PRÁCTICA 1

Introducción al laboratorio. Uso de micropipetas. Curva de titulación de un aminoácido y

manejo del pH-metro.

NORMAS BÁSICAS DE SEGURIDAD.

1. Para la realización de las prácticas es obligatorio el uso de una bata blanca.

2. Además, se suprimirán los adornos superfluos (collares, pulseras etc) que pueden interferir o
entorpecer las manipulaciones requeridas y favorecer arrastres indeseados.

3. Se desaconseja igualmente la utilización de lentillas en las prácticas de laboratorio, siendo más

recomendable la utilización de lentes convencionales.

4. En algunos casos, como durante la utilización de ácidos o el calentamiento de mezclas de reacción, se

hará necesario el uso de gafas protectoras para evitar los efectos de salpicaduras potenciales (que no
deben producirse si se siguen las recomendaciones adecuadamente).

5. Nunca se orientarán las bocas de tubos, matraces, o pipetas directamente a otra persona, pero
especialmente cuando se trabaje con sustancias corrosivas, cáusticas o a elevada temperatura.

6. Las manos se protegerán en todo momento utilizando guantes (de látex o vinilo) que deberían
ajustarse bien a las manos. Además, cuando se manipulen reactivos en caliente las manos deberán
protegerse mediante el uso de guantes o manoplas destinadas para este fin.

7. Cuando se vayan a tirar los guantes se evitará tocar su exterior, que puede estar contaminado por los
reactivos utilizados. Para ello se cogerá el borde superior de uno de los guantes y se volverá hasta que
aparezcan los dedos de esa mano. A continuación, con la mano parcialmente desenguantada se procederá
a retirar completamente el otro guante que será introducido dentro del primero al acabar de desenguantar
la primera mano.

UTILIZACIÓN DE PIPETAS Y MICROPIPETAS.

PIPETAS

Las pipetas se utilizan para dispensar volúmenes conocidos de líquidos. Tienen una marca (aforo) en su parte
superior que determina el volumen de líquido que contiene, que puede oscilar entre 1 y 50 ml, aunque nosotros
no utilizaremos pipetas de volúmenes mayores a 10 ml.

Para utilizar correctamente la pipeta se deben seguir los siguientes pasos:

1. La pipeta debe estar limpia y seca.

2. Con la ayuda de una bomba, o pera, se llena la pipeta hasta más arriba de la línea de aforo y, con la pipeta en
posición vertical, se expulsa lentamente el reactivo hasta alcanzar la línea de aforo (el menisco debe ser
tangente superiormente a la línea de aforo cuando se observa a la altura de los ojos).

5. Se dispensa el volumen de reactivo al recipiente adecuado (vaso de precipitados, erlenmeyer, tubo de ensayo)
con la punta de la pipeta apoyada sobre una de las paredes del recipiente (la pipeta en posición vertical y la
pared del recipiente formando un ángulo aproximado de 45º). En estas condiciones quedará un poco de reactivo
en la punta de la pipeta que no debe tratar de expulsarse (está previsto en el aforo de la pipeta).

6. Después de su utilización las pipetas deben ser lavadas con una disolución conteniendo agua jabonosa y tras
aclararlas varias veces con agua del grifo se aclaran 3 veces con agua destilada. Se dejan a secar invertidas
sobre material absorbente para favorecer la eliminación del agua residual.

MATERIALES

 Pipetas de 2 y 5 ml
 2 vasos de precipitados (uno vacío y otro con agua destilada)
 Instrumentos de succión (pera y bomba de pipetas).

Proceder a utilizar las pipetas tanto con las bombas como con las peras para familiarizarse con el equipo.

MICROPIPETAS.

Las micropipetas sirven para dispensar pequeños volúmenes de muestra (1-1000μl). Estas herramientas
permiten realizar el análisis en muestras poco abundantes y también ahorrar reactivos en los ensayos que
pueden así realizarse en volúmenes menores. Estos instrumentos, como todos en el laboratorio, necesitan de un
estado de limpieza, calibración y mantenimiento adecuado, aspectos que son fundamentales para su correcto
funcionamiento. Durante el desarrollo de esta práctica aprenderemos a manejar y comprobar el estado de
funcionamiento de la micropipeta.

El funcionamiento de las micropipetas se basa en el desplazamiento de un émbolo dentro de un cilindro, cuyo

recorrido se regula mediante un tornillo micrométrico. El desplazamiento del tornillo micrométrico mueve una
graduación de tres dígitos que nos sirve para ajustar el volumen de muestra que deseamos tomar. En las pipetas
Nahita, que vamos a utilizar, todas las pipetas contienen 3 dígitos en la graduación pero dispensan diferentes
volúmenes (H20 hasta 20l, H100 hasta 100l y H1000 hasta 1000l), por tanto el significado de la graduación
es diferente en cada una de estas pipetas. Regulando la graduación de la H20 a 100 estaremos dispensando un
volumen de 10 l y, por tanto, cada división en esta micropipeta equivale a 0,1 l. Análogamente, en la H100
graduada a 100 estaremos tomando 100 l (cada división equivale a 1 l), y en la H1000 graduada a 100
estaremos tomando 1000 l (cada división equivale a 10 l).

Para pipetear correctamente procedemos del siguiente modo:

1. Seleccionamos el volumen que deseamos dispensar mediante la graduación y aplicamos una punta
desechable a la pipeta (azul para la H1000 y amarilla para H20 y H100).
2. Presionamos el émbolo de la pipeta hasta el primer punto de resistencia (R1), con lo que se desplaza un
volumen de aire al exterior equivalente al seleccionado en la graduación (Si presionamos el émbolo más allá de
este punto –hasta el final (R2)- habremos desplazado un volumen de aire mayor que el seleccionado en la
graduación).
3. Introducimos la punta desechable de la micropipeta por debajo del nivel del líquido que queremos
succionar y liberamos suavemente la presión sobre el émbolo. El desplazamiento de recuperación del émbolo
hace que un volumen de muestra equivalente al aire expulsado previamente penetre en la punta desechable.
4. Con la pipeta en posición vertical se dispensa el volumen de muestra en el tubo adecuado. Si está vacío la
muestra se aplica al fondo del tubo y si tiene líquido la muestra se dispensa siempre por debajo de la superficie
del líquido. Para expulsar la muestra se presiona suavemente el émbolo hasta su tope final R2 y, manteniéndolo
presionado, se retira la pipeta.
5. Se desecha la punta de la pipeta mediante el botón de expulsión (en el vaso de precipitados destinado a tal
efecto).

MATERIALES

 Pipetas automáticas
 Puntas desechables
 Tubos
 Balanzas
 Parafilm

Tras familiarizarse con el manejo de las micropipetas disponer una pieza de parafilm (o una naveta) en un
granatario y tararlo. Pipetear sobre la pieza de parafilm 750l de agua con la pipeta apropiada (repetir la
operación 3 veces por persona y anotar los resultados). Si obtenéis resultados no reproducibles (o inadecuados)
ponedlo en conocimiento del profesor, para que determine el origen de los errores potenciales.

Curva de titulación de un aminoácido y manejo del pH-metro.

Según la definición de Bronsted-Lowry, un ácido es una sustancia capaz de ceder un protón al medio y una base
es una sustancia capaz de aceptar un protón del medio. El pH de una disolución acuosa se define como:
pH= -log H+]
La disociación de un ácido débil puede esquematizarse por la siguiente reacción

AH A- + H +
donde AH es el ácido y A- su base conjugada.

La constante de equilibro Ka (también llamada constante de disociación) se define como:

Ka 
H * A 
 

AH 
Cuanto mayor sea Ka, mayor será la tendencia del ácido a disociarse.
Reordenado:

  AH
A  
Ka  H  *

tomando logaritmos en ambos términos tenemos:

 
log K a  log H   log
A 


AH 
y reordenado los términos:

 
 log H    log K a  log
A 

AH 
Esta ecuación nos permite definir otro término importante el pKa.
Por similitud con el pH, el pKa se define como -log Ka (notad que el pKa será menor cuanto más fuerte sea el ácido).
Sustituyendo estos términos en la ecuación tenemos:

pH  pK a  log
A 


AH 
Esta es la ecuación de Henderson-Hasselbalch que nos permite calcular las proporciones relativas de ácido y base
conjugada a un determinado pH conociendo el pKa de esa sustancia. De la fórmula se deduce que el pH = pKa
cuando el log A-/HA = 0 y esto ocurre cuando A-/HA = 1, es decir, cuando el ácido se halla disociado al
50% (50% se hallará como HA y el 50% como A-). Así podemos definir el pKa como el pH al que un grupo
ionizable está disociado al 50%.

Los ácidos y las bases puros contienen un único tipo de grupo ionizable. Sin embargo, algunas moléculas poseen
diferentes grupos ionizables y pueden comportarse como ácidos y como bases. Este tipo de sustancias se llaman
anfóteras o anfolitos.

Los aminoácidos (Aa) constituyen un buen ejemplo de sustancias anfóteras que contienen al menos 2 grupos
ionizables: un grupo alfa-carboxilo (COOH) y un grupo alfa-amino (NH2) en su estructura básica:

+
El pH al que un Aa tiene el mismo número de cargas positivas y negativas se le denomina
H3N H
punto isoeléctrico, pI (la carga neta del Aa a ese pH es cero). El pI de un Aa puede deducirse
COO-
si se conocen los valores de pK de sus grupos ionizables según la fórmula:
R

pKn  pK (n  1)
pI 
2

donde n es igual al número máximo de cargas positivas del aminoácido en su forma totalmente protonada. Los
pK se ordenan numéricamente desde el de menor valor pK1 (más ácido) al de mayor valor pK3 (más básico). Una
observación de interés respecto al pI de los Aa es que cuando un Aa puro se disuelve en agua, el pH de la
disolución resultante es cercano al pI del Aa (nos puede servir para estimar el pI de un determinado Aa).

La carga de los grupos ionizables de los Aa es biológicamente importante puesto que afecta tanto a la estructura
como a la función de las proteínas, por lo que no es sorprendente que el pH del medio afecte a ambas (ej. PH
óptimo de enzimas; alteración de conformación y afinidad por oxígeno de hemoglobina etc). Ahora bien, cuando
los Aa forman parte de las proteínas sólo intervienen en dichos procesos el grupo alfa-amino del primer Aa, el
alfa-carboxilo del último, y los grupos ionizables contribuidos por las cadenas laterales R de los Aa.
Titulación de una solución de glicina 0,1 M.
Materiales:

1.- dos tubos; 1 y 2, conteniendo una disolución de glicina 0,1 M en agua.

2.- disolución de ClH 0.1 M
3.- disolución de NaOH 0,1 M

Procedimiento:
1.- Medir el pH de la disolución de glicina:
Para ello:
a) lavar el electrodo con agua destilada.
b) secar con mucho cuidado el exceso de agua con una toallita de papel.
c) introducir el electrodo en la solución y esperar a que el aparato realice la medida.

2.- Añadir 0,25 ml de NaOH al tubo 1.

Añadir 0,25 ml de ClH al tubo 2.
Mezclar por inversión y, medir el pH y apuntad el resultado.

3.- Añadir 0,5 ml de NaOH al tubo 1.

Añadir 0,5 ml de ClH al tubo 2.
Mezclar por inversión y, medir el pH y apuntad el resultado.

4.- Repetid el paso 3 con cada tubo 3 veces más.

5.- Representar gráficamente pH frente a volumen de NaOH y ClH añadidos.

Preguntas:

1.- Define el pKa de un grupo disociable.

2.- A partir de la gráfica obtenida estima los valores de pK1 y pK2 de la glicina
3.- ¿Cuál es la forma iónica predominante de la glicina a pH 4?
4.- Determina el punto isoeléctrico de la glicina.
5.- ¿En qué rango de pH analizado no tiene poder amortiguador la glicina?

6a. Dibuja la gráfica de la curva de valoración de un aminoácido con tres grupos disociables cuyos valores son
α-COOH pK: 2,3; α-NH3+pK: 9,6; COOH pK: 4,5
6b. ¿Cuál será la forma iónica predominante de dicho aminoácido a pH 3,5?
6c. ¿Cuál será el pI de este aminoácido?