Universidad de Ginebra, Suiza
después de la lesión, y en respuesta a un producto natural multicomponente y multiobjetivo, Tr14. Usando la
Revisado por:
Tanja Dominko, secuenciación de ARN de una sola molécula (RNA seq), hubo cambios temporales claros en las transcripciones
Instituto Politécnico de Worcester,
conocidas relacionadas con las vías de cicatrización de heridas y nuevas transcripciones adicionales de genes
Estados Unidos

Cuncong Zhong,
codificantes y no codificantes. El tratamiento con Tr14 moduló >100 transcritos relacionados con vías clave de
Universidad de Kansas, Estados Unidos reparación de heridas, como la respuesta a heridas, la contracción de heridas y la respuesta de citoquinas. Los
*Correspondencia: resultados proporcionan la caracterización más precisa y completa hasta la fecha de la respuesta
Timothy A. McCaffrey
del transcriptoma al daño de la piel, la reparación y la terapia con productos naturales de múltiples
mcc@gwu.edu
componentes. Al comprender el proceso de reparación de heridas y los efectos de los productos
Sección de especialidades:
Este artículo fue enviado a

naturales, debería ser posible intervenir de manera más efectiva en enfermedades que involucran reparación abe
RNA,
una sección de la revista
Palabras clave: cicatrización de heridas, RNAseq, Traumeel (Tr14), multicomponente, multiobjetivo, productos naturales, TGFß1, perfiles de transcripción
Fronteras en Biociencias Moleculares

Recibido: 13 de marzo de 2017

Aceptado: 02 agosto 2017 INTRODUCCIÓN

Publicado: 17 agosto 2017

Citación: Los eventos celulares y fisiológicos que comprenden el proceso de cicatrización de heridas siguen siendo primordiales en los
St. Laurent G III, Seilheimer B, esfuerzos por comprender los mecanismos biológicos de las enfermedades crónicas. Las principales enfermedades, como la
Tackett M, Zhou J, Shtokalo D, aterosclerosis, se entienden en el contexto de la reparación de heridas aberrantes (Ross, 1993). Incluso en el cáncer, la importancia
Vyatkin Y, Ri M, Toma I, Jones D y del sistema de inflamación y cicatrización de heridas ha llevado a los autores a describir los tumores como “heridas que no
McCaffrey TA (2017) Análisis del
cicatrizan” (Dvorak, 1986).
transcriptoma de secuenciación profunda
Los recientes avances en biología de sistemas han catalizado una amplia transformación en el mapa conceptual
de la cicatrización de heridas en murinos:
efectos de un multicomponente,
deNalaturianleflsamTr1a4c.ión, en particular, la importancia de su evolución temporal y espacial. Por ejemplo, el descubrimiento de
multiobjetivo Terapia de Productos
Frente. mol. Biosci. 4:57. las resolvinas y sus acciones dentro del sistema de inflamación han establecido el proceso de "resolución" como un evento definitorio
doi: 10.3389/fmolb.2017.00057 entre "agudo" y "crónico".

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inflamación, esta última a menudo asociada con progresión de la enfermedad y mal
pronóstico (Levy, 2010). Simultáneamente con la resolución de la inflamación, la
cicatrización de heridas desencadena el inicio de un programa
coordinado de regeneración. Este programa implica la migración de
fibroblastos y células epiteliales residentes, el reclutamiento de células madre
adultas y progenitores en el sitio, seguido de la diferenciación, la producción
de matriz extracelular y la remodelación de tejidos.
La reparación de heridas es una respuesta cuidadosamente orquestada que integra
muchos de los aspectos del desarrollo embrionario: diferenciación coordinada de
células progenitoras, migración sincrónica de células de reparación y patrones
temporales de división celular, producción de matriz
y remodelación (Larson et al., 2010) .
La inflamación temprana se combina de manera efectiva con la regeneración tisular
posterior, pero también puede contribuir a la cicatrización persistente en el sitio
(Eming et al., 2007). Mientras que los enfoques convencionales para la lesión tisular
se centran en gran medida en la supresión de cualquier tipo de inflamación, a través
de medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y glucocorticoides, cada
vez se presta más atención a la utilización de terapias multiobjetivo para reducir la
hiperactividad del sistema inmunitario innato (Hwang et al . , 2013). Recientemente,
hemos propuesto un marco general para comprender la base científica de las vías
reguladoras de las enfermedades humanas, denominado "Medicina de sistemas
biorreguladores" (BrSM). BrSM proporciona un modelo general de cómo se pueden
corregir las desregulaciones subyacentes utilizando productos de múltiples
componentes, como Traumeel (Tr14) (Goldman et al., 2015). Tr14 es un producto
natural que contiene 14 ingredientes vegetales y minerales. Se desconocen los
mecanismos de acción exactos, pero varios estudios sugieren propiedades
antiinflamatorias (Porozov et al., 2004; Birnesser y Stolt, 2007) y antioxidantes
(Baldwin y Bell, 2007; Zilinskas et al., 2011).
Tr14 ha mostrado efectos sobre los niveles celulares y de citoquinas en ensayos
controlados aleatorios, doble ciego (ECA) de traumatismo muscular inducido por el
ejercicio (Pilat et al., 2015; Muders et al., 2016, 2017), y demostró alivio del dolor en
pacientes agudos. esguinces de tobillo (Gonzalez
de Vega et al., 2013), con evidencia sustancial que indica un papel beneficioso en la
inflamación y reparación de heridas (Wolfarth et al., 2013).
El presente estudio empleó la secuenciación avanzada de una sola molécula
(SMS) de ARN (RNAseq) para crear un mapa de alta resolución del transcriptoma
del ratón durante la cicatrización de heridas, y luego usa este mapa para definir los
cambios resultantes de la intervención terapéutica con Tr14. El perfilado de
transcripciones por RNA seq proporciona una
vista del transcriptoma de última generación y relativamente libre de sesgos que se
puede utilizar para identificar redes prometedoras para evaluar las acciones de los
fármacos y los objetivos biológicos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Modelo de curación de heridas La
cepa ICR de ratones en el rango de edad de 4 a 6 semanas, ~20 g cada uno, se
utilizó para los estudios de curación de heridas, según los protocolos aprobados por
el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Nantong (PR China). Bajo
sedación (ketamina 100 mg/kg, xilazina 10 mg/kg IP), se afeitó la región
dorsal/escapular del ratón y luego se raspó un área de 1 cm2 con una herramienta
rotatoria abrasiva. Se recuperó tejido de piel de espesor completo mediante
sacrificio en tiempos específicos: 0, 12, 24,
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36, 72, 96, 120 y 192 h después de la lesión. Cada punto de tiempo de cada grupo
de tratamiento utilizó 7 ratones, para un análisis total de 224 ratones.
El tejido se almacenó en RNAlater a 80◦C hasta que se aisló el ARN.
Condiciones de tratamiento El diseño
general del estudio se presenta en la Tabla complementaria 1, que describe los
puntos temporales, los grupos de tratamiento y las muestras individuales
secuenciadas en el estudio. Se introdujeron Tr14 (grupo Tr14I, 9,5 mg/ml) o el
vehículo salino (grupo S) en 6 inyecciones subcutáneas para un total
de 0,1 ml en la región alrededor de la herida usando una aguja 23G colocada debajo
del área erosionada.
Otros ratones recibieron las inyecciones con la adición de ungüento Tr14 tópico dos
veces al día (0,1 ml de 34 mg/ml) en la herida (grupo Tr14IO) o el control de
ungüentos sin fármaco (grupo U). La solución inyectable (envasada en ampollas de
vidrio, clase hidrolítica I) y la pomada Tr14 fueron fabricadas por Biologische
Heilmittel Heel GmbH, Alemania, según normas GMP. El medicamento del estudio
fue empaquetado, enviado y etiquetado por Biologische Heilmittel Heel GmbH,
Alemania. La descripción completa de los ingredientes y el etiquetado del paquete
está disponible en el sitio web fda.gov (Administración de Alimentos y
Medicamentos de los Estados Unidos, 2015, 2017).
Aislamiento de ARN para RNASeq
Los ácidos nucleicos totales, enriquecidos para ARN, de la piel de ratón herida
preservada con ARNlater se extrajeron usando TRIzol (Invitrogen) usando el
protocolo del fabricante. La muestra se homogeneizó utilizando
cuchillas de corte rotatorio (Tissue Tearer) en un volumen de 10x de TRIzol.
A continuación, se midió la calidad y la cantidad del ARN resultante utilizando la
absorbancia a 260/280 nm en un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific)
(Chomczynski y Mackey, 1995). Los ácidos nucleicos totales se trataron con
ADNasa (TurboDNAse, 1 ul, 30 min, 37 °C) y luego se depletó el ARN
ribosómico utilizando los reactivos de eliminación de ARNr RiboZero
(Epicentre). A continuación, se volvió a evaluar la calidad del ARN con un
número de integridad de ARN Agilent 2100 Bioanalyzer (RIN > 7) y se
cuantificó la muestra con un Nanodrop con un umbral de calidad de A260/280 >
1,8.
Secuenciación del transcriptoma (RNASeq)
La metodología SMS para la cuantificación del transcriptoma está descrita por
Lipson et al. (2009), y se muestra gráficamente en la Figura complementaria 1. El
ARN empobrecido en ribosomas (200 ng) se convirtió en ADNc utilizando el kit
de síntesis de ADNc Superscript III (Invitrogen) y cebadores de hexámeros
aleatorios, de acuerdo con el procedimiento del fabricante. El ARN que quedaba
en la muestra se degradó luego mediante la adición de 1 unidad de RNasa H y 1
unidad de RNasa If (New England
Biolabs). A continuación, el ADNc resultante se purificó dos veces en columnas de
filtración en gel Performa (EdgeBio).
A continuación, se cuantificó la concentración del cDNA resultante utilizando un
Nanodrop, como se describió anteriormente (Lipson et al., 2009).
Para capturar el ADNc en las placas de secuenciación, se añadieron colas poli A 3'
al ADNc (100 ng) usando transferasa terminal. Las moléculas de ADNc capturadas
se secuenciaron directamente mediante nucleótidos fluorescentes en el secuenciador
de molécula única Heliscope (SMS, SeqLL, Inc).
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St. Laurent III et al.
Tr14 multicomponente afecta el transcriptoma de heridas

Análisis de datos de RNASeq Cada

Se consideró una puntuación de alineación de 4,3. Hasta el 30 % de las lecturas
canal de secuenciación produce un promedio de 42 millones de lecturas por canal,
se asignan a secuencias de ARN ribosómico y se filtran intencionalmente, lo que
o 43 millones de lecturas por muestra después de la doble secuenciación de
evita la asignación errónea de esas lecturas al resto del genoma. En promedio,
canales con baja cobertura (Tabla complementaria 5E). El procesamiento
7,1 millones de lecturas por muestra, o el 33 % de las lecturas filtradas,
bioinformático de los datos se realizó utilizando el paquete Helisphere 1.2.740
satisfacen los criterios de mapeo: tienen la mejor posición de mapeo única en
como se describió anteriormente (St. Laurent et al., 2013a). Las lecturas se
chr119, X, Y, M (Tabla complementaria 5E). Estas lecturas asignadas se
filtraron mediante la utilidad filterSMS con parámetros predeterminados para
denominan lecturas informativas en el análisis posterior. Teniendo en cuenta la
eliminar secuencias de baja complejidad, como poliA, y lecturas cortas de menos
longitud de lectura corta, el requisito de alineación única y las propiedades de la
de 25 pb. Las lecturas restantes (21 millones en promedio por muestra) luego se
plataforma, la proporción de lecturas informativas en relación con las
mapearon en el genoma mm9 (UCSC) combinado con secuencias de ARN
lecturas filtradas está dentro del rango esperado. Las lecturas informativas se
ribosómico de NCBI (Accesos: NR_003278.1, J01871.1, NR_003279.1) usando
asignaron a transcripciones basadas en el archivoknownGene.txt (versión mm9 del
el alineador indexDPgenomic (Lipson et al . , 2009; St. Laurent et al., 2013a).
genoma del ratón) en la base de datos UCSC Genes (Kent et al., 2002). El número
Solo lee con la mejor alineación única en o por encima del mínimo
de lecturas informativas que superponen intervalos exónicos en el genoma en cada
transcripción

FIGURA 1 | La respuesta temporal del transcriptoma a la herida de la dermis del ratón. Los resultados de secuenciación de ARN se analizaron en cada punto de tiempo (eje X) para identificar transcritos que
diferían significativamente de la muestra de control ilesa de 0 h. Las transcripciones resultantes se clasificaron luego en ontologías seleccionadas previamente, y las ontologías con la mayor actividad se trazan en
función de la probabilidad de que la ontología se active de manera desproporcionada en una muestra aleatoria de transcripciones (eje Y, valor p, escala log10 ) . Debido a que una ontología puede contener ~200
transcripciones, en cualquier punto de tiempo puede haber transcripciones que aumenten o disminuyan en magnitud
en relación con el punto de tiempo de control. (A) muestra 4 ontologías con la probabilidad estadística más alta de aumentar en el punto de tiempo de 12 h, por lo que la ontología de
"respuesta inmunitaria" (línea azul) está sobrerrepresentada con una probabilidad de 10−40 en comparación con un conjunto aleatorio de transcripciones. (B) representa 5 ontologías que participan en el
marco de tiempo de 24 a 72 h.

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CUADRO 1 | Las principales ontologías de genes cambiaron en cada momento. CUADRO 1 | Continuado

Top 8 GO UP regulados Top 8 GO DOWN Top 8 GO UP regulados Top 8 GO DOWN regulado

regulado

Término IR* Término IR* Término IR* Término IR*

12 horas 96 horas Adhesión celular desarrollo del ectodermo desarrollo

respuesta inmune regulación del sistema

proceso adhesión biológica de la epidermis

respuesta de defensa despolarización de la membrana proceso metabólico del diferenciación de queratinocitos

fosfato
respuesta a la herida regulación de la contracción
muscular metabolismo del fósforo diferenciación de células epidérmicas

proceso
activación celular regulación de la contracción
del corazón a base de filamentos de actina queratinización
proceso
respuesta inflamatoria regulación de la contracción del
músculo estriado fosforilación de diferenciación de células epiteliales

aminoácidos de proteínas adhesión

regulación positiva de la regulación de la producción de
de células homofílicas ciclo del pelo
respuesta al estímulo interleucina10
organización del ciclo de muda
vía de señalización mediada por transporte de oxigeno
citoesqueleto de actina
citoquinas

quimiotaxis regulación de la producción de 120 horas desarrollo de vasos sanguineos desarrollo del ectodermo desarrollo
interleucina4
desarrollo vascular de la epidermis

24 horas fosforilación de aminoácidos diferenciación de células epiteliales

Adhesión celular proceso biosintético de
de proteínas
melanina
regulación positiva de la desarrollo del epitelio
adhesión biológica proceso metabólico de la melanina
función molecular

angiogénesis ensamblaje del nucleosoma

fosfato metabólico desarrollo del mesodermo
desarrollo vascular ensamblaje de cromatina proceso
desarrollo de vasos sanguineos montaje o desmontaje de la proceso metabólico del fósforo diferenciación de queratinocitos

cromatina

vaso sanguíneo organización del nucleosoma vía de señalización de la diferenciación de células epidérmicas

morfogénesis proteína del receptor ligado a enzimas

a base de filamentos de actina ensamblaje del complejo angiogénesis formación de mesodermo

proceso proteínaADN
192 horas proceso metabólico de fósforo de desarrollo del ectodermo
regulación de la proliferación celular empaque de ADN
transporte mediado por desarrollo de la epidermis

36 horas vesículas
proceso metabólico de glicoproteínas desarrollo del ectodermo

proceso metabólico del fosfato diferenciación de queratinocitos

transporte mediado por vesículas

desarrollo de la epidermis diferenciación fosforilación de aminoácidos

vaso sanguíneo
de proteínas diferenciación de células epiteliales
morfogénesis de queratinocitos
a base de filamentos de actina
desarrollo de vasos sanguineos desarrollo
proceso Adhesión diferenciación de células epidérmicas
diferenciación de células epiteliales
vascular
celular
diferenciación de células epidérmicas
a base de filamentos de actina iniciación traslacional
adhesión biológica
proceso desarrollo del epitelio
desarrollo del mesodermo
adhesión de células homofílicas
glicosilación de biopolímeros
queratinización
queratinización

glicosilación transporte de iones de metales de transición * Ontologías presentadas en orden de menor a mayor valor p de Top 8.

72 horas Adhesión celular desarrollo del ectodermo desarrollo

adhesión biológica de la epidermis se calcula y se convierte a unidades de RPKM (lecturas por mil (K) nucleótidos
a base de filamentos de actina diferenciación de células epiteliales de longitud de la transcripción empalmada, por millón de lecturas capturadas
proceso por muestra) utilizando un script Perl personalizado. Estudios previos
organización del diferenciación de queratinocitos confirman que los niveles de expresión cuantitativa generados por este proceso
citoesqueleto de actina organización
pueden detectar cambios de < 2 veces, incluso con una abundancia absoluta de
del citoesqueleto adhesión célula- diferenciación de células epidérmicas ARN bastante baja (St. Laurent et al., 2013a).
célula queratinización

adhesión de células homofílicas
invaginación de membrana
transporte de iones de metales de transición Genes Expresados Diferencialmente (DEG)
ciclo de muda
Se compararon el cambio de pliegue (escala log2 ) y el valor p (probabilidad de
obtener el cambio de pliegue por casualidad) para cada transcripción
(Continuado)

4
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St. Laurent III et
entre grupos de muestras utilizando la prueba de Welch y el paquete de software edgeR
Bioconductor (Robinson et al., 2010). Los parámetros se ajustaron para hacer
propiedades biológicas de seleccionados
FIGURA 2 | Evolución temporal de la respuesta del ARN a las heridas de la piel. Panel superior: un
resumen gráfico de las principales vías involucradas durante la reparación de heridas en mamíferos
según la adaptación de Seifert et al. (2012). Panel inferior: las
principales ontologías de genes de las transcripciones reguladas por heridas en la piel del ratón,
como se detalla en la Tabla 1.
FIGURA 3 | El efecto de Tr14 en los patrones de expresión génica después de una herida. Los
resultados de la secuenciación del ARN se analizaron para identificar las transcripciones que se
expresaron de manera diferencial entre los controles tratados con placebo y las heridas tratadas con
Tr14, en cada punto de tiempo después de la lesión (eje X). El efecto de Tr14 en una ontología dada se
muestra como una puntuación de expresión génica agregada de las transcripciones expresadas
diferencialmente en ese grupo GO, expresada como la relación log2 de Tr14 frente a los niveles de
control (eje Y, relación log2 Tr14/Con). Para Muscle Contraction GO, se afectaron un total de 25
transcripciones que cubren 17 genes únicos no redundantes. Tr14 afectó a 87 transcritos (51 genes) en
la respuesta a Wounding GO, y a 9 transcritos (6 genes) en la respuesta a Cytokine Stimulus GO.
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Tr14 multicomponente afecta el transcriptoma de heridas
genes más prominentes y minimizar la tasa de descubrimiento falso (FDR). Para la
comparación del grupo tratado con Tr14 (Tr14I o Tr14IO) frente al grupo tratado con
solución salina con placebo (S), se requirió que el valor p no ajustado de edgeR fuera
inferior a 0,0005. La dispersión común, la dispersión de tendencia y la dispersión por
etiqueta de los recuentos de expresión sin procesar (no normalizados por RPKM) se
consideraron al ajustar los parámetros del modelo de Poisson sobredisperso mediante el
software edgeR.
Para la comparación del curso de tiempo U frente a 0 h U, se usó la prueba de Welch y se
requirió que el límite del valor de p no ajustado fuera inferior a 0,001. Los resultados de la
comparación de U frente a U en los grupos de 0 h con edgeR no se usaron porque las
grandes diferencias entre los tejidos lesionados y no
lesionados hicieron que los resultados de la herramienta edgeR altamente sensible fueran
demasiado amplios y desenfocados.
Para los genes expresados diferencialmente, se requería que el cambio de pliegue
entre los valores de RPKM promediados entre las muestras fuera al menos 1,41 (o 0,5 en
la escala log2). Se seleccionaron un máximo de 2000 genes expresados diferencialmente,
definidos de esta manera con el valor p más bajo, para el análisis posterior. Este umbral se
aplicó para hacer que el análisis de enriquecimiento de ontología génica sea comparable
entre diferentes grupos, porque el análisis GO depende en gran medida del número de
genes de entrada. De hecho, en cada punto de tiempo de U frente a 0 h U, se aplicó
sustancialmente el límite de 2000, lo que mantuvo el FDR por debajo de 0,025.
Análisis de datos de biología de sistemas Para comprender
las correlaciones y los patrones entre los diferentes elementos del transcriptoma, los
ARN expresados diferencialmente se asignan a sus respectivas rutas biológicas y
categorías de ontología génica (GO) (Harris et al., 2004) utilizando el software DAVID
(Huang da et al. , 2009). Los cambios enriquecidos en rutas u ontologías individuales
fueron probados por su significancia estadística medida por un número de aciertos mayor
al esperado por casualidad, con p < 0.1, calculado usando un modelo hipergeométrico. Se
tomó como resultado la tabla GOTERM_BP_DIRECT de la salida de "anotación
funcional" de DAVID. Las vías específicas se analizaron y estudiaron con Pathway
Studio (Nikitin et al., 2003) y el software ExPlain (Kel et al., 2006).
RESULTADOS
Respuesta de cicatrización de heridas en ratones a la abrasión de espesor parcial
La caracterización histológica del
modelo de abrasión de espesor parcial empleado aquí ha sido bien descrita por otros (Gupta
et al., 2014). El proceso de reparación de heridas murinas se ha detallado recientemente
utilizando imágenes intravitales de heridas por punción para proporcionar una excelente
descripción temporal de la migración, proliferación y diferenciación celular (Park et al.,
2017). De acuerdo con los procesos de reparación de heridas cutáneas muy eficientes en el
ratón, no hubo cambios sorprendentes en el proceso de reparación morfológica general
inducido por Tr14, por lo que es probable que los efectos observados en la expresión génica
no se deban a cambios celulares importantes en las regiones de heridas recolectadas.
agosto 2017 | Volumen 4 | Artículo
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St. Laurent III et Tr14 multicomponente afecta el transcriptoma de heridas

Perfil de expresión génica de la respuesta de cicatrización de heridas Aunque Los procesos de reparación de heridas se activaron y luego disminuyeron, dando paso a
existen más de 108 000 programas transcripcionales diseñados para restaurar la

referencias relacionadas con la cicatrización de heridas en la base de datos de PubMed, integridad del tejido, como la síntesis de matriz extracelular y la contracción de heridas.
relativamente pocas proporcionan datos sobre la expresión génica. Actualmente, el En conjunto, estos datos demuestran una imagen detallada y de alta resolución del
único conjunto de datos de RNAseq publicado que perfila un curso de tiempo de paisaje transcripcional de la cicatrización de heridas murinas. La Tabla 1 enumera las
curación de heridas cubre un modelo de curación ósea en ovejas (Jager et al., 2011). principales categorías de GO reguladas (hacia arriba y hacia abajo) en cada punto de
Para describir los cambios en el transcriptoma de piel de ratón durante la cicatrización tiempo posterior a la herida.
normal de heridas, se realizó un análisis de los cambios de expresión génica en los La Figura 2 resume estos cambios en el transcriptoma y superpone los resultados
cursos de tiempo de control utilizando un método combinado de cambio de actuales con las descripciones publicadas anteriormente de la progresión de la
pliegue/valor p en cada punto después de la lesión. En conjunto, el análisis de RNAseq reparación de heridas cutáneas, como se revisó recientemente (Seifert et al., 2012).
representa más de 3900 millones de lecturas de secuencias, que actualmente se
encuentra entre los conjuntos de datos de RNAseq más grandes que existen para la
Los efectos de Tr14 en la expresión génica durante la reparación de
cicatrización de heridas en la piel, y se compara favorablemente en alcance con un
heridas Los datos
análisis reciente de RNAseq de reparación después de una lesión muscular inducida
de RNAseq indican que el tratamiento con Tr14 produjo cambios biológicamente
por crio (Aguilar et al., 2015).
significativos y consistentes en cientos de genes involucrados en las vías de curación
Las figuras complementarias 2AG presentan diagramas de dispersión Tagwise
de heridas. Cabe destacar la técnica
que muestran la distribución de genes por nivel de expresión (eje X) y cambio de
pliegue (eje Y) para el punto de tiempo de 12 h hasta el punto de tiempo de 192 h de
las heridas de control (U) en relación con el tiempo 0. Los genes marcados en rojo
representan el subconjunto que tiene mediciones de cambio de pliegue
estadísticamente significativas.
La Tabla complementaria 2 enumera los 100 genes principales regulados hacia
arriba o hacia abajo en cada punto de tiempo de cicatrización de heridas, sus niveles de
expresión relativos medidos por recuentos de lectura normalizados y valores p. La lista
destaca cientos de genes de las principales vías de mamíferos críticas para la
cicatrización de heridas, como citocinas, moduladores de la organización de tejidos,
factores de crecimiento y otros genes activos en el proceso de cicatrización de heridas.

Análisis de la vía de curación de heridas Los resultados

anteriores demuestran cientos de genes regulados hacia arriba y hacia abajo durante el
transcurso del tiempo de curación de heridas. Para lograr una mejor comprensión a nivel
de sistemas de cómo el sistema de cicatrización de heridas involucra las transcripciones
en cada fase de la reparación, se empleó el análisis Gene Ontology (GO). GO facilita un
vocabulario formalizado y consistente para comprender las categorías funcionales de
muchos genes en un sistema. El compromiso de la respuesta a la herida GO se
demuestra mediante la modulación de 53 genes en esta categoría a las 12 h posteriores a
la lesión, que es mucho más de lo que se esperaría aleatoriamente (se esperaban 14
genes, p < 1046), consulte la Figura complementaria 3 para más detalles.
La Figura 1 organiza estos grupos de transcritos según los cambios de respuesta
temprana, media y tardía en heridas tratadas con placebo (U). Como era de esperar, el
punto de tiempo de 12 h demuestra una señal intensa para los genes de curación de
heridas (Figura 1A). En el punto de tiempo de 12 h, hay un compromiso muy llamativo
de la respuesta de defensa, la respuesta inmune, la respuesta a las heridas y la respuesta
inflamatoria, como lo demuestra la fuerte sobrerrepresentación de estas transcripciones
[log (valor p) en el eje Y , es decir, 40 es 1*10−40 de probabilidad de que las
transcripciones de la Respuesta Inmunológica se hayan visto afectadas solo por
casualidad.] La Figura 1B demuestra que ciertos procesos se mantienen en los marcos
de tiempo posteriores con al menos el 80 % de la expresión máxima a las 24 h o más
tarde. Curiosamente, este grupo de categorías GO con participación sostenida incluye
Localización de células, Activación de leucocitos, Producción de citocinas, Adhesión
biológica y Producción de TNF.

FIGURA 4 | El efecto de Tr14 en transcripciones seleccionadas en la vía de la interleucina. Los datos

Dentro de este período de 8 días, la mayoría de los procesos inflamatorios y
de secuenciación de ARN se analizaron para identificar las transcripciones moduladas por el
tratamiento con Tr14. Los aumentos significativos en tres de las transcripciones (A–C) en la vía de la
interleucina se muestran como expresión génica (RPKM, eje Y) en función del tiempo en horas (eje
X).

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St. Laurent III et
Las características de la tecnología SeqLL/Helicos SMS han demostrado precisión y
reproducibilidad incluso con cambios bajos (1,5X) a moderados (2X) en la expresión
génica (St. Laurent et al., 2013a,b).
Las comparaciones publicadas de tSMS RNAseq con RTPCR han observado
correlaciones de 0,85 a 0,90 entre estos métodos (St.
Laurent et al., 2013b, 2016). Independientemente del modo de administración, el
tratamiento con Tr14 dio como resultado cientos de genes regulados diferencialmente
en comparación con el grupo de control con solución salina. Por ejemplo, a las 96 h, el
grupo Tr14IO dio como resultado 21 genes expresados diferencialmente de la
categoría GO de respuesta a heridas,
mientras que el grupo Tr14I dio como resultado 31 genes expresados diferencialmenAtRe.Nm de la proteína accesoria del receptor de IL18 (IL18RAP) en los tratados
En particular, estos dos conjuntos se superpusieron en 13 genes, más del 50
% de la superposición potencial máxima (p < 2,1 × 10−10, prueba exacta de Fisher,
figura complementaria 4), lo que demuestra que 2 formas diferentes de tratamiento con
Tr14 produjeron muchos cambios de transcripción similares, al mismo tiempo que
enfatizaba que la administración tópica e inyectable producía respuestas algo diferentes.
Se observó una concurrencia similar entre las dos formas de administración en la
categoría GO de diferenciación de células epiteliales (Figura 5 complementaria).
Cambios de expresión en vías clave de cicatrización de heridas resultantes del
tratamiento con Tr14 Los genes regulados diferencialmente, ya sea aumentados o
disminuidos por Tr14IO en comparación con el control, se resumen mediante sus
ontologías génicas principales en la Figura 3. En la Figura 3 se produce un número
relativamente grande de cambios en la expresión génica curso como resultado del
tratamiento con Tr14. Hubo un efecto notable de Tr14 en la respuesta a las heridas y
la respuesta a las ontologías génicas de citoquinas, alcanzando su punto máximo
alrededor de 96 a 120 h después de la lesión y el tratamiento (Figura 3).
Varias categorías exhibieron picos secundarios a las 96–120 h, en particular,
Antiapoptosis y Diferenciación celular (no se muestra).
Notable fue un fuerte compromiso de la ontología de contracción muscular a
las 96 h, que involucra transcripciones que están relacionadas con la contracción de la
herida (Figura 3). Como se muestra más adelante en la Figura 6, alrededor
del 25 % de las transcripciones en la vía de contracción muscular se vieron afectadas a
las 96 h.
Transcripciones de reparación de heridas seleccionadas afectadas por
Tr14 Usando el
curso de tiempo como un filtro adicional, se identificaron transcripciones con cambios
en múltiples puntos de tiempo porque es más probable que sean factores importantes en
la red fisiológica mediada por Tr14. De hecho, la mayoría de estos genes pertenecen a
categorías relevantes para la cicatrización de heridas y proporcionan objetivos
potenciales para estudios adicionales de
los mecanismos moleculares de la acción de Tr14.
Por ejemplo, el tratamiento con Tr14 regula varios genes de la familia de las
interleucinas, que desempeñan un papel clave en la comunicación intercelular entre los
linfocitos y una variedad de otros tipos de células inmunitarias. Las Figuras 4AC
muestran la expresión relativa de los miembros de la familia de las interleucinas en
animales tratados con Tr14 en comparación con los controles. La Figura 4A muestra
que el tratamiento con Tr14 retrasa y atenúa entre un 30 y un 40 % el fuerte aumento (
600 veces) en la expresión del ARNm de IL1ß en el período de 12 a 24 horas después
de la herida.
Producida por monocitos y macrófagos, la IL1ß es un importante mediador de la
respuesta inflamatoria (Mirza y Koh, 2015).
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Tr14 multicomponente afecta el transcriptoma de heridas
IL1ß induce la ciclooxigenasa2 (PTGS2/COX2), que es una enzima clave en la
producción de tromboxanos, leucotrienos y HETE, lo que contribuye directamente al
dolor inflamatorio y la hipersensibilidad (Burke and Collier,
2011). La reducción de los niveles de ARNm de IL1ß es consistente con la acción
conocida de Tr14 para reducir el dolor de la inflamación en otras
indicaciones (Schneider, 2011; Gonzalez de Vega et al., 2013). También se sabe que
otras terapias derivadas de plantas, como el resveratrol, atenúan los niveles de IL1ß
después de las quemaduras (Tao et al., 2015).
La Figura 4B muestra una comparación de los niveles de expresión de
con Tr14 frente a los controles. La herida inicial provoca un aumento casi idéntico de
aproximadamente 12 veces por encima de los niveles de IL18RAP
basales en heridas tratadas y no tratadas. Sin embargo, en cada uno de los siguientes 6
puntos de tiempo, el grupo tratado con Tr14 muestra un aumento moderado pero
reproducible en los niveles de expresión. Se ha demostrado que IL18RAP regula la
producción de interferónγ en monocitos de sangre
periférica (Myhr et al., 2013), por lo que este aumento podría reflejar una infiltración
monocítica alterada.
La Figura 4C demuestra el efecto de Tr14 sobre la expresión de IL36 en la herida
del ratón. Varios estudios implican a la IL36 en afecciones inflamatorias de la piel en
ratones (Blumberg et al., 2007) y en la psoriasis humana (Towne et al., 2011).
Curiosamente, el cambio de veces de IL36 en los animales tratados aumenta hasta 20
veces más en las heridas tratadas con Tr14 a las
96 h después de la lesión. La lesión provocó inducciones de hasta 10 veces del ARNm
de IL6, IL8 e IL 10, con un efecto relativamente leve de Traumeel
a lo largo del tiempo (Figura 6 complementaria).
Una variedad de otros genes importantes en la cicatrización de heridas muestran
cambios en la expresión a lo largo del tiempo como resultado del tratamiento con Tr14
y se enumeran en la Tabla complementaria 3. La tasa de descubrimiento falso para esta
lista es 0.159, 0.557, 0.238, 0.066, 0.024, 0.019
y 0,026 para los puntos de tiempo de 12, 24, 36, 72, 96, 120 y 192 h,
respectivamente. Algunos ejemplos incluyen marcadores de daño y estrés celular
(NKG2D, DNAJ B), genes reguladores de la matriz extracelular (inhibidor de serina
proteasa A3F) y miRNA (mir543) (Figuras 5AD). NKG2D (KLRK1), por ejemplo, es
un receptor de células asesinas naturales que tiene una conexión ampliamente publicada
con la capacidad del sistema de respuesta inmunitaria innata para detectar el estrés y las
células senescentes (Sagiv et
al., 2016), y por lo tanto, junto con sus ligandos, se considera una diana terapéutica
para enfermedades inmunitarias (Gonzalez et al., 2008). DNAJB13 es un miembro de
la familia de proteínas de choque térmico (HSP) y
recientemente se ha asociado con defectos en la motilidad celular (El Khouri et al.,
2016).
El inhibidor de la serina proteasa A3 probablemente esté involucrado en el control de
la actividad de la elastasa y los miembros de esta familia han estado implicados en el
mantenimiento de las funciones de barrera (Hu et al., 2013). El micro ARN 543
(mir543) se ha asociado con la diferenciación de células madre mesenquimales y, por
lo tanto, puede estar relacionado con cambios en las vías de diferenciación celular (Xu
et al., 2017).
Principales categorías de ontologías génicas afectadas por el tratamiento con
Tr14 El mapeo de ontologías
génicas del conjunto de datos RNAseq proporciona un medio para identificar
patrones de expresión génica durante la reparación de heridas. Una lista completa de
categorías de Gene Ontology significativamente
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FIGURA 5 | Comparación de la expresión génica para transcritos seleccionados (A–D) en animales tratados con Tr14 frente a controles con solución salina. El eje X informa el tiempo después de la lesión en la piel del ratón,
cuando se recolectó la región lesionada para el ARN y la cuantificación mediante RNAseq. El eje Y refleja la expresión génica normalizada promedio para las transcripciones especificadas en cada panel. Las líneas rojas
indican los niveles de expresión en los ratones de control y las líneas azules indican los niveles en las heridas tratadas con Tr14 (Grupo IO).

afectados por el tratamiento con Tr14IO en cada punto de tiempo se incluye en

la Tabla complementaria 4. Un grupo importante de genes regulados por el
tratamiento con Tr14 incluye moduladores de la organización de tejidos y el
desarrollo de patrones. Por ejemplo, 12 h después de la lesión, un grupo de
El análisis de red proporciona hipótesis para el modo de acción de Tr14
Mientras que las categorías
GO representan amplias colecciones de genes agrupados por funciones

moduladores clave del proceso de desarrollo se ven afectados por Tr14,
incluidos Desmoglein 4 (Dsg4), el receptor activado por proliferador de
peroxisomasγ (Pparg) y la familia de las queratinas (Krt) . Entre las categorías
de ontología génica más intrigantes afectadas por Tr14 en este estudio estaban
las categorías de contracción muscular, respuesta a heridas y respuesta al
estímulo de citocinas, como se muestra en la Figura 3, Tr14 regula al alza un
número relativamente grande de estos genes, especialmente durante el 96–
Plazo de 192 h.
Los datos revelan un efecto similar, pero inverso, de Tr14 en la categoría
de ontología del gen de diferenciación de células epiteliales en puntos de
tiempo posteriores. La Figura 5 complementaria detalla
solo los genes en la diferenciación de células epiteliales GO que están
regulados hacia arriba y hacia abajo en cualquiera de los dos grupos de
tratamiento Tr14. En dos puntos de tiempo, hay una superposición de
>50 % en estos genes expresados diferencialmente entre los dos grupos de
tratamiento, y con un valor de p muy significativo. En general, los amplios
cambios en los genes de diferenciación celular en los grupos tratados con Tr14
sugieren una regulación mejorada del estado diferenciado en los microambientes
de las heridas tratadas con Tr14.
Este efecto aumentaría la capacidad de reparación en la zona de la
Tr 1 4.
herida, y podría explicar otro aspecto fundamental del efecto terapéutico de T r 1 4 .
biológicas, efectivamente una "Lista de piezas", las redes biológicas equivalen a
"diagramas de cableado" detallados que incluyen circuitos reguladores, bucles de
retroalimentación y elementos de control. La ontología de contracción muscular
se seleccionó para un análisis posterior porque estaba fuertemente afectada por
Tr14 y es una red de genes bien caracterizada con una función común bien
definida. Para analizar la contracción muscular en forma de red, desarrollamos
una metodología para filtrar los nodos y bordes de la red recopilados de la
literatura seleccionando solo nodos expresados diferencialmente para la
representación final de la red, lo que enfatizaría los nodos que son susceptibles
de regulación. A las 96 h, 65 de las 249 transcripciones en esta vía se vieron
afectadas por el tratamiento con Tr14, que es mucho más grande de lo que se
esperaría solo por casualidad (p = 7,8 ×
1029 ). La red de contracción muscular resultante, representada en el punto de
tiempo de 96 h en la figura 6, muestra un conjunto de transcripciones que están
asociadas con la contracción de la herida y reguladas hacia arriba (rojo) o hacia
abajo (azul). Por lo tanto, utilizando esta vía preconstruida (Nikitin et al., 2003)
como mapa molecular, se podría concluir que los transcritos en la vía de
contracción de la herida se ven afectados por el tratamiento con Tr14, lo que
posiblemente contribuya a un efecto terapéutico de

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FIGURA 6 | Red de genes de contracción muscular a las 96 h. Las transcripciones afectadas por el tratamiento con Tr14 se analizaron por su relevancia para una serie de vías biológicas preestablecidas
como se describe en Métodos (Biología de sistemas). Un número de transcritos superior al esperado pertenecía a la vía de contracción muscular, lo que probablemente refleja los procesos de contracción de
la herida. En esta ruta, reconstruida a partir de la literatura por el software Pathway Studio (Nikitin et al., 2003), las transcripciones individuales descritas por su símbolo genético estándar están conectadas
por líneas. Las líneas pueden conectar genes si se sabe que un producto génico induce la expresión de
otro, si los productos interactúan directamente o si un producto es un sustrato para el otro. Las transcripciones que aumentan con Tr14 se resaltan en ROJO, mientras que las transcripciones que disminuyen se
muestran en AZUL.

DISCUSIÓN estudios realizados en cicatrización de heridas completados hasta la fecha, y el

El proceso fisiológico de curación de heridas proporciona un modelo integrado para
lesiones, inflamación y reparación. Como el genoma de mamíferos no humanos más
extensamente anotado, el ratón ofrece muchas ventajas para los estudios genómicos,
especialmente en las amplias ontologías y vías disponibles para un análisis de biología
de sistemas. La biología de los sistemas de reparación de heridas involucra muchos de
los procesos que pueden desregularse en enfermedades crónicas. Los tejidos afectados
por enfermedades crónicas muestran procesos fisiológicos similares a los involucrados
en la cicatrización aberrante de heridas, incluida la tendencia a la fibrosis y la falta de
cicatrización efectiva.
primero con una terapia multicomponente.
Los resultados indican que varias redes importantes de expresión génica están
implicadas en la cicatrización de heridas. Podría decirse que estos cambios reflejan dos
tipos generales de cambios: (1) cambios en la expresión génica de las células en el
tejido lesionado y (2) la entrada de nuevos tipos de células en el área lesionada. La
afluencia de nuevos tipos de células en respuesta al daño de la piel, como macrófagos
y linfocitos, probablemente influya en la expresión de varios genes regulados.
Asimismo, la señalización paracrina, la muerte celular y la reprogramación del estado
celular también generan cambios coordinados en la expresión génica dentro de las
células residentes del tejido de la herida.

Este estudio del transcriptoma durante la reparación de heridas y el tratamiento El tratamiento con Tr14 da como resultado cambios extensos en la expresión
con Tr14 explora por primera vez los cambios en los patrones de expresión genómica génica durante la cicatrización de heridas, incluidas vías bien conocidas, como TGFβ,
resultantes de un medicamento multicomponente y multiobjetivo en el contexto de un señalización de citoquinas, inflamación, contracción de heridas, colágeno y enzimas de
proceso fisiológico complejo crítico para el tratamiento de enfermedades. El estudio la matriz extracelular. Curiosamente, los dos grupos tratados con Tr14 revelaron
incluye una base de datos de casi 4 mil millones de lecturas de secuencias que cubren cambios amplios y estadísticamente significativos en tres grupos de ontología génica
224 animales, 4 condiciones y 8 puntos de tiempo. Con respecto a la profundidad de de gran importancia para la cicatrización de heridas: respuesta a heridas, respuesta a
lectura, citocinas y
los puntos de tiempo y las réplicas biológicas, se encuentra entre los más grandescdoentRraNccAiósneqd.e músculos/heridas. Estas señales

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puede indicar efectos sobre los fibroblastos residentes y las células inmunitarias
infiltrantes, que podrían haberse pasado por alto fácilmente en modelos
experimentales más simples. Este resultado concuerda con la evidencia clínica de
que la terapia con Tr14 mejora una variedad de lesiones
musculoesqueléticas, incluido el dolor y la inflamación asociados (Schneider, 2011tr)a.bajo esquemático de la secuenciación de ARN utilizando el
La evidencia de una amplia regulación de genes en estas tres categorías de Gene
Ontology tiene implicaciones interesantes para el modo de acción de Tr14. Los
patrones de cambios de expresión compartidos por los tratamientos con Tr14IO y
Tr14I sugieren dos hipótesis intrigantes sobre la acción de Tr14 en el tejido enfermo.
La regulación constante de muchos
genes relacionados con la diferenciación celular sugiere un efecto sobre el estado
celular en el microambiente de la herida. El efecto neto podría
promover una transición más efectiva a un estado menos diferenciado y más
pluripotente entre las células del microambiente. Al mismo tiempo, los cambios en
la expresión de los genes de "motilidad celular" sugieren que Tr14 facilita la
migración celular y la organización de los tejidos durante el proceso de
cicatrización de heridas.
Un mayor apoyo a la pluripotencialidad podría ser sinérgico con la facilitación de la
movilidad celular para mejorar la regeneración de tejidos en una variedad de
contextos de enfermedades y daños.
Combinados, los presentes estudios demuestran que mientras que Tr14 no tuvo
un efecto observable en la reparación morfológica de la piel del ratón, tuvo un
efecto claro en la expresión génica en la herida. Los ratones, como la mayoría de
los roedores, tienen mecanismos de reparación de heridas muy eficientes y rara vez
muestran los tipos de cicatrices aberrantes que pueden ser comunes en los humanos
(Rittie, 2016). Por lo tanto, se deben interpretar los estudios de curación de heridas
en ratones con precaución con respecto a los posibles efectos beneficiosos en
humanos. Es razonable especular que los cambios en la expresión génica observados
en este modelo de roedor indican que esta terapia multicomponente y multiobjetivo
tiene efectos perceptibles en aspectos clave de la reparación
reguladas al alza se analizaron para determinar el enriquecimiento preferencial de la
re s p u e st a a la he rid a G O . L os dos tipos de tratamiento con Tr14 se muestran en columnas separadas
de heridas, y debe estudiarse más en los trastornos de la piel humana y otras afec c i o n e s in fla m a to r ia s .
ACCESIBILIDAD DE DATOS
Los datos brutos de RPKM, incluido cada animal en cada punto de tiempo en
cada grupo, se envían para acceso público en la carpeta de la Tabla
complementaria 5.
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
Concibió y diseñó los estudios: GS, BS y TM. Realizó los experimentos: JZ, IT,
MT, DJ. Analizó los datos de RNAseq: DS, YV, GS, YV y TM. Escribió el papel:
GS y TM. Comentó y editó el manuscrito: todos los autores.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Los estudios fueron financiados por Biologische Heilmittel Heel GmbH y el Instituto
St. Laurent. Los autores agradecen el excelente apoyo administrativo de Juan Lizarazo
y los útiles consejos sobre el análisis de datos del Dr.
Denis Antonets. El trabajo está dedicado a la vida de GS, quien falleció después de
completar los estudios, pero antes de que el trabajo pudiera ser enviado para su
publicación. Georges fue un genio, un amigo, una inspiración para todos nosotros, y
lo extrañamos mucho.
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MATERIAL SUPLEMENTARIO
El material complementario de este artículo se puede encontrar en línea en: http://journal.frontiersin.org/ article/10.3389/fmolb.
2017.00057/full#supplementarymaterial Figura complementaria 1 | El flujo de
método SeqLL true Single Molecule Sequencing (tSMS). El ARN total de las muestras de piel
conservadas con RNAlater en el sitio de la herida se aisló con Trizol y luego se agotó el ARN
ribosómico (riboARN) antes de la fragmentación para el ARNseq.
Los fragmentos se conectan con poliA para permitir la captura por cadenas de poliT en la placa de
secuenciación. La secuenciación de una sola molécula verdadera se llevó a cabo y produjo alrededor de
42 millones de lecturas totales y 21 millones de lecturas cortas (25 a 65 nt) por
canal, después del filtrado. Las lecturas cortas filtradas se alinean con el genoma del ratón y luego las
lecturas dentro de los exones se cuentan y se suman por transcripción. El recuento de
lecturas sin procesar se ajusta según la longitud de la transcripción y el número total de lecturas alineadas
obtenidas para esa muestra.
Figura complementaria 2 | (A–G) Gráficos de dispersión por etiquetas de transcripciones relacionadas con
heridas en ratones de control no tratados en momentos específicos después de la lesión. Los datos de RNA-
seq, expresados como RPKM, se analizaron para determinar la expresión diferencial entre las 0 h, sin
heridas y puntos de tiempo específicos posteriores. La expresión del gen log2 RPKM para cada transcrito
(círculo rojo o azul) se relaciona entre los
puntos de tiempo de la muestra para crear una expresión diferencial como un cambio de pliegue (eje Y)
frente al nivel absoluto de expresión del transcrito (eje X). Las transcripciones resaltadas
en rojo son las 2000 más expresadas diferencialmente (DE) entre los puntos de tiempo establecidos.
Figura complementaria 3 | Representación gráfica de la intensidad de la categoría Respuesta
a la herida GO en puntos de tiempo específicos de la respuesta de curación de la herida. Detalles del total de
transcritos afectados (aciertos), total de transcritos en la ruta, aciertos esperados por casualidad y valor p,
para la categoría Respuesta a la herida/Curación de heridas GO, en cada momento.
Figura complementaria 4 | El efecto del tratamiento con Tr14 en las transcripciones en la respuesta a la
herida GO. Las transcripciones reguladas al alza se calcularon entre Tr14 frente
a los controles tratados con solución salina en cada uno de los puntos de tiempo especificados como se
describe en Materiales y métodos, excepto que se aplicó un umbral de valor p de 0,01. Las transcripciones
y las transcripciones superpuestas con el valor p exacto de la prueba de Fisher se cuentan en las columnas de la
derecha.
Figura complementaria 5 | El efecto del tratamiento con Tr14 en las transcripciones en la
diferenciación de células epiteliales GO. Los detalles son similares a los de la Figura 4
complementaria , excepto que se analizaron las transcripciones reguladas hacia arriba y hacia abajo
en la diferenciación de células epiteliales GO.
Figura complementaria 6 | El efecto de la abrasión de espesor parcial y el tratamiento con Tr14 en los
niveles de ARNm de IL6, IL8 e IL10. Los niveles de 3 interleucinas bien caracterizadas se muestran a lo
largo del tiempo después de la lesión de la piel del ratón. Las heridas de control tratadas con solución
salina (S) se comparan con las heridas tratadas con Tr14 como
una combinación de inyecciones y tratamiento tópico como se especifica (IO, etiquetado como G aquí).
Cuadro complementario 1 | Diseño general del estudio, que describe los puntos temporales, los
grupos de tratamiento y las muestras individuales secuenciadas en el estudio.
Cuadro complementario 2 | Los 100 principales se expresaron diferencialmente en heridas de control en
comparación con el punto de tiempo de 0 h sin heridas. Los datos de RNAseq se analizaron
para identificar las transcripciones afectadas por heridas abrasivas de la piel del ratón en los puntos de
tiempo especificados. Las transcripciones expresadas diferencialmente se identificaron mediante
comparación estadística utilizando la prueba de Welch (valor P). El cambio de pliegue de la diferencia
entre los niveles de expresión se informa como un valor log2 (Log2Fold). El nivel absoluto de expresión
de cada transcrito de UCSC ID se describe para cada
punto de tiempo en RPKM. Las 100 mejores transcripciones elevadas (0 < 12 h) o disminuidas (0 > 12 h) se
enumeran para cada punto de tiempo probado.
Cuadro complementario 3 | Transcripciones expresadas diferencialmente en heridas tratadas con Tr14
en comparación con el control. Los datos de RNAseq se analizaron para
identificar las transcripciones moduladas por Tr14 durante la reparación de heridas. Las transcripciones con p <
0,0005 y un cambio de pliegue > 1,41 se muestran para cada uno de los puntos de tiempo
de 12 a 192 h. Para cada punto de tiempo, los valores de RPKM se muestran para cada
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muestra y cada ID de UCSC. El cambio de pliegue log2 y el valor P por EdgeR también se muestran para cada
Cuadro complementario 5 | Datos sin procesar para el análisis de secuenciación de ARN de la reparación de
transcripción.
heridas en ratones. Los datos de RPKM sin procesar para la expresión génica para todos los grupos, animales y
Cuadro complementario 4 | Categorías de ontología génica (GO) para genes expresados diferencialmente
puntos de tiempo se informan en las siguientes tablas. (A) Informa el grupo (U) de
afectados por el tratamiento de heridas con Tr14 a lo largo del tiempo. Los datos de RNAseq se analizaron para
animales tratados con placebo, (B) informa el grupo de control inyectado con solución salina (S), (C) informa el (I) grupo de
identificar las transcripciones moduladas por Tr14IO durante la reparación de heridas, como se muestra en la
inyección de Traumeel, y (D) informa el grupo de inyección de Traumeel (IO) más el
Tabla complementaria 3. Luego, las transcripciones se organizaron utilizando DAVID (Huang da et al., 2009) en
grupo de ungüento de Traumeel. (E) Informa un resumen de los datos de secuenciación con respecto al total de
Ontologías de genes que cubrieron esas transcripciones en cada punto de tiempo posterior a la lesión.
lecturas sin procesar, lecturas filtradas, lecturas informativas y el número de transcripciones expresadas para
cada muestra en el estudio, por grupo.

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