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PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA
DE CAMARONES PENAEIDOS
PROGRAMA CYTED
ÁREA DE AGROALIMENTACIÓN
RED II-D: Red Vannamei
Editores:
Vielka Morales Q.
Jorge Cuéllar-Anjel
Autores:
María José Almanza Abud
Margherita Anna Barracco
Jorge Cuéllar-Anjel
Donald V. Lightner
Emiko Shinozaki Mendes
Alitiene Moura Lemos Pereira
María Soledad Morales Covarrubias
Carlos Pantoja
Luciane María Perazzolo
Rafael Diego Rosa
Agnés Saborio Coze
Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Derechos reservados:
© 2008 Vielka Morales Q. y Jorge Cuéllar-Anjel
(507) 6671-8936
(507) 6616-0756
email: vielkamorales2003@yahoo.com
email: jocuan@gmail.com
Panamá
Diseño e impresión:
New Concept Publications, Inc.
(507) 226-7694
Panamá
Daniel Ho - Fotografías de portada, contraportada, páginas 1, 55, 117, 135, 159, 169, 225, 243 y 254
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AGRADECIMIENTOS
De igual manera por la revisión y aportes de la Dra. Patricia Del Portillo (Métodos
Moleculares), Dra. Margherita Barracco (Parámetros Inmunológicos), Dr. Carlos Pantoja
y Kenneth W. Hasson (Parásitos en Camarones), Ing. Roberto Chamorro y Dra. María del
Pilar Moyano (Métodos de Diagnósticos) y Oscar Olivares (glosario y correcciones de
texto).
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
IN MEMORIAM
El Grupo Técnico Asesor (GTA) de la Red Vannamei del CYTED y los autores de esta
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, deseamos dedicarla
a nuestro amigo, hermano y compañero, ELPIDIO. El fue uno de nuestros pilares en el
GTA de la Red Vannamei, con aportes de grandes ideas y colaboración desinteresada para
el buen manejo y beneficio de la actividad camaronera no sólo en Brasil, su país natal,
sino también en el resto de los países iberoamericanos que conforman esta importante
familia CYTED.
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PRÓLOGO
GUILLERMO A. SALAZAR N.
Ministro de Desarrollo Agropecuario
Panamá, 2008
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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INTRODUCCIÓN
VIELKA MORALES Q.
Coordinadora Red Vannamei
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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ÍNDICE DE CONTENIDO
Prólogo v
Introducción vii
Reseñas de los editores y autores xi
Capítulo 1 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de 1
Cultivo (Jorge Cuéllar-Anjel)
1.1 Anamnesis 2
1.2 Examen clínico 2
1.3 Microscopía Directa 5
1.4 Montajes en Fresco (María Soledad Morales-Covarrubias) 8
1.5 Bacteriología 18
1.6 Histología 22
1.7 Pruebas con anticuerpos 29
1.8 Métodos moleculares 31
1.9 Parámetros inmunológicos 39
1.10 Microscopía electrónica de transmisión 45
1.11 Bioensayos 47
1.12 Referencias bibliográficas 52
Capítulo 2 Enfermedades Virales (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) 55
2.1 Principales enfermedades y métodos de diagnóstico 58
2.2 Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoiética infecciosa (Infectious 62
hypodermic and hematopietic necrosis virus, IHHNV)
2.3 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus, 70
WSSV)
2.4 Virus del Síndrome de Taura (Taura syndrome virus, TSV) 79
2.5 Virus del síndrome de la cabeza amarilla (Yellow head syndrome virus, 87
YHV)
2.6 Virus de la mionecrosis infecciosa (Infectious myonecrosis virus, IMNV) 92
2.7 Mionecrosis infecciosa viral (IMNV) y sus implicaciones en los 96
cultivos de camarones brasileños (Alitiene Moura Lemos Pereira,
Emiko Shinozaki Mendes, Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira)
2.8 Penaeus vannamei nodavirus (PvNV) 104
2.9 Referencias bibliográficas 106
Capítulo 3 Enfermedades Bacterianas (María Soledad Morales-Covarrubias) 117
3.1 Vibriosis sistémica 120
3.2 Erosión bacteriana del caparazón 122
3.3 Síndrome de Zoea II 124
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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RESEÑAS DE LOS EDITORES
VIELKA MORALES Q.
Coordinadora Red Vannamei-CYTED
vielkamorales2003@yahoo.com
Licenciada en Biología. Experiencia de 14 años en el tema de larvicultura, maduración,
zooplancton y fitoplancton en laboratorio de camarones. Responsable del diseño y construcción
de la Estación de Maricultura del Pacífico, Puerto Vacamonte en Panamá. Desde 1996 coordinadora
técnica de la Organización del Sector Pesquero y Acuícola de Centroamérica. Consultora
para FAO y PRADEPESCA-UE. Cuenta con 19 publicaciones (11 en temas de camarones). Ha
participado en otras redes del CYTED relacionada a camarones y moluscos.
JORGE CUÉLLAR-ANJEL
Director del Departamento de Patología e Investigación
Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO)
Aguadulce, Coclé, República de Panamá
jocuan@usa.net
Médico Veterinario, Máster en Microbiología. Experiencia de 18 años en las áreas de cultivo
de camarón marino Litopenaeus vannamei; diseño y montaje de laboratorios de patología de
camarones (microbiología, histopatología y biología molecular); docencia universitaria en
pregrados y postgrados así como investigación aplicada en Producción, Patología, Inmunología
y Nutrición de camarones penaeidos; manejo sanitario de cultivos de camarón (larvicultura,
engorde y maduración) mediante clínica y pruebas de campo y de laboratorio (montajes en fresco,
microbiología, histopatología y biología molecular); conferencista en Congresos Internacionales;
miembro del Grupo Ad hoc de la OIE en crustáceos para las Américas. Ha tenido desempeño
laboral en Ecuador, Colombia y Panamá.
JORGE CUÉLLAR-ANJEL
Director del Departamento de Patología e Investigación
Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO)
Aguadulce, Coclé, República de Panamá
jocuan@usa.net
La reseña de este autor ha sido citada previamente en “Reseña de los Editores”
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
CARLOS PANTOJA
Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología
Universidad de Arizona
Tucson, Estados Unidos
cpantoja@u.arizona.edu
Ingeniero Bioquímico en Explotación de Recursos Acuáticos (Tec de Monterrey, Campus
Guaymas, México). Maestría en Acuacultura (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México).
Doctorado en Patobiología (The University of Arizona). Actualmente es profesor investigador
asociado en el laboratorio de patología acuícola de la Universidad de Arizona. Principales
áreas de trabajo son patología morfológica, caracterización de nuevas enfermedades y agentes
infecciosos de camarones peneidos, desarrollo de métodos de detección de agentes infecciosos y
diagnóstico de enfermedades. Provee servicios de consultoría a la industria camaronícola en el
área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través
de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.
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DONALD V. LIGHTNER
Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología
Universidad de Arizona
Tucson, Estados Unidos
dvl@u.arizona.edu
PhD en Patología y Biología Pesquera, Maestría en Biología Pesquera y su Licenciatura en
Biología Pesquera. Su experiencia está dirigida a la patología y enfermedades de los cultivos
de crustáceos y peces, enfermedades de invertebrados, marinos y de agua dulce, enfermedades
infecciosas, virología, histología, microscopio electrónico, desarrollo de métodos de diagnósticos,
nutrición de animales acuáticos y toxicología acuática. Provee servicios de consultoría a la industria
camaronicola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de
enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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Capítulo 1
Jorge Cuéllar-Anjel
Director del Departamento de Patología e Investigación
Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO)
Coclé, Panamá
Introducción
Con base en las principales técnicas utilizadas en la actualidad para determinar
enfermedades en camarones, la siguiente lista presenta los pasos básicos y métodos
que sirven como herramienta para realizar diagnósticos y detectar agentes etiológicos
en estos crustáceos de gran importancia comercial en la economía mundial. Aunque
algunos de estos procedimientos pueden ser realizados por los mismos productores en
los laboratorios de maduración y/o larvicultura o en las fincas camaroneras, la mayoría
deben ser hechos por profesionales en sanidad acuícola o por Médicos Veterinarios
especialistas. Se debe recordar siempre que el diagnóstico no consiste en una prueba de
laboratorio como tal, sino en la interpretación que hace el especialista con base en sus
conocimientos y en la información recopilada de las pruebas de campo y de laboratorio.
Las citas bibliográficas utilizadas para la preparación de una parte de este Capítulo, no
serán mencionadas a lo largo del texto para facilitar la lectura de los diferentes temas. A
cambio, serán incluidas al final del Capítulo en las “Referencias bibliográficas”.
- PCR, RT-PCR y PCR en tiempo real para pruebas directas con muestras de tejido
fresco o con ADN o ARN extraído
• Parámetros inmunológicos (hemogramas y medición de perfiles inmunes)
• Microscopía electrónica de barrido o de transmisión
• Bioensayos con portadores sospechosos o subclínicos, utilizando hospederos
altamente susceptibles (estadios del animal o especies) como indicadores de la
presencia del patógeno
1.1 Anamnesis
En la medida de lo posible, el técnico en sanidad responsable de realizar el
diagnóstico de una enfermedad en una población de camarones, debe incluir una visita
a la instalación afectada (maduración, larvicultura o finca de engorde).
Durante esta visita, el técnico debe recopilar la información histórica previa a
la aparición del brote de la enfermedad. Esto puede incluir cambios en parámetros
ambientales o fisicoquímicos, tránsito inusual de personas o equipos por las
instalaciones, presencia de animales foráneos al sistema como perros, aves, roedores o
vacas, alteraciones en el régimen y tipo/calidad del alimento suministrado, cambios en
los procedimientos o tipos de fertilizantes, uso de productos químicos o biológicos en
el cultivo afectado, existencia de brotes similares con anterioridad en dicha empresa o
en otras conocidas y, toda aquella información pasada o presente relacionada directa o
indirectamente con la población en cuestión.
Debe llevarse un registro de esta información obtenida en la empresa, para estudios
de correlación con los hallazgos obtenidos en el examen clínico y en las pruebas de
laboratorio complementarias que se harán luego de la visita de campo.
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Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo
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MÉTODO DE MICROSCOPÍA
(Montajes en fresco)
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Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo
MÉTODOS DE MICROSCOPÍA
(Montajes en fresco)
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Introducción
El diagnóstico implica un entendimiento de la causa y, si es posible, un
conocimiento de los factores contribuyentes significativos que influyan en la aparición
de la enfermedad.
Con el diagnóstico aumenta la probabilidad de un control efectivo cuando se
determina la causa exacta y se relaciona con sus factores contribuyentes efectivos. Sin
embargo, debemos aceptar que el conocimiento de la salud y la enfermedad varía en
diferentes animales acuáticos, incluidos los camarones y que en las granjas camaroneras
y laboratorios aparecen nuevas enfermedades. Por tanto, en una situación particular, la
precisión esperada y la calidad de un diagnóstico pueden ser directamente afectadas por
el conocimiento disponible respecto a enfermedades de camarones, por el entrenamiento
y experiencia de la persona encargada de realizar el diagnóstico, así como por las
prácticas de manejo en los sistemas de cultivo.
Uno de los objetivos principales en el diagnóstico de una enfermedad de un animal
en producción, es la determinación de la causa (etiología). La identificación de los agentes
etiológicos de la enfermedad se realiza (o debería realizarse) mediante la aplicación de
métodos científicos de investigación. La observación de muestras de órganos y tejidos
de camarones (para buscar bacterias, hongos, protozoarios, metazoarios e inclusiones
de rickettsias y virus) a través de microscopía de luz e histopatología (respuesta del
hospedero-patología), son métodos comúnmente empleados para establecer los agentes
etiológicos, los cuales conllevan a determinar la causa de enfermedades en camarones.
Los agentes patógenos se encuentran en el ambiente en forma natural y el medio
acuático no es la excepción. Muchos de ellos son oportunistas; es decir que mientras
los camarones se encuentren sanos y las condiciones de los parámetros de cultivo no
se alteren, los patógenos no atacan. Este es un dato muy importante, pues el hecho de
tener patógenos presentes en una granja o laboratorio no significa precisamente que los
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Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo
Análisis en fresco
El análisis en fresco, es la técnica que se utiliza para monitorear el estado de salud de
los organismos y realizar diagnósticos presuntivos en laboratorio y campo. Consiste en la
disección del camarón en todos sus estadios, para observar las alteraciones y patógenos
que presenten sus órganos y tejidos. La capacitación para este tipo de análisis consta de
un corto entrenamiento básico que profesionales (biólogos, ingenieros en acuicultura,
médicos veterinarios etc.) pueden recibir en una granja o laboratorio.
Para realizar el diagnóstico del estado de salud de una población se requiere de la
selección y toma adecuada de la muestra, la cual es elegida de acuerdo al estado de salud
de los organismos o a la sospecha de alguna enfermedad. La intensidad del muestreo
(número de muestreos en el tiempo hasta la cosecha) dependerá de la necesidad de la
información, de la historia de la granja, del origen de los organismos y de la densidad de
organismos sembrados en el cultivo. Por lo tanto para una buena selección se tiene que
tomar en cuenta lo siguiente:
Muestreo aleatorio. Cuando solamente se quiere determinar el estado de salud o para
buscar la prevalencia de patógenos, se toman los organismos y estanques al azar, lo cual
debe realizarse de cuatro áreas diferentes del estanque (Figura 1.11).
El tamaño mínimo de muestra o submuestra debe garantizar un 95% de confianza
que de existir una infección, ésta se incluirá en la muestra y para la prevalencia su
muestreo dependerá de la prevalencia estimada del patógeno y del nivel de confianza
elegido (Tabla 1). Los camarones seleccionados se depositan en contenedores con
aireación, procurando crearles el menor estrés posible y se trasladan de inmediato al
laboratorio para su posterior análisis.
Muestreo no aleatorio. Muestra que contiene solamente organismos enfermos. Este tipo de
muestreo se realiza cuando se tiene la sospecha de la presencia en el estanque, de alguna
enfermedad o síndrome. Se seleccionan por lo menos 10 organismos que presenten
señales clínicas tales como: decoloración, melanización y necrosis en la cutícula, así
como anorexia (falta de apetito), letargia (reducción de la actividad normal), coloración
rojiza de los pleópodos y telson o cualquier otra alteración que se observe en ellos. Los
organismos con estas características generalmente se encuentran en la compuerta de
salida de los estanques (Figura 1.12).
Las muestras deben procesarse inmediatamente, de acuerdo al procedimiento o
procedimientos que se hayan elegido para la detección del agente causal de la enfermedad.
Los organismos deben ser enviados vivos a los laboratorios de diagnóstico.
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Tabla 1. Selección del tamaño de muestra y cálculo del porcentaje de prevalencia de un patógeno
en una población determinada (Tomada de Lightner, 1996 y modificada de Amos, 1985).
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Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo
Para la realización del análisis en fresco, se requiere contar con espacio limpio en
donde se tenga el siguiente material:
Microscopio compuesto con objetivos de 4, 20, 40, 60 y 100 X
Portaobjetos
Cubreobjetos
Bisturí
Navajas de disección
Pinzas de disección
Tijeras finas de disección
Tabla de disección
Cajas de petri
Pizetas
Guantes
Agua de mar estéril o filtrada
Resina
Jeringas desechables de varias medidas (1 mL, 3 mL y 5 mL)
Hematoxilina
Eosina Y
Solución de Davidson (AFA, Alcohol-Formaldehído-Ácido acético)
Solución de Davidson modificada (AFA, Alcohol-Formaldehído-Ácido clorhídrico)
Etanol absoluto
Etanol al 70%
Xileno
Contenedores para muestras
Hoja de reporte
Manuales
Desarrollo de la técnica:
Los organismos se miden y pesan para obtener el peso y tamaño promedio.
• Se analiza tanto la superficie del organismo para detectar deformaciones en el rostro
y en el sexto segmento abdominal, como cutícula delgada (o suave), epicomensales,
decoloración, coloración rojiza, melanización, ampollas y necrosis de cutícula
(Figura 1.13); pleópodos, pereiópodos y antenas.
• Se selecciona una pequeña porción de cada tejido u órgano (Figura 1.14). Las
porciones se colocan individualmente en portaobjetos limpios (no mezclar porciones),
se les adiciona unas gotas de agua de mar estéril y se pone el cubreobjetos; debe
procurarse que en la muestra no se formen burbujas que puedan interferir (para ello
hay que realizar una leve presión sobre el cubreobjetos con la pinza de disección).
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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No_________________________ Fecha._____________________________________________
Procedecia._ ____________________________________________________________________
Especie.________________________________________________________________________
Estanque No. _______________ Tamaño de la muestra._______________________________
No. de muertos.______________ No. de examinados._________________________________
Estado de vida.______________ Peso promedio.___________ Tamaño promedio._________
CARACTERÍSTICAS
CARACTERÍSTICAS EXTERNAS OBSERVACIONES OBSERVACIONES
INTERNAS
Deformidades en el rostrum,
antenas abdomen, telson, Deformación de los túbulos
urópodos y pleópodos
Presencia de gregarinas en
Melanización (color café claro)
todos sus estadíos
BRANQUIAS INTESTINO
Presencia de gregarinas en
Coloración
todos sus estadíos.
Masas melanizadas de
Presencia de epibiontes
hemocitos
Presencia de melanización y
Microsporidios
necrosis
Síndrome del
encalambramiento
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Tabla 3. Guía general para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad
a la infección, infestación y síndrome (Lightner, 1996).
GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLÍNICOS
No presentan signos de infección por el agente patógeno, parásito
0 o epicomensal. No presentan lesiones características de sín-
dromes.
Presencia muy baja del patógeno, parásito o epicomensal. En
aquellos donde se tiene un número estándar permitido, éste se
1
encuentra justo arriba del límite normal. Se observan muy pocas
lesiones características del síndrome.
Se observa la presencia baja y moderada del patógeno, parásito o
epicomensal. Se observan lesiones ligeras o moderadas, car-
2
acterísticas del síndrome. Incremento en la mortalidad si no se
aplica tratamiento (cuando existe tratamiento).
Se observa la presencia moderada del patógeno, parásito o epico-
mensal. Se observan lesiones moderadas a severas, características
3
del síndrome. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento
(cuando existe tratamiento).
Se observa gran cantidad del patógeno, parásito o epicomensal.
4 Se observan severas lesiones características del síndrome. Muy
letal con altas mortalidades.
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1.5 Bacteriología
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MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA
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MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA
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1.6 Histología
Objetivo. La histología es la rama del saber científico que se ocupa del estudio de
los rasgos morfológicos de los tejidos, por medio de instrumentos amplificantes. La
histopatología es entonces la ciencia que estudia las modificaciones patológicas de las
células y tejidos. En camarones, es una herramienta de diagnóstico que permite identificar
cambios a nivel celular en cortes de tejidos que han sido sometidos a procesos físicos
y tinciones rutinarias o especiales. Esta técnica permite detectar factores de mortalidad,
bajo crecimiento, alteraciones de comportamiento y otros aspectos durante el cultivo
en laboratorios de larvicultura, fincas de engorde e instalaciones de maduración de
reproductores.
Descripción. La histopatología permite identificar en la mayoría de los casos, la etiología
de la enfermedad de la población de camarones bajo estudio; se logra generalmente
hacer el diagnóstico de todas las enfermedades virales reportadas en camarones (por
ejemplo las causadas por IHHNV, TSV, WSSV, HPV, YHV, BP, IMNV y PvNV), necrosis
hepatopancreática (NHP), bacteriosis crónicas, gregarinas, protozoarios epicomensales,
nemátodos, enteritis hemocítica y necrosis muscular idiopática, entre otras enfermedades.
Para esto, se requiere que las láminas histológicas sean perfectamente preparadas y
examinadas bajo el microscopio por el ojo de un patólogo entrenado.
La autolisis es un proceso post-mortem que se presenta en los crustáceos
extremadamente rápido y que consiste en la ruptura celular, salida de enzimas y
componentes celulares, pérdida de la arquitectura de los tejidos y destrucción de los
órganos. Por esta razón, los camarones deben morir por efecto de la inyección del fijador
y por la inmersión en el mismo, el cual debe ofrecer una rápida penetración en los
tejidos. El hepatopáncreas es el órgano más susceptible a la autolisis. Durante la fijación,
la solución debe penetrar el órgano rápidamente o los cambios post-mortem conducirán
a la pérdida de estructuras tisulares, eliminando zonas de tejido importantes para el
diagnóstico.
Si existe interés en estudiar problemas de morfología externa en camarones como
es el caso de deformidades en post-larvas o presencia de epibiontes (epicomensales)
adheridos a las branquias, también se obtienen buenos resultados si los animales son
fijados vivos por inmersión en una solución de formalina al 10%.
Metodología. El fijador de Davidson (Humason, 1979) es el más utilizado y sugerido
para los procedimientos de rutina, cuando se van a preparar muestras de camarones
para análisis histopatológico. Además de ofrecer buen nivel de detalle en el núcleo de
las células, el ácido acético del fijador descalcifica la cutícula, evitándose así pasos
adicionales de descalcificación del exoesqueleto durante el proceso histológico. La
preparación del fijador de Davidson debe realizarse con base en la siguiente fórmula:
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del substrato y se agregan 100 μL a los pozos, incubando luego a temperatura ambiente
por 60 minutos. Finalmente se agrega la solución de parada en cantidad suficiente y se
leen las microplacas en un lector de ELISA.
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Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo
Dot blot
Objetivo. Detección de patógenos (ej.: virus) en una muestra de tejido de camarón, mediante
el reconocimiento de la presencia de su ADN a través de un proceso de lisis (ruptura) celular,
extracción del ADN, hibridación y revelado.
En camarones existen sondas para detectar virus como WSSV o IHHNV y para detectar
bacterias intracelulares como la alfa Proteobacteria causante de la NHP.
Descripción. El dot blot es una técnica de hibridación en la cual el ADN se ubica directamente
sobre una membrana de nylon o de nitrocelulosa. Su nombre se debe a que sobre la membrana
donde se ubican las muestras del ADN extraído, se forman círculos o puntos. Esta técnica
involucra sondas genéticas en su procedimiento, las cuales son pequeños fragmentos de ADN
(oligonucleótidos), que son complementarios de regiones que nos interesan en el ADN que
se está buscando en una muestra (ej.: virus). De esta manera, si en una muestra problema se
produce la hibridación entre la sonda y el ADN viral, se puede concluir que el virus en cuestión
se encuentra presente.
Las sondas genéticas para camarones son marcadas utilizando moléculas como la biotina
o la digoxigenina, las cuales son luego detectadas mediante enzimas como la fosfatasa alcalina,
produciendo una reacción colorimétrica y de esta manera detectable por el ojo humano. Las
sondas genéticas son específicas para un único tipo de microorganismo.
En la actualidad, es factible conseguir sondas genéticas en kits comerciales. Este tipo de
prueba es muy útil cuando se quiere estudiar un gran número de muestras, pero tiene la limitante
de no ofrecer muy alta sensibilidad, además de que su revelado final es por colorimetría.
Metodología. El procedimiento de dot blot en camarones, inicia con una muestra de hemolinfa
o de otro tipo de tejido de un animal sospechoso de una enfermedad (ej.: virus WSSV). Cabe
recordar que se debe utilizar una sonda específica para el tipo particular de microorganismo
que se va a buscar.
La muestra es macerada mecánicamente con un tampón (buffer) de lisis, con lo cual
se busca romper las células y permitir la salida de las moléculas de ADN hacia la solución
del macerado. Luego, una cantidad de macerado (inferior a una gota) es puesta sobre una
membrana de nylon (o de nitrocelulosa). El ADN es luego desnaturado, es decir, se separan las
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
cadenas de la doble hebra y luego se coloca la sonda previamente calentada. Dicha sonda ha
sido modificada, habiéndosele unido una molécula de digoxigenina.
Se incuban las muestras con la sonda y si esta encuentra regiones del ADN viral que
sean complementarias (guardando el concepto de complementariedad de los nucleótidos A-T
y C-G), se produce anillado o hibridación (unión entre la sonda y el ADN viral), que es una
molécula estable de ADN híbrida de doble cadena.
Luego de incubar, se realiza un lavado y se agregan anticuerpos anti-digoxigenina, que
han sido previamente marcados con la enzima fosfatasa alcalina. Si la sonda está presente
en las muestras, se formará un complejo “antígeno-anticuerpo” con la digoxigenina. Se hace
un último lavado y se agrega una solución reveladora (BCIP-NBT), la cual reacciona con la
fosfatasa alcalina y produce una reacción colorimétrica. La intensidad del color morado que se
produce, es proporcional a la cantidad de microorganismos presentes en la muestra (partículas
virales de WSSV en el caso de este ejemplo).
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Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo
la técnica de dot blot, es una unión entre la sonda y fragmentos del genoma viral o bacteriano,
que forma así una molécula estable.
Para los virus IHHNV, HPV y TSV, la sonda se diluye en la solución de hibridación y es
puesta directamente sobre la muestra. En el caso de BP, MVB, WSSV y NHP, se requiere de un
calentamiento previo de la muestra para desnaturalizar el ADN baculoviral de doble cadena
(dsDNA). La muestra se debe incubar en cámara húmeda toda la noche; para el caso de IHHNV
y HPV a 37ºC, para BP, MVB, WSSV, NHP y TSV a 42ºC.
Posteriormente las muestras deben ser sometidas a varios lavados con buffers distintos
y luego se aplican los anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina. Se
incuban y posteriormente se hacen nuevos lavados con soluciones buffer.
Se aplica la solución de desarrollo y se frena luego la reacción cuando sea ya necesario
de acuerdo con criterios colorimétricos, lavando con soluciones buffer y después con agua
destilada. Las muestras se someten luego a tinción con el colorante “Bismark Brown Y” y se
deshidratan posteriormente utilizando etanoles ascendentes (95% y 100%) y xilol (o algún
substituto).
Sin dejar secar la muestra en este momento (y en ninguno de los procesos anteriores),
se pone una gota de medio de montaje sobre el tejido y se cubre con una laminilla o lámina
cubreobjetos. Se deja secar y se observa luego en un microscopio de campo oscuro, para
detectar depósitos intracelulares de precipitado negro o azul oscuro y/o alguna citopatología
específica que haya sido marcada por la sonda.
La interpretación de los resultados varía en cada muestra, según el patógeno que se está
buscando y, por consiguiente, las células de los tejidos “blanco” que se espera hayan sido
infectados por el agente viral o bacteriano.
En el caso del virus TSV, debe considerarse que una manipulación incorrecta antes de la
prueba, puede arrojar resultados falsos negativos. Adicionalmente, las muestras para TSV deben
ser manejadas en ambientes y con reactivos libres de RNAsas; el personal debe ser entrenado
en el manejo de muestras con patógenos cuyo genoma es ARN y en este tipo de ambientes
libres de RNAsas.
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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Figura 1.42 Procedimiento de extracción de ADN, mediante la Figura 1.43 Cámara de trabajo para PCR. Dentro de ella, circula
utilización de un kit comercial con base en soluciones de lisis aire ultrafiltrado y se utiliza para la preparación de los reactivos
celular. Nótese el uso de puntas de micropipeta protegidas con que se utilizarán en las pruebas de amplificación (PCR). Los
un filtro (blanco) en su base, para evitar la contaminación de elementos que se utilizan dentro de la cámara, no deben salir
la micropipeta y el paso de ADN viral de una muestra a otra de la misma y deben estar marcados según sean utilizados en
(contaminación cruzada). diferentes tipos de muestras o para diferentes tipos de agentes
patógenos.
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Figura 1.46 Transiluminador de luz ultravioleta utilizado Figura 1.47 Gel de agarosa con productos de amplificación
para revelar la presencia de bandas de ADN, producto de la de ADN obtenidos mediante PCR, vistos a través de un
amplificación por PCR y que migraron en una cámara de transiluminador de luz ultravioleta. La columna de la izquierda
electroforesis. La tapa que se observa color púrpura, posee posee un marcador de peso molecular; las columnas siguientes
un filtro que protege al operario de la luz uv. Nótese el uso (1 a 5) poseen muestras que fueron amplificadas. Las bandas
de guantes por parte del operario, mientras manipula el gel de blancas que se observan en éstas, corresponden a resultados
agarosa para ser puesto sobre el transiluminador. positivos en la búsqueda de un agente patógeno de una muestra
mediante PCR.
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volumen de suero a una microplaca y se hace reaccionar con el reactivo del método
utilizado. De esta manera se obtiene la formación de un complejo coloreado el cual
es medido con un lector de microplacas utilizando un filtro con una longitud de onda
determinada para cada método (ej.: 546 nm para Biuret). Finalmente, se extrapola la
concentración de proteínas totales en el plasma de la muestra, a partir de una curva de
calibración con una solución stock de BSA estándar (1mg/mL).
Capacidad de hemoaglutinación: con este método es posible determinar las condiciones
sanitarias de los camarones, mediante la medición de la capacidad de las proteínas
de reconocimiento de patrones (PRPs) (especialmente las de reconocimiento de
lipopolisacáridos), presentes de manera natural en la hemolinfa. Sus funciones incluyen
reconocer y aglutinar cuerpos invasores. Por comodidad, se usan en los ensayos eritrocitos
de diferentes mamíferos, por ser células extrañas al camarón y, sobretodo, por ser células
con coloración natural, facilitando así la observación a simple vista de la reacción. El
estudio de estas proteínas y sus mecanismos de reconocimiento, comienza a ser una
herramienta muy potente para las estrategias de selección de animales genéticamente
resistentes a enfermedades. La actividad hemoaglutinante de la hemolinfa, podría
constituirse en un indicador de salud y de adaptación del camarón, ya que por ejemplo
existe una relación directa entre los títulos de hemoaglutinación y la calidad reproductiva
de los machos (índice de espermatogénesis). Igualmente, la sensibilidad de la actividad
hemoaglutinante ante el estrés, demuestra que los títulos de hemoaglutinación pueden
ser usados tanto como indicadores sanitarios, como de adaptación de los animales a sus
condiciones de vida. La prueba de hemoaglutinación se realiza utilizando eritrocitos
humanos o de otros mamíferos (principalmente de roedores que son particularmente
reconocidos por las aglutininas de camarón) en microplacas de 96 pozuelos con fondo
en forma de “U” y en presencia de suero. Se determina así visualmente la presencia de
aglutinación y el título aglutinante. Cuanto mayor es el título, mayor será la cantidad de
PRP en la hemolinfa del camarón.
Actividad de la fenoloxidasa: la enzima fenoloxidasa (PO por sus siglas en Inglés), se
encuentra confinada en el interior de los hemocitos del camarón y juega un papel
crucial en la cascada inmunológica que se activa cuando es reconocida una substancia
como cuerpo extraño (antígeno). La PO se encuentra en forma de enzima inactiva
(zimógeno) llamada profenoloxidasa (proPO). En condiciones de infección, esta enzima
inactiva es exocitada de los hemocitos hacia el plasma del camarón y es convertida en
PO mediante el efecto de la Enzima Activadora de la proPO (AEproPO), la cual es una
serin-proteasa. Las reacciones que culminan con la transformación de proPO en PO y
con la subsecuente melanización, son consideradas como un componente que integra
los mecanismos de reconocimiento y de defensa de los crustáceos. En pruebas hechas
in vitro, se ha observado que el paso de proPO a PO se produce incubando la muestra
con Tripsina (serin-proteasa comercial). La actividad total de la PO se mide utilizando
L-DOPA como sustrato. La determinación de la actividad de la PO, permite tener una idea
de la capacidad de respuesta inmune de un camarón, frente a la presencia de agentes
patógenos en el organismo. Para su medición, se parte de la reacción en la que se utiliza
suero de los camarones o un lisado de sus hemocitos, que son la fuente de la enzima PO
y se incuba con la L-DOPA y tripsina (activador de proPO). En presencia de oxígeno, se
forma un compuesto colorido (rojo-coral) que presenta su máxima absorbancia a 490
nm y puede ser detectada espectrofotométricamente con un lector de microplacas.
Actividad antibacteriana de los hemocitos por la producción de intermediarios reactivos
de oxígeno (fagocitosis): en condiciones normales, las células fagocíticas de los
camarones se encuentran en estado inactivo. La presencia de partículas extrañas sobre
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25% n/a 4 / 96 16 / 84 24 / 76
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Figura 1.56 Microscopio Electrónico de Transmisión (PHILIPS CM-12), gobernado por un microprocesador. Permite observaciones
de 31X hasta 730.000X, con capacidad de resolución de 0,2 nm entre líneas y 0,3 nm entre puntos. Trabaja con distintos voltajes
de aceleración: 20, 40, 60, 80, 100, y 120 kV. Tiene opciones de observación en campo claro, campo oscuro y difracción de
electrones. Posee sistema fotográfico automático adaptado para película plana o película de 35 mm. Las principales aplicaciones son:
organización de células y tejidos, estudio de organelos celulares, estudio de especialización celular: cilios, flajelos, sinapsis, uniones
GAP, morfología de virus, estudios de micropartículas y nanopartículas y, estructura interna de láminas delgadas.
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1.11 Bioensayos
Objetivo. Determinar si el agente causal de una enfermedad es de origen infeccioso
(virus, bacterias, hongos, etc.), tóxico (toxinas químicas o biológicas) o, descartando lo
anterior, de origen ambiental o por manejo. También se utilizan los bioensayos para
evaluar la patogenicidad de una cepa viral o bacteriana inyectada o suministrada vía oral
a camarones libres de dichos agentes patógenos.
Descripción. Los bioensayos son estudios realizados con seres vivos, camarones en este
caso, durante los cuales se busca reproducir una enfermedad detectada en camarones
de una población determinada, utilizando como organismos “blanco” camarones sanos
y susceptibles a dicha enfermedad. Éstos pueden ser “libres de patógenos específicos”
(SPF por su sigla en inglés) o simplemente libres de la enfermedad que se pretende
reproducir.
La susceptibilidad de los camarones que se utilizan en los bioensayos, hacen
referencia a la especie y talla de los animales. La manera de buscar su eventual infección
es utilizando batido (macerado) de camarones enfermos y los cuales presentaban
manifestaciones de la enfermedad (sacrificados en fase aguda). La aparición de
la enfermedad en los camarones susceptibles utilizados en un bioensayo, deberá
corresponder al tiempo estimado de aparición de los signos clínicos en los camarones
que se enferman en condiciones naturales.
Metodología. Los bioensayos son pruebas de desafío, en las cuales se utiliza tejido
infectante para realizar de manera experimental, una infección per os (vía oral) en
camarones susceptibles. El material infectante debe provenir de camarones vivos
(enfermos avanzados o moribundos), que hayan presentado los mismos signos clínicos de
la enfermedad en cuestión y procedentes de una misma población (edad y talla similar).
La capacidad infectante de este batido de tejido de camarones enfermos, depende de la
carga viral o bacteriana que tenga (cantidad de microorganismos por gramo de aquellos
que causan la enfermedad) y de la cantidad de tejido que se suministre a los camarones
“blanco”. Si existen pruebas moleculares disponibles para el agente etiológico del
estudio, se puede establecer de manera semi-cuantitativa (PCR con diluciones seriadas
del ADN extraído) o cuantitativa (PCR en tiempo real), la carga del patógeno presente en
cada gramo de tejido infectante.
Los camarones que van a ser infectados experimentalmente per os, deben estar
libres de la enfermedad que se pretende reproducir. Para ello, deben proceder de una
población libre de patógenos conocidos, SPF si es posible y que no hayan presentado
o estén presentando signos clínicos de ninguna enfermedad (completamente sanos). Si
existen herramientas moleculares de diagnóstico para la enfermedad en cuestión, se
debe someter a prueba un grupo de camarones procedentes de la población de donde
se utilizarán los animales “blanco” para el estudio. Éstos, deben ser negativos (“no
detectado”) al patógeno del cual es objeto el bioensayo.
Cuando el objetivo del bioensayo incluye trabajar con un patógeno desconocido y
para el cual no existen en el momento pruebas de diagnóstico moleculares, los camarones
“blanco” deben ser SPF para que los resultados de la prueba sean concluyentes.
Los bioensayos deben realizarse en instalaciones cerradas, con condiciones
controladas y con parámetros físico-químicos estables. Los principales factores que
deben mantenerse bajo control durante un bioensayo, son los siguientes:
• Calidad del agua: filtrada, recambio constante o frecuente, condiciones
bacteriológicas apropiadas
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BIOENSAYOS
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Recomendación general
Es de gran importancia hacer una eliminación adecuada de todos los productos
de desecho procedentes de pruebas de diagnóstico, así como de camarones que han
sido utilizados para extracción de muestras o para bioensayos. Esto, para evitar la
contaminación de entornos acuáticos comerciales o silvestres y del propio ambiente.
Apéndice
Métodos para la detección de los principales agentes virales en camarones penaeidos
(modificado de Lightner y Pantoja, 2001. En: USDA-UCA, 2001).
IHH-
Método WSSV BP MBV BMN SMV YHV* TSV IMNV PvNV
NV
Directa BF /
++ - +++ +++ ++ - ++ + - -
LM / PH / DF
Histopa-
++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ ++ ++
tología
Bioensayos ++ + + - + - + ++ + +
TEM / SEM + + + + + ++ + + + +
ELISA CON
- - + - + - - ++ - -
PAb / MAb
Sondas ADN /
+++ +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ + +
DBH / ISH
PCR / RT-PCR +++ +++ +++ + - +++ +++ +++ +++ +++
*Grupo YHV. La información sobre los virus IMNV y PvNV, fue suministrada por el Dr. Carlos Pantoja de la Universidad de Arizona,
USA (2008).
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Montajes en Fresco:
Lightner, D.V. 1996. A handbook of shrimp pathology and diagnostic procedures for diseases of
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Morales-Covarrubias, M. S. 2004. Enfermedades del camarón. Detección mediante análisis en
fresco e histopatología. Editorial Trillas, SA de CV., Av. Río Churubusco 385, Col. Pedro María
Anaya, México, D.F. Primera edición. ISBN: 968-24-7112-5. 1-122.
Morales-Covarrubias, M. S. (en prensa 2008). Enfermedades del camarón. Detección mediante
análisis en fresco e histopatología. Editorial Trillas, SA de CV., Av. Río Churubusco 385, Col.
Pedro María Anaya, México, D.F. Segunda edición.
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
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Capítulo 2
Enfermedades Virales
Introducción
En poco menos de 40 años, la camaronicultura mundial se ha desarrollado desde
sus inicios a nivel experimental hasta volverse una industria con ingresos de billones de
dólares, proveyendo de empleo, directa e indirectamente, a cientos de miles de personas.
Desde 1970 hasta 1990, la industria dependía completamente de la captura de
postlarvas silvestres o de postlarvas producidas a partir de reproductores capturados en
el océano. La mayoría de las veces, estos animales eran capturados cerca de la región en
donde serían cultivados. Los sistemas de cultivo eran relativamente simples, se usaban tasas
muy altas de recambio de agua y las medidas de bioseguridad eran mínimas o no existentes.
En esa época se sabía de muy poco de las enfermedades del camarón y todavía menos
sobre los mecanismos de defensa -humoral y celular- especialmente contra agentes virales.
Había muy pocos especialistas en enfermedades de camarón y la capacidad de diagnóstico
era muy pequeña en la mayoría de las regiones. El uso de antibióticos y agentes químicos
era práctica común, tanto en los laboratorios de producción de postlarvas como en las
granjas. No fue sino hasta 1987, cuando el aumento explosivo de la industria camaronícola
fue acompañado de pandemias virales, que rápidamente se puso de manifiesto que las
enfermedades ocasionadas por virus eran una de las mayores amenazas para la industria.
También rápidamente se puso en evidencia que la dispersión de esas enfermedades fue el
resultado del traslado sin control tanto de postlarvas como de reproductores.
La industria camaronícola del presente ha sido transformada por la necesidad de un
mejor control de las enfermedades. Como resultado de los cambios rápidos que comenzaron
a principios de los 90’s, la dependencia de la industria sobre el suministro de postlarvas
silvestres, o de postlarvas derivadas de reproductores silvestres, ha disminuido notablemente.
Desde hace algunos pocos años hasta la fecha, poblaciones domesticadas de Penaeus
vannamei (también llamado Litopenaeus vannamei) han reemplazado a P. monodon como
la principal especie cultivada y se encuentran ya en progreso varios programas para la
domesticación de otras especies. Se han descrito ya muchas enfermedades importantes y
aunque se han desarrollado métodos para su diagnóstico, existen todavía algunos problemas
relativos a su implementación y estandarización. Las medidas de bioseguridad aplicadas a
los sistemas intensivos de cultivo se vuelven más comunes cada día. El uso de probióticos
se ha vuelto también común tanto en los laboratorios de producción de postlarvas como
en granjas y se investigan ya medidas sofisticadas de control biológico. Como resultado
de esto, el uso de antibióticos ha disminuido y se ha vuelto más responsable. Estudios de
biología molecular están ayudando a lograr un mejor entendimiento de la relación entre
el camarón y los agentes patógenos que lo atacan. El resultado de todos estos avances ha
sido un incremento continuo de la producción mundial de camarón cultivado.
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
En el futuro, se espera que la industria camaronícola mundial tenga acceso fácil a una
variedad de especies domesticadas de camarón, genéticamente mejoradas y libres de los
patógenos más importantes. Métodos para el diagnóstico de estas enfermedades, tanto
en el laboratorio como en el campo, estarán disponibles en el mercado en forma de kits
y se mejorarán los mecanismos para su estandarización. De la misma manera se espera
una mejora en los métodos de bioseguridad, los cuales serán aplicados en todos los tipos
de sistemas de cultivo, aunque aquellos con mayor control (sistemas intensivos y super-
intensivos) serán más competitivos que los sistemas más tradicionales y extensivos. En
general, la eficiencia en la producción y el desarrollo de métodos intensivos de cultivo se
verán facilitados a través del mejor entendimiento del camarón, sus patógenos, la ecología
microbiana y el uso de agentes antibacterianos y antivirales ambientalmente seguros.
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Enfermedades de origen
Enfermedades de origen viral Otras enfermedades
bacteriano/fúngico
WSSV (White spot syndrome virus Vibriosis Epicomensales
disease) - sistémica/entérica - Leucothrix mucor
- vibriosis larvaria - Protozoarios
YHV (Yellow head virus disease) peritrichidos
BMN (Baculoviral midgut gland Rickettsia
necrosis virus disease) Gregarinidos
Enfermedades de origen
Enfermedades de origen viral Otras enfermedades
bacteriano/fúngico
WSSV (White spot syndrome virus Vibriosis Epicomensales
disease) - sistémica/entérica. - Leucothrix mucor
- vibriosis larvaria - Protozoarios
TSV (Taura syndrome virus disease) peritrichidos
BP (Baculovirus penaei disease) NHP (Necrotizing he-
patopancreatitis disease) Gregarinidos
YHV (Yellow head virus disease)
IHHNV (Infectious hypodermal Espiroplasmosis
and hematopoietic necrosis virus
disease)
HPV (Hepatopancreatic parvovirus Microsporidios
disease)
IMNV (Infectious myonecrosis virus Micosis larvaria Desbalances nutricionales
disease)
PvNV (Penaeus vannamei nodavi- Fusariosis Síndromes tóxicos
rus disease)
Síndromes ambientales
Síndrome de Zoea II
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Muestreo
Muestreo aleatorio
Cuando se requiera muestrear al azar a una población para determinar el estado de
salud o la prevalencia de algún patógeno, el número de camarones que será necesario
colectar va a depender de la prevalencia estimada de dicho patógeno y del nivel
estadístico de confianza deseado. En este aspecto, la Tabla 3 es usada con frecuencia
como una guía para determinar el tamaño muestral.
Muestreo no aleatorio
En situaciones en las que los camarones presentan claramente signos externos de
la enfermedad, el cálculo de la prevalencia es más fácil y la información provista en
la Tabla 3 puede ser usada para verificar el tamaño muestral y el nivel estadístico de
confidencia.
Seleccione por lo menos 10 camarones que muestren signos característicos de la
enfermedad de la que se sospecha o bien alguna otra anormalidad.
Para asegurar un diagnóstico acertado, las muestras deben de ser procesadas de
inmediato, o a la brevedad posible, de acuerdo al procedimiento o procedimientos que
hayan sido seleccionados. Los especímenes deberán ser preservados con las soluciones
fijadoras adecuadas o bien empacadas en hielo o congelados dentro de un contenedor
estéril (por ejemplo, bolsas de plástico).
Tabla 3. Tamaño muestral basado en una estimación de la prevalencia del patógeno en una
población de camarón (modificado a partir de Amos 1985).
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
• Historial del caso. Una explicación breve del porqué se está enviando las
muestras. Esto deberá incluir una descripción de las anormalidades observadas
tales como mortandades, crecimiento lento, comportamiento anormal de nado o
de alimentación, lesiones externas, cambios de coloración en el exoesqueleto, etc.
Si no hay problemas aparentes y las muestras se están colectando para hacer una
evaluación de rutina, esto también se debería de mencionar.
• Especie. Especie (o especies) de camarón
• Estadío de vida, en el caso de muestras de larvas.
• Origen de cada grupo de muestras. Esto se refiere al país de origen, nombre de la
granja o laboratorio, número de tanque o estanque, etc.
• Fecha en que la muestra fue colectada y fijada.
• Fijación. Método de fijación o el nombre de la, solución fijadora (por ejemplo,
Davidson, alcohol etílico al 90-95%, glutaraldehído, formalina al 10%, congelado,
etc.).
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Grados de severidad
Una forma de documentar de manera semicuantitativa las observaciones que servirán
para alcanzar un diagnóstico, es a través de la asignación de grados de severidad. Dicha
asignación puede referirse a una lesión en particular o al proceso infeccioso en general.
La Tabla 4 ilustra el criterio que se utiliza para la asignación de los grados de severidad.
El valor numérico asignado también es útil para determinar tendencias y para la toma de
decisiones de manejo tales como: cuándo aplicar un tratamiento, cuándo cosechar, etc.
Nombre de la enfermedad
Necrosis hipodérmica y hematopoiética infecciosa (enfermedad IHHN); síndrome
de la deformidad y enanismo (“runt deformity syndrome” o RDS). Virus de la necrosis
hipodérmica y hematopoiética infecciosa (IHHNV).
Agente
IHHNV es un pequeño parvovirus (diámetro promedio de 22 nm) constituido por
una cadena sencilla de ADN.
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Rango geográfico
• Ampliamente distribuido en instalaciones de cultivo de América y Asia incluyendo:
- América: sureste de los Estados Unidos, México, América Central, Ecuador,
Perú, Brasil y numerosas islas del Caribe.
- Pacífico Central: Hawai, Guam, Tahití y Nueva Caledonia
- Asia e Indo-Pacífico: Singapur, Filipinas, Tailandia, Malasia e Indonesia
• Se presume que IHHN es endémico en camarones peneidos silvestres del Indo-
Pacífico; ha sido detectado también en camarones silvestres del Ecuador, la costa
occidental de Panamá y la costa occidental de México.
• Se ha demostrado la existencia de diferencias a nivel de genoma entre cepas de
IHHNV de distintas regiones geográficas (Tang, K.F.J., et al. 2003). Asimismo, se ha
reportado la existencia de la integración de una porción del genoma de IHHNV al
genoma de una población silvestre de Penaeus monodon en África (Tang, K.F.J. &
Lightner 2006). En el caso del IHHNV integrado al genoma del camarón, la porción
integrada no es infecciosa.
Especies afectadas
• Se han observado infecciones naturales en: Penaeus stylirostris, P. vannamei, P.
occidentalis, P. californiensis, P. monodon, P. semisulcatus y P. japonicus.
• Debido a que otras especies de camarones peneidos (P. setiferus, P. duorarum, y P.
aztecus) han podido ser infectadas en condiciones de laboratorio, es probable que
también ocurran infecciones naturales en otras especies.
• Especies tales como P. indicus y P. merguiensis parecen ser refractarias a IHHNV.
• Aparentemente los miembros sobrevivientes de poblaciones que han sido infectadas
por IHHNV pueden volverse portadores del virus de por vida y transmitirlo
a su progenie y a otras poblaciones por medio de transmisión de tipo vertical y
horizontal.
P. stylirostris
IHHN es una enfermedad de tipo agudo que puede ocasionar altas mortandades
en juveniles de esta especie. Larvas y postlarvas infectadas verticalmente no se
muestran enfermas sino hasta alcanzar aproximadamente el estadío de PL35 o un poco
después. Una vez alcanzada esta edad, es posible observar signos externos, los cuales
son seguidos por mortandades masivas. En animales infectados horizontalmente, el
período de incubación y la severidad de la infección dependen, hasta cierto punto, del
tamaño/edad, siendo los juveniles pequeños los más severamente afectados. Los adultos
raramente presentan signos de la enfermedad o mortandades.
Los signos externos de la enfermedad no son específicos de IHHN, pero en la etapa
aguda de la infección, los juveniles de P. stylirostris muestran una marcada reducción
en el consumo de alimento, lo cual es seguido por cambios en el comportamiento y la
apariencia. Durante la fase aguda, se ha observado que los camarones de esta especie
nadan lentamente hacia la superficie en donde se quedan completamente quietos, se
voltean con el vientre hacia arriba y luego se hunden lentamente hasta el fondo del
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
tanque. Se ha visto que los camarones que muestran esta conducta pueden hacerlo
por horas hasta que se vuelven demasiado débiles para continuar o hasta que son
canibalizados por sus congéneres más sanos. En este estadío de la infección, P. stylirostris
puede llegar a presentar una coloración blanquecina con manchas de color crema, lo
cual le da al camarón una apariencia moteada. Este patrón moteado no es definitivo y
tiende a desaparecer un poco más adelante. También se ha observado frecuentemente
que en P. stylirostris y en P. monodon infectados por IHHNV, se tiende a adquirir una
coloración azulosa bastante distintiva y una opacidad de la musculatura abdominal.
Si la enfermedad progresa hasta alcanzar una fase crónica, P. stylirostris también
puede sufrir de lo que se conoce como síndrome de las deformaciones y el enanismo.
P. vannamei
En esta especie, IHHN es típicamente una enfermedad de tipo crónico. El síndrome
de las deformidades y el enanismo (“Runt Deformity Syndrome” o RDS) que afecta a
esta especie ha sido ligado a IHHNV. Típicamente, los juveniles afectados por RDS
exhiben rostros doblados o deformes, antenas arrugadas, caparazón áspero o rugoso,
y otras deformidades. Las poblaciones de juveniles con RDS exhiben típicamente una
distribución de tallas relativamente amplia con una proporción de tallas pequeñas
(enanos) mucho mayor de lo normal. El coeficiente de variación (CV=La desviación
estándar dividida entre el promedio de diferentes grupos de tallas dentro de una población
dada) de una población con RDS es típicamente mayor de 30% y puede incluso llegar al
50%, mientras que en poblaciones de juveniles de P. vannamei libres de IHHNV (y por
lo tanto sin RDS) los CVs son de entre 10% y 30%.
Diagnóstico presuntivo
• Presencia de signos clínicos.
• Historial de las instalaciones de cultivo, de las especies cultivadas o de la región,
que indique la posibilidad de infección por IHHNV.
64
C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
o Hibridación in situ
La prueba de hibridación in situ para la detección de IHHNV (en cualquier fase de
la infección) puede aplicarse sin ningún problema a especímenes de camarón fijados en
formalina o solución de Davidson (AFA) y bañados en parafina. Por medio de esta prueba,
es posible observar la formación de un precipitado azul-negro o púrpura en cualquier
lugar del cuerpo del camarón en donde el ADN del virus IHHN (y presumiblemente
mARN) se encuentre presente.
65
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
En una prueba típica de hibridación in situ, las células con CAIs muestran una
intensa reacción nuclear a la sonda, especialmente en la cromatina marginada o en la
superficie interna de la membrana nuclear. Mediante esta prueba se ha demostrado con
frecuencia, que los núcleos picnóticos y núcleos de células aparentemente normales
también pueden contener ácidos nucleicos de IHHNV.
Muchas células positivas para IHHNV también muestran densas acumulaciones
citoplasmáticas del virus. De la misma manera, se puede observar con frecuencia
una reacción positiva a la sonda asociada a los fragmentos de células necróticas en el
debris extracelular y en el contenido de los fagolisosomas de los fagocitos del corazón,
branquias y otros tejidos.
Comúnmente, la porción no celular de la cutícula del camarón (infectado o no
por IHHNV) toma una coloración azul debido a la reacción no específica de la sonda.
Esta coloración azul es debida a la presencia de la quitina, un polímero complejo
de n-acetilglucosamina, el cual se adhiere (tal vez electrostáticamente) al ADN de la
sonda.
Muestra
La muestra consiste de un apéndice, como el segundo o tercer pleópodo, un proceso
branquial, o uno de los maxilípedos. Después de obtener el apéndice, este debe ser
preservado ya sea por congelación, en solución de Davidson o en alcohol etílico al 95%
y finalmente procesado de acuerdo al método de diagnóstico de preferencia.
Las muestras de hemolinfa deben de ser procesadas ya sea inmediatamente
o preservadas por congelación o fijación en alcohol al 95% y subsecuentemente
procesadas.
Pruebas de diagnóstico
Dos de las pruebas más apropiadas para examinar este tipo de biopsias son PCR e
hibridación in situ con la sonda genética BS4.5 específica para IHHNV (u otras sondas
para IHHNV). Aunque menos sensitiva, la hibridación en formato “Dot blot” también
puede utilizarse para analizar este tipo de muestras.
Histología de rutina
El diagnóstico de esta enfermedad está basado en la presencia de inclusiones
intranucleares (CAI). El corte histológico del apéndice es hecho en el plano longitudinal
medio para de esta manera poder proveer una panorámica tan amplia como sea posible
de los tejidos presentes (epidermis, subcutis, y fibras nerviosas). El corte resultante es
examinado para determinar la presencia de inclusiones intranucleares tipo CAI (las cuales
aparecen como cuerpos elongados en las células de las fibras nerviosas). Mediante
esta técnica es posible detectar muchos de los animales infectados en una población
dada, sin embargo, se desconoce la sensibilidad del procedimiento y por lo tanto no es
recomendable para certificar la condición SPF de una población.
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
2.3 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus,
WSSV)
Nombre de la enfermedad
En la literatura (principalmente la referencia de los primeros reportes de esta
enfermedad) se hace mención a por lo menos tres “virus” dentro del complejo del
síndrome de la mancha blanca (WSSV). Hoy en día se sabe que todos son en realidad
el mismo agente. Estos son:
Rango geográfico
El virus del síndrome de la mancha blanca ha sido reportado en las regiones
geográficas mencionadas más abajo. Sin embargo, debido a que la industria depende
mucho del transporte regional e internacional de camarón vivo, es muy posible que
70
C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Especies afectadas
Infecciones naturales. Se han observado infecciones naturales en las siguientes especies:
Penaeus monodon, P. japonicus, P. chinensis (=orientalis), P. indicus, P. merguiensis, P.
setiferus, P. stylirostris y P. vannamei.
Infecciones experimentales. En estudios de laboratorio, una cepa de virus originaria
de Tailandia resultó altamente patogénica para las siguientes especies: P. vannamei, P.
stylirostris, P. aztecus, P. duorarum y P. setiferus.
No se ha observado resistencia significativa en ninguna de las especies de camarones
peneidos.
Factores ambientales
Se ha reportado la influencia marcada de la temperatura del agua en la manifestación
de la enfermedad (Vidal, O.M. et al., 2001; Granja, C.B. et al., 2003). Camarones
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Diagnóstico presuntivo
La presencia de signos clínicos tal y como se describió anteriormente.
• Historial de las instalaciones de cultivo, de la especie cultivada, o de la región,
que indique la posibilidad de que haya una infección por WSSV (por ejemplo, la
importación previa de camarones peneidos, ya sea PLs, reproductores, etc., desde
una región en donde recientemente haya habido un brote de WSSV).
• Demostración de núcleos hipertrofiados y vacuolizados, visibles en preparaciones o
improntas de tejido epitelial y tejido conectivo del estómago y/o de las branquias, en
camarones que presenten signos clínicos de la enfermedad tal y como se describió
anteriormente.
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Materiales y equipo:
A continuación se proporciona una lista del material necesario:
- Microscopio compuesto
- Pipetas Pasteur o gotero
- Tijeras y navaja fina o bisturí
- Pinzas de punta fina
- Portaobjetos y cubreojetos de vidrio
- Solución fijadora de Davidson
- Papel filtro o bolsas de té vacias (para envolver las piezas de tejido)
- Seis contenedores pequeños (25-100 ml de capacidad) o cajas de Petri
- Etanol al 50 y 70%
- Hematoxilina (de Mayer/Bennett)
- Eosina “Y” al 2% (solución acuosa)
- Agua corriente
- Agua destilada
Selección de la muestra:
Para llevar a cabo esta prueba, se deben utilizar únicamente animales moribundos
o que muestren signos agudos de la infección (por ejemplo, letárgicos, coloración café
oscura o rojiza, altas tasas de mortandad, etc.). Al menos en el caso Penaeus vannamei
o P. stylirostris no es común observar las manchas blancas que característicamente se
observan en otras especies tales como P. monodon.
Fijación:
Este protocolo ha sido diseñado para su uso con camarones o partes de camarón
que han sido previamente fijados con solución de Davidson AFA (4-24 horas) y luego
transferidos a alcohol etílico al 70%.
Procedimiento:
- Tome la muestra y fíjela con la solución de Davidson siguiendo el método usual.
- Prepare seis contenedores con las siguientes soluciones:
a) etanol 70% d) hematoxilina
b) etanol 50% e) agua corriente
c) agua destilada f) eosina “Y” al 2%
(Para prevenir evaporación mantenga los contenedores cubiertos).
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
• Las células de los tejidos infectados por WSSV se tiñen intensamente en los lugares
en donde la sonda se ha hibridado con el material genético del virus.
• El virus WSSV es “reconocido” únicamente por la sonda específica para WSSV.
Ninguna de las otras sondas (por ejemplo para IHHNV, BP, HPV, etc.) reacciona con
WSSV.
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
• El tiempo para la obtención de resultados es de tan sólo unas horas (si se parte de
muestras ya fijadas).
Por otro lado, la sensibilidad del método del “Shrimple” es por lo menos similar a la
del PCR de un paso (no anidado).
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Nombre de la enfermedad
Virus del Síndrome de Taura (TSV); Síndrome de Taura (TS); enfermedad de Taura;
enfermedad de la cola roja.
Agente
Debido a que presenta las siguientes características, el virus del síndrome de Taura
(TSV) ha sido clasificado tentativamente como un miembro de la Familia Picornaviridae:
tiene una morfología icosahédrica, las partículas tienen un diámetro promedio de 30-32
nanómetros, tienen una densidad de 1.337 g/mL, el tipo de replicación es citoplásmico,
los sitios de replicación son Feulgen negativos, contiene ARN de una sola cadena con
una longitud de aproximadamente 9 kb y la cápside está compuesta de tres proteínas
estructurales principales (49, 36.8 y 23 kDa) y dos secundarias (51.5 y 52.5 kDa).
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Especies afectadas
• El rango de especies afectadas no se conoce completamente.
• Se han documentado infecciones en poblaciones silvestres de P. vannamei, P.
stylirostris y P. setiferus.
• Se ha logrado infectar experimentalmente postlarvas y juveniles de P. setiferus,
postlarvas de P. aztecus y juveniles de P. chinensis.
• En el estadío de postlarva (de ~PL-12 en adelante) y de juvenil de P. vannamei,
TSV causa infecciones serias y altas mortandades en poblaciones de camarón
cultivado.
• En contraste, aunque TSV puede infectar juveniles de P. stylirostris, esta especie
parece ser menos susceptible a la infección.
• Los estadíos de postlarva y de juvenil de P. aztecus y P. duorarum parecen ser
resistentes a esta enfermedad.
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Los animales con infección peraguda severa mueren típicamente durante la ecdisis,
lo cual sugiere que el proceso de muda es una parte importante de la patogénesis del
síndrome de Taura.
Fase crónica/recuperación: en los estanques, cantidades bajas o moderadas de camarón
tienden a presentar lesiones multifocales melanizadas del tipo de la enfermedad de la
concha.
Los camarones en esta fase de la enfermedad pueden o no presentar su cutícula
blanda y expansión de los cromatóforos rojos. Es posible observar a tales camarones
comportándose y alimentándose normalmente.
Estos camarones son sobrevivientes de la etapa peraguda o aguda de la enfermedad,
los cuales al haber mudado exitosamente muestran las lesiones melanizadas en vías de
recuperación.
Aunque una epizootia de síndrome de Taura puede resultar en mortandades
acumuladas que van del 80% al 90% de la población en un estanque, los sobrevivientes
típicamente muestran supervivencias de 60% o más al tiempo de la cosecha.
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Agente Etiológico
Virus de la cabeza amarilla (YHV).
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Agente
• YHV no es un baculovirus ya que no contiene cdADN (cadena doble de ADN) sino
csARN (cadena sencilla de ARN).
• El virus de la cabeza amarilla es un virus de ARN de cadena sencilla (ssARN), tiene
forma cilíndrica, presenta una envoltura y es de replicación citoplásmica.
• Los viriones tienen forma cilíndrica y varían en tamaño en un rango de 150
nm a 200 nm de longitud por 40 nm a 50 nm de ancho. Las estructuras que
posiblemente sean las nucleocápsides (y/o formas aberrantes de nucleocápsides)
miden aproximadamente 15 nm de diámetro con longitudes variables de hasta
aproximadamente 800 nm de largo.
Rango geográfico
Aparentemente YH es una enfermedad ampliamente distribuida en poblaciones de
P. monodon.
Aunque hasta hace relativamente poco la enfermedad de la cabeza amarilla fue
reconocida y descrita por primera vez en camarones de Tailandia, es probable que
YHV haya sido el mismo síndrome que ha venido afectando a la industria del cultivo
de P. monodon por casi una década. Es posible que YHV haya sido responsable del
hundimiento de la industria de Taiwán en 1986-1987 y de epizootias más pequeñas, pero
serias, en regiones de Indonesia, Malasia, China y Filipinas que cultivan P. monodon.
Hace relativamente poco, se reportó la presencia de YHV en el continente americano
(Lo et al., 1998); sin embargo, el hallazgo nunca pudo ser confirmado y es probable que
se haya tratado más bien de un diagnóstico erróneo.
Especies afectadas
• YHD es una enfermedad importante en sistemas intensivos de cultivo de P. monodon
en el sureste de Asia e India.
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Diagnóstico presuntivo
Historial y signos clínicos
Diagnóstico definitivo
El diagnóstico definitivo se basa en el historial, la presencia de signos clínicos
descritos anteriormente y la confirmación por medio de histopatología.
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Histopatología
La histopatología se caracteriza por una necrosis generalizada, de multifocal a
difusa, con presencia prominente de picnosis y cariorrexis. En los tejidos afectados es
posible observar inclusiones citoplasmáticas perinucleares basofílicas, generalmente
esféricas. Entre los tipos de células o tejidos afectados se incluyen los hemocitos, órgano
linfoide, tejido hematopoyético, células pilar y epiteliales de las lamelas branquiales,
tejido conectivo esponjoso del subcutis, músculo, intestino, glándula antenal, gónadas,
cordón y ganglios nerviosos, entre otros.
Entre los cambios celulares tempranos ocasionados por YHV se incluye la hipertrofia
nuclear, disminución y marginación de la cromatina y desplazamiento lateral del
nucleolo.
Puede llegar a ocurrir una respuesta inflamatoria en forma de infiltración hemocítica,
agrupamiento y encapsulación, pero es más bien difusa y no muy conspicua, a menos de
que al mismo tiempo se presente una infección bacteriana secundaria.
Existe un tipo único de célula que se presenta con frecuencia en camarones
infectados con YHV y que puede servir como ayuda para el diagnóstico histológico de
esta enfermedad. Este tipo de célula se presenta en cantidades muy variables, pero no
es del todo rara. Generalmente se le puede observar en los espacios hemales existentes
en varios tejidos tales como branquias, glándula antenal, hepatopáncreas, corazón etc.;
este tipo de célula es generalmente esférica, presenta citoplasma de apariencia uniforme,
pálidamente basofílico y con un núcleo esférico y central. Es probable que estas células
sean en realidad hemocitos inmaduros liberados prematuramente por los órganos
hematopoyéticos en respuesta a la hemocitopenia causada por la infección de YHV.
Es importante tener en cuenta que infecciones severas de WSSV pueden llegar a
ocasionar una necrosis del órgano linfoide casi idéntica a la ocasionada por YHV (Pantoja
y Lightner, 2001). Esta similitud puede ocasionar confusión y resultar en un diagnóstico
erróneo de YHV. Sin embargo, en el caso de WSSV dicha necrosis del órgano linfoide
es acompañada por la presencia de los cuerpos intranucleares característicos de WSSV.
De cualquier manera, si hay razón para sospechar la presencia de YHV en muestras de
camarón procedentes de regiones afectadas por WSSV, se debe de recurrir a pruebas de
hibridación in situ (con la sonda para YHV) y/o de RT-PCR para determinar el estatus real
de YHV en los animales en cuestión.
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Nombre de la enfermedad
Mionecrosis infecciosa; Necrosis infecciosa del músculo.
Agente Etiológico
Virus de la mionecrosis infecciosa.
Agente
IMNV es un virus tentativamente clasificado como un totivirus (Familia Totiviridae).
Los viriones son de forma icosaédrica, con un diámetro de aproximadamente 40 nm y
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Tejidos/órganos afectados
Típicamente se incluyen el músculo esquelético (y el cardiaco con menor frecuencia),
tejido conectivo, hemocitos y las células parenquimales del órgano linfoide.
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Procedimientos de diagnóstico
Diagnóstico presuntivo. Basado en historial del caso y signos clínicos descritos
anteriormente.
Diagnóstico confirmatorio. Basado en uno o más de los siguientes métodos:
Histopatología. Utilizando técnicas de rutina con tinciones de hematoxilina-eosina
(H&E), se puede observar que en los camarones infectados se presenta una necrosis
de tipo coagulativo en las fibras musculares estriadas acompañada frecuentemente por
edema. En algunos casos, es posible observar una combinación de lesiones “nuevas”
o agudas y “viejas” o crónicas. El progreso de las lesiones parece ir de los niveles más
agudos en donde predomina la necrosis coagulativa, hasta los estadios más crónicos
en donde se observa primero infiltración hemocítica y posteriormente una matriz
suelta de fibrocitos y fibras de tejido conectivo mezcladas con fibras musculares recién
regeneradas. El análisis histológico también puede poner de manifiesto la hipertrofia
del órgano linfoide ocasionada por la acumulación de esferoides. Esta lesión se presenta
de manera muy consistente en camarones durante las fases agudas y crónicas de la
enfermedad. Con frecuencia, estos esferoides se pueden observar también en otras partes
del cuerpo del camarón, incluyendo el corazón, branquias, glándula antenal, cordón
ventral nervioso, tejido conectivo, etc. El análisis histológico también puede poner de
manifiesto la presencia de cuerpos de inclusión intracitoplásmicos en las células del
músculo esquelético, órgano linfoide y/o tejido conectivo.
RT-PCR. Utilizando los métodos descritos por Poulos et al. 2006, o bien alguno de los
“kits” disponibles en el mercado (por ejemplo, IQ2000). Debido a la gran similitud
entre las lesiones producidas por IMNV y por PvNV, es aconsejable combinar el análisis
histológico con el RT-PCR, o con pruebas de hibridación in situ y sondas genéticas
específicas, para poder obtener un diagnóstico confirmatorio confiable.
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Alitiene Moura Lemos Pereira¹, Emiko Shinozaki Mendes², Tereza Cristina Vasconcelos
Gesteira³
³ Universidade Fed. do Ceará, LABOMAR, Av. da Abolição, 3207, Fortaleza, CE, Brasil, cgesteira@labomar.ufc.br
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C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Introducción
El cultivo de camarón brasileño concentró sus esfuerzos en el desarrollo de un
sistema de producción con la especie Litopenaeus vannamei nativa del océano Pacífico,
luego de problemas de baja productividad y adaptación al medio ambiente con especies
nativas y exóticas en los años 90. Esta especie ampliamente estudiada, demostraba un
buen desempeño zootécnico, rusticidad y adaptabilidad, además de que ya se conocía
su tecnología de producción y formulación para alimento balanceado, con base en
sus requerimientos nutricionales. El factor decisivo para la escogencia de esta especie,
fue el incremento exponencial de producción obtenido en Brasil, permitiéndose así la
importación de larvas y reproductores de otros países y resultando en aumento de divisas
para el sector productivo (Figura 6).
A pesar de las mejoras económicas y del crecimiento de la producción (70% al año),
pasando de 2.880 toneladas en 1996 a 25.000 toneladas en 2000, el sistema de cultivo
utilizado con esta nueva especie presentó fallas, debido a problemas de adaptación,
ausencia de técnicas adecuadas de cultivo y aumento de la intensificación del sistema
de producción, lo cual no fue acompañado de un aumento importante del área cultivada
(MAPA, 2001).
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Diseminación de la enfermedad
Varios profesionales y productores del Nordeste de Brasil, registraron las
alteraciones más comunes en los ambientes de cultivos y su relación con la evolución
de la enfermedad. Sin embargo, como se trataba de una nueva enfermedad, fue difícil
su caracterización. A pesar de lo anterior, el intercambio de información entre el sector
98
C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
científico y productivo del país fue mínimo y la mayoría de los productores no sabía lo
que estaba ocurriendo. Para agravar la situación, la ausencia de barreras sanitarias en
la actividad acuícola del país, permitió la rápida diseminación de la enfermedad entre
las camaroneras de la Región Nordeste de Brasil, mucho antes de que se conociera la
verdadera dimensión del problema.
Con la diseminación de la enfermedad en ambientes adversos, el rango de los
brotes se fue ampliando llegando a afectar sistemas de producción con las siguientes
condiciones:
• Fases de pre-cría con densidades de 35 a 120 pls/litro
• Fase de engorde con camarones de 3 g promedio
• En densidades de 15 a 80 camarones/m2
• Camarones procedentes de diferentes laboratorios de producción de post-
larvas
• Cultivos que utilizan variadas marcas de alimentos comerciales
• En cultivos con la variables físicas y químicas aceptables para la especie
• La supervivencia promedio obtenida fue de 30 a 40% con un FCA > 2:1
Algunos productores cultivaron L. vannamei en agua dulce durante el período de
gran incidencia de mionecrosis y no reportaron problemas con la enfermedad. Pero el
virus puede presentarse también en animales cultivados en agua dulce y afectar todos
los estadios de desarrollo.
Etiología
• Bioensayos realizados en laboratorio, por Graf et al. (2003), exponiendo individuos
presumiblemente saludables a tejidos de camarones con signos clínicos de
mionecrosis, mostraron que el mayor vector de transmisión de esa patología, fue
la ingestión directa de los tejidos contaminados, caracterizando por tanto, su
transmisión horizontal.
• Después de la confirmación de la naturaleza infecciosa, a través de desafíos por
inyecciones y preparación de tejidos contaminados en individuos SPF, el agente
causante de IMN fue identificado como un virus perteneciente a la familia Totiviridae
(Lightner y Pantoja, 2004). La purificación y caracterización del virus denominado
virus de la mionecrosis infecciosa, fueron efectuadas por Poulos et al. (2006). La
partícula viral tiene forma icosahédrica y mide 40 nm de diámetro. Su genoma está
formado por una molécula de ARN de doble cadena (dsRNA) de 7.560 bp.
• Esta enfermedad conocida como IMNV (Necrosis Infecciosa Muscular o Mionecrosis
Infecciosa Viral), tuvo su primer registro en los estados del Nordeste de Brasil y más
recientemente en L. vannamei cultivado en Indonesia (Senapin et al., 2007). La
detección fue hecha utilizando un kit comercial de RT-PCR y análisis subsecuentes
revelaron que la muestra del IMNV de Indonesia tenía 99,6% de similitud con
la secuencia del ácido nucleico del IMNV brasileño registrado en GeneBank.
Según algunos autores y como información extra oficial, hubo entrada irregular de
reproductores provenientes del Brasil, en la Isla de Java.
• Además del diagnóstico de la enfermedad en todas las fases de cultivo (post-larva,
juvenil y adulto) de la especie L. vannamei, también se han mostrado susceptibles al
virus IMNV camarones de las especies L. stylirostris y Penaeus monodon, presentando
signos clínicos y alteraciones en los tejidos característicos de la enfermedad (Tang et
al., 2005).
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Métodos de diagnóstico
El diagnóstico puede ser presuntivo con base en la sintomatología observada
macroscópicamente, siendo el foco principal la pérdida de transparencia del músculo
abdominal. También se puede detectar la enfermedad a través de estudios histopatológicos,
cuando son investigadas posibles alteraciones en los órganos internos y tejidos. La
hibridación in situ fue desarrollada y optimizada como una herramienta de diagnóstico
por Tang et al. (2005). Otro método molecular para la detección del virus es la RT-PCR.
Andrade et al. (2007) mostraron que el RT-PCR usado con sondas TaqMan resulta ser un
método de diagnóstico de alta sensibilidad.
Signos clínicos
En el inicio del brote de la IMN, los camarones presentaban opacidad focal o
multifocal del músculo del abdomen y en casos de mayor severidad, se tornaban rojizos,
principalmente en el último segmento. Los individuos quedaban aletargados, presentaban
baja conversión alimenticia, abdomen encalambrado (en algunos casos), expansión de
los cromatóforos, reducción de la tasa de crecimiento y tiempo elevado de coagulación
de la hemolinfa (Figura 6.1a y 6.1b).
De acuerdo con lo reportado por Gesteira (2006), los grados de infección pueden
cambiar y presentar cuadros clínicos diversos:
• De leve a moderado – baja mortalidad y menos de 10% de los camarones cultivados
presentan signos clínicos.
• Aguda - elevada mortalidad, más de 10% de la población cultivada presenta signos
clínicos con nivel de severidad de medio a alto.
• Crónica – mortalidad baja, pero persistente y signos clínicos perceptibles en menos
de 5% de los individuos. En ese estado se pueden presentar signos agudos, cuando se
presentan fallas de manejo o cualquier otro evento que produzca en los camarones
una condición de inmunosupresión.
Aparentemente, la mionecrosis es una enfermedad que surge como consecuencia de
fallas de manejo, o en sistemas sobrecargados de materia orgánica. Todos los eventos han
tenido en común el desequilibrio de condiciones de cultivo, denominadas “detonantes”
por muchos autores, las cuales desencadenan la enfermedad e incluyen el exceso de
lluvias, presencia elevada de plancton, infestación elevada de parásitos como gregarinas
o, acción de bacterias oportunistas como los vibrios.
Como consecuencia de la enfermedad, las fincas camaroneras han adoptado buenas
prácticas de manejo que incluyen bajar las densidades de siembra y buen tratamiento de
suelo entre los ciclos de cultivo, entre otras. Con éstas, se obtienen buenos resultados de
producción final, a pesar que se detecten lesiones sugestivas de mionecrosis durante el
análisis presuntivo o confirmatorio durante el ciclo. La presencia de putrefacción en el
último segmento abdominal que se observó al principio de los brotes en Brasil (2003),
prácticamente no se observan en la actualidad.
Histopatología:
Los exámenes histopatológicos muestran diferentes alteraciones en órganos y tejidos
afectados por el IMNV, dependiendo del grado de severidad de la enfermedad. El aumento
en la talla del órgano linfoide es común y también es frecuente observar esferoides en
este órgano (lymphoid organ spheroids- LOS) (Figura 6.2). Pueden ser encontrados
los ectópicos en tejido conjuntivo, músculo del corazón y próximos a los túbulos de
la glándula antenal (Figura 6.3a y 6.3b). Las lesiones del tejido muscular dependen
100
C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
101
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Figura 2.41 – (a) Foto de micrografías mostrando la presencia de LOS ectópicos en la región cardiaca (setas); (b) detalle mayor. H
&E. Autor: Pereira, A. M.
Figura 2.42 – (a) Mionecrosis acompañada de infiltración hemocítica y fibrosis ; (b) lesiones coagulativas musculares resultantes de
la acción del virus de la mionecrosis H & E. Autor: Gesteira, T.C.V.
102
C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Diagnóstico diferencial
La necrosis muscular en el abdomen de los camarones, es una lesión que puede
ocurrir como consecuencia de estrés, bajas de oxígeno, alta densidad de siembra,
cambio brusco de temperatura o salinidad (Lakshmi et al., 1978; Rigdom & Baxter, 1970)
y también puede ser resultante de la acción de un agente infeccioso, como el caso de la
IMNV. Lesiones similares se observan en la enfermedad de la cola blanca causada por
un Nodavirus.
A pesar de la importancia de la histopatología como herramienta de diagnóstico
confirmatorio, el uso de sondas geonómicas, como hibridación in situ o PCR, garantizan
una mayor sensibilidad y especificidad en el diagnóstico. Un ejemplo es la necrosis
muscular detectada en camarones de la especie L. vannamei procedentes de Belice.
Según Tang et al, (2007), los individuos presentaban la misma opacidad muscular en
el abdomen, con características histopatológicas similares a aquellas observadas en
portadores de IMNV. Después del examen utilizando las técnicas de hibridación in situ
y RT-PCR, los resultados fueron negativos para IMNV, sugiriendo que la enfermedad era
causada probablemente por otro virus RNA. Los autores encontraron 69% de similitud
de este virus de Belice con el nodavirus del Macrobrachium rosenbergii, adoptando este
nuevo virus la denominación de PvNV (Penaeus vannamei nodavirus).
Además de agentes virales, las bacterias también pueden causar opacidad muscular
que se asemeja a la observada en IMNV (Lightner, 1996), como por ejemplo los vibrios
y las pseudomonas. La diferencia puede ser vista a través de histopatología (ausencia de
cuerpos de inclusión) o mediante pruebas moleculares como RT-PCR.
Tratamientos
Considerando las características del sistema inmune de los camarones, no existe
un tratamiento específico para la IMNV. Como cualquier enfermedad, las medidas
preventivas son las más económicas y eficaces. Un buen manejo de los cultivos debe
incluir la adopción de normas de bioseguridad para evitar la entrada y establecimiento de
nuevos patógenos y permitir una mejor supervivencia en la presencia de enfermedades.
Consideraciones finales
Actualmente, en muchas fincas camaroneras algunas de las prácticas de manejo de
cultivos fueron cambiadas principalmente por reducción de la densidad de siembra (10
a 40 camarones/m2), tratamientos del suelo entre los cultivos, preparación y fertilización
de los estanques y vaciado sanitario entre los ciclos de cultivo.
En algunos laboratorios productores de pls, fueron implementados programas de
mejoramiento genético, inclusive con importación de reproductores SPF y SPR que
podrían proporcionar pls de buena calidad y con menores posibilidades de enfermedad
por IMNV. En otros laboratorios, a pesar de no tener implementada esas prácticas, han
sido cuidadosos con la bioseguridad y por ello, en cultivos que son bien manejados, no
se detecta una incidencia elevada de IMN. En la actualidad, a pesar de que en Brasil
se pueden observar lesiones sugestivas de mionecrosis durante análisis presuntivos o
confirmatorios en camarones, la supervivencia promedio es de 70%.
103
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
104
C. R. Pantoja y D.V. Lightner Enfermedades Virales
Procedimientos de diagnóstico
Diagnóstico presuntivo. Basado en historial del caso y signos clínicos descritos
anteriormente.
Diagnóstico confirmatorio. Basado en uno o más de los siguientes métodos:
Histopatología. Utilizando técnicas de rutina con tinciones de hematoxilina-eosina
(H&E), se puede observar que en los camarones infectados se presenta una necrosis
de tipo coagulativo en las fibras musculares estriadas acompañada frecuentemente
por edema. En algunos casos, es posible observar una combinación de lesiones
“nuevas” o agudas y “viejas” o crónicas. El progreso de las lesiones parece ir de los
niveles más agudos en donde predomina la necrosis coagulativa, hasta los estadios
más crónicos en donde se observa primero infiltración hemocítica y posteriormente
una matriz suelta de fibrocitos y fibras de tejido conectivo mezcladas con fibras
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
116
Capítulo 3
Enfermedades Bacterianas
Capítulo 3
Enfermedades Bacterianas
Introducción
La creciente demanda en el consumo del camarón, la drástica declinación de
sus reservas naturales y la sobrepesca del mismo, trajo consigo el surgimiento de la
camaronicultura. La industria del cultivo de camarón en América Latina, ha surgido
como una de las fuentes de mayor generación de divisas en la región. Sin embargo,
las enfermedades principalmente de origen viral y bacteriano, han ocasionado pérdidas
de los cultivos, empleos e ingresos por caídas de las exportaciones. Especialmente
desde la aparición de la enfermedad de la mancha blanca; la producción ha disminuido
significativamente en muchos países y los productores de camarón están encontrando
serias dificultades para continuar el negocio.
Los patógenos se encuentran en el medio ambiente acuático generalmente en
forma natural, muchos de ellos son oportunistas, es decir que mientras los camarones
se encuentren en buenas condiciones, los patógenos no atacan, de tal manera que su
presencia no necesariamente significa que los organismos se encuentren enfermos.
Sin embargo, factores como los genéticos, contaminación del medio ambiente e
intensificación de los métodos de producción, estresan a los camarones reduciendo o
perturbando el funcionamiento normal del organismo, haciéndolos altamente sensibles
a las enfermedades y reduciendo las oportunidades de supervivencia.
El estrés en los organismos provoca cambios en todos sus sistemas, produciendo
respuestas adversas en el metabolismo, regulación inmunológica, regulación hormonal y
osmorregulación, haciendo al organismo más susceptible al ataque de cualquier agente
patógeno, afectando la capacidad de supervivencia, reproducción y crecimiento.
Actualmente, en organismos cultivados por los diferentes métodos de acuacultura,
se observan camarones con características externas de organismos sanos, durante y
después de un periodo de estrés, pero esto no significa que el organismo este sano, ya
que después de un cierto tiempo se puede manifestar la replicación alta de un patógeno
produciendo una enfermedad donde se observen porcentajes altos de mortalidad, o
en otras ocasiones los organismos son portadores asintomáticos de diferentes agentes
patógenos y no manifiestan características externas de animales enfermos mientras las
condiciones de cultivo sean las óptimas para su desarrollo, pero si estas condiciones
se tornan desfavorables, el sistema de defensa que los tenía protegidos, se suprime y la
multiplicación del patógeno se desarrolla de tal manera que sobrepasa los mecanismo
de defensa, causando en muchas ocasiones mortalidad al hospedero.
En un estanque de cultivo existen factores como son: temperatura, salinidad,
oxígeno, pH, nutrientes orgánicos e inorgánicos, los cuales influyen en las comunidades
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
bacterianas presentes en los estanques, ya que éstas son susceptibles a las fluctuaciones
que ellos tienen en el desarrollo del cultivo, dando como resultado en muchas ocasiones
un aumento en el número o haciendo que proliferen patógenos nocivos dando como
resultado mortalidades en los organismos cultivados.
Para que las poblaciones bacterianas se mantengan estables en un sistema de cultivo,
es necesario mantener los parámetros óptimos, así como también es indispensable la
aplicación correcta de la alimentación y el mantenimiento del florecimiento de algas para
una buena calidad del agua y de los fondos de los estanques y mantener un equilibrio en
la población microbiana.
Las bacterias en un estanque son necesarias para mantener el suelo y el agua en
óptimas condiciones, ya que algunas de ellas se encargan de la degradación de los
detritos y otras del reciclamiento de nutrientes; por tal motivo, la bacterias no solamente
son sinónimo de enfermedad cuando se encuentran presentes en los estanques.
Actualmente, el movimiento de organismos vivos que se realiza de manera frecuente
en diversos países para mejorar la producción de algunas especies, ha propiciado la
introducción y propagación de patógenos exóticos en lugares donde no existían,
diseminándose en algunos casos a las poblaciones silvestres; es por esto que es de vital
importancia conocer qué enfermedades son las de mayor presencia en la región donde se
desarrolla la camaronicultura y qué patógenos las ocasionan para poder dar seguimiento
a los organismos que serán cultivados por sus diversos métodos en acuicultura, así como
también para la aplicación de las medidas de bioseguridad ya que éstas requieren de
capacitación del personal, trabajo en equipo, organización y registro de la medidas
aplicadas.
Las enfermedades de origen bacteriano son unas de las principales en camarones
de cultivo en el continente americano, siendo las bacterias Gram negativas las que
predominan en el ambiente marino y usualmente constituyen la mayoría de las bacterias
que normalmente se presentan en la microflora asociada a los camarones silvestres y de
cultivo. En el presente capítulo se hace una revisión de las enfermedades bacterianas
presentes en los laboratorios de producción de larvas comercial y en los cultivos de
engorda de camarón de América Latina.
120
María Soledad Morales-Covarrubias Enfermedades Bacterianas
Signos Clínicos
Se observan mortalidades altas (hasta un 90%), en postlarvas y juveniles tempranos.
Los camarones moribundos son encontrados en la superficie y nadando en las orillas de
los estanques, con presencia de aves alimentándose de ellos. Cuando la enfermedad se
encuentra en fase inicial se observan algunos organismos con opacidad muscular y tracto
digestivo vacío y en la fase grave es posible observar organismos con expansión de los
cromatóforos, hepatopáncreas inflamado y en algunos camarones luminiscencia.
Diagnóstico y Control
Para el diagnóstico de esta enfermedad se utilizan diferentes análisis como son:
el análisis bacteriológico, el cual consiste en tomar organismos con expansión de los
cromatóforos, intestino vacío y presencia de opacidad muscular para cuantificar las
Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en hepatopáncreas (UFC/g) y en hemolinfa
(UFC/mL), ya que estos poseen una carga bacteriana regular (tabla 1), por lo que es
posible diferenciar cuando se encuentran alterados.
Hemolinfa Hepatopáncreas
Tipos de UFC (UFC/mL) (UFC/g)
>103 <103 <105 <105
Verdes Lum. 100 % muy grave grave grave grave
Verdes >50% grave serio Serio serio
Verdes < 50% Serio serio-normal Serio serio-normal
Amarillas Serio normal Normal normal
121
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
122
María Soledad Morales-Covarrubias Enfermedades Bacterianas
Signos clínicos
Se observan en la cutícula manchas de color rojo, cafés o negras en áreas que han
sido erosionadas por acción de bacterias quitinolíticas. Cuando la infección progresa se
puede observar el músculo melanizado y con secciones de necrosis y atrofia muscular.
Diagnóstico y control
Al revisar externamente a los organismos, o al realizar el análisis en fresco de
muestras de cutícula y músculo, se observan claramente las manchas, rojas, cafés, negras
y secciones de músculo con erosiones melanizadas (Figura 3.3)
En organismos con esta enfermedad por histopatología con tinción de hematoxilina-
eosina, se observa en algunas secciones de la cutícula y músculo, melanización y necrosis
con infiltración de hemocitos (Figura 3.4), atrofia de los paquetes musculares y presencia
de nódulos hemocíticos con masas de bacterias.
Como método de control, se utiliza la disminución de la biomasa en los estanques
mediante cosechas parciales e incremento en los recambios diarios de agua. Es importante
que entre cada ciclo de cultivo después del secado, se realicen remociones del exceso de
detritos. Al ser una enfermedad de tipo bacteriana, es necesario el empleo de antibióticos.
Su uso es causa de mucha controversia y abuso en la industria. Las reglas publicadas por
numerosos autores para la utilización de antibióticos son las siguientes:
1. Es necesario mejorar el ambiente de los estanques de cultivo donde se desarrollan
los organismos.
2. Sólo se debe usar antibióticos cuando sea muy necesario y únicamente para las
infecciones de origen bacteriano.
3. Usar los antibióticos adecuados, que sean sensibles a las bacterias que están
causando la enfermedad. La sensibilidad se realiza mediante análisis de laboratorio,
nunca se debe medicar un estanque sin antes revisarlo.
4. Usar sales de antibióticos fresco.
5. Realizar el tratamiento con la dosis adecuada.
6. Finalizar los tratamientos por lo menos 15-30 días antes de la cosecha para permitir
la eliminación de residuos de antibióticos en el músculo del camarón.
Figura 3.3. Muestra de camarón peneido con manchas negras en la cutícula causadas por bacterias quitinolíticas
123
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Signos clínicos
Se presentan altas mortalidades después de 36-48 horas de haber transcurrido la
metamorfosis de Zoea I a Zoea II, las sintomatologías más importantes son la anorexia
(falta de apetito), rápida evacuación del contenido intestinal, letargo (disminución de
la actividad normal) con nado errático y la permanencia en el fondo del tanque de los
organismos infectados.
Diagnóstico y control
El diagnóstico se realiza mediante la elaboración de placas en fresco de Zoeas II.,
donde se observa atrofia del hepatopáncreas con desprendimiento celular o hepatocitos
hipertrofiados y redondos “llamados bolitas blancas” (Figura 3.5), inflamación y presen-
cia de células del hepatopáncreas viajando a través del intestino. Se piensa que las boli-
tas blancas son una reacción a la presencia de toxinas bacterianas (Vibrio spp). También
se han observado en el hepatopáncreas de zoeas y postlarvas tempranas “bolitas negras”,
las cuales han sido asociadas a infecciones bacterianas, estas bolitas poseen una sus-
tancia oscura, que ha sido identificada como clorofila; probablemente aparecen por las
toxinas producidas por las bacterias asociadas con el tracto digestivo, las cuales causan
desórdenes metabólicos y una mala digestión de las algas ingeridas. Hasta la fecha, se
desconoce el origen de las bolitas negras en el cultivo larvario.
En organismos con la enfermedad de bolitas blancas, se diagnóstica por histopa-
tología con tinción de hematoxilina-eosina, y se busca la presencia de células “bolitas
blancas” viajando por el lumen del túbulo del hepatopáncreas (Figura 3.6) y del intestino
124
María Soledad Morales-Covarrubias Enfermedades Bacterianas
125
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Signos clínicos
Los organismos infectados con esta bacteria se observan con luminiscencia, letargo
(disminución de la actividad normal), nado errático, permanencia en el fondo del tanque
y mortalidades masivas.
Diagnóstico y control
El diagnóstico se realiza mediante la elaboración de placas en fresco de larvas, donde
se observa en la fase inicial colonización masiva de las bacterias en los apéndices, tracto
digestivo y región oral. Pero conforme avanza la enfermedad y entra en la fase grave,
se observa colonización en el intestino medio y posterior y en hepatopáncreas hasta
llegar a colonizar todos los órganos y tejidos del organismo, hasta tener una septicemia
generalizada con mortalidades altas.
Por análisis de bacteriología es necesario aislar la bacteria principalmente de
organismos moribundos que muestren una gran colonización de bacterias. El aislamiento
se realiza en agar TCBS sembrando el macerado de los organismos previamente
desinfectados. Al obtener los resultados en las placas, se observa gran cantidad de
colonias luminiscentes de color verde (Tabla 1).
En organismos con la enfermedad de luminiscencia, se diagnostica por histopatología
con tinción de hematoxilina-eosina y se busca la presencia de colonias de bacterias,
infiltración de hemocitos, nódulos hemocíticos, melanización, necrosis en apéndices
(Figura 3.8), tracto digestivo, intestino y hepatopáncreas. Para el control de esta
enfermedad de luminiscencia, es necesario aplicar tratamiento mediante el empleo de
antibióticos, con la previa realización de antibiogramas y en algunos casos se desechan
todos los organismos y se desinfectan los tanques de larvicultura.
126
María Soledad Morales-Covarrubias Enfermedades Bacterianas
causa mortalidades en los camarones si no es detectada a tiempo, ya que ataca a uno de los
principales órganos del camarón (hepatopáncreas). En México, NHP-B, se ha detectado a
través de trabajos de investigación realizados en sistemas de cultivo desde 1998, pero su
más alta prevalencia fue observada por primera vez en 1999, continuando hasta el 2007.
En estos años, se ha observado que esta enfermedad ocurre en los meses de abril, mayo,
julio, agosto, pero su alta prevalencia es observada en los meses de septiembre y octubre
causando altas mortalidades en los camarones cultivados. Esta enfermedad también ha
sido observada con una alta prevalencia en hembras ablacionadas y baja prevalencia en
hembras no ablacionadas pero que tienen temperatura y salinidad constante.
Signos clínicos
Durante la fase inicial de la enfermedad, no aparecen signos clínicos de organismo
enfermo.
Durante la fase aguda, la primera señal que se reporta para esta enfermedad, es
reducción en el consumo de alimento en postlarvas tardías, juveniles y adultos hasta
dejar de comer por completo. Posteriormente se observa la aparición de camarones
moribundos nadando cerca de la superficie y en las orillas de los estanques. Los camarones
moribundos muestran palidez generalizada del cuerpo, con un color café claro, branquias
de color amarillo pálido a café y hepatopáncreas atrofiado, con coloración café claro a
oscuro, provocando que sea fácil de confundir con enfermedades virales; en esta fase se
observan las más altas mortalidades.
También en esta fase en muchas ocasiones no es posible observar camarones en
las orillas de los estanques, ya que éstos permanecen en el fondo o en el área de salida
de agua del estanque, por lo que es indispensable realizar muestreos de estas dos áreas
para detectar organismos moribundos o muertos. En la fase crónica, se observa el
hepatopáncreas atrofiado de color oscuro y una disminución de las mortalidades en
camarones de cultivo.
Diagnóstico y control
Para realizar el análisis en fresco de deformación tubular, los organismos muestreados
deben de estar en fase de intermuda. En la fase inicial de NHP-B, no se observa atrofia
del hepatopáncreas, pero presentan deformación tubular (Figura 3.9, grado 1) donde se
observa atrofia y estrangulamiento de los túbulos con desprendimiento (Figura 3.9, grado
2; Tabla II) e hipertrofia celular y nuclear. En estos organismos es posible observar muy
pocas reservas de lípidos y masas de bacterias.
Fase aguda: se observa atrofia del hepatopáncreas, mayor desprendimiento celular,
células con núcleos hipertrofiados, coloración pálida (desaparece el color naranja),
textura blanda y edematosa (fluido blanquecino al realizar la disección), melanización,
atrofia tubular y necrosis de las células y de los túbulos del hepatopáncreas, así como
también es posible observar nódulos hemocíticos en el hepatopáncreas (Figura 3.9,
grado 3).
También se observa en fase aguda, formación multifocal de granulomas dentro
del hepatopáncreas; afectando a uno o más túbulos, las células epiteliales dentro de los
granulomas en algunos casos están hipertrofiadas, conteniendo en el citoplasma colonias
de bacterias (coloración basofílica). Las células de los túbulos cercanos a los atrofiados y
con presencia de granulomas, presentan atrofia, núcleos picnóticos, muy pocas vacuolas
de lípidos (células R) y vacuolas secretoras (células B). También es posible observar que
el epitelio columnar de estos túbulos del hepatopáncreas se vea afectado, pues la atrofia
de las células lo convierte en epitelio cuboidal.
127
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Figura 3.9. Corte histológico de apéndice de camarón; donde se observa infiltración de hemocitos, nódulos hemocíticos,
melanización y necrosis. Tinción de hematoxilina-eosina).
128
María Soledad Morales-Covarrubias Enfermedades Bacterianas
Fase aguda: con atrofia severa de los túbulos del hepatopáncreas; formación multifocal
de granulomas dentro del hepatopáncreas; afectando a uno o más túbulos (Figura 11);
las células epiteliales dentro de los granulomas en algunos casos están hipertrofiadas
conteniendo en el citoplasma colonias de bacterias (Figura 12) (coloración basofílica).
Las células de los túbulos cercanos a los atrofiados y con presencia de granulomas,
presentan atrofia con núcleos picnóticos, muy pocas vacuolas de lípidos (células R) y
vacuolas secretoras (células B). Tambien es posible observar que el epitelio columnar
de estos túbulos del hepatopáncreas se ve afectado, pues la atrofia de las células lo
convierte en epitelio cuboidal.
Fase crónica: el epitelio de los túbulos del hepatopáncreas se aprecia muy atrofiado; en
algunas secciones se observan la formación de nódulos hemocíticos melanizados.
Para el control de esta enfermedad de origen bacteriano intracelular, el método
de tratamiento más usado es el empleo de antibióticos para inhibir el crecimiento
bacteriano.
129
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Tabla 2. Guía para dar un valor numérico cualitativo del grado de severidad a la deformación
tubular en hepatopáncreas con análisis en fresco (Tomada de Morales-Covarrubias 2004).
Signos clínicos
En estados medios y avanzados, las branquias se observan de color café claro a
oscuro, en estado avanzado impiden el intercambio gaseoso provocando con esto
la muerte del tejido (necrosis multifocal), intestino inflamado, en algunos casos los
organismos dejan de comer y se observa el intestino vacío con infección bacteriana.
Diagnóstico y control
Para detectar la presencia de bacterias filamentosas por análisis en fresco, se toman
muestras de branquias, cutícula, región oral y pleópodos. Se observan al microscopio
compuesto con objetivos de 40X y 60X, los filamentos de diversos tamaños de L. mucor
(Figura 3.13), con presencia de melanización y necrosis en algunos casos.
Por histopatología con tinción de hematoxilina-eosina, en branquias, cutícula
y apéndices, se observan las formas bien definidas de L. mucor, con presencia de
melanización y necrosis. En algunos organismos con intestino inflamado se observa
gran infiltración de hemocitos (Figura 3.14). Para el control se requiere mantener una
buena calidad de agua de cultivo, con excelente producción de fitoplancton para que
dichas poblaciones compitan por los nutrientes disponibles con L. mucor.
130
María Soledad Morales-Covarrubias Enfermedades Bacterianas
Agente Etiológico
Spiroplasma penaei.
Agente
Las bacterias incluidas dentro del género Spiroplasma (Clase Mollicutes) se
caracterizan por carecer de una pared celular y por tener una morfología helicoidal.
Los espiroplasmas son mótiles a pesar de carecer de flagelos. Históricamente,
los espiroplasmas han sido asociados a enfermedades de plantas y de artrópodos,
principalmente insectos y garrapatas, pero más recientemente se han encontrado a
miembros de este género infectando a algunas especies de cangrejos de agua dulce
(Eriocheir sinensi) y los camarones alvinocáridos de las chimeneas hidrotermales en el
fondo del océano (Rimicaris exoculata) en donde parece no causar enfermedad alguna
sino más bien parece ser parte de la microflora normal. Spiroplasma penaei es el primer
espiroplasma patogénico que ha sido aislado a partir de un crustáceo marino.
131
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
ESPIROPLASMOSIS
Spiroplasma penaei
132
María Soledad Morales-Covarrubias Enfermedades Bacterianas
Tejidos/órganos afectados
Típicamente se incluyen el cordón ventral nervioso, músculo esquelético, corazón,
glándula antenal, órgano linfoide, tejido conectivo fibroso dentro del hepatopáncreas,
tejido conectivo esponjoso perigástrico, filamentos branquiales y subcutis en el
caparazón y apéndices corporales.
Procedimientos de diagnóstico
Diagnóstico presuntivo. Basado en historial del caso y signos clínicos descritos
anteriormente.
Diagnóstico confirmatorio. Basado en uno o más de los siguientes métodos:
Histopatología. Las lesiones causadas por este espiroplasma son las características de una
enfermedad bacteriana de tipo sistémico. Utilizando técnicas de rutina con tinciones
de hematoxilina-eosina (H&E), los camarones moribundos presentan reacciones
inflamatorias sistémicas multifocales, moderadas a severas, en forma de congestión
hemocítica, coagulación de hemocitos, formación de nódulos hemocíticos, fagocitosis
(algunas veces acompañada de melanización) y fibrosis. Los órganos afectados incluyen
(en orden de severidad): cordón ventral nervioso, músculo esquelético, corazón,
glándula antenal, órgano linfoide, tejido conectivo fibroso dentro del hepatopáncreas,
tejido conectivo esponjoso perigástrico, filamentos branquiales y subcutis. El desarrollo
de las lesiones parece ser como sigue: (1) Presencia de células necróticas con núcleos
picnóticos; (2) Migración y congregación de células fagocíticas en el área necrosada;
(3) Fagocitosis de las células necrosadas y restos celulares y formación de nódulos
hemolíticos; (4) Melanización de nódulos hemolíticos; (5) Inflamación fibrocítica.
PCR. Utilizando los métodos descritos por Nunan et al. 2004. Debido a la gran similitud
entre las lesiones producidas por S. penaei y otras enfermedades bacterianas tales
como vibriosis sistémica, es aconsejable combinar el análisis histológico con PCR, o
con pruebas de hibridación in situ, para poder obtener un diagnóstico confirmatorio
confiable.
133
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
SPIROPLASMA
Nunan L.M., Pantoja C.R, Salazar M., Aranguren F., Lightner D.V. 2004. Characterization and
molecular methods for detection of a novel spiroplasma oathogenic to Penaeus vannamei. Dis.
Aquat. Org. 62:255-264.
Nunan L.M., Lightner D.V., Oduori M.A., Gasparich G.E. 2005. Spiroplasma penaei sp. nov.,
associated with mortalities in Penaeus vannamei, Pacific white shrimp. Intl. J. Syst. Evol.
Microb. 55:2317-2322.
134
Capítulo 4
Jorge Cuéllar-Anjel
Director del Departamento de Patología e Investigación
Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO)
Coclé, Panamá
Introducción
Un parásito puede ser considerado como todo organismo vegetal o animal que vive
a costa de otro de distinta especie, alimentándose de las sustancias que este consume o
elabora y pudiéndole o no perjudicar, aunque sin llegar necesariamente a producirle la
muerte. Los parásitos se clasifican en endoparásitos y ectoparásitos, según si habitan en
el interior o en el exterior de sus hospederos.
La afección de un animal por parásitos, es llamada parasitosis. Los principales
parásitos de camarones son gregarinas, epicomensales (protozoarios, algas y bacterias
filamentosas), microsporidios, haplosporidios y metazoarios (nematodos o tremátodos).
Los protozoarios son los que más comúnmente afectan a los camarones, pudiendo ser
observados en branquias, apéndices, exoesqueleto y tracto digestivo (intestino medio y
eventualmente hepatopáncreas). Las citas bibliográficas utilizadas para la preparación
de una parte de este Capítulo, no serán mencionadas a lo largo del texto para facilitar
la lectura de los diferentes temas. A cambio, serán incluidas al final del Capítulo en las
“Referencias bibliográficas”.
4.1 Gregarinas
Las gregarinas (Protozoa, Apicomplexa) son parásitos protozoarios de diversos
tipos, ampliamente distribuidos en la naturaleza y comunes en muchos grupos de
invertebrados, especialmente artrópodos, anélidos y moluscos. En éstos, las gregarinas
pueden aparecer ínter o intracelularmente y aunque las células hospedero individuales
son destruidas por el estadio intracelular, muchas especies no son consideradas como de
alta patogenicidad. Sin embargo, cada especie de gregarina suele ser específica de una
única especie de hospedero.
Las gregarinas pueden ser encontradas tanto en camarones silvestres, como en
sistemas de cultivo. Todos los camarones penaeidos son hospederos conocidos o
potenciales de las gregarinas. Por lo menos dos géneros, Nematopsis y Cephalolobus, cada
uno con diversas especies, aparecen de manera frecuente en los camarones penaeidos
con una distribución geográfica mundial. Un tercer género llamado Paraophioidina, se ha
observado esporádicamente en postlarvas de P. vannamei bajo condiciones de cultivo.
Debido a que se considera que existen múltiples especies de gregarinas con
distribución geográfica aún sin definir en todo el mundo, es recomendable realizar
monitoreos sanitarios cuando van a ser movilizados camarones procedentes de regiones
aisladas, ya que éstas pueden poseer poblaciones nativas de estos parásitos.
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Ciclo de vida
En los camarones, la ingestión de un hospedero intermediario que contenga esporas
de gregarina, trae como consecuencia la infestación. Las esporas ingeridas “germinan”
para llegar a ser esporozoitos, los cuales se adhieren a la capa de quitina de las paredes y
a los pliegues terminales del filtro gástrico. También pueden invadir o unirse al intestino
medio o a las células epiteliales del ciego anterior, con su proceso especializado de
epimeritos. Una vez adheridos, se desarrollan a trofozoitos que se caracterizan por su
epimerito especializado y consisten en la forma inicial del protomerito, con un núcleo
diferenciado y localizado centralmente. De cada uno pueden generarse al menos tres
trofontes.
Los trofontes se separan de su unión al estómago o intestino medio, para convertirse
en esporadio y pasar al intestino posterior, alojándose en sus pliegues. De cada
célula individual de esporadio, se desarrolla un gametocisto. Algunas de estas células
darán paso a la fase sexual de la reproducción del parásito, formando microgametos
(gametos masculinos) y macrogametos (gametos femeninos). Cuando hay ruptura de los
gametocistos, los gametos se entrecruzan y fusionan para formar cigotos, los cuales son
liberados al medio externo.
Las zigosporas son consumidas por bivalvos y poliquetos. En el interior de estos
segundos hospederos, ocurre la esporogonia en las células del epitelio intestinal.
Posteriormente, el camarón ingiere los poliquetos o sus heces y se infesta. Dentro del
tracto gastrointestinal del camarón, se liberan los esporozoitos, ocupando el estómago
posterior o el intestino medio, adhiriéndose a la cutícula o penetrando las membranas de
138
Jorge Cuéllar-Anjel Enfermedades por Parásitos
las células del hospedero. Los esporozoitos son desarrollados a trofozoitos en el intestino
medio, posterior o en el propio estómago.
Mecanismos de transmisión
Debido a la necesidad de varios hospederos dentro del ciclo de vida de las gregarinas,
se cree que la transmisión de un camarón a otro no es frecuente. Algunos ensayos de
transmisión en acuarios han mostrado que eliminando el segundo hospedero una vez
están infestados los camarones, desaparecen los protozoarios del tracto intestinal en
pocos días.
Aunque los moluscos bivalvos han sido implicados tradicionalmente como
hospederos intermediarios de las gregarinas para camarones penaeidos, el poliqueto
Polydora cirrhosa, anélido muy común que vive en el fondo de los estanques de cultivo
de camarón, fue encontrado como un importante hospedero intermediario para el
Nematopsis sp. según estudios realizados en Ecuador, en estanques de cultivo de P.
vannamei.
Signos clínicos
Los camarones con infestaciones muy altas (más de 100 trofozoitos por cm de
intestino medio), pueden mostrar una coloración amarillenta del intestino. En los casos
en los que la infestación es severa e involucra a una gran parte de la población de
cultivo, se puede presentar bajo crecimiento de los camarones y aumento en el factor de
conversión alimenticia.
Los camarones con niveles bajos o moderados de infestación por gregarinas, pueden
no presentar signos clínicos y tener una apariencia general equivalente a camarones
aparentemente sanos.
Diagnóstico
Montaje en fresco: pueden ser observados esporozoitos, trofozoitos o gametocistos
en heces de camarones extraídas del intestino medio y examinadas bajo el microscopio,
utilizando objetivos de 10X y 20X. No se requieren tinciones para la diferenciación
del parásito. Su apariencia será pálida cuando esté inmaduro y tiende a color marrón
oscuro entre más cercano esté de ser adulto. En algunos casos se observan gregarinas
con su extremo distal bifurcado en forma de “Y”. Cada “segmento” (célula) que
conforma el organismo, tiene su núcleo visible y de fácil diferenciación cuando se usa
el ajuste micrométrico de foco en el microscopio. Cuando están vivas, se les observa un
movimiento lento de avance lineal y en algunos casos se dobla súbitamente en forma de
“L” volviendo luego a su forma normal.
Histopatología: se observan parásitos en el intestino medio y con frecuencia en la luz
del ciego anterior, así como en los conductos primarios del hepatopáncreas; estómago
anterior y porción inicial del tracto digestivo anterior. Las lesiones significativas aparecen
típicamente en infestaciones severas y consisten en taponamiento mecánico del lumen
intestinal, reducción del grosor de la mucosa del intestino medio, hiperplasia del epitelio
intestinal formando pliegues tipo “vellos” y, perforaciones de la mucosa intestinal. Éstas,
pueden proporcionar una ruta de entrada a Vibrio spp. u otras especies de bacterias
extracelulares, que son agentes oportunistas potencialmente causantes de bacteremia y
enfermedad.
139
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Medidas de control
Los aumentos en la intensificación de los sistemas de producción, han venido
acompañados por aumentos en la incidencia de gregarinas en las explotaciones
de cultivo de camarón. Con el fin de mantener los niveles de gregarinas por debajo
de los grados considerados como de riesgo para el crecimiento (y eventualmente
supervivencia), muchos productores realizan monitoreos periódicos para gregarinas y
han comenzado a incorporar anticoccidiales veterinarios en los alimentos balanceados,
con las dosis recomendadas para avicultura y ganadería bovina, teniendo buenos
resultados determinables en los muestreos de rutina. Otras técnicas de control incluyen
la eliminación del organismo hospedero (Polydora sp. y moluscos bivalvos), mediante
la adición de cal en niveles adecuados al fondo del estanque luego de la cosecha, para
destruir estos vectores potenciales del protozoario. Recientemente se han lanzado
productos al mercado con base en compuestos naturales (no químicos) dirigidos
específicamente contra gregarinas y cuya efectividad aun se está evaluando en sistemas
comerciales de producción de camarón.
GREGARINAS
Figura 4.2 Ciclo de vida de las gregarinas: A. El camarón ingiere las esporas con detritus orgánicos del fondo. B. Los esporozoitos
emergen del intestino del camarón. C. Los esporozoitos se adhieren a la pared intestinal y crecen en trofozoitos; algunos trofozoitos
no se adhieren a las paredes sino entre sí, formando estructuras inusuales. D. Estas formas inusuales se desarrollan y se adhieren a
la parte final del intestino (recto) para formar gametocistos. F. Las gimnosporas son engolfadas por células de la superficie del tejido
blando de las almejas. G. Dentro de las almejas, se desarrollan hasta formar esporas. H. Las esporas (con esporozoitos en su interior)
son luego liberadas por la almeja adheridas a masas de moco. Adaptado de Johnson (1978)
140
Jorge Cuéllar-Anjel Enfermedades por Parásitos
GREGARINAS
141
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
4.2 Microsporidios
Nombre de la enfermedad
Microsporidiosis, enfermedad del camarón algodonoso, enfermedad del camarón
lechoso o enfermedad del Nosema (entre otras).
Etiología
La microsporidiosis es una enfermedad parasitaria producida en camarones penaeidos
por protozoarios intracelulares miotrópicos del phylum protista Microspora (Orden
Microsporidia), pertenecientes a los géneros Agmasoma (anteriormente Thelohania),
Ameson (anteriormente Nosema) y Pleistophora (anteriormente Plistophora).
Especies afectadas
Probablemente todas las especies de camarones penaeidos puedan ser infestadas por
una o más especies de microsporidios. Los tejidos afectados están típicamente inflamados.
Las células que son parasitadas, presentan hipertrofia tanto del citoplasma como del
núcleo y poseen esporas del protozoario que pueden verse esféricas o cilíndricas.
Estos parásitos protozoarios intracelulares afectan a artrópodos, peces y también al
hombre. Poseen reproducción sexual por esporogamia (en el hospedero) y asexual por
fisión múltiple (esquizogamia).
La enfermedad del camarón algodonoso en P. vannamei, se presenta cuando el
músculo estriado es invadido por el protozoario Ameson sp. Los procesos de reproducción
asexual culminan con la producción de gran cantidad de esporas que se localizan dentro
de las células en tejido muscular del camarón.
142
Jorge Cuéllar-Anjel Enfermedades por Parásitos
Figura 4.6 Adaptada y modificada después de Johnson 1978 por el Dr. Kenneth W. Hasson. Partes de la figura fueron tomadas
directamente de Canning y Lom, 1986; Perkins 1991 y Putz y McLaughlin, 1970.
Métodos de diagnóstico
El examen clínico permite detectar presencia de manchas blancas en cefalotórax,
gónadas, tracto digestivo y/o músculo esquelético en abdomen o cefalotórax, las cuales
pueden sugerir infestación con el protozoario. Estos hallazgos también pueden estar
acompañados por opacidad u oscurecimiento generalizado del camarón.
El montaje en fresco a partir de tejido muscular afectado sin teñir o coloreado con la
técnica de Giemsa, permite observar las esporas del parásito bajo el microscopio (400X).
Son características las masas de esporas refringentes que de acuerdo con su tamaño y
forma, indican el tipo de organismo que se encuentra presente en los tejidos afectados.
El análisis histológico realizando tinciones con H&E, Giemsa o ácido-alcohol
resistente (“acid fast”), permite visualizar las esporas de los microsporidios claramente
dispuestas en colonias dentro de los tejidos afectados.
Las siguientes son las características de las esporas de cada especie, según los nuevos
esquemas taxonómicos y mediante el uso de microscopía electrónica de transmisión
(TEM):
Ameson: esporas de 1.2 x 2 μm y son producidas individualmente a partir de
esporontes
Pleistophora: esporas de 2.1 x 2.6 μm presentes de 16 a más de 40 en cada esporonte
Agmasoma penaei: esporas de 2.0 x 5.0 o de 5.0 x 8.2 μm con 8 por esporonte
Agmasoma duorara: esporas de 3.6 x 5.4 con 8 por esporonte
143
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Mecanismos de control
No se conocen tratamientos específicos para el control de la microsporidiosis en
sistemas de producción. Por esta razón, solamente se puede tratar de evitar el contacto
entre los camarones expuestos a riesgo de infestación (hospederos intermediarios), los
peces requeridos como hospederos definitivos para cerrar el ciclo y, el parásito en sí.
Por lo anterior, se hace evidente la importancia de realizar planes de exclusión de
predadores de camarones (peces), tanto de los estanques de cultivo, como de los canales
de suministro de agua (reservorios).
Los camarones afectados por el parásito, deben ser descartados -si es posible-
durante el momento de la cosecha. De igual manera, deben extremarse cuidados para
evitar la diseminación de reproductores de P. vannamei infestados con alguna de las
especies de microsporidios, en regiones geográficas en donde el parásito no se encuentre
o no haya sido reportado.
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Jorge Cuéllar-Anjel Enfermedades por Parásitos
MICROSPORIDIOS
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
MICROSPORIDIOS
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Jorge Cuéllar-Anjel Enfermedades por Parásitos
4.3 Haplosporidios
Nombre de la enfermedad
Haplosporidiosis hepatopancreática, infección por haplosporidios, haplosporidiosis.
Agente
Se cree que las afecciones en camarones penaeidos son producidas por varios
posibles haplosporidios. Algunos de estos parásitos reportados en cultivos de camarón en
Asia y México, no han sido lo suficientemente estudiados y tampoco han sido demostradas
esporas del parásito como para poder ser ubicados taxonómicamente dentro del phylum
Haplosporea. Para ello, se requerirán estudios a partir de TEM con el fin de utilizar las
características de su ultraestructura en una correcta clasificación.
Sin embargo, recientemente ha sido propuesto (Painhealth Medical References) que
los haplosporidios sean clasificados en el orden sporozoa como protozoarios del phylum
Ascetospora, clase Stellatosporea, con reproducción asexual mediante esquisogonias y
que producen esporas pero no flagelos, pudiendo tener seudópodos.
Métodos de diagnóstico
Análisis histológico para demostrar la presencia intracelular del protozoario en las
células epiteliales de los túbulos del HP. En infestaciones típicas, el protozoario se aprecia
apicalmente o lateralmente al núcleo, como si fuera un plasmodio multinucleado que
puede fragmentarse en estadios mononucleados. Estas células mononucleadas pueden
ser encontradas en el lumen de los túbulos del HP, presumiblemente después de haber
sido liberadas por células necróticas. Los plasmodios pueden ser observados en cortes
histológicos teñidos con hematoxilina y eosina o con Wolbach’s Giemsa.
En los casos de infestaciones muy severas, los túbulos del HP con alta presencia
de haplosporidios se observan rodeados por masas de hemocitos, los cuales están
encapsulando y melanizando activamente las porciones afectadas de los túbulos.
Al realizar estudios mediante TEM a partir de células epiteliales de túbulos afectados
del HP, se observa la presencia de haplosporosomas dentro del parásito cuyo tamaño
aproximado es de 29-140 nm x 130-603 nm.
Signos clínicos
No han sido reportados signos de enfermedad en camarones penaeidos afectados
por el parásito, que puedan ser asociados con presencia de haplosporidios en sus tejidos.
Sin embargo, los camarones afectados podrían presentar bajo crecimiento.
147
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Estrategias de control
Los camarones infestados con haplosporidios deben ser removidos del sistema de
producción y eliminados adecuadamente para destruir el parásito. Las instalaciones de
cultivo deben ser desinfectadas de manera cuidadosa y los camarones (en cualquier
estadio) infestados o sospechosos, no deben ser movilizados ni entre fincas, ni entre
regiones geográficas.
4.4 Epicomensales
Los camarones penaeidos cultivados en sistemas de producción semiintensivos,
intensivos o sobreintensivos, con altas densidades de siembra en los estanques o aguas
de baja calidad, frecuentemente desarrollan formas de enfermedad causadas por
microorganismos que se adhieren a las branquias o a la superficie del animal. La mayoría
de éstos, viven en estado libre en el agua y no son patógenos verdaderos. Debido a
que utilizan al camarón como un substrato para adherirse, son llamados organismos
epicomensales o epibiontes. En la mayor parte de los casos, estos organismos no causan
daños directos al camarón, aunque sí producen problemas indirectamente al adherirse
a las branquias (compitiendo por el oxígeno disuelto), o a las superficies cuticulares de
apéndices y otras partes del cuerpo.
Nombre de la enfermedad
Enfermedad de las branquias, enfermedad de branquias filamentosas, enfermedad
bacteriana de las branquias, branquias sucias, branquias negras, branquias cafés o,
branquias con adherencias de protozoarios.
148
Jorge Cuéllar-Anjel Enfermedades por Parásitos
Diagnóstico
Las enfermedades por organismos epicomensales, son diagnosticadas mediante
la observación de preparaciones en fresco de los microorganismos, tanto en larvas y
postlarvas, como en secciones de branquias y apéndices orales de camarones juveniles
o adultos afectados.
En sistemas intensivos y sobreintensivos, debe ser una práctica frecuente el monitoreo
de camarones y su examen bajo un microscopio, para determinar la prevalencia y
severidad de la enfermedad. De esta manera, se proporciona información significativa
sobre las condiciones sanitarias de las branquias con base en la adherencia de epibiontes
en los camarones. Las decisiones para implementar sistemas de control en los casos de
enfermedades por organismos epicomensales, están basadas en los datos obtenidos a
partir de estos monitoreos.
Los camarones para los análisis de rutina, no deben ser seleccionados aleatoriamente
de una población bajo estudio. El mejor procedimiento es seleccionar individuos que
estén decaídos, con las branquias manchadas o que tengan la musculatura opaca
(sospechosos de hipoxia), ya que el propósito principal de este examen es decidir si se
necesita algún tipo de tratamiento y qué clase de químico o manejo debe ser utilizado
para salvar la población.
Normalmente, de cinco a diez camarones de un tanque o estanque, deben ser
seleccionados y sometidos a un examen microscópico.
Utilizando cortes histológicos en parafina teñidos con H&E, pueden detectarse y
usualmente identificarse organismos epicomensales del cuerpo, branquias y apéndices.
Además, el grado de severidad de la infestación por organismos epicomensales, es con
frecuencia fácilmente determinado, especialmente por cortes que proporcionan un
panorama de las branquias.
Rango geográfico y especies afectadas
La presencia de epicomensales puede ser observada en cualquier región del mundo
donde se cultiven camarones penaeidos.
Todas las especies de camarones son potencialmente susceptibles a adherencias de
epicomensales, tanto en sistemas extensivos, como semi-intensivos e intensivos. También
pueden ser observados en otras especies de decápodos bentónicos que sirven como
hospederos o vectores. De igual manera, enfermedad por epibiontes puede presentarse
en todos los estadios del ciclo de vida de los camarones.
A pesar de su amplia distribución geográfica, pueden presentarse cepas o especies
únicas y que son propias de determinadas regiones. Éstas, pueden significar un peligro
para instalaciones de cultivo de otros lugares donde no existan, en caso de que se realice
una importación con camarones infestados. En este sentido, deben tomarse medidas
preventivas para excluir parásitos epicomensales potencialmente exóticos.
149
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Signos clínicos
Las lamelas de las branquias son el lugar más frecuente para la infestación en juveniles
y camarones mayores. Por esta razón, el examen visual de camarones afectados mostrará
cambio de coloración de las branquias, constituyéndose así en un examen valioso para la
detección de enfermedad por epicomensales.
La presencia de coloración amarilla, café o negra en las branquias, está relacionada
con colonización de epicomensales y puede ser debido a material detrítico o lodo
atrapado por los microorganismos que están adheridos a las lamelas.
Si se observa coloración verde o verdosa de las branquias, puede deberse a
colonización de las lamelas branquiales por una o varias especies de algas.
Algunos camarones pueden tomar una apariencia de “peluche”, algodonosos o
como si estuvieran colonizados por hongos, lo cual corresponde en realidad a una fuerte
colonización por organismos epicomensales sobre la superficie del animal.
En infestaciones de larvas o postlarvas, con frecuencia se ven involucrados los
apéndices natatorios, ojos y algunas partes de la boca. Como se mencionó anteriormente,
los animales afectados pueden mostrar dificultades para moverse y alimentarse.
Una invasión desde moderada hasta alta, puede inhibir la respiración del animal. Los
camarones pueden aparecer exteriormente normales pero mueren rápidamente durante
o inmediatamente después del ejercicio, manipulación (muestreos o transferencias) o
exposiciones a condiciones de oxígeno bajo en el agua.
Cuando los camarones se encuentran severamente afectados por epicomensales,
pueden morir durante la muda, encontrándose luego en el fondo con apariencia “limpia” del
exoesqueleto, pero con la cutícula suave. Teniendo las branquias fuertemente colonizadas
por epibiontes, las condiciones de oxígeno disuelto bajo durante las madrugadas, pueden
potencializar el ambiente hipóxico del camarón que de por sí se está presentando por la
enfermedad en las branquias.
Tanto los hallazgos mediante montajes en fresco como a través de análisis histológicos,
deben ser registrados para establecer la prevalencia y severidad del problema. Los grados
de severidad pueden ser estimados en la escala de 0 a 4 de acuerdo con la siguiente tabla
propuesta por Lightner (1996):
150
Jorge Cuéllar-Anjel Enfermedades por Parásitos
Vías de transmisión
Todos los agentes epicomensales son habitantes normales del medio acuático
marino. Estos organismos son parte de la flora natural asociada con la cutícula de
los crustáceos marinos y, de esta manera, infestaciones menores causan pequeña o
ninguna pérdida de las funciones o signos de enfermedad. Cuando las condiciones
medioambientales son convenientes, puede desencadenarse la adherencia de organismos
epicomensales, los cuales generarán enfermedad por adherencias en los camarones de
cultivo. El hacinamiento en los estanques y el aporte de nutrientes mediante el alimento
suministrado, contribuyen a las condiciones eutróficas en los cultivos de camarón, lo
que favorece la proliferación de epicomensales.
Estrategias de control
La prevención de enfermedades causadas por organismos epicomensales, requiere
de condiciones ambientales óptimas de cultivo, que permitan el sano crecimiento
de los camarones. Sin embargo, no existen lineamientos específicos disponibles,
concernientes a los niveles de requerimientos nutricionales mínimos, manipulación
precisa del medioambiente y factores de manejo que alteren los niveles de infestación.
Por esta razón, los cambios en las condiciones que predisponen la presencia de estas
enfermedades, deben ser manejados hasta el momento, de manera intuitiva aunque con
fundamentos técnicos.
Los factores básicos que pueden ser alterados, incluyen el aumento en el recambio
de agua, mejoramiento de la circulación del cuerpo de agua, disminución en la densidad
de cultivo o reducción de la biomasa (raleo), uso de alimentos balanceados y fertilizar el
terreno adecuadamente, teniendo en cuenta la proporción P:N para evitar la acumulación
de materia orgánica y proliferación de protozoarios.
151
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Si el control no puede mantenerse a través del manejo del agua y del alimento o del
saneamiento del tanque o estanque, se ha reportado efectividad en el uso de Neomicina,
realizando baños durante la noche a 10 ppm en tanques de larvicultura. Para el caso
de juveniles y adultos, se ha utilizado sulfato de cobre (Cutrine plus: 0.2 - 0.5 ppm Cu,
baños de 4 horas) y Formalina (50 - 100 ppm, baños de 1 hora).
EPICOMENSALES
152
Jorge Cuéllar-Anjel Enfermedades por Parásitos
EPICOMENSALES
153
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
4.5 Metazoarios
Agente causal
Larvas de parásitos metazoarios como nemátodos o tremátodos, las cuales de
manera ocasional infestan tejidos de camarones penaeidos.
Especies afectadas y estadios susceptibles
Los metazoarios pueden ser encontrados en tejidos de camarones subadultos hasta
reproductores, potencialmente en la mayoría de las especies de penaeidos.
Ciclo de vida
En el medio natural, los camarones P. vannamei sirven como hospederos
intermediarios para muchos parásitos metazoarios incluyendo nemátodos y tremátodos.
En el tejido del camarón, se desarrolla un estadio intermediario de la larva como parte del
ciclo de vida del organismo, requiriendo de otro hospedero para completar su ciclo. Este
hospedero final generalmente no está presente en los estanques de cultivo de camarón
y, por lo tanto, no es frecuente observar larvas de metazoarios en camarones de cultivo,
siendo más fácil encontrarlos en tejidos de reproductores silvestres.
Signos clínicos
Aunque no se han reportado signos clínicos ocasionados por estos parásitos, es
posible hallar muchos de ellos en un solo camarón y tal vez afectan la tasa de supervivencia
en poblaciones de camarones de cultivo. De igual manera, podrían disminuir la tasa
reproductiva en reproductores que están severamente afectados por estos parásitos.
Diagnóstico
El método más común y rápido para diagnosticar la presencia de metazoarios en
camarones, es mediante montajes en fresco de tejidos sospechosos, observando (luego de
liberarlos de su cápsula) los organismos muy activos en hepatopáncreas y en contenido
intestinal.
En los parásitos se puede observar un tubo digestivo notorio, mediante movimientos
con el ajuste micrométrico del microscopio y se nota un extremo anterior (curvo y romo)
y uno posterior (agudo).
Mediante histopatología, se pueden observar cortes longitudinales, sagitales y/o
transversales del parásito, enquistados generalmente en tejido perigástrico, aunque
también se observan los organismos o parte de ellos en HP y contenido intestinal.
154
Jorge Cuéllar-Anjel Enfermedades por Parásitos
Estrategias de control
Las medidas sanitarias más indicadas para el manejo de instalaciones en las que
exista un riesgo importante de padecer infestaciones por metazoarios, deben estar
centradas en evitar la introducción de reproductores silvestres, si éstos se encuentran
altamente infestados con larvas de parásitos.
En casos de infestaciones severas en estanques de producción en los cuales los
metazoarios estén causando problemas, además de excluir reproductores silvestres,
debe determinarse cuáles son los hospederos definitivos y eliminarlos del sistema de
producción para cortar el ciclo del parásito.
METAZOARIOS
155
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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157
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
158
Capítulo 5
Introducción
Prácticamente todos los estadíos de vida del camarón son susceptibles a enfermedades
causadas por hongos. Independientemente de la especie de camarón de que se trate,
los estadios larvarios son susceptibles a este tipo de infecciones y por lo tanto, es común
y necesario el uso de tratamientos profilácticos para poder controlarles. Se desconoce
si las especies de hongos que afectan los estadíos larvarios del camarón son todas de
distribución mundial, pero la mycosis larvaria es un problema que se presenta tanto
en el hemisferio oriental como el occidental. Por otro lado, los estadios de vida más
avanzados (postlarva, juvenil, adulto) también son susceptibles a enfermedades causadas
por hongos, siendo Fusarium solani la especie más común. F. solani es un patógeno
oportunista y como tal se establece con mayor facilidad en camarones que se encuentran
ya debilitados por otra(s) enfermedad(es), o que se encuentran estresados por condiciones
ambientales extremas, o por haber sido expuestos a agentes químicos irritantes, o que
han sufrido heridas por trauma físico (por ejemplo, heridas causadas por el rostrum de
otros camarones). Una vez iniciada la infección por F. solani, las heridas causadas en el
camarón facilitan el ataque de otros patógenos oportunistas, tales como Vibrio spp.
5.1 Micosis
Nombre de la enfermedad
Micosis larvaria.
Nombre del agente: Lagenidium spp., Sirolpidium spp.
Agente
La mayoría de los casos de micosis larvaria son debidos a hongos phycomycetos
Lagenidium spp. (L. callinectes es la especie mas común) y Sirolpidium spp. Otras
especies, tales como Phytium spp., Leptolegnia marina y Haliphthoros milfordensis, se
pueden llegar a presentar ocasionalmente causando enfermedades.
si específicamente Lagenidium spp. y Sirolpidium spp. son cosmopolitas o no. Todas las
especies de camarones peneidos son susceptibles a la micosis larvaria.
Tejidos/órganos afectados
Típicamente el micelio invade completamente el cuerpo del camarón reemplazando
todos los órganos y tejidos.
Procedimientos de diagnóstico
Diagnóstico presuntivo. Basado en historial del caso y signos clínicos descritos
anteriormente.
Diagnóstico confirmatorio. Basado en uno o más de los siguientes métodos:
Preparaciones en fresco. Las larvas son examinadas en fresco utilizando un
microscopio de luz con objetivo de por lo menos 20X. Las larvas infectadas muestran
la presencia de un micelio extensivo, sin septas y altamente ramificado invadiendo
el cuerpo y los apéndices de la larva. Las hifas reemplazan prácticamente todos los
tejidos y órganos de las larvas o postlarvas y son de una coloración pálida verde-
amarillenta y contienen numerosas inclusiones pequeñas que refractan la luz. Un
tipo de hifa especializada forma tubos de descarga, los cuales pueden o no presentar
una vesícula terminal en su parte distal y se les puede observar empujando hacia
afuera a través de la cutícula. En el caso de Sirolpidium spp., las zoosporas mótiles
pueden ser observadas al ser liberadas a través de los tubos de descarga (los cuales
son mas cortos que los de Lagenidium spp. y no protruyen a través de la cutícula). En
el caso de Lagenidium spp., las zoosporas se desarrollan dentro de la vesícula apical
prominente en el ápice de un túbulo de descarga relativamente largo.
Análisis histológico. El diagnóstico histológico se basa en la demostración de las hifas
y los tubos de descarga que protruyen conspicuamente (en el caso de Lagenidium
spp.) o no (en el caso de Sirolpidium spp.) a través de la cutícula.
162
Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner Enfermedades causadas por hongos.
Información adicional
Debido a la implementación de medidas profilácticas a las cuales son sometidos
tanto los huevecillos como los nauplios, la frecuencia de casos de micosis larvaria ha
tenido una tendencia a disminuir en la camaronicultura moderna. Probablemente, entre
estas medidas, las más efectivas han sido la colecta de nauplios basada en la respuesta
fototáctica positiva y el uso de tratamientos con treflan durante las primeras fases del
cultivo larvario.
MICOSIS LARVARIA
163
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
5.2 Fusariosis
Nombre de la enfermedad
Fusariosis, enfermedad de las branquias negras (en Penaeus japonicus).
Agente
Hongo imperfecto Fusarium solani y posiblemente otras especies del mismo género,
incluyendo F. moniliforme. Los hongos phycomycetos Atkinsiella dubia y Haliphthoros
spp. raramente causan enfermedades en camarones peneidos, pero se les ha encontrado
asociados a lesiones en las branquias o en la cutícula, las cuales son muy similares a las
causadas por Fusarium.
Tejidos/órganos afectados
Cualquier parte externa del cuerpo, incluyendo branquias y cámara branquial.
Fusarium tiene tendencia a infectar la base coxal de los pereiópodos para posteriormente
invadir el tejido branquial adyacente causando melanización intensa. De la misma
manera, tiene tendencia a invadir las porciones basales de la cabeza y los apéndices de
la cola, desde donde se dispersa a zonas adyacentes.
164
Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner Enfermedades causadas por hongos.
Procedimientos de diagnóstico
Diagnóstico presuntivo. Basado en historial del caso y signos clínicos descritos
anteriormente.
Diagnóstico confirmatorio. Basado en uno o más de los siguientes métodos:
==> Preparaciones en fresco. Examen en fresco de raspados de lesiones melanizadas.
El análisis microscópico a magnificaciones de 100X o 200X revela la presencia de
las hifas del hongo. Estas preparaciones son también útiles en la demostración de
las macroconidias, las cuales tienen una forma de canoa. La demostración de las
macroconidias proporciona un diagnóstico definitivo.
==> Análisis histológico. El análisis con tinciones de H&E revela la presencia de lesiones
granulomatosas bastante prominentes, acompañadas de una multitud de nódulos
hemocíticos con centros melanizados. Tinciones especiales (por ejemplo, PAS y
tinciones de plata basadas en la técnica de PAS) demuestran claramente la presencia
de las hifas y de las macroconidias, las cuales se tiñen de color rosa o rojo (PAS) o
negro (tinciones de plata basadas en la técnica de PAS).
Información adicional
Fusarium solani es un patógeno oportunista que ataca camarones debilitados por
otras enfermedades, por exposición a agentes químicos irritantes o a ciertos metales
pesados, o por amontonamiento a densidades altas.
El principal mecanismo para el establecimiento de la infección es la presencia de
lesiones (pequeñas o grandes) en la cutícula. La infección puede comenzar en varias
partes del cuerpo al mismo tiempo y pueden llegar a cubrir hasta un 10% de la superficie
corporal.
Una vez hecha su aparición, la enfermedad progresa con un porcentaje de
recuperación de solo un 30% aproximadamente. Las lesiones producidas por Fusarium
también sirven como puerta de entrada para otros patógenos oportunistas, tales como
Vibrio spp.
165
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
166
Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner Enfermedades causadas por hongos.
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168
Capítulo 6
Introducción
Los crustáceos pertenecen a un antiguo y exitoso grupo zoológico, constituido por
más de 40 mil especies, muchas de las cuales son muy apreciadas para consumo humano,
como son los camarones, langostas, langostas de agua dulce, cangrejos y jaibas.
El cultivo de crustáceos, principalmente de camarones (camaronicultura), sobresale
en este contexto como una importante alternativa para la producción rápida y en gran
escala de alimento para consumo humano, contribuyendo además con la protección de
las poblaciones naturales de una excesiva extracción. Actualmente, cerca del 30% de los
camarones consumidos en el mundo son provenientes del cultivo y las especies marinas
más cultivadas son los penaeidos Litopenaeus vannamei (40,66%), Penaeus monodon
(37,41%) y Fenneropenaeus chinensis (10,97%) (FAO, 2007). La camaronicultura es
responsable hoy día de millones de empleos emergentes en países tropicales, siendo los
principales productores mundiales China y Tailandia en Asia y Ecuador, México y Brasil
en América Latina.
El principal factor limitante para el éxito de la camaronicultura mundial, consiste
actualmente en el control de las infecciones, principalmente las de origen viral. Las
altas densidades poblacionales usualmente utilizadas en los cultivos, propician la rápida
propagación de los agentes infecciosos, resultando generalmente en mortalidades masivas
y ocasionando, como consecuencia, perjuicios económicos incalculables. Actualmente,
la profilaxis y el control de las enfermedades en los cultivos se circunscriben básicamente
a la práctica adecuada del manejo y la disminución de las condiciones de estrés, una
vez que los factores que determinan el estado de salud de los camarones, todavía son
muy poco conocidos. En este contexto, el estudio del sistema inmunológico de los
crustáceos sobresale como una estrategia reciente y promisoria, pues permite conocer
las bases de la susceptibilidad y de la resistencia de estos animales a los microorganismos
patógenos y parásitos, además de proporcionar aportes valiosos para el establecimiento
de parámetros de salud e inmuno marcadores para la selección genética de animales
más resistentes a las infecciones.
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
172
Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
173
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Por otra parte, los hemocitos granulares (HGPs y HGGs) son descritos como células
de citoplasma más abundante y ricos en gránulos de diversos tamaños y contenidos
(Figuras 6.2B, C, E, F). Algunos autores señalan los HGPs como formas intermedias, que
luego de su maduración se transforman en HGGs (Bauchau, 1981; Hose et al., 1990;
Söderhäll y Cerenius, 1992; Gargioni y Barracco, 1998). En cuanto a la función de los
hemocitos granulares, esta parece estar relacionada principalmente con la fagocitosis de
microorganismos, en la formación de cápsulas y nódulos y también con la producción
de moléculas tóxicas y microbicidas (Hose et al., 1990; Gargioni y Barracco, 1998; van
de Braak et al., 2002b).
174
Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
175
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
que les confiere una elevada capacidad de reaccionar con las estructuras y compuestos
próximos, tales como las membranas celulares, proteínas y ácidos nucleicos (ADN).
Siendo así, funcionan como agentes microbicidas potentes, destruyendo o inhibiendo el
crecimiento de los microorganismos invasores (Anderson, 1996; Bogdan et al., 2000).
La producción de esos radicales está ligada a la activación de un complejo enzimático
denominado NADPH oxidasa, localizado en la membrana celular y en la superficie
de los gránulos lisosomales (Figura 6.4). Este complejo es activado por componentes
microbianos, tales como los lipopolisacáridos (LPS), lipoproteínas de bacterias y
β-glucanos de hongos (Bogdan et al., 2000). La activación de la NADPH resulta en
la reducción del oxígeno molecular al anión superóxido (O2-), que puede disputarse,
espontáneamente o a través de la enzima intracelular superóxido dismutasa (SOD), en
peróxido de hidrogeno (H2O2). El H2O2 es un compuesto igualmente tóxico y, si no es
destruido por la catalasa del peroxisoma, puede difundirse y llegar al medio extracelular
(Warner, 1994). El O2- puede también ser convertido en otros componentes citotóxicos,
como en el radical hidroxilo (-OH) y en aniones hidroxilo (OH-) por la reacción de
Haber-Weiss o, luego de la dismutación en H2O2, en ácido hipocloroso (HOCl), oxígeno
singlet (1O2) y en cloraminas por la acción de la mieloperoxidasa (MOP) (Bogdan et al.,
2000) (Figura 6.4).
Además de las ROIs, ocurre también la producción intracelular de especies reactivas
de nitrógeno (RNIs), como el óxido nítrico (NO) y el peroxinitrito (ONOO-), compuestos
altamente citotóxicos y microbicidas (Kröncke et al., 1997). El peroxinitrito es resultante
de la reacción entre el NO con el anión superóxido (Anderson, 1996; Murphy et al.,
1998) (Figura 6.4).
Es importante resaltar que la producción de estas moléculas altamente tóxicas,
importantes en la destrucción de los patógenos invasores, puede también provocar graves
daños a los tejidos del hospedero. Para evitar esta autoagresión, el hospedero cuenta
básicamente con tres mecanismos de protección o defensa antioxidantes. Los primeros
dos mecanismos son endógenos e incluyen la presencia de enzimas intracelulares,
como las enzimas antioxidantes SOD, catalasa y la glutationa peroxidasa, capaces
de degradar/neutralizar a las ROIs y, también las enzimas de reparación que pueden
restablecer los daños provocados por las ROIs en el DNA, membranas y proteínas del
hospedero (Warner, 1994). El tercer mecanismo comprende la acción de compuestos
antioxidantes de origen exógeno, como el ácido ascórbico (vitamina C), la glutationa
y el α-tocoferol (vitamina E), que pueden interactuar directamente con los radicales
libres neutralizándolos o interactuando directamente con los radicales libres (Warner,
1994). Es conveniente resaltar que los antioxidantes de origen exógeno, asumen especial
importancia en los cultivos de camarones, una vez que pueden ser adicionados a las
dietas en dosis apropiadas.
La producción in vitro de ROIs por los hemocitos inmuno estimulados por
componentes microbianos, ya fue descrita en el cangrejo Carcinus maenas (Bell y
Smith, 1993), en Macrobrachium rosenbergii (Sierra et al., 2005) y en varias especies de
penaeidos, como en P. monodon (Song e Hsieh, 1994; Sung et al., 1996), L. vannamei
(Muñoz et al., 2000) y en las especies nativas brasileñas, F. paulensis y L. schmitti (Guertler,
2007).
La cuantificación in vitro de la producción del anión superóxido por los fagocitos
es usualmente realizada a través del método de reducción del NBT (del inglés, nitro-
blue-tetrazolium), o por la técnica de la quimioluminiscencia. Esta evaluación permite
determinar el grado de estrés oxidativo de los animales, como consecuencia de diferentes
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
Por otro lado, la producción de RNIs tiene origen en la enzima óxido nítrico sintasa
(del inglés, NOS), presente en el citoplasma de varios tejidos animales, incluyendo las
células del sistema inmunológico. En estas últimas, la NOS es inducida por situaciones
de estrés (iNOS, del inglés inducible nitric oxide synthase) y produce NO y en seguida
el peroxinitrito (ONOO-), ambos compuestos altamente tóxicos (Figura 6.4). En los otros
tejidos, la NOS es expresada de forma constitutiva.
En los vertebrados, están bien documentadas las actividades antivirales,
antibacterianas y antiparasitarias de las RNIs, que igual que las ROIs causan daños al
DNA, a varias enzimas y a las membranas de los patógenos, directa o indirectamente
(ver revisión de Kröncke et al., 1997; Chakravortty y Hensel, 2003). Lamentablemente,
existen todavía muy pocas referencias sobre la participación del NO y sus derivados en
las respuestas de defensa de los crustáceos. Entre éstos, se destacan los trabajos de Jiang
et al. (2006) que mostraron una actividad de la NOS en los hemocitos de los camarones
F. chinensis y M. japonicus y el de Yeh et al. (2006), en el cangrejo rojo Procambarus
clarkii. La actividad de la NOS en estos animales es particularmente estimulada por
LPS bacterianos, sugiriendo que en los crustáceos, las RNIs deben actuar como agentes
microbicidas.
Es importante resaltar que la utilización de la producción de RNIs como inmuno
parámetros para evaluar el estado inmunológico de los camarones de cultivo, es una
herramienta muy poco utilizada, a pesar de su potencial promisorio. Se espera que en
un futuro próximo, se de un mayor progreso en las técnicas de detección de RNIs en
los camarones, para permitir su utilización como un parámetro inmunológico y/o como
indicador de inmuno estimulación.
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Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
nd = no determinada.
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
al., 2007; Rosa et al., 2007) y también en cangrejos, langostas y otros camarones (Relf
et al., 1999; Hauton et al., 2006; Christie et al., 2007; Jiravanichpaisal et al., 2007b).
En el crustáceo Pacifastacus leniusculus y en los penaeidos L. setiferus y L. vannamei,
las crustinas representan cerca de 3, 4 y 9% de los AMPs transcritos en sus hemocitos,
respectivamente (Gross et al. 2001; Jiravanichpaisal et al., 2007b). En contraposición, en
el camarón P. monodon estos AMPs pueden alcanzar cerca de 26% de los expresados
(Supungul et al., 2004). La expresión de crustinas, así como de las peneidinas, se inicia
en las fases tempranas del desarrollo de los camarones (nauplios IV) (Jiravanichpaisal et
al., 2007a).
Los factores anti-lipopolisacáridos (ALFs: del inglés, anti-lipopolysaccharide factors)
son moléculas de 10 a 14 kDa, inicialmente aisladas y caracterizadas en los hemocitos
granulares del limúlido Limulus polyphemus (Tanaka et al., 1982). En los camarones
penaeidos, los ALFs fueron primeramente detectados en las especies L. setiferus (Gross
et al., 2001) y P. monodon (Supungul et al., 2002) y mostraron contener dos residuos
conservados de cisteína comprometidos en la formación de una estructura terciaria en
forma de grapa (ß-hairpin) como en los ALFs de limúlidos. Esa estructura concentra una
región altamente hidrofóbica con un dominio de unión a LPS. Los ALFs incluyen varias
isoformas y son moléculas constitutivamente expresadas en los hemocitos (cerca de 26%
de los transcritos de AMPs de P. monodon) con actividad antimicrobiana potente y de
amplio espectro, siendo activas contra bacterias Gram-positivas y negativas y hongos
filamentosos, con la propiedad de unirse y neutralizar LPS (Somboonwiwat et al., 2005;
Nagoshi et al., 2006). Todavía no es conocido cuando se da el inicio de la producción de
los ALFs durante el desarrollo ontogenético de los camarones. Secuencias codificadoras
para esos péptidos han sido ampliamente detectadas en los hemocitos de diferentes
especies de penaeidos y de otros crustáceos (Gross et al., 2001; Supungul et al., 2004;
Liu et al., 2005; Liu et al., 2006a; Nagoshi et al., 2006; Towle y Smith, 2006; Imjongjirak
et al., 2007).
Además de estas tres principales familias de AMPs, otros grupos de moléculas
antimicrobianas fueron recientemente caracterizados en crustáceos, la calinectina de
Callinectes sapidus (Khoo et al., 1999), las astacidinas de P. leniusculus (Lee et al., 2003;
Jiravanichpaisal et al., 2007b), la armadilidina de Armadillidium vulgare (Herbinière et
al., 2005) y la cigonadina de Scylla serrata (Wang et al., 2007).
Otras importantes moléculas con potente actividad antimicrobiana son también
encontradas en los hemocitos de crustáceos. Entre estas se destaca la lisozima, enzima
mencionada anteriormente, que representa aproximadamente 4% de las proteínas totales
de los hemocitos del camarón (Sotelo-Mundo et al., 2003). Las lisozimas poseen una
actividad lítica potente contra un amplio espectro de bacterias Gram-positivas y negativas,
incluyendo especies de vibrios marinos, debido al clivaje de los peptidoglucanos de las
paredes bacterianas (Hikima et al., 2003; De La Vega et al., 2006).
En adición a las familias de AMPs constitutivamente producidas en los hemocitos,
otros grupos de moléculas antimicrobianas, como los péptidos originados a partir de la
hidrólisis de proteínas precursoras, también fueron encontrados en camarones. Entre
éstos se destaca el péptido derivado de la porción C-terminal de la proteína plasmática
hemocianina. Este fragmento, de características aniónicas, presenta actividad restringida
a los hongos filamentosos y puede funcionar como molécula inmunoseñalizadora
(Destoumieux-Garzón et al., 2001). Péptidos antifúngicos originados a partir de la
hidrólisis de la hemocianina fueron también referenciados en la langosta de agua dulce P.
leniusculus (Lee et al., 2003). En los camarones penaeidos, fue demostrado que péptidos
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Las respuestas de defensa en los crustáceos son desencadenadas a partir del contacto
con el patógeno, a través de sus componentes, o hasta con antígenos ambientales.
Esas reacciones son iniciadas por el reconocimiento del agente invasor por proteínas
de reconocimiento patrón, presentes en el hospedero. El término “proteínas de
reconocimiento patrón” o PRPs (del inglés, pattern-recognition proteins), hace alusión
al hecho de que el sistema inmunológico reconoce primariamente patrones moleculares
presentes específicamente en los microorganismos o PAMPs (del inglés, pathogen-
associated molecular patterns) (Medzhitov y Janeway, 1997; Janeway y Medzhitov,
2002). Las PRPs son moléculas producidas por el hospedero, secretadas hacia el plasma
o localizadas en la superficie de las células, principalmente las del sistema inmune, que
reconocen y se unen a los PAMPs.
En los invertebrados, los principales PAMPs reconocidos por PRPs son los
lipopolisacáridos (LPS) de la superficie de las bacterias Gram-negativas y los
peptidoglucanos (PGs) de la pared de las Gram-positivas, los β-1,3-glucanos de la pared
de hongos y el dsRNA (del inglés, double-stranded RNA) producido durante la replicación
de varios virus (Lee y Söderhäll, 2002). Estos PAMPs, característicos de microorganismos
y ausentes en el hospedero, son esenciales para la supervivencia de los microorganismos,
lo que significa que estos blancos de la inmunidad innata no pueden ser evolutivamente
descartados por los microbios, para evadirse del reconocimiento por el hospedero.
Una vez dentro del hospedero, los patrones moleculares del patógeno son
reconocidos y unidos a sus respectivas PRPs y en el caso de los crustáceos, inician la
activación principalmente de los hemocitos, desencadenando una respuesta inmune
celular o la producción/liberación de una serie de moléculas inmuno efectoras/
inmuno reguladoras por degranulación o, aún más, por modular la expresión de genes
inmunológicos específicos (Figura 5).
Varias PRPs fueron identificadas y caracterizadas en la hemolinfa de los crustáceos,
tales como la proteína que se une a los LPS o LBP (del inglés, LPS-binding protein), las
proteínas que se unen a los β-1,3-glucanos o βGBP y GBP (del inglés, β-glucan binding
proteins), la proteína que se une a ambos LPS y β-1,3-glucanos o LGBP, la proteína
“mas-like” (del inglés, masquerade-like protein) que reconocen varios microorganismos
y varias clases de lectinas (Lee y Söderhäll, 2002). Las diferentes PRPs identificadas en
los crustáceos hasta el momento se presentan en la Tabla 2.
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Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
GBP (β-glucanos)
P. monodon 2002 Purificada/clonada 31 kDa/1314pb Sritunyalucksana et al.
Lectinas (Azúcares)
Varias especies Purificadas/clonadas varias Marques y Barracco (2000)
LBP (LPS)
F. californiensis 1993 Purificada 175kDa Lee et al.
P. leniusculus 1993 Purificada 65-80kDa Kopacék et al.
L. schmitti 2002 Purificada 31+34kDa Cominetti et al.
P. monodon 2006 Purificada/clonada 18kDa/709pb Luo et al.
P. monodon
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
(Yépiz-Plascencia et al., 1998). Así, se considera actualmente, que las βGBP de los
crustáceos tienen una doble función: transportar lípidos como una HDL y participar en
el sistema inmune como una PRP.
La interacción de la βGBP con los β-1,3-glucanos lleva a la formación de un complejo
que se une a (los) receptor(es) de membrana en los hemocitos (Duvic y Söderhäll, 1990;
1992). Luego de esta unión, ocurre la activación celular, que resulta en el estiramiento y
degranulación parcial de los hemocitos granulares (Barracco et al., 1991). La exocitosis
del material granular promueve la liberación de las moléculas del sistema proPO, entre
otras moléculas, ocurriendo una posterior activación de este sistema por los mismos
β-1,3-glucanos (Cerenius et al., 1994; Vargas-Albores et al., 1996; Perazzolo y Barracco,
1997). Fue también demostrado que la βGBP puede actuar como una opsonina,
aumentando la fagocitosis in vitro de levaduras por los hemocitos de los cangrejos señal
(Cerenius et al., 1994).
El complejo βGBP-β-1,3-glucanos del cangrejo señal P. leniusculus se puede unir en
la superficie de los hemocitos granulares a través del motivo RGD, lo que sugiere que esta
unión sea mediada por una proteína semejante a la integrina, presente en la membrana
del hemocito, como se mencionó anteriormente. Efectivamente, una proteína de la
familia de las β-integrinas fue aislada de los hemocitos del cangrejo y es una candidata a
receptor de la βGBP (Holmblad et al., 1997).
Entre tanto, un receptor de la membrana para βGBP fue aislado de los hemocitos del
cangrejo señal por Duvic y Söderhäll (1992), siendo caracterizado como un heterodímero
proteico de 230 y 90 kDa. La interacción con el hemocito ocurre solamente si la βGBP
estuviera integrada a los β-1,3-glucanos. Curiosamente, este receptor es el mismo
que se une a la proteína de adhesión celular peroxinectina (tratada adelante), que es
una superóxido dismutasa (SOD) que contiene CuZn (Johansson et al., 1999a), no
perteneciendo por lo tanto a la familia de las integrinas.
Otra proteína que se une a los β-glucanos, es la GBP, recientemente clonada de los
hemocitos del camarón P. monodon (Sritunyalucksana et al., 2002). Esta proteína (39,5
kDa) es constitutivamente expresada en los hemocitos y se une a los β-1,3-glucanos
presentes en curdlan y zymosan, pero no se une a los LPS bacterianos, demostrando su
especificidad en el reconocimiento de los hongos.
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Aglutininas y lectinas
Las lectinas son proteínas sin actividad catalítica, con capacidad de unirse
específicamente a los carbohidratos de la superficie de diferentes células, incluyendo
microorganismos, causando su aglutinación. Esa propiedad deriva del hecho de que estas
moléculas son por lo menos bivalentes, presentando dos o más sitios de unión. Debido
a esta característica, inicialmente se consideró que las lectinas de los invertebrados eran
análogas funcionales de las inmunoglobulinas de los vertebrados, pero hoy se sabe que
son estructural y funcionalmente distintas (Marques y Barracco, 2000). Debido al hecho
que las lectinas, tanto de vertebrados como de invertebrados, son capaces de reconocer
y unirse a los azucares específicos de la superficie de patógenos, estas moléculas son
también definidas como PRPs.
Además de actuar como PRPs en los invertebrados, las lectinas están también
relacionadas con varios procesos biológicos, debido a su interacción con carbohidratos,
como la adhesión celular, opsonización y formación de nódulos (Lee y Söderhäll, 2002).
Algunas lectinas de invertebrados parecen todavía estar implicadas en la activación del
sistema proPO de insectos (Yu et al., 1999) y tener actividad antibacteriana en tunicados
y limúlidos (Suzuki et al., 1990; Kawabata e Iwanaga, 1999).
La mayoría de las lectinas relacionadas con el sistema inmune pertenece a la
superfamilia de las lectinas del tipo-C, cuya actividad biológica es Ca2+-dependiente
y presentan dos dominios para el reconocimiento de carbohidratos (del inglés, CRD)
(Drickamer y Taylor, 1993).
Las lectinas de crustáceos son mucho menos conocidas e investigadas que las de
otros artrópodos, como insectos y limúlidos. En estos dos últimos grupos zoológicos, ya
se describió la ocurrencia de lectinas múltiples en la hemolinfa, específicamente para
diferentes tipos de microorganismos. Algunas de esas lectinas presentan un amplio
espectro de reconocimiento, se unen tanto a bacterias Gram-positivas como Gram-
negativas, mientras que otras son altamente específicas, reconociendo configuraciones
químicas específicas de azúcares de la superficie de un determinado microorganismo
(Marques y Barracco, 2000).
En los crustáceos, las lectinas son proteínas plasmáticas constitutivas, sintetizadas
generalmente por el hepatopáncreas (Gross et al., 2001; Luo et al., 2006) y que
reconocen principalmente azúcares N-acetilados, en especial derivados del ácido siálico
y sialoglicoconjugados (Marques y Barracco, 2000).
La ocurrencia de lectinas múltiples fue descrita inicialmente en la hemolinfa de la
langosta Homarus americanus, hace más de 30 años (Hall y Rowlands, 1974) y desde
entonces, otras varias lectinas han sido identificadas y aisladas en diferentes crustáceos.
Sin embargo, la mayoría de esos trabajos están restrictos a caracterizar una única lectina
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Sistema de Coagulación
La coagulación de la hemolinfa es un mecanismo inmunológico esencial para la
supervivencia de animales invertebrados con un sistema circulatorio abierto o semi-
abierto como los crustáceos. Ella previene tanto la pérdida de la hemolinfa, como la
diseminación de los patógenos por la cavidad corporal del animal.
En los invertebrados son reconocidos dos diferentes mecanismos de coagulación
(Theopold et al., 2004; Jiravanichpaisal et al., 2006). El primero es una cascada
proteolítica activada por componentes microbianos, como LPS y β-1,3-glucanos,
ocurriendo en limulídeos, como en T. tridentatus (Kawabata et al., 1996) y el segundo
es una reacción de coagulación dependiente de la enzima transglutaminasa (TGasa),
ocurriendo en insectos y crustáceos.
En el caso de la coagulación de los crustáceos, un componente clave en el proceso
de gelificación del plasma es la proteína de coagulación (CP), que forma coágulos
estables por medio de una reacción de unión cruzada entre sus moléculas, mediadas
por la TGasa (Figura 6.6) (Martin et al., 1991; Muta e Iwanaga, 1996). Las TGasas son
enzimas Ca2+-dependientes, usualmente compartimentalizadas dentro de los hemocitos
de los crustáceos (Lorand et al., 1979; Greenberg et al., 1991), capaces de formar uniones
covalentes γ-glutamil-ε-lisina (Figura 6.8) entre ciertas proteínas, como la proteína de
coagulación presente en el plasma (Lorand y Conrad, 1984).
En crustáceos, la CP fue aislada y caracterizada en varias especies, entre ellas la
langosta Panulirus interruptus (Fuller y Doolittle, 1971; Doolittle y Riley, 1990), en los
cangrejos P. leniusculus (Kopácek et al., 1993b) e Ibacus ciliatus (Komatsu y Ando, 1998)
y en los camarones P. monodon y M. japonicus (Yeh et al., 1998), L. vannamei (Montaño-
Pérez, et al., 1999) y F. paulensis (Perazzolo et al., 2005).
Las CPs de los crustáceos son lipoproteínas homodiméricas (200 kDa) (Sritunyalucksana
y Söderhäll, 2000). Secuencias aminoacídicas completas de la CP fueron determinadas
en P. leniusculus (Hall et al., 1999), P. monodon (Yeh et al., 1999) y M. japonicus (Cheng
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Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
Defensas antivirales
Como se mencionó anteriormente, las enfermedades virales constituyen actualmente,
la más seria amenaza para la industria de la camaronicultura a nivel mundial y el principal
riesgo para la sostenibilidad de la actividad.
La principal enfermedad viral que afectó la industria del camarón, ocurrió en
las Américas a inicios de los años 80, causada por el virus de la necrosis infecciosa
hipodérmica y hematopoyética (del inglés IHHNV), que resultó en mortalidades masivas.
Otros brotes graves de enfermedades virales siguieron al IHHNV, destacándose el virus
de la cabeza amarilla (del inglés, YHV) en Asia, el virus del síndrome del Taura (del inglés,
TSV) en las Américas y más recientemente el virus del síndrome de la mancha blanca (del
inglés, WSSV) que alcanzó proporciones catastróficas principalmente en Asia (a inicio
de los años 90) y enseguida en las Américas (al final de los años 90) (Flegel, 2007). El
WSSV parece ser uno de los virus más desastrosos de la historia de la camaronicultura,
causando un índice altísimo de mortalidad que ocurre hasta el presente y que ha llevado
a pérdidas económicas incalculables (Flegel, 2007). La contribución más urgente y
esperada en la industria de la camaronicultura es indiscutiblemente el control de las
infecciones virales.
En los vertebrados, las infecciones virales inducen a varias respuestas inmunológicas,
que en última instancia buscan controlar la duplicación y propagación de los virus y los
daños celulares causados por ellos. Entre estas respuestas se destacan, (1) la destrucción
de las células infectadas por las células NKs (del inglés, natural killer) y linfocitos T
citotóxicos (CTLs), (2) la producción de anticuerpos neutralizantes para virus, (3) la
inducción de proteínas del sistema interferón (IFN) que activan la trascripción de diversos
genes que protegen las células de los daños causados por los virus, generando un estado
antiviral y, (4) el silenciamiento de genes virales por la vía del RNA de interferencia
(RNAi).
Los crustáceos tienen apenas un sistema inmune innato, como ya se mencionó
anteriormente y por tanto, están desprovistos de una línea celular linfocítica. Siendo así,
sólo pueden contar eventualmente con los dos últimos mecanismos antivirales descritos,
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
una vez que los dos primeros son relacionados con los linfocitos. La ocurrencia de estos
dos últimos mecanismos en crustáceos se presenta a continuación.
Sistema interferón
Vertebrados
En los vertebrados, los interferones (IFNs), son conocidos principalmente por su
capacidad de interferir en la replicación viral y en inducir un estado antiviral en el
hospedero. En la realidad, los IFNs son más que simples proteínas antivirales y ejercen
un amplio espectro de otras funciones biológicas, siendo la mayoría relacionada con el
sistema inmune. En lo referente a la defensa antiviral, apenas los interferones tipo I, IFN-α
e IFN-β, son de real importancia (Samuel, 2001). En mamíferos las infecciones virales
inducen a la producción de IFN-α/β, que a su vez estimulan la expresión de una serie de
genes participantes en las respuestas antivirales. En las infecciones virales, las células
del hospedero reconocen PAMPs específicos a través de receptores celulares específicos,
principalmente las proteínas de la familia Toll o TLRs, ya comentadas anteriormente,
que tienen un papel crucial en la inmunidad innata, iniciando la primera línea de
defensa contra los patógenos (Uematsu y Akira, 2006; 2007). Los TLRs de mamíferos son
homólogos a la proteína Toll inicialmente identificada en Drosophila y que induce una
respuesta inmunológica contra los hongos (Lemaitre et al., 1996). Entre los diferentes
TLRs de mamíferos, algunos reconocen particularmente PAMPs de virus, siendo TLR3
uno de los mas importantes, por reconocer el dsRNA, producido durante la replicación
de muchos virus de RNA y DNA.
Recientemente, fue descrito que las enzimas citoplasmáticas del tipo RNA-
helicasa RIG-I (del inglés, retinoic acid inducible gene I) y Mda5 (del inglés, melanoma
differentiation-associated gene 5) también son capaces de reconocer dsRNA (Fujita et al.,
2007; Andrejeva et al., 2004).
Luego de la internalización de los virus en la célula, sus ácidos nucleicos son
liberados por el sistema endósomo/fagolisósomo y reconocido por los diferentes
TLRs. Los TLRs activan una compleja cascada de señalización intracelular, induciendo
la transcripción de una variedad de genes, incluyendo los IFN-α/β (Uematsu y Akira,
2006; 2007). Por su parte, los IFN-α/β, desencadenan la activación de múltiples vías
intracelulares que interfieren con muchas de las etapas del ciclo de vida de los virus,
limitando la amplificación y el extendimiento de los virus, atenuando así el proceso
infeccioso (Guidotti y Chisari, 2001). Los IFNs secretados participan en el ciclo de
activación autocrina/paracrina, mediante la activación de la señalización intracelular
JAK/STAT (del inglés, kinase/signal transducer and activator of transcription), que resulta
en la inducción de múltiples genes que codifican diversas proteínas implicadas en las
respuestas antivirales. Entre ellas se destacan la PKR (del inglés, serine/threonin protein
kinase), la OAS (del inglés, 2´-5´-oligoadenylate synthetase), la RNase L, la ADAR (del
inglés, RNA-specific adenosine desaminase) y la Mx (del inglés, myxovirus-resistance
protein GTPase). Estas proteínas afectan principalmente la multiplicación de los virus
en la célula infectada, generando un estado antiviral inespecífico en las células del
hospedero (Samuel, 2001).
Camarones
Hasta muy recientemente, las proteínas del sistema IFN eran consideradas moléculas
presentes desde los cordados inferiores hasta los mamíferos (Krause y Pestka, 2005),
no encontrándose en los invertebrados, principalmente en el ramo de los protostomios
196
Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
que incluye los crustáceos. Además, en los genomas completos disponibles de varios
invertebrados, como el del nemátodo Caenorhabditis elegans (TCSC, 1998), de la mosca
de la fruta D. melanogaster (Adams et al., 2000), del mosquito de la malaria A. gambiae
(Holt et al., 2002) y de la abeja A. mellifera (THGSC, 2006), no fueron encontradas
secuencias génicas homólogas para IFNs. Sin embargo, recientemente la expresión
de una proteína homologa al IFN-α de los mamíferos fue reportada por primera vez
en un invertebrado, en los hemocitos del penaeido M. japonicus (He et al., 2005).
Interesantemente, esta proteína denominada IntlP (del inglés, interferon-like protein;
GenBank AY695938) sólo se expresa en camarones supervivientes a la infección por
WSSV y no en camarones sanos.
La determinación de este producto génico en 2005 provocó gran optimismo, una
vez que implicaba en la presencia de un sistema antiviral en crustáceos basado en IFN,
como en los vertebrados. Los autores produjeron IntlP en un sistema recombinante y
mostraron que esta proteína tenía de hecho una actividad antiviral, una vez que confería
protección celular contra los efectos citopáticos causados por el virus del pez SGIV (del
ingles, Singapore grouper iridovirus).
Infelizmente, los resultados obtenidos por He et al. (2005) parecen no corresponder
a la realidad una vez que en los análisis moleculares recientes realizados por nuestro
grupo fue demostrado que el IntlP corresponde de hecho a una cadena β de la porción
F0 de la ATP sintetasa mitocondrial y no a una proteína del sistema interferon. Se trata
por consiguiente de una proteína expresada constitutivamente, independiente o no de
la presencia de infecciones virales y que fue detectada en varios penaeidos (Barracco y
Rosa, in press).
Se debe resaltar, que a pesar de la aparente ausencia de moléculas homólogas a los
IFNs de mamíferos en penaeidos, la inducción de un estado antiviral inespecífico fue
inequívocamente mostrado en los camarones L. vannamei, un poco antes (Robalino et
al., 2004) del reporte de la IntlP por He et al. (2005). Robalino et al. (2004) demostraron
que la inyección de secuencias inespecíficas de dsRNA en camarones, causaba un
aumento significativo de su resistencia a la infección por dos virus no relacionados, el
TSV y el WSSV. Estos resultados mostraron, por primera vez en crustáceos, la inducción
de un estado antiviral inespecífico, independiente de la secuencia de dsRNA inyectada
y por tanto muy semejante al estado antiviral producido por los IFNs de mamíferos.
Poco después, Westenberg et al. (2005) demostraron que también pequeños RNAs de
doble cadena de interferencia (siRNA: del inglés, small interference RNA) eran capaces
de inducir una protección antiviral. Estos resultados, aliados a la existencia de receptores
Toll en los hemocitos de camarones L. vannamei (Yang et al., 2007) y P. monodon (Arts
et al., 2007) llevaron a la suposición natural de la existencia de citocinas semejantes
a IFNs en camarones. En contraposición a esta idea, está el hecho de la ausencia de
secuencias génicas con homologías para IFNs en los genomas completos de insectos,
filogenéticamente relacionados con los crustáceos. Ante estos resultados, es razonable
suponer que citocinas análogas y no homólogas a los IFNS de vertebrados, deben existir
en camarones y serían las responsables por la producción del estado antiviral inespecífico
relatado por los autores citados.
La identificación de estas citocinas todavía no descritas en crustáceos, llevará
ciertamente a una mayor comprensión de los mecanismos antivirales de los camarones
y puede abrir nuevas perspectivas para la estimulación de un estado antiviral general
en camarones de cultivo, buscando un mayor control de las apariciones de infecciones
virales.
197
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
198
Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
Figura 6.9: Apoptosis celular. Representación de la apoptosis de una célula, con la formación de cuerpos apoptóticos endocitados
por una célula saludable (A). Núcleos apoptóticos (B) y no-apoptóticos (C) de hemocitos de L. vannamei infectados con el virus de
la mionecrosis infecciosa (IMNV), teñidos con bis-benzimida.
199
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
progenie del virus, es empacado en los cuerpos apoptóticos. Los virus son así indetectables
para el sistema inmune, estando protegidos dentro de los cuerpos apoptóticos. Evitan
de esta manera las respuestas inflamatorias y su inactivación por anticuerpos y proteasas
del hospedero. Estos cuerpos apoptóticos, alojando innumerables virus replicados, son
enseguida rápidamente fagocitados por las células vecinas e irónicamente garantizan la
propagación y la infección viral. O sea, la inducción de una apoptosis tardía parece ser
una óptima estrategia de propagación para el virus que evolutivamente no desarrollaron
todavía defensas anti-apoptóticas u otros mecanismos de evasión inmunológica (Roulston
et al., 1999).
En camarones, la inducción de la apoptosis en infecciones virales viene siendo
activamente descrita en estos últimos años. En P. monodon infectados por WSSV
(Sahtout et al., 2001; Wongprasert et al., 2003) o por YHV (Khanobdee et al., 2002)
ocurre un aumento progresivo de la apoptosis hasta niveles muy altos, comprometiendo
así varios tejidos y pareciendo ser la principal causa de la muerte de los camarones.
También en M. japonicus infectados por WSSV, la incidencia de la apoptosis se mostró
muy alta, resultando en elevadas mortalidades de los animales (Wu y Moroga, 2004).
Estas referencias sugieren que en las infecciones virales severas en los camarones, ocurre
la inducción de una apoptosis tardía, llevando una fuerte propagación de la progenie
viral y resultando en la muerte del camarón por exceso de apoptosis en sus tejidos.
Muy recientemente, fueron identificadas y clonadas caspasas en los camarones
Penaeus merguiensis (Phongdara et al., 2006) y P. monodon (Wongprasert et al., 2007)
y en ambos animales estas proteasas son inducidas durante las infecciones de WSSV. La
relación apoptosis-infección viral en camarones será mejor explorada más adelante, en
el ámbito del concepto de acomodación viral.
200
Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
moribundos durante los brotes virales, pudiendo llegar a valores muy altos (hasta 40% de
muerte celular, Sahtout et al., 2001) y que la muerte del camarón sería una consecuencia
de este exceso de apoptosis.
El concepto de acomodación viral propone que el camarón coexiste con los
virus sin haber efectos negativos, debido a un proceso combinado virus-hospedero,
que comprende la reducción del proceso apoptótico en el hospedero inducido
por el virus. Este concepto fue reforzado, al ser evidenciado que los camarones sin
signos de la enfermedad, pero con infección viral persistente, no presentan apoptosis
en las células infectadas (Wongprasert et al., 2003). Sin embargo, los mecanismos
moleculares subyacentes a la tolerancia a los virus patógenos por el camarón, son
todavía desconocidos y probablemente distintos de la tolerancia inmunológica de los
vertebrados. Por otro lado, falta también confirmar si esta aparente tolerancia adquirida
es efectivamente provocada por una reducción/supresión de apoptosis, o si es debida a
otros procesos celulares/moleculares de control viral todavía desconocidos.
201
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
6.2 Inmunoestimulantes
El gran interés en compuestos inmunoestimulantes surgió de la necesidad de tratar el
cáncer en los humanos, buscando compuestos capaces de activar las células del sistema
inmunológico (macrófagos, células NK, linfocitos B y T), para aumentar su capacidad
de destruir los tumores. Por otro lado, además de proporcionar una mayor protección
contra los tumores, la activación de las células inmunológicas lleva todavía a una mayor
resistencia a las infecciones por diferentes microorganismos, como virus, bacterias,
hongos y otros parásitos.
Sustancias inmunoestimulantes están siendo obtenidas a partir de varias fuentes
naturales y también por síntesis química con base en la estructura molecular de los
propios productos naturales. Entre estos compuestos, se encuentran muchos derivados
de microorganismos o de algas, destacándose los componentes de la pared celular de
diferentes bacterias, hongos, microalgas y macroalgas. Los principales principios activos
de estos componentes capaces de generar una inmunoestimulación son: fragmentos de
peptidoglucanos (PGs), lipopolisacáridos (LPS), lipopéptidos, polisacáridos sulfatados,
β-glucanos, acil-oligopéptidos y péptidos bacterianos específicos (revisión de Song y
Huang, 2000).
Con relación a los camarones, muchas sustancias descritas como inmunoestimulantes
han sido utilizadas con el propósito de aumentar la resistencia natural, en vista de la
imposibilidad de vacunar estos animales. Sin embargo, existe una falta casi completa
de información sobre el mecanismo de acción de estos compuestos a nivel del sistema
inmune de los camarones, además de no haber consenso sobre su real eficacia y sobre
la reproducibilidad de los resultados.
Está bien establecido que la mejor forma de prevenir las infecciones en los cultivos
de camarones, depende esencialmente de las buenas prácticas de manejo, que incluyen
una buena calidad del agua, adecuada densidad poblacional, buena nutrición y
reducción de los factores ambientales potencialmente estresantes (principalmente las
variaciones bruscas de salinidad, temperaturas y oxígeno). El uso de sustancias capaces
de aumentar la inmunocompetencia de los camarones, en paralelo a un buen manejo
202
Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
del cultivo, apunta ciertamente como una herramienta promisoria en la búsqueda de una
mayor protección inmunológica contra el desarrollo de infecciones.
Existe una real necesidad de maximizar la inmunocompetencia de los camarones
cultivados, minimizando el uso de agentes terapéuticos químicos, como antibióticos, que
contaminan la carne del animal y el ambiente y también inducen el aparecimiento de
microorganismos resistentes.
Muchas sustancias consideradas inmunoestimulantes han sido utilizadas en los
cultivos de camarones, para aumentar su resistencia inmunológica y sería imposible
cubrir en este capítulo, la infinidad de referencias que existen a este respecto. Entre los
compuestos más utilizados en los cultivos se destacan los β-1,3/1,6-glucanos de hongos
o algas, PGs de bacterias Gram-positivas, LPS de bacterias Gram-negativas, polisacáridos
sulfatados de algas y algunas proteínas virales (Song y Huang, 2000 y Smith et al.,
2003). Entre estos inmunoestimulantes, los β-glucanos son tal vez los más ampliamente
utilizados para camarones y los presumiblemente más inmuno efectivos y compatibles
con la práctica de la camarinocultura (revisión de Smith et al., 2003).
Además de estos compuestos de la superficie de microorganismos y de algas, otros
productos también se muestran aparentemente inmuno efectivos para los camarones,
como los extractos de diferentes hierbas (Citarasu et al., 2006), bacterinas (bacterias,
principalmente vibrios, inactivadas por calor, formol o liofilizadas), probióticos y
suplementos nutricionales (astaxantina y ácido ascórbico polifosfatado) (Song y Huang,
2000). Varios de estos compuestos son actualmente vendidos comercialmente, otros están
en fase experimental y otros todavía no cuentan con financiamiento para una producción
comercial (Smith et al., 2003).
Los inmunoestimulantes son usualmente utilizados en los cultivos de camarones
sobre formas de baño (inmersión de los animales), como suplemento en la dieta o, más
raramente, sobre forma de inyección (aparentemente más eficaz). Se torna evidente,
que entre estos métodos, la adición del inmunoestimulante en la ración, es más viable
para la utilización en las granjas de cultivo. Las otras dos formas de administración
(inyección y baños) son menos viables, pero pueden ser útiles para el tratamiento de
larvas y reproductores, o para experimentos en laboratorio cuyo principal objetivo sea
comprender el mecanismo de acción de estos compuestos.
Se debe resaltar que el efecto inmunoestimulante real de estos productos, es todavía
bastante controvertido y poco fundamentado, dado que varios trabajos relatan resultados
opuestos sobre el efecto de un mismo inmunoestimulante. Los buenos resultados
obtenidos en algunos casos, no son muchas veces reproducibles. Como ejemplo entre
muchos, se puede citar el uso de los β-glucanos, que en algunos casos confieren efectos
benéficos para los camarones tratados (aumento del desempeño e inmuno estimulación)
(Sung et al., 1996) y en otros, no afecta o hasta perjudica a los animales (Schlolz et
al., 1999; Sritunyalucksana et al., 1999a). La comprensión del mecanismo de acción
de estos productos, es por lo tanto de crucial importancia para que su uso pueda ser
efectivamente validado.
Otro punto importante que debe ser considerado, es referente a la administración
de los inmunoestimulantes en la dieta de los camarones. La cuestión es: ¿Cómo explicar
la resistencia de estos compuestos a la digestión por las enzimas del tracto digestivo o
su absorción aparentemente intacta por el epitelio/cutícula del intestino para llegar a
la hemolinfa a fin de activar el sistema inmunológico del camarón? Alternativamente,
¿existen receptores específicos o moléculas señalizadoras presentes en el intestino/
203
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
de la hemolinfa, (3) actividad de la enzima PO, (4) índice de fagocitosis, (5) producción
de ROIs, (6) actividad antimicrobiana, (7) título hemoglutinante del plasma y (8)
concentración de proteínas totales de la hemolinfa. Otros parámetros comienzan a ser
implementados como la actividad de la lisozima hemolinfática, la producción de RNIs y
la actividad del inhibidor de la proteasa α2M (Tabla 3).
Entre los parámetros citados, las alteraciones más evidentes en los animales
(principalmente camarones) infectados/estresados se refieren a la modulación del
número total de hemocitos o THC (del inglés, total hemocyte count) y la disminución de
la capacidad coagulante de la hemolinfa (Lightner, 1996; Lee et al., 1999).
Es bien conocido, en la práctica de los cultivos, el aumento en el tiempo de
coagulación de la hemolinfa en crustáceos sobre estrés fisiológico o durante infecciones
(Jussila et al., 2001; Song et al., 2003). La técnica clásica para evaluar este parámetro, es
la obtención de la hemolinfa con un capilar de vidrio (Sarathi et al., 2007) siendo muy
simple; si es bien efectuada, puede generar información útil sobre el estado de salud de
los animales. Como se explicó anteriormente, el proceso de coagulación envuelve varios
factores: la proteína de coagulación, la enzima hemocitaria TGase y la concentración
plasmática de Ca2+. No se conoce claramente cual de estos factores es el responsable por
el aumento en el tiempo de coagulación en animales estresados/infectados. Los estudios
205
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
recientes sugieren que hay una interacción de estos factores. Camarones L. vannamei
infectados con TSV tienen una capacidad disminuida de coagulación y presentan una
actividad significativamente reducida de TGasa en los hemocitos, además de una caída
de 16 a 20% en la concentración de calcio plasmático (Song et al., 2003).
El conteo total de hemocitos circulantes (THC), de por sí es uno de los
inmunoparámetros más utilizados para expresar las condiciones de salud de los crustáceos.
La modulación de la THC es utilizada en diferentes especies sobre condiciones de estrés
ambiental y/o fisiológico y durante las infecciones (Rodríguez y Le Moullac, 2000).
La THC puede aumentar o disminuir sus valores, dependiendo del tipo y tiempo de
exposición a los agentes causantes del estrés. Es común que se observe una disminución
de la THC durante las primeras horas de un proceso infeccioso y un aumento del número
de células en fases mas tardías (Rodríguez y Le Moullac, 2000). Esta disminución inicial
se debe probablemente a una migración e infiltración de los hemocitos en los tejidos
infectados, mientras que el aumento posterior probablemente sea debido a la liberación
de nuevas células a partir de los órganos hematopoyéticos (van de Braak et al., 2002b).
La mayoría de los autores concuerda que un aumento en el THC debe proporcionar una
mayor protección de los crustáceos contra infecciones, una vez que los hemocitos son los
principales responsables por las diferentes reacciones inmuno-celulares (Jiravanichpaisal
et al., 2006) y son los sitios de expresión de las diferentes moléculas inmunológicas (Gross
et al., 2001). Curiosamente, la alteración en la proporción de los tipos de hemocitos
en crustáceos, no es muy usual durante situaciones de estrés o durante infecciones
(Rodríguez y Le Moullac, 2000; Vogan y Rowley, 2002).
La producción de ROIs por los hemocitos de crustáceos, medida principalmente
por la producción de aniones superóxido (O2-), se ha constituido en uno de los
inmunoparámetros más consistentes para evaluar el estado de inmunocompetencia de
los camarones. La evaluación de la producción intracelular de O2- por los hemocitos
fagocitarios, es usualmente determinada por el método de reducción del NBT, o por
la técnica de la quimioluminicencia, utilizando componentes de la superficie de
microorganismos, como LPS y ß-1,3-glucanos (laminarina, zymosan, curdlan) para
estimulación de los hemocitos in vitro. Este inmunoparámetro es también muy utilizado
para evaluar el efecto de sustancias inmunoestimulantes en camarones (Song y Hsieh,
1994; Muñoz et al., 2000; Campa-Córdova et al., 2002 a, b; Hou y Cheng, 2005; Yeh et
al., 2006; Fu et al., 2007).
La primera referencia de producción de ROIs en camarones, fue publicada por
Song y Hsieh (1994) en P. monodon, siendo realizados desde entonces estudios con
otras especies, cuyas metodologías fueron adaptadas. Existen sin embargo diferencias
fundamentales entre los protocolos experimentales utilizados por los diferentes grupos
que estudian los crustáceos, lo que resulta frecuentemente en resultados dispares y poco
comparables. Como ejemplo, se puede citar el trabajo de Muñoz et al. (2000) en L.
vannamei, que indica un porcentaje muy bajo de estimulación de los hemocitos por el
zymosan (30%), luego de 2 horas de incubación, mientras que en nuestro laboratorio
ocurre una alta estimulación hemocitaria (80%) en la misma especie, en apenas 15
minutos de incubación con el mismo inductor (Guertler, 2007).
En camarones P. monodon (Sung et al., 1996) y L. vannamei (Muñoz et al., 2000)
infectados con bacterias del genero Vibrio, se observa un aumento de la producción de
ROIs. Apenas las especies V. alginolyticus y V. anguillarum fueron capaces de estimular
la producción del anión superóxido, mientras que el V. harveyi no causó ninguna
alteración en la producción de este radical (Muñoz et al., 2000), lo que podría explicar
la patogenicidad de esta bacteria para los camarones.
206
Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
Con relación a las infecciones causadas por virus, ocurre una disminución
significativa en la producción de ROISs en L. vannamei infectados con WSSV, así
como la alteración de otros inmunoparámetros como la THC, la actividad fagocítica, la
actividad de la PO y la actividad de la SOD (Chang et al., 2003). De manera semejante,
infecciones con TSV, también resultan en la disminución significativa de los valores de
la THC, la concentración de proteínas totales, de hemocianina, de la proteína de la
coagulación y de iones Ca2+ y Cu2+ en el plasma de L. vannamei (Song et al., 2003).
Además, la producción de ROIs y la actividad de la PO aumentan en los camarones
infectados con TSV (Song et al., 2003). Estos resultados parecen indicar que algunos
parámetros hemato-inmunológicos pueden efectivamente reflejar el estado de salud de
los camarones.
La actividad antimicrobiana de la hemolinfa de los crustáceos viene también siendo
utilizada como un potencial inmunoparámetro durante las infecciones y otras situaciones
de estrés (Sritunyalucksana et al., 1999a; Tsvetnenko et al., 2001; Vogan e Rowley,
2002). Como se mencionó anteriormente, la mayoría de los AMPs no es constituida por
moléculas rápidamente inducidas. Éstas, se encuentran almacenadas en los gránulos de
los hemocitos y pueden ser utilizadas intracelularmente o exocitadas mediante estímulos
apropiados. Muchas familias de AMPs, pueden ser inducidas en fases más tardías de
la infección o pueden ser inhibidas en situaciones de estrés. Como ejemplo se puede
citar la inducción tardía de las crustinas y peneidinas, luego de 48 horas de la infección,
como se mencionó anteriormente. Siendo así, la modulación de los niveles de AMPs
puede también representar un importante inmunoparámetro en el monitoreo del estado
de salud de los crustáceos.
En relación a la capacidad aglutinante de la hemolinfa, es conocido el hecho que
las infecciones y otras situaciones de estrés, pueden resultar en la alteración de los títulos
aglutinantes de la hemolinfa de los crustáceos. Como ejemplo, podemos citar, que en P.
monodon infectados por Vibrio vulnificus ocurre un aumento de la actividad aglutinante
de su plasma (Ratanapo y Chulavatnatol, 1992). Mientras que en las hembras adultas de
L. vannamei, sometidas al proceso de ablación unilateral para la maduración ovariana,
ocurre una reducción significativa del título aglutinante de su hemolinfa, probablemente
en respuesta a esta práctica mutiladora (Maggioni et al., 2004). Es importante resaltar
que los niveles de la actividad aglutinante no varían siempre de forma significativa en
respuestas a las infecciones o situaciones de estrés. En F. paulensis, por ejemplo, no hubo
alteración de los títulos aglutinantes en animales mantenidos a bajas salinidades o luego
de la ablación (Perazzolo et al., 2002).
Por otro lado, estudios recientes sobre la expresión de una lectina tipo-C de F.
chinensis (Fclectin) muestran una super-expresión de esas moléculas luego de 3 a 12
horas de infección con WSSV y bacterias Gram-negativas, respectivamente, sugiriendo
que esta lectina sea expresada de manera diferenciada según el agente infeccioso (Liu
et al., 2007).
La concentración de proteínas totales del plasma de crustáceos es también un
parámetro utilizado para evaluar el estado de salud de los camarones. A pesar de este
parámetro ser afectado por factores ambientales y fisiológicos (Chen y Cheng, 1995;
Rosas et al., 2000; Sánchez et al., 2001) o durante infecciones y lesiones (Hennig et al.,
1998; Perazzolo et al., 2002; Vogan y Rowley, 2002), el significado de esta variación
necesita ser todavía mejor comprendido.
Debemos considerar que el pigmento respiratorio hemocianina representa cerca
de 90-95% de las proteínas totales del plasma de crustáceos (Rochude y Fine, 1978) y
las fluctuaciones en su concentración se refleja directamente en este tipo de parámetro
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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Margherita Anna Barracco et al. Inmunología del Camarón
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Capítulo 7
Introducción
En el año de 1976 se dio la conferencia técnica de la FAO sobre Acuicultura, la
cual fue celebrada en Kyoto, Japón y en el año 2000 se celebró la conferencia sobre la
Acuicultura en el Tercer Milenio, en Bangkok, Tailandia. Ambas conferencias trataban
de perfilar las oportunidades y funciones de la acuicultura dentro de la sociedad y
recomendar estrategias para responder a las expectativas y exigencias de desarrollo
sostenible de la acuicultura en los dos o tres próximos decenios. La Conferencia de Kyoto
examinó las oportunidades ofrecidas por la tecnología y la ciencia y las posibilidades de
establecimiento de redes, desarrollo del capital humano y fortalecimiento institucional
para el desarrollo de la acuicultura.
Además de estos aspectos, la Conferencia de Bangkok examinó el papel que la
acuicultura desempeñará en el contexto general del desarrollo en todos los planos,
desde el local al mundial. La Conferencia de Kyoto adoptó dos estrategias amplias:
aproximar la ciencia a la acuicultura, sector que era hasta entonces casi exclusivamente
tradicional y, ampliar el desarrollo de la acuicultura mediante la cooperación regional.
Estas estrategias se tradujeron en políticas e iniciativas de los gobiernos, con asistencia
inicial de varios organismos multilaterales y bilaterales.
En diciembre de 1997, la FAO realizó la Consulta Técnica sobre Políticas para el
Cultivo Sustentable del Camarón en Bangkok, Tailandia. Esta “Consulta de Bangkok”
llevó a la reunión de delegados de gobierno y observadores de 12 países de Asia y
América, que sumaban cerca de 90% de la producción global del camarón cultivado, a
la que también acudieron los principales países consumidores y observadores de cinco
organizaciones intergubernamentales y de cuatro organizaciones no gubernamentales
(ONGs).
La consulta destacó que el alcance de la sustentabilidad en el cultivo del camarón
depende de políticas de gobierno efectivas y acciones regulatorias, así como de la
cooperación del sector de cultivadores de camarón, utilizando tecnologías apropiadas
en su planeación, desarrollo y operaciones. En este sentido, la Consulta consideró
pertinente que la FAO realizara reuniones de expertos para elaborar las mejores
prácticas (el Reporte de la Consulta Técnica de Bangkok de la FAO se refiere a “buenas
prácticas”. El término “Buenas Prácticas de Manejo” (BPM) fue adoptado por la FAO
para esta Consulta de Expertos) para el cultivo del camarón y elementos de interés
legales y otros instrumentos regulatorios para la acuicultura costera.
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
228
Agnés Saborío Coze y María José Almanza Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura
229
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
230
Agnés Saborío Coze y María José Almanza Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura
231
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
232
Agnés Saborío Coze y María José Almanza Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura
Figura 7.3. Construcción de estanques de camarón. Figura 7.4. Canales de drenaje de agua.
Figura 7.5. Instalaciones en una granja camaronera. Figura 7.6. Preparación de estanques.
233
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Preparación de estanques
Los fondos de los estanques deben ser secados completamente cuando menos
después de tres o cuatro ciclos de producción y con más frecuencia si es necesario
(Figura 7.6)
Densidad de siembra
La densidad de siembra debe determinarse con base en la supervivencia y la
capacidad de carga.
Para estanques semi intensivos sin aireación mecánica, las densidades de carga en
la cosecha deberán estar generalmente en el rango de 10 a 15 camarones/m2.
Fertilización
1. Los fertilizantes químicos se deben usar solamente cuando sea necesario
incrementar la abundancia de fitoplancton.
2. Se debe evitar aplicaciones excesivas de fertilizantes como urea y amonio.
3. Se prefiere el uso de fertilizantes líquidos, pero si se utilizan fertilizantes granulados,
asegurarse que sea la dilución correcta.
4. Si es necesario utilizar fertilizantes orgánicos, se debe evitar el uso de estiércol a
menos que sea confirmada su calidad.
5. Los fertilizantes deben ser almacenados en lugares limpios y secos, lejos de chispas
y se debe evitar su derrame.
234
Agnés Saborío Coze y María José Almanza Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura
Encalado
1. La cal agrícola, más que cal viva o la cal hidratada, debe ser utilizada para
neutralizar la acidez del fondo.
2. La cal viva y la cal hidratada se usan en el fondo del estanque, sólo cuando es
necesario romper los ciclos de patógenos.
3. Las aguas con alcalinidades mayores a 60 mg/L no deben ser encaladas.
4. Los materiales para encalar deben aplicarse uniformemente sobre la superficie
del fondo del estanque y arar a una profundidad de 5 a 10 cm. Esto acelera la
reacción del material calizo.
5. Los materiales calizos deben ser aplicados de acuerdo con las pruebas de suelo.
6. Los fondos de los estanques con enfermedad deben ser secados dos o tres
semanas, tratados con 2 ó 3 toneladas de cal viva por hectárea para elevar el pH
y desinfectar el estanque.
7. El uso de los antibióticos y otros agentes debe ser limitado a las ocasiones en
que se sospeche la presencia de patógenos que sean susceptibles al producto
seleccionado y con base en el criterio de un especialista.
8. Las granjas de camarón deben enfocar sus planes de salud animal en la prevención
de enfermedades mediante una buena alimentación, buen manejo de los estanques
y reducción del estrés.
Equipos y materiales
1. Garantizar que los equipos y materiales empleados en la cosecha sean de un
material fácil de lavar para la buena desinfección de los mismos.
2. Controlar que los equipos a utilizar en la cosecha estén limpios y que hayan sido
debidamente desinfectados con cloro.
235
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Calidad de agua
1. Clorinar el agua utilizada para el personal y que sea proveniente de pozo.
2. Las aguas de baños, cocinas y otras instalaciones deben ser tratadas en tanques
sépticos. Estos tanques deben ser diseñados para que las aguas negras no se filtren
al medio y causen problemas ambientales.
3. No mezclar agua dulce de pozo con agua del estanque para mejorar salinidad.
4. Las necesidades de aireación mecánica deberán ser estimadas para que se evite la
aireación excesiva.
5. Usar aireadores con buena eficiencia en la transferencia de oxígeno. Deben usarse
aireadores grandes (2 HP) porque causan menos erosión por unidad de esfuerzo
que aireadores más pequeños. La aireación deberá ser usada durante el ciclo de
producción para regular la biomasa del camarón en el estanque (Figura 7.7)
6. Cuando el estanque tiene varios aireadores, deben operar menos aireadores en el
día que en la noche. Los aireadores deben ser colocados tres o cuatro metros lejos
de los bordes para evitar la erosión.
7. Considerar si el recambio de agua mejorará la calidad de agua del estanque o si
deberán ser consideras otras alternativas.
8. El agua debe ser descargada de los estanques tan despacio como sea práctico,
para minimizar la erosión.
9. El itinerario de descarga de los estanques debe ser escalonado para minimizar el
flujo del agua en los canales de descarga y reducir la erosión.
10. La descarga de agua a través de los bosques de manglar u otras tierras anegadas
salobres, debe ser considerada y probada experimentalmente.
11. Reducir el flujo para incrementar el tiempo de retención hidráulica, tanto como sea
posible, para incrementar la sedimentación (6 horas según Haws et al., 2001).
12. Implementar monitoreos de calidad de agua dentro de la granja como en el
afluente-efluente, para determinar si la implementación de las BPM está dando
resultado (Figura 7.8).
Insumos
1. Mantener la identificación de la fuente de agua, así como del sistema de drenaje.
2. Mantener actualizada la lista de los proveedores de semilla, alimentos y productos
químicos utilizados.
3. Controlar la “semilla” (postlarvas) y el alimento libre de sustancias prohibidas
(cloramfenicol, nitrofuranos).
236
Agnés Saborío Coze y María José Almanza Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura
Control de fármacos
1. Mantener actualizada la lista de fármacos utilizados, registrados y autorizados
oficialmente en el país.
237
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Control de contaminantes
1. Monitorear a través de un programa de control, los contaminantes tales como los
siguientes metales pesados: Mercurio, Plomo, Cadmio, Arsénico y Cromo
2. Manejar adecuadamente los combustibles, lubricantes, otros.
Personal
1. No permitir personas con indicios clínicos de enfermedades infectocontagiosas o
con heridas durante la cosecha.
2. Utilizar zapatos y ropa adecuada (botas, gabachas) (Figura 7.10)
3. Facilitar medios de desinfección de manos al personal que labora durante la etapa
de cosecha.
Cosecha
El camarón es un organismo perecedero que si no se trabaja con la temperatura
adecuada, puede descomponerse muy rápido. Es por ello que la manipulación durante
la cosecha y el transporte debe ser la óptima para evitar daños a la salud humana.
1. El camarón debe ser lavado y enhielado continuamente durante la cosecha.
2. El camarón cosechado debe ir directamente a la planta procesadora.
3. El camarón debe ser cosechado y transportado de una manera que se asegure que
la temperatura del tejido, no aumentará entre la cosecha y la entrega en la planta
procesadora.
4. Los equipos y los envases usados para cosechar y transportar el camarón, deben
estar limpios para prevenir la contaminación (Figura 7.11)
5. Los camarones de estanques diferentes serán identificados por escrito y mantenidos
por separado hasta la entrega a la planta procesadora.
6. El camarón cosechado debe recibir un número de lote único que servirá para
remontar a los expedientes de la producción correspondiente.
7. Controlar que el agua utilizada en los procedimientos de cosecha sea agua potable,
acorde con los estándares internacionales establecidos por FAO/WHO.
8. Controlar que el hielo utilizado en el producto haya sido elaborado con agua
potable y que no presente ninguna alteración en sus propiedades físicas.
238
Agnés Saborío Coze y María José Almanza Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura
Figura 7.7. Aireadores en estanques de cultivo de camarón. Figura 7.8. Toma de muestras de agua para análisis de
laboratorio.
Figura 7.9. Buenas prácticas en plantas formuladoras de Figura 7.10. Vestimenta adecuada para el personal.
alimento para camarón.
239
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Control de plagas
Los depredadores pueden crear problemas en la productividad de las granjas
camaroneras, ya que pueden entre otros problemas, consumir los camarones, propagar
y difundir enfermedades, consumir el alimento de los camarones y, en casos donde
los depredadores son caimanes o cocodrilos, se pueden perder vidas humanas. Para
controlar a los predadores, se deben utilizar los mecanismos más inofensivos para el
ambiente.
1. Utilizar mallas de filtración en las compuertas de entrada y salida.
2. Utilizar apropiadamente los plaguicidas.
3. La depredación por pájaros debe ser minimizada por métodos no letales, si es
posible, como ruidos repelentes, luces repelentes.
4. El uso de trabajadores para espantar a los pájaros también es recomendable.
Transporte
Se debe garantizar un transporte confiable antes del comienzo de la cosecha, se
deben utilizar vehículos aislados y cubiertos.
1. Para cada estanque cosechado, se debe registrar: número y fecha del estanque
cosechado, área del estanque y fecha de la siembra, número de postlarvas
sembradas, fuente de las postlarvas, antibióticos y drogas usados, herbicidas,
alguicidas y pesticidas usados, tipo de alimento usado y porcentaje de proteína,
tipo y cantidad de fertilizante usado, nombre de la planta procesadora usada para
el proceso.
2. Realizar un buen enhielado del producto cosechado, se recomienda la relación
hielo–producto de 1:1.
3. Registrar en formatos de cosecha la aplicación de meta-bisulfito en el producto
cosechado, se recomienda una dosis de1.5 kg/ 1000 lb de camarón.
4. El producto cosechado enhielado debe ser enviado lo más pronto posible a la
planta procesadora.
5. El producto debe ser supervisado para evitar la contaminación química provocada
por generadores, camiones, etc., utilizados durante la cosecha.
6. El productor debe mantener controlados los animales y las plagas durante la
cosecha, para prevenir la contaminación por suciedad.
7. Los envases asignados para transportar el camarón de la granja a la planta
procesadora, no deben tener contacto con el suelo.
240
Agnés Saborío Coze y María José Almanza Buenas prácticas de manejo en la camaronicultura
Figura 7.12. Selección de producto en planta de proceso. Figura 7.13. Producto cosechado.
241
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Aquaculture Certification Council, INC. 2007. Código de Conducta Técnico, Social y Ambiental
Responsable para la Camaronicultura en Nicaragua. 64 páginas.
Bolaños, M. A. 2004. Buenas Prácticas de Manejo en el Cultivo del Camarón Cultivado. Fondo
Mundial para la Naturaleza (WWF) PROARCA. 38 páginas.
FAO/Gobierno de Australia. 2001. Consulta de Expertos sobre: Buenas Prácticas de Manejo
y Buenos Arreglos Legales e Institucionales para el Cultivo Sustentable del Camarón. 77
páginas.
Haws, M.C. y C.E. Boyd. 2001. Métodos para mejorar la camaronicultura en Centroamérica.
Universidad Centroamérica (UCA). Managua, Nicaragua. 296 páginas.
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Saborío, Agnes; et al. 2007. Manual de Buenas Prácticas de Manejo en el cultivo de Camarón
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Acuáticos. Universidad Centroamericana, Conferencia Red Vannamei, CYTED. Managua,
Nicaragua. 60 páginas.
242
GLOSARIO
GLOSARIO
Bacilo Son bacterias con forma de bastón cuando son observadas en un microscopio.
Bacterias Gram Las que se tiñen de rosa o rojo con la tinción de Gram (violeta de metilo-safranina).
negativas
Bacterias Las que causan enfermedades tanto a los animales, vegetales y al hombre.
patógenas
Bacterias Microorganismos unicelulares en forma de filamentos, cocos y estructuras espirales.
No poseen clorofila.
Bactericida Sustancia que tiene la propiedad de destruir las bacterias
Bacteriemia Presencia de bacterias en la hemolinfa.
Bioensayo Experimento que se hace utilizando organismos vivos, bajo condiciones y ambientes
controlados
Biopsia Toma y examen de una pequeña parte del tejido o liquido corporal del organismo
para completar un diagnóstico sobre su estado de salud.
Biótico Organismos que comparten un mismo ambiente en un tiempo determinado.
Biotipo Forma típica de organismos vivos que puede considerarse modelo de su especie,
variedad o raza
Brote Aparición de dos o más casos de una misma enfermedad, en los que se observa una
relación con un agente etiológico común, estableciéndose esta relación en términos
de tiempo, lugar y tipo de organismos afectados.
Calambre Proceso de fatiga muscular que implica una contracción rígida del músculo esquelé-
tico, producida por un período de hipoxia prolongado.
Calidad del agua Complejo de variables fisicoquímicas del agua relacionadas con la acuicultura.
Camaronicultura Cultivo de camarones
Cápside Estructura proteica formada por una serie de monómeros llamados capsómeros. En
el interior de esta cápside se encuentra siempre el material genético del virus.
Cariorrexis Fragmentación de la cromatina y su distribución por el citoplasma como resultado de
la desintegración nuclear.
Cefalotórax “cabeza” del camarón; estructura que contiene órganos y tejidos propios del tórax y
de la cabeza.
Citopático Efecto dañino o destructivo que un tóxico químico o biológico ejerce sobre las
células
Coagulación Mecanismo fisiológico utilizado por los organismos para evitar perdida de sangre o
hemolinfa, mediante la activación de factores que detienen su salida a través de una
herida.
Contingencia Posibilidad de que algo suceda o no suceda.
Control Muestra que se excluye de un análisis experimental, para que sirva de referencia en
la evaluación de resultados de la parte analizada.
Copépodo Son una subclase de crustáceos maxilópodos de tamaño muy pequeño, muchas
veces microscópicos, que se encuentran abundantemente, tanto en agua dulce como
salada
Cromatina Es el conjunto de ADN, histonas y proteínas no histónicas que se encuentra en el
núcleo de las células eucariotas y que constituye el cromosoma eucariótico
Cromatóforos Son células con pigmentos en su interior que reflejan la luz.
Crónico Se llama enfermedad crónica a aquella patología de larga duración, cuyo fin o cura-
ción no puede preverse claramente o no ocurrirá nunca.
Cuarentena Es la acción de aislar o apartar a animales durante un período de tiempo, para evitar
o limitar el riesgo de que extiendan una determinada enfermedad contagiosa.
246
Glosario
Cutícula Es la capa más exterior del tegumento, inmediatamente por encima de la epidermis
(epitelio cuticular) y segregada por ésta. Es una formación rígida, acelular (sin célu-
las), de estructura compleja y compuesta por quitina y calcio entre otras sustancias.
Degradación Transformación de una sustancia compleja en otra de estructura más sencilla.
Desinfectante Bactericida y germicida o agente que mata organismos, generalmente microscópi-
cos.
Diagnóstico Conocimiento y estudio de los signos de una enfermedad, para la determinación del
carácter y causa de la misma.
Diagnóstico Conocimiento final sobre la o las causas de una enfermedad, obtenido después de
definitivo o realizar y analizar información histórica y de campo, pruebas de campo y pruebas
confirmatorio de laboratorio.
Diagnóstico Es la causa probable de una enfermedad, cuyo conocimiento debe aún profundi-
presuntivo zarse más mediante pruebas adicionales para llegar a un diagnóstico definitivo o
confirmatorio.
Digestión Proceso de transformación de los alimentos que son ingeridos en sustancias más
sencillas para ser absorbidos.
Ectodermis Es el comienzo de un tejido que cubre las superficies del cuerpo. Emerge primero y
forma la capa externa de las capas germinativas.
Ectoparásito Parásito que vive sobre la superficie del hospedero
Edema Es la acumulación de líquido en el espacio tisular intercelular o intersticial y también
en las cavidades del organismo, debido al incremento en la transudación de los
líquidos capilares.
Encapsulación Formación de una cápsula aislante alrededor de un cuerpo extraño. Se puede dar a
nivel celular o tisular
Endémico Una enfermedad que se presenta sistemáticamente, de manera regular y sin variacio-
nes apreciables de población afectada dentro de un segmento demográfico.
Endoparásito Parásito que se encuentra en el interior de los animales
Enfermedad Proceso mórbido definitivo, el cual tiene una cadena de signos característicos que
pueden afectar el cuerpo entero o alguna de sus partes y su etiología, patología y
pronóstico, pueden ser conocidos o desconocidos
Enfermedad aguda Aquellas enfermedades que tienen un inicio y un fin claramente definidos. General-
mente son de corta duración, aunque no hay un consenso en cuanto a que plazos
definen a una enfermedad como aguda y cual como crónica
Enzima Son sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas siempre que
sea termodinámicamente posible (si bien no pueden hacer que el proceso sea más
termodinámicamente favorable). Las enzimas sirven para controlar las reacciones
químicas, acelerándolas
Eosina Es un colorante ácido de color rosado oscuro usado en preparaciones histológicas,
cuya propiedad está basada en su polaridad negativa lo que le permite enlazarse con
constituyentes celulares de carga positiva (alcalinos).
Epicomensal Parasito que se adhiere a la parte externa de las hospederos, utilizándoles como
sustrato
Epidemia En su definición tradicional, es una enfermedad ampliamente extendida que afecta a
muchos individuos en una población.
Epitelio Es el tejido formado por una o varias capas de células yuxtapuestas que recubren
todas las superficies libres del organismo, y constituyen el recubrimiento interno de
las cavidades y órganos. Los epitelios también forman el parénquima de muchos
órganos.
247
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Epizootia Es una enfermedad contagiosa que ataca a un número inusual de animales al mismo
tiempo y lugar y se propaga con rapidez. El término epizootia está cayendo gradual-
mente en desuso puesto que en la actualidad se prefiere el término epidemia.
Epleción Cantidad de eses que se encuentra en el intestino medio de un camarón.
Esclerotización Es el endurecimiento y oscurecimiento de la quitina en el exoesqueleto
Especificidad Capacidad de una prueba de diagnóstico para determinar de confiable un agente
infeccioso específico, sin riesgos mayores de reacción cruzada con otro patógeno
distinto
Espécimen Es aquel individuo o parte de un individuo que se toma como muestra, especial-
mente el que se considera representativo de los caracteres de la población a la que
pertenece.
Espermatóforo Es una cápsula o masa creada por los especimenes macho de varios invertebrados,
que contienen espermatozoides, siendo integralmente introducida al órgano sexual
femenino durante la cópula.
Esterilización Procesos físicos o químicos mediante los cuales se elimina el 100% de los microor-
ganismos contaminantes presentes en un sustrato
Estrés Es toda demanda física o fisiológica que se le haga al organismo. Puede ser causada
por enfermedades o ser de origen séptico, nutricional o ambiental.
Estuario Es la parte más ancha y profunda en la desembocadura de los ríos, en los mares
abiertos o en los océanos, en aquellas zonas donde las mareas tienen mayor ampli-
tud u oscilación. La desembocadura en estuario está formada por un solo brazo o
curso fluvial muy ancho y profundo, aunque también suele tener a modo de playas
a ambos lados en las que la retirada de las aguas permite crecer algunas especies
vegetales que soportan aguas salinas.
Etiología Agente o parámetros que de manera individual o conjunta, causan una enfermedad.
Exoesqueleto Es el esqueleto externo continuo que recubre toda la superficie de los animales del
filo artrópodos (arácnidos, insectos, crustáceos y otros grupos relacionados), donde
cumple una función protectora y otra mecánica, proporcionando el sostén necesario
para la eficacia del aparato muscular. También se llama exoesqueleto a la base.
Fagocitosis Es un tipo de endocitosis por el cual algunas células rodean con su membrana
citoplasmática a una sustancia extracelular (un sólido generalmente) y la introducen
al interior celular. Esto se produce gracias a la emisión de pseudópodos alrededor de
la partícula o microorganismo hasta englobarla completamente y formar alrededor
de él una vacuola, la cual fusionan posteriormente con lisosomas para degradar la
sustancia fagocitada, la cual recibe el nombre de fagosoma.
Fagocitosis Proceso por le cual un cuerpo extraño o un desecho celular es ingerido por células
especiales (fagocito) mediante invaginación.
Farmacoterapia Tratamiento de las enfermedades mediante fármacos (medicamentos).
Fijación Preservación de tejidos de un organismo, mediante la inyección y/o inmersión del
mismo en una solución que evita cambios autolíticos.
Genoma Es todo el material genético contenido en las células de un organismo en particular.
Por lo general, al hablar de genoma en los seres eucarióticos nos referimos sólo al
ADN contenido en el núcleo, organizado en cromosomas.
Giemsa Es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos y otro tipo de muestras
biológicas, que permite la tinción diferencial de zonas con un alto contenido de
ADN, y concretamente de uniones A-T. Esto permite distinguir perfectamente en mi-
croscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos
casos, incluso el ADN mitocondrial.
Glutaraldehido Fijador utilizado para microscopía electrónica de transmisión
Gram Coloración para diferenciar bacterias.
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Glosario
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
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Glosario
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Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
Postlarva Estado que ocurre después del estado larval, parecido al juvenil pero aún le faltan
algunas características. Para crustáceos el estado siguiente a la metamorfosis de larva
zoea a juvenil. En camarones penaeidos, normalmente se cuentan los días después
de la aparición de las características de postlarva. Ej., PL12 indica que la postalarva
ha vivido 12 días desde su metamorfosis desde el estado de mysis.
Post-mortem Cambios naturales que ocurren a nivel bioquímico y morfológico en un organismo
después de su muerte
Postmuda Fase del proceso de muda de los crustáceos que sigue a la ecdisisi o “muda”
Prevalencia Es la proporción de individuos de un grupo o una población que presentan una ca-
racterística o evento determinado en un momento, o periodo de tiempo (“prevalecía
de periodo”), determinado.
Primers Indicadores, fragmentos de ADN usados en biología molecular.
Probiótico Microorganismos vivos presentes en un alimento que permanecen activos en el in-
testino y ejercen importantes efectos fisiológicos. Ingeridos en cantidades suficientes
tienen efecto muy beneficioso, como contribuir al equilibrio de la flora bacteriana in-
testinal del hospedero y potenciar el sistema inmunológico. Son capaces de atravesar
el tubo digestivo, recuperarse vivos en las heces y adherirse a la mucosa intestinal.
No son patógenos.
Profilaxis Procedimientos que buscan prevenir una infección.
Pseudópodos Elongaciones de la membrana de las células que se asemejan a “extremidades”.
Quitinosis Melanización multifocal de la cutícula de origen bacteriana.
Repleción Cantidad de heces que se encuentran en el intestino medio de un camarón.
Respiración Se entiende al proceso fisiológico indispensable para la vida de organismos aeróbi-
cos, consistente en capturar O2 del medio y en eliminar CO2.
Sensibilidad Capacidad de una prueba de diagnóstico para detectar un agente (microorganismo)
de interés que está presente en mínimas cantidades en una muestra.
Septicemia Síndrome clínico caracterizado por un proceso infeccioso severo que incluye la
invasión del sistema sanguíneo (hemolinfa) por los microorganismos patógenos.
Séptico Que produce putrefacción o es causado por ella, por presencia de bacterias.
Signo Se entiende por signo clínico a cualquier manifestación objetivable consecuente a
una enfermedad o alteración de la salud, y que se hace evidente en la biología del
organismo enfermo.
Síndrome Es un cuadro clínico o conjunto sintomático con cierto significado y que por sus
características posee cierta identidad; es decir, un grupo significativo de síntomas y
signos, que concurren en tiempo y forma, caracterizando un estado morboso deter-
minado o enfermedad.
Síntoma Es la referencia subjetiva que da un organismo enfermo por la percepción o cambio
que puede reconocer como anómalo o causado por un estado patológico o enfer-
medad.
Sistémico Enfermedad que se encuentra en todo el cuerpo.
Sonda genética Fragmento de ADN que es complementario a una parte del genoma de un organismo
y es utilizada para la detección genómica de dicho organismo en una muestra.
Taxonomía En su sentido más general, la ciencia de la clasificación. Por lo general, se emplea el
término para designar la taxonomía biológica, la ciencia de ordenar a los organismos
en un sistema de clasificación compuesto por una jerarquía de taxones anidados.
Tóxico Es toda sustancia química que, administrada a un organismo vivo, tiene efectos
nocivos. El estudio de los venenos es conocido como toxicología.
Transmisión Forma de transmisión de un a enfermedad mediante el canibalismo entre organismos
horizontal o ingesta de alimento infectado.
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Glosario
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