Ramo: Bases de tecnologías diagnosticas

Fecha: 20 de abril de 2017

Metodos de diagnostico
inmunologico (parte 1)
Dr. Ulises Vergara

NOTA: Recuerden Inmunología, el profesor preguntaba cosas de los power, estudien también de
los power.

Cuando un individuo esta enfermo con alguna alteracion de distinta indole

inevitablemente habrá activación del sistema inmune para destruir al agente infeccioso
asi tambien frente a celulas propias (envejecidas, alteradas, celulas tumorales, celulas
dañadas, etc.) pero no habra activacion del sistema inmune con celulas sanas y
normales del individuo.

Efecto primario: El sistema inmune de manera especifica debe destruir aquello que debe
ser eliminado

Efecto secundario: Al haber respuesta contras células especificas no solo se destruye a

la célula que se desea eliminar, sino también a las células normales que rodean el área,
es un efecto indeseado.

Hipersensibilidad: respuesta secundaria inespecífica que acompaña y es inseparable de

la respuesta inmune especifica que es la que destruye, está también destruye, pero de
manera inespecífica.

Si hay un daño en un tejido por ejemplo el que ocasiona un agente infeccioso y el

individuo está enfermo. La pregunta es si la enfermedad producida: se debe al 1)
agente infeccioso o se debe a 2) respuesta inmune que siendo específica del agente
infeccioso por hipersensibilidad destruye. En otras palabras, que un individuo este
enfermo que tenga daño a algún tejido como consecuencia de una infección no
necesariamente significa que la infección es la que produce la enfermedad sino la

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respuesta inmune que en su intento por proteger al individuo del agente infeccioso por
hipersensibilidad destruye órganos y tejidos y produce la enfermedad.

De manera que siempre hay que tener esto en mente “¿es el agente infeccioso el que
produce la enfermedad o la respuesta inmune que acompaña a esa defensa la que
produce la enfermedad? Frente a esta disyuntiva uno puede tratar con antibióticos al
individuo para eliminar el agente infeccioso, pero si el sistema inmune es quien produce
la enfermedad el individuo va a seguir enfermo, porque lo que produce la enfermedad
no es el agente infeccioso que ya fue eliminado, sino que la enfermedad es la
consecuencia de la activación del sistema inmune.

Cada vez que un individuo está enfermo sin importar la causa el sistema inmune está
activado, siempre va a estar activo cuando haya alguna alteración, infección. Y por lo
tanto subyace frente a este antecedente si la enfermedad es producida o no por el
sistema inmune o el sistema inmune se suma al daño producido por un agente infeccioso
o por una transformación secundaria.

Cada vez que un individuo va al médico después de ser examinado el medico pide
exámenes de sangre y lo hace por que el individuo que está enfermo no importa de
que su sistema inmune está activado y si está activado yo debo encontrar células
sanguíneas que forman parte del sistema inmune que están aumentadas o que están
disminuidas o moléculas producidas por el sistema inmune y que permiten sospechar
que a lo mejor esa enfermedad además de la causa original se suma o es consecuencia
de la activación del sistema inmune. Por eso entonces los métodos de diagnóstico
inmunológico que permiten detectar componentes celulares o moleculares son
fundamentales e inevitables en cualquier diagnóstico de laboratorio. Todo diagnostico
debe ser acompañado de solicitud de antecedentes inmunológicos que se estudian en
los fluidos de un individuo principalmente la sangre o en biopsia si es que hay que tomar
una muestra de tejido que hoy en día ya no son necesarios porque hoy día es posible
encontrar restos de agentes infecciosos, restos de células tumorales, de cualquier célula
dañada. Es posible encontrarlo en sangre y por lo tanto examinando la sangre uno
puede encontrar restos de antígenos tumorales, restos de agentes infecciosos, etc. Y a

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este análisis de un fluido particularmente la sangre se utiliza el concepto de

normalmente biopsia liquida. Inevitablemente si un individuo presenta una infección
habrá antígenos infecciosos derivados del agente infeccioso presentes en la sangre.

Si el individuo tiene un tumor o células dañadas esas células tumorales liberan antígenos
y uno puede encontrar antígenos en la sangre de un individuo. No solamente se
detectan distintos tipos de moléculas que en términos generales llamamos antígenos,
sino que también podemos detectar DNA y RNA propio del agente infeccioso o propio
de la célula que está dañada. En otras palabras, yo puedo encontrar DNA de células
tumorales en la sangre, puedo encontrar RNA propio y exclusivo de las células tumorales
en la sangre y por lo tanto hoy día en Chile hay un centro de estudio de medicina de
precisión que detecta moléculas como proteínas o cualquier otra molécula producida
por células tumorales o un agente infeccioso y DNA o RNA proveniente de agentes
infecciosos.

En otras palabras, hoy en día se puede hacer con la nanotecnología diagnostico

exclusivamente a partir de la sangre buscando moléculas propias del agente infeccioso
o de las células alteradas o buscando moléculas del sistema inmune. Toda enfermedad
requiere el uso de métodos que permitan el diagnostico o la detección de
determinadas células o moléculas.

El concepto de una salud es un concepto muy importante ya que nosotros dependemos

de el resto de individuos que están en nuestro sistema como por ejemplo contaminantes
ambientales, no solo importa la salud de un individuo o especie como tal, sino que es la
salud del ecosistema completo porque de ello depende la sobrevida del individuo.
Desde este punto de vista dado este concepto uno tiene que hacer una relación no
solo desde la medicina humana sino también contar con la medicina veterinaria. Se
debe asegurar la inocuidad de los alimentos ya sea de origen animal o vegetal que esté
libre de contaminantes de todo tipo. Y esa responsabilidad de aquello que ocurre en el
ambiente que afecta a nuestros animales y como consecuencia de esta relación
zoonotica entre las distintas especies que pueden afectar al ser humano pone sobre

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nuestros hombros una responsabilidad bastante mayor de lo que imaginábamos hacia

un tiempo atrás.

Las enfermedades que afectan a nuestros animales inevitablemente van a afectar la

salud humana ya sea por la interacción que se produce entre el hombre y los animales.
Todo aquello que afecta al medio ambiente inevitablemente va a afectar la salud de
los humanos. La invasión por parte de la especie humana y por parte de animales de
producción ha causado la movilización de la fauna silvestre, cambio climático,
degradación ambiental y desde luego la globalización va a tener efectos implicando
el desplazamiento de enfermedades que solo existen en los lugares de origen. La
enfermedad de Chagas producida por tripanosoma cruzi propia de nuestro territorio
hoy en día se ha dispersado por todas partes del mundo producto de esta globalización
que permite que los individuos se muevan desde un lugar a otro. Y a eso se suma el
tráfico ilegal de animales exóticos cuyo ingreso al país está prohibido y aun mas su
comercialización. Desde el punto de vista inmunológico uno puede utilizar métodos que
le permiten identificar cualquier molécula como por ejemplo la medición de hormonas
en un individuo. Una hormona que como es una molécula particular uno la puede utilizar
como antígeno para inocularla en un animal de experimentación y ese animal sintetiza
anticuerpos específicos contra la hormona y ese anticuerpo yo lo uso para medir o
detectar los niveles de hormona en un individuo. La inmunología se convierte en una
herramienta biotecnológica para medir o detectar cualquier molécula.

¿Cómo puede detectarse una molécula cualquiera? Simplemente teniendo un

anticuerpo especifico que reconozca esa molécula, si hay miles de millones de
moléculas en un individuo yo cada una de ellas la puedo detectar con un anticuerpo
especifico, cada anticuerpo mide solo esa molécula en particular.

Yo puedo medir contaminantes ambientales que están presentes en los tejidos de los
animales mediante anticuerpos específicos que reconocen esa molécula. De manera
que como herramienta biotecnológica la inmunología va mas allá que la del sistema
inmune propiamente. Desde luego toda herramienta inmunológica implica la
detección de moléculas a través del uso de anticuerpos específicos y por lo tanto

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cuando yo tengo un individuo en el que quiero detectar una molécula en particular ya

sea porque pertenece a un agente infeccioso o porque pertenece a ciertos tipos de
células tumorales y si yo encuentro la molécula que pertenece al anticuerpo numero 1
quiere decir que el individuo está desarrollando ese tipo de tumor y así sucesivamente.

Pero eso que puedo hacer detección de moléculas que le damos el nombre genérico
de antígeno a través de anticuerpos, no olviden que lo mismo se puede hacer a través
de la biología molecular detectando ácidos nucleicos propios del agente infeccioso o
propio de las células transformadas, envejecidas o alteradas.

Para detectar cualquier molécula que no sea RNA ni DNA estos también se pueden
detectar con anticuerpos específicos anti-DNA, anti-RNA para detectar ácidos
nucleicos yo utilizo la biología molecular, en resumen, la técnica de PCR eso me permite
medir y detectar ácidos nucleicos propios de, pero los anticuerpos pueden ir más lejos
porque pueden detectar cualquier molécula incluido DNA y RNA y para detectar una
molécula especifica (proteína, hidrato de carbono, RNA, etc.) necesito un anticuerpo
especifico. La detección de moléculas pasa en primer lugar de los anticuerpos
específicos que este pueda reconocer, de esa manera el anticuerpo se convierte en
una herramienta de diagnóstico o de detección (si está o no está presente la molécula)
y puede cuantificarlas y la cuantificación de una molécula nos permite establecer la
evolución de la afección. Al haber más antígeno presente en un agente infeccioso
quiere decir que hay más agente infeccioso en el individuo; si hay más antígeno de
origen tumoral en el individuo quiere decir que el tumor está más desarrollado y se
puede determinar en qué etapa está asociado al diagnóstico de moléculas.
Obviamente que si ese tumor se convierte en una masa que es detectable a través de
imágenes, pero la idea del diagnóstico es que uno quiere detectar lo más
tempranamente posible la célula tumoral ojala la primera, la única pero que todavía no
se multiplique ese es el mejor tratamiento adecuado. Y ese diagnóstico tan inicial y tan
temprano solo se puede hacer con anticuerpos específicos o la detección de DNA o
RNA de origen tumoral. Las imágenes sirven cuando el daño ya es mayor y es una masa
donde hay muchas células que puede ser abordado de forma quirúrgica, se puede

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tratar con radioterapia o con quimioterapia, pero siempre existe la duda si ya hay
metástasis en algún otro lugar.

La detección de moléculas no importa cual esta sea permite hacer un diagnóstico

temprano.

Uno puede hacer la detección en un individuo desde el lado opuesto porque si tengo
una molécula propia de un agente tumoral o un agente infeccioso yo la puedo
detectar utilizando un anticuerpo, con el anticuerpo yo detecto la presencia de esa
molécula particular que yo asocio a la existencia de una enfermedad particular, pero
también lo puedo hacer a la inversa yo puedo tener antígenos de origen molecular y lo
que quiero es detectar en el paciente son anticuerpos contra ese tumor. Se supone que
un individuo que desarrolla un tumor no solamente va a tener antígenos tumorales, sino
que además su sistema inmune se va a activar y entre otras cosas va a sintetizar
anticuerpos específicos contra los antígenos tumorales. Yo en un individuo puedo hacer
un diagnóstico tumoral a partir de:

A) la detección de antígenos para los cuales necesito un anticuerpo

B) buscando el anticuerpo para el cual necesito el antígeno.

El diagnostico lo puedo hacer en paralelo y puedo buscar tanto antígenos específicos

como anticuerpos específicos. Si un individuo sintetiza anticuerpos contra una molécula
si y solo si esas moléculas están presentes en su organismo, si es una molécula de un
agente infeccioso el individuo tendrá antígenos de ese agente infeccioso, pero además
tendrá anticuerpos contra la molécula de ese agente infeccioso. Puede ocurrir que los
niveles de antígeno sean indetectables, pero bastan unos pocos antígenos para tener
la producción de una gran cantidad de anticuerpos. De manera que las dos técnicas
se complementan y a eso además le podemos sumar la biología molecular y además
por si acaso imágenes.

Si se quiere evaluar la respuesta inmune se deben buscar elementos propios del sistema
inmune por ejemplo la cuantificación de linfocitos b, t y todas las células propias del
sistema inmune o también medir moléculas sintetizadas por el sistema inmune, lo cual

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nos puede indicar que el sistema inmune está activado y cada vez que está activado
inevitablemente se va a sumar al daño producido en ese órgano o tejido producido por
la infección, alteración celular el sist. Inmune se suma al daño por hipersensibilidad.

Los métodos inmunológicos se van a basar en la detección de moléculas. Hay dos tipos
distintos de moléculas que podemos detectar que están interrelacionadas A) Moléculas
propias de un agente infeccioso o una célula tumoral (antígenos) o B) detección de
anticuerpos específicos en contra de esos antígenos.

En el método inmunológico uno tiene un reactivo que nos permite detectar una
molécula o su opuesto o complementario específico con la muestra del paciente.
Entonces tengo un reactivo que uso para detectar una molécula en particular, si ese
reactivo es un antígeno lo que yo estoy buscando en el paciente es un anticuerpo y
viceversa. De manera que los métodos se pueden separar en los que detectan
antígenos o que detectan anticuerpos (con su reactivo específico). En cualquier caso,
en el método diagnóstico estaré midiendo la formación del complejo antígeno-
anticuerpo o Complejo Inmune. Entonces si el reactivo lo tengo en un tubo (fase soluble
o medio líquido) y lo pongo en contacto con lo que quiero detectar (con su
correspondiente mezcla de la solución), una molécula de anticuerpo (forma de “Y”) se
unirá a 2 moléculas de antígenos en cada brazo y un segundo anticuerpo se unirá a uno
de esos antígenos y su brazo restante estará unido a una tercera molécula de antígeno
y así sucesivamente, lo importante es que esto irá aumentando de tamaño hasta que
se formará un complejo macromolecular que hará que el tubo traslúcido comience a
verse opaco e incluso podremos llegar a evidenciar un precipitado. Este fenómeno lo
denominamos Precipitación en fase líquida o fluida, pongo en contacto la muestra del
paciente (fase fluida) con mi reactivo (también en fase fluida), los mezclo e incubo y
detecto la formación del complejo macromolecular y lo puedo visualizar y si no, lo
detectamos con un aparato. Si tengo a un lado un tubo y al lado izquierdo una fuente
luminosa y al lado derecho del tubo un detector de la luz. Si en el tubo no hay nada no
se interrumpirá el paso de la luz, por lo tanto, toda la luz llega al detector de luz, aquí
evidenciamos 100% de Transmitancia. En el caso de que hubiese algo en el tubo, en

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este caso, un complejo molecular, el rayo de luz choca y se refracta y por lo tanto no es
transmitida hasta el detector, y por ende la Transmitancia disminuirá. En este fenómeno,
en el que el complejo macromolecular desvía la luz y se comporta como si se estuviese
absorbiendo, lo llamaremos Absorbancia. Si hay 100% Transmitancia, la Absorbancia es
0%. Si hay 80% Transmitancia, habrá al mismo tiempo 20% de Absorbancia de modo que
ambos términos describen el mismo fenómeno pero en sentido contrario. Para que yo
pueda visualizar el precipitado en un tubo el complejo debe ser enorme, pero cuando
los complejos inmunes son pequeños no veré precipitado. Esto lo solucionamos con el
método de la Espectrofotometría (lo descrito anteriormente
Transmitancia/Abosrbancia) con el Espectrofotómetro.

Por otro lado, yo puedo tener las moléculas ya unidas que forman parte de una célula
o puedo unir las moléculas a una célula o una partícula. En otras palabras, yo tengo un
antígeno y lo hago reaccionar con una partícula de modo que el antígeno se pegue a
la partícula y lo que yo voy a tener son partículas pequeñitas (células, bacterias, células
de un polímero) y eso me permite detectar la presencia de anticuerpos en la muestra
del paciente. Entonces la pegunta es ¿hay anticuerpos en la muestra del paciente?
Para saberlo primero tomamos un portaobjeto y en él ponemos la partícula que tiene el
antígeno y le agregamos la muestra del paciente (donde teóricamente deberían estar
los anticuerpos) ¿Qué va a ocurrir? Yo puedo poner una gota de sangre en un
portaobjeto y luego agregar anticuerpos que reconozcan antígenos que están en las
células sanguíneas y lo que yo voy a observar en el portaobjeto es que las células se van
a agregar formando enormes complejos celulares que llamaremos Aglutinado,
entonces el método es uno de Aglutinación, la partícula en la cual está presente el
antígeno o yo he unido el antígeno me permiten detectar anticuerpos en la muestra del
paciente y cuando se forma complejo las partículas se empiezan a aglomerar, si antes
era molécula ahora son partículas y eso yo lo puedo ver a ojos desnudos. Entonces, en
el método de Aglutinación yo a mi partícula le añado mi antígeno o anticuerpo
conocido y después la muestra y en cualquiera de los casos se evidenciará aglutinación
(siempre y cuando haya formación del complejo inmune). La aglutinación es un método

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que se realiza en fase sólida porque la partícula en la que yo añado mi reactivo (Ag o
Ac) conocido está en fase sólida.

Entonces los métodos inmunológicos lo que hacen es poner en evidencia la formación

de un complejo entre Ag y Ac y el tamaño de ese complejo debe ser adecuado de
manera tal que yo lo pueda detectar a ojos desnudos o si el tamaño de estos es
complejo debo tener una herramienta tecnología para poder detectarlos.

Los distintos métodos tecnológicos se pueden clasificar en distintas categorías según lo

que los caracteriza:

1) Técnica de Aglutinación: Una molécula está unida a una partícula sola en fase
sólida (célula, bacteria o esfera de un polímero plástico o látex que es la
denominación genérica de esos polímeros sintéticos) y detecto formación
complejo inmune mediante la aglutinación de las partículas.
2) Técnica de Precipitación en un medio líquido: Los 2 elementos los tenemos en
fase líquida o fluida, mi reactivo conocido y la muestra donde buscaré presencia
de Ac o Ag, y detecto la presencia del complejo inmune mediante el precipitado
en el tubo.
3) Técnica de Precipitación en fase sólida: Lo que ocurre es que una molécula que es
un polímero que viene en forma de un polvillo desecado que uno disuelve en una
fase líquida, un buffer, y eso lo calienta para que este polímero se disuelva (se
ejemplifica con la gelatina) y a medida que se enfría se solidifica o gelifica y esta
gelatina la puedo poner un portaobjeto y cuando se enfríe voy a tener sobre el
portaobjeto la gelatina y lo que deposite encima en fase líquida se solidificará y una
vez que pasa esto yo puedo hacer dos perforaciones en el gel, una para poner mi
reactivo conocido y en el otro la muestra del paciente (Explica que cuando la
gelatina disuelta es poco concentrada, al 2% por ejemplo, las moléculas de este
polímero o gel al solidificarse se van uniendo y dejando poros o espacios entre ellos
pero son grandes y si aumento la concentración del polímero, al 50% por ejemplo,
los poros que van dejando son más pequeños y por lo tanto habrá menos espacio
para que moléculas se desplacen porque las moléculas que se podrán desplazar por

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los espacios son solamente las que sean de menor tamaño que los poros que dejaron
las moléculas del gel). Entonces tenemos estos 2 poros en el gel, en uno depositamos
el reactivo conocido (Ag o Ac) y en el otro la muestra del paciente y esperamos que
difundan (movimiento de moléculas de un lugar de mayor concentración a otro de
menor concentración) a través del gel. Esta difusión es radial por parte de ambos
elementos en los poros hasta que lo que está en ambos poros se encuentran y se
forma el complejo inmune, si este es pequeñito sigue moviéndose a través del gel
pero cuando crece el complejo será mayor que los poros que tiene el gel y por lo
tanto se detendrá el movimiento y lo que veremos en la placa será una banda de
precipitación. Tendremos más bandas si tenemos más de 1 antígeno o más de 1
anticuerpo (Recuerden la inmunodifusión radial en placa de agar) y bandas más
anchas o delgadas dependiendo de la concentración de los Ag y Ac. El polímero
que generalmente se usa es el de agar o agarosa que es de glucosa. La difusión es
un fenómeno espontáneo pero es un proceso lento y lo puedo acelerar con
temperatura, pero no más allá de 60°C, aun así sigue siendo lento. Pero también
puedo acelerar el proceso colocando el gel en un campo reactivo en donde
tendremos un polo negativo y otro positivo y haremos que pase una corriente
eléctrica (flujo de electrones) del polo negativo al polo positivo. Entonces uno mi gel
al polo negativo y la corriente eléctrica pasará por este gel empujando todo lo que
se encuentre a su camino (los reactivos en este caso) y pasamos de un método de
inmunodifusión simple a uno en que aplicamos corriente llamado Electroforesis.
4) Técnica de electroforesis (Inmunoelectroforesis): Ponemos nuestra fase líquida o
sólida a un campo eléctrico.

Yo puedo acelerar este proceso aún más agregando un buffer que hace que las
moléculas adquieran carga negativa. Aquí viene un punto importante a señalar que es
el punto isoeléctrico ¿Qué es el punto isoeléctrico? Una molécula cualquiera yo la
puedo poner en un medio líquido y preparar una gradiente de pH desde el 0,1 hasta el
14, entones tengo una seria de tubos y en cada uno de ellos tengo un buffer, pero en el
tubo 1 tengo un pH 0,1, en el tubo dos un pH 0,2 y así hasta el pH 14. Luego tomo mi
molécula (de la que quiero conocer el punto isoeléctrico), la pongo en cada uno de

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esos tubos y se produce que en algunos de los tubos va a haber un precipitado. El tubo
en el cual precipita es porque en ese pH tiene su punto isoeléctrico (el punto isoeléctrico
se expresa como pH) ¿Por qué precipita? Porque en ese tubo con un determinado pH
el número de cargas negativas es igual al número de cargas positivas. (Carga neta 0)
¿Por qué esto es importante? Cuando esa molécula está en un buffer con un pH mayor
al de su PI, la molécula tiene carga negativa; pero si pongo la molécula en un pH menor
a su PI esta tendrá carga positiva (O sea, depende el buffer y el pH cuál será su carga).

Si tiene carga negativa en un campo eléctrico se mueve hacia el polo positivo, y si tiene
carga positiva se mueve hacia el polo negativo.

Si quiero hacer imnunolectroforesis, quiero que la molécula sea arrastrada por el flujo de
electrones y que se movilice hacia el polo positivo, pero para hacer esto aún más rápido
quiero que la molécula en si tenga carga negativo y para ello tengo que disolverla en
un buffer superior al de su punto isoeléctrico. Entonces la molécula se mueve por sí
misma y además la van a empujar los electrones, por lo tanto se mueve más rápido. En
un campo isoeléctrico la molécula se mueve, en función de su tamaño pero si es
empujada por los electrones esto se facilita.

Los métodos que hemos visto hasta ahora, tanto el reactivo como el reaccionante son
moléculas que no tienen modificación, a lo más su carga neta dependiendo del pH,
pero hay métodos en los que a mi reactivo les puedo agregar una segunda molécula.

En los siguientes métodos una molécula está unida a una segunda molécula, que yo le
doy un nombre genérico: Sonda  una segunda molécula unida al reactivo (así se
define) entonces yo mido complejos antígenos anticuerpos

Sii está en fase fluida puedo centrifugar, tendré los complejos en el fondo y en el
sobrenadante voy a tener la moléculas que están disueltas como estaban originalmente,
saco el sobrenadante y me quedo con el precipitado, yo quiero medir la molécula en
cuestión, pero en este caso no mido el antígeno o el anticuerpo, yo mido la segunda
molécula (sonda) a la cual yo he unido el anticuerpo o el antígeno. Por ejemplo, esta
segunda molécula es una átomo radiactivo; tengo la partícula disuelta unida a un

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átomo radiactivo y el complementario también, yo centrifugo y saco el sobrenadante

(saco lo que no forma complejo) y en el complejo mido la radiación, porque si hay más
radiación hay más de esta molécula. A mayor cantidad d la sonda quiere decir que hay
más concentración de lo que busco.

Esa molécula que yo utilizo como sonda y que uno a mi reactivo puede ser distinta a un
átomo radiactivo, puede ser una enzima.

Entonces lo que tengo en fase fluida es la partícula con la enzima y la que estoy
buscando en el paciente. Se forma el complejo y mido en el precipitado. ¿Cómo se que
esta la enzima? La enzima se detecta agregándole el sustrato  Tengo la enzima unida
al reactivo, le agrego un reaccionante y un sustrato, como la enzima es específica al
sustrato lo va a degradar y yo mido la degradación del sustrato, a mayor degradación
más enzima, si hay más enzima hay más reactivo y si hay más reactivo hay más
reaccionante.

La relación es uno es a uno, por cada molécula de enzima se degrada una molécula
de sustrato. A mayor degradación del sustrato hay mayor cantidad de lo que estoy
buscando en la muestra del paciente, este método que usa una enzima se denomina
método de Elisa (es el típico método Elisa pero el profe lo explicó un poco complejo)

El líquido va cambiando de color, si debe dar amarillo y da amarillo intenso es porque

hay mucha concentración de lo que busco; si sale pálido es porque hay poco. Si busco
antígenos lo que debo marcar con la enzima son anticuerpos y si busco anticuerpos
debiese marcar los antígenos con la enzima.

5) Método de fluorescencia y citometría de flujo: A la molécula de mi reactivo, yo

le uno una molécula que es un fluorocromo (covalentemente unidos) este
fluorocromo si yo lo ilumino se excita (el electrón adquiere mayor energía y se va
a una órbita más lejana del núcleo, pero como esto es inestable el electrón
vuelve a un nivel más cercano al núcleo y libera energía, cada vez que esto pasa
la energía se libera como calor o como luz) ¿Qué longitud de onda tiene en
comparación a la luz original? A mayor longitud de onda menor energía y

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viceversa, si excito con una determinada longitud de onda este fluorocromo se

excita y luego vuelve al estado basal, el electrón excitado, se emite luz y esta
siempre será de menor longitud de onda que la luz inicial.

El profe habla de un experimento casero: hacer macerado de espinacas, a ese

macerado le ponen alcohol o acetona y filtrarlo, en un tubo tendrían un líquido
verde  clorofila, este mismo tubito lo iluminamos y se ve rojo ¿Por qué? Porque en
la clorofila los electrones se excitan y vuelven a su estado basal pero la energía es
de mayor longitud de onda y menor energía que la luz inicial. El verde es de menor
longitud de onda que el rojo, por ello mayor energía. Se basa en el uso de
fluorocromo que emite fluorescencia que emite longitud de onda mayor que la luz
incidente se llama fluorescencia. Se pueden usar diferente fluoroforos.

En el complejo tengo mi molécula unida a un fluorocromo, lo ilumino con una

determinada longitud de onda, entonces emite fluorescencia. Así se detecta lo que
buscamos en función de la fluorescencia.

Se puede hacer en fase líquida o sólida. Si es líquida, reactivo y reaccionante deben ser
líquidos y se forma un precipitado y ese es el que puedo detectar mediante la turbidez,
a mayor turbidez, mayor concentración de lo que busco y se llama turbidometría. O lo
que se mide es la absorbancia o transmitancia de luz que hago incidir, floculación o
nefelometría.

La reacción de aglutinación utiliza una partícula a la cual está unido mi reactivo de

detección, y cuando lo pongo en presencia de la muestra del paciente o donde quiero
demostrar que esta lo que busco, se produce agregación o aglutinación que se detecta
a ojo desnudo.

Sin embargo todos estos métodos se basan en la formación de complejo Ag-Ac que es
una reacción química y como toda reacción química depende de ciertas variables:

 Concentración de electrolitos en el buffer: Donde están disueltos el reactivo y el

reaccionante (pH)

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 Temperatura: Puedo acelerar la reacción si aumento la temperatura hasta cierto

nivel.
 Concentraciones relativa de antígeno y anticuerpo: Si hay más anticuerpo que
antígeno, ocurre que solo se forma un complejo tan pequeñito que sale negativo
o no se ve nada; lo mismo si hay exceso de antígeno, a cada anticuerpo se unen
dos antígenos y es pequeño y tampoco se ve, por lo que tengo en ambos casos
fasos negativos, por excesos de antígenos o anticuerpos. Por ende las
concentraciones equivalentes de reactivo y de aquello que busco es muy
importante para que se produzca el complejo macro que es el que yo puedo
detectar.

El tema es que no me sé la concentración que tiene la muestra del paciente: Si supongo

que en la muestra del paciente hay mucho de aquello que quiero detectar puedo diluir
esta muestra en diferentes tubitos, entonces empiezo la reacción en estos tubitos, hasta
que en uno se forme el complejo

Pero si esto es lo contrario y la muestra del paciente tiene baja concentración de lo que
busco, diluyo el reactivo hasta que forma el complejo; o puedo concentrar la muestra
del paciente, se le hace liofilización, le saco agua a la muestra. Se evapora el líquido y
se concentran las moléculas.

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