TEMA 1

Practical rules for laboratory activities with biological risk

1. Consider all clinical specimens, body fluids and tissues from inoculated or infected
humans or laboratory animals as potential carriers of pathogens (Considere todas las
muestras clínicas, fluidos corporales y tejidos de humanos o animales de laboratorio
inoculados o infectados como posibles portadores de patógenos).
2. The management of the samples referred to in the previous point must take place
exclusively in a biological safety cabinet (hood) of Class II or higher (El manejo de las
muestras a que se refiere el punto anterior deberá realizarse exclusivamente en una
cabina de seguridad biológica (campana) de Clase II o superior).
3. The doors of the laboratory must always remain closed during the carrying out of work
activities (Las puertas del laboratorio deberán permanecer siempre cerradas durante
la realización de las actividades laborales).
4. Access to the laboratory is allowed, exclusively, to authorized and suitably trained
persons (El acceso al laboratorio está permitido, exclusivamente, a personas
autorizadas y debidamente formadas).
5. Appropriate signs must be affixed to the laboratory access door
containing the intended use of the room, the specific prohibition
signs, obligations, warnings, the list of biological agents used, the
access rules for authorized personnel (En la puerta de acceso al
laboratorio se colocarán carteles apropiados que contengan el uso
previsto de la sala, los carteles de prohibición específicos,
obligaciones, advertencias, la lista de agentes biológicos utilizados,
las normas de acceso para el personal autorizado).
6. In the laboratories it is forbidden to eat, drink, smoke, chew gum,
store food, wear make-up, wear rings and bracelets. The hair, if long, must be
gathered behind the head. The use of contact lenses is not recommended (En los
laboratorios está prohibido comer, beber, fumar, mascar chicle, almacenar alimentos,
maquillarse, llevar anillos y pulseras. El pelo, si es largo, debe recogerse detrás de la
cabeza. No se recomienda el uso de lentes de contacto).
7. Operators must not wear open footwear (Las operadoras no deben usar calzado
abierto).
8. Appropriate signs must be posted near the work áreas (Se deben colocar letreros
apropiados cerca de las áreas de trabajo).
9. On each of the containers that must be stored in refrigerators or freezers, the scientific
name of the materials contained, the name of the operator who put them away and
the date must be indelibly indicated. Containers of non-identifiable materials must be
disposed of according to the procedures envisaged for the management of special
waste (En cada uno de los envases que deban almacenarse en frigoríficos o
congeladores, se deberá indicar de manera indeleble el nombre científico de los
materiales contenidos, el nombre del operador que los almacenó y la fecha. Los
envases de materiales no identificables deberán eliminarse según los procedimientos
previstos para la gestión de residuos especiales).
10. The laboratory must be kept clean, tidy and free of any objects not relevant to the job
(El laboratorio debe mantenerse limpio, ordenado y libre de cualquier objeto que no
sea relevante para el trabajo).
11. Work surfaces must be decontaminated with an appropriate chemical germicide at
least once a day and, in any case, after each spilling of material (for example: splashes
of blood or other biological liquids) and at the end of daily work (Las superficies de
trabajo deberán descontaminarse con un germicida químico apropiado al menos una
vez al día y, en todo caso, después de cada vertido de material (por ejemplo:
salpicaduras de sangre u otros líquidos biológicos) y al finalizar la jornada laboral).
12. Always decontaminate and clean scientific equipment after use (Siempre
descontamine y limpie el equipo científico después de su uso).
13. Appropriate containers for the collection of special sanitary waste must be placed near
each workplace (Cerca de cada lugar de trabajo se colocarán contenedores adecuados
para la recogida de residuos sanitarios especiales).
14. Preferably use disposable material or resort to electric incinerators (sterilization of
loops or other objects by flaming with a Bunsen burner causes a micro-explosion with
projection of infected particles on the hand and surrounding surfaces)( Utilizar
preferentemente material desechable o recurrir a incineradores eléctricos (por
ejemplo, la esterilización de asas u otros objetos por llamas con mechero Bunsen
provoca una microexplosión con proyección de partículas infectadas sobre la mano y
superficies circundantes).
15. Decontaminate laboratory materials before discarding them and, in the case of
glassware or other recyclable material, before washing (Descontaminar los materiales
de laboratorio antes de desecharlos y, en el caso de cristalería u otro material
reciclable, antes de lavarlos).
16. Take the necessary measures to prevent accidents caused by needles, scalpels and
other sharp objects used during the performance of usual work activities (Tomar las
medidas necesarias para prevenir accidentes causados por agujas, bisturís y otros
objetos cortantes utilizados en el desempeño de las actividades laborales habituales).
17. Use only mechanical systems for pipetting all liquids (Use solo sistemas mecánicos
para pipetear todos los líquidos).
18. All micropipettes must be equipped with a tip ejector. The latter must be disposed of
together with other special sanitary waste (Todas las micropipetas deben estar
equipadas con un expulsor de puntas. Estos últimos deben eliminarse junto con otros
residuos sanitarios especiales).
19. The micropipettes must always be kept in a vertical position and never placed on the
work bench. At the end of each job, the micropipette must be properly disinfected (Las
micropipetas deben mantenerse siempre en posición vertical y nunca colocadas sobre
la mesa de trabajo. Al final de cada trabajo, la micropipeta debe ser debidamente
desinfectada).
20. Personal protection: All operators involved, for whatever reason, in activities that may
involve direct skin contact with the materials referred to in point 1 above, must always
wear protective gloves suitable for the work they perform. In addition, to prevent
exposure of the mucous membranes of the mouth, eyes and nose, when contact is
conceivable following sprays of blood or other biological liquids, they must wear
protective goggles, masks, visors or other protections (Protección personal: Todos los
operarios que participen, por cualquier motivo, en actividades que puedan implicar un
contacto directo de la piel con los materiales a los que se refiere el punto 1 anterior,
deberán llevar siempre guantes de protección adecuados al trabajo que realicen.
Además, para evitar la exposición de las mucosas de la boca, ojos y nariz, cuando sea
 previsible un contacto tras salpicaduras de sangre u otros líquidos biológicos, deberán
llevar gafas protectoras, máscaras, visores u
otras protecciones).

Risk Phrases (R; H) are conventional phrases, introduced

by European legislation that describe the risks for
human, animal and environmental health connected to
the handling of chemical substances.

The Safety Phrases (S; P) which are also conventional

phrases, indicate what to do to minimize the danger in
the event of:
- Handling
- Dispersion
- to manage incidents
- to provide first aid

Next to the R and S phrases you can also find pictograms,

that is symbols of the danger of chemical substances: the skull with crossbones on an orange
field is a typical example of these symbols.
Las frases de riesgo (R; H) son frases convencionales, introducidas por la legislación europea,
que describen los riesgos para la salud humana, animal y ambiental relacionados con el
manejo de sustancias químicas.
Las Frases de Seguridad (S; P), que también son frases convencionales, indican qué hacer para
minimizar el peligro en caso de: Manejo, Dispersión, para gestionar incidentes, para
proporcionar primeros auxilios.

Laboratory equipment
 Laminar flow hoods (Cabina de flujo laminar) (1)
 CO2 incubator (Incubadora de CO2) (2)
 inverted (phase contrast) microscopes
(microscopios invertidos (contraste de fase)) (3)
 bench-top centrifuge (centrífuga de mesa) (4)
 thermostated bath (baño termostatizado) (5)
 refrigerator (frigorífico) (6)

1)
Laminar flow hoods always have a glass
part, some times fixed while others
movable at different heights. These
hoods must ensure the safety of the
product and the operator thanks to the
presence of HEPA (High Ef fi ciency
Particulate Air) fi lters. The difference
between the different classes of hoods
(I, II, III), is given by the quantity of
filters present inside.
Las campanas de flujo laminar siempre tienen una parte de vidrio, algunas veces fijas y otras
móviles a diferentes alturas. Estas campanas deben garantizar la seguridad del producto y del
operador gracias a la presencia de filtros HEPA. La diferencia entre las diferentes clases de
campanas (I, II, III), viene dada por la cantidad de filtros presentes en su interior.
- Class II biological hoods: mostly used in research and microbiological laboratories,
they are also defined as microbiological safety cabinets (Campanas biológicas clase II:
mayoritariamente utilizadas en laboratorios de investigación y microbiológicos,
también se definen como cabinas de seguridad microbiológica).
- Class III biological hoods: characterized by a total hermetic closure, they work at
negative pressure; manipulations inside the chamber are allowed by two or more
rubber gloves incorporated into the structure of the hood. The samples, in closed
containers, are introduced through a double door system. They have a HEPA filter on
the incoming air and a double HEPA filter on the outgoing air (Campanas biológicas
clase III: caracterizadas por un cierre hermético total, trabajan a presión negativa; las
manipulaciones en el interior de la cámara están permitidas por dos o más guantes de
goma incorporados a la estructura de la campana. Las muestras, en contenedores
cerrados, se introducen a través de un sistema de doble puerta. Disponen de filtro
HEPA en el aire de entrada y doble filtro HEPA en el aire de salida).
Laminar flow: unidirectional flow of air threads parallel to each other and all having the same
speed (generally 0.5 m / sec), which drag contaminants away from the work area and avoid the
formation of vortices.
HEPA filters (High Efficiency Particulate Air): prevent particle contamination, they retain at
least 99.97% of the particles of diameter = 0.3 mm (even more effective with diameters higher
or lower) However, these filters tend to get clogged, so they are regularly changed and,
depending on the use of the hood, a date is set for maintenance (generally once a year). If the
filter becomes clogged, not only does it no longer perform its function but also alters the
laminar flow and therefore it is easier for eddies to form under the hood
Flujo laminar: flujo unidireccional de hilos de aire paralelos entre sí y con la misma velocidad
(generalmente 0,5 m/seg), que arrastran los contaminantes fuera del área de trabajo y evitan
la formación de vórtices.
Filtros HEPA: evita la contaminación por partículas, retienen al menos el 99.97% de las
partículas de diámetro = 0.3 mm (aún más efectivos con diámetros mayores o menores) Sin
embargo, estos filtros tienden a obstruirse, por lo que se limpian periódicamente y se cambia,
dependiendo del uso de la campana, se fija una fecha de mantenimiento (generalmente una
vez al año). Sí el filtro si obstruye, no solo deja de cumplir su función, hasta que altera el flujo
laminar y, por lo tanto, es más fácil que se formen remolinos debajo de la cabina.
Biosecurity levels:
- Security Level Type 1 (BSL-1): is what most labs have. An example is laboratories
where DNA is extracted (this does not require living cells and therefore does not
require a sterile environment). Furthermore, in these laboratories it is common to
work on the counter and not in a biological hood. (El nivel de seguridad tipo 1 (BSL-1)
es el que tienen la mayoría de los laboratorios. Un ejemplo son los laboratorios de los
que se extrae el ADN, esto no requiere células vivas y por lo que no requiere un
ambiente estéril. Además, en estos laboratorios es habitual trabajar en mostrador y no
en cabina biológica).
 - Cell culture laboratories, on the other hand, are already at level 2 (BSL-2) because
agents with a moderate risk of causing disease in humans are handled if ingested, by
percutaneous transmission or exposure of the mucous membranes. Here we do not
work on the counter but under a biological hood (los labs de cultivo celular, en cambio,
ya están en el nivel 2 (BSL-2) porque se manejan agentes con riesgo moderado de
causar enfermedades en humanos en caso de ingestión, por transmisión percutánea o
exposición de las mucosas. Aquí no trabajamos sobre el mostrador sino bajo una
cabina biológica).
- Level 3 (BSL-3) is appropriate for local or exotic pathogens that can be transmitted by
aerosols or that can cause serious and fatal infections. SARS-CoV-2 and HIV require this
level. HIV is not transmitted via aerosols but is handled in these types of laboratories
due to its lethality (El nivel 3 (BSL-3) es apropiado para patógenos locales o exóticos
que pueden transmitirse por aerosoles o que pueden causar infecciones graves y
mortales. El SARS-CoV-2 y el VIH requieren este nivel. El VIH no si se transmite a través
de aerosoles, pero si se manipula en este tipo de laboratorios es debido a su letalidad).
- Class 4 (BSL-4) laboratories are appropriate for exotic pathogens that represent a high
level of aerosol transmission hazard and for which no treatments exist (eg Ebola virus).
In these cases, not only the laboratory, but also the entire building has this level of
security. In Italy, only the Luigi Sacco hospital in Milan and the National Institute for
Infectious Diseases in Rome belong to this category. In addition to having this level of
safety, these buildings must be anti-seismic, the staff has the obligation to be
extremely protected and there is a rule that there must always be two (Los
laboratorios de Clase 4 (BSL-4) son apropiados para patógenos exóticos que
representan un alto nivel de riesgo de transmisión por aerosol y para los cuales no
existen tratamientos (p. Ej., El virus del Ébola). En estos casos, no solo el laboratorio,
hasta todo el edificio cuenta con este nivel de seguridad. En Italia, solo el hospital Luigi
Sacco de Milán y el Instituto Nacional de Infecciones de Roma pertenecen a esta
categoría. Además de tener este nivel de seguridad, estos edificios deben ser
antisísmicos, el personal tiene la obligación de estar extremadamente protegido y
existe la regla de que siempre debe haber dos).
2)
It provides the optimal environment for the growth of eukaryotic cells, allowing particular
conditions such as temperature, humidity and CO2 level to be maintained constant. The CO2
level must be close to the partial pressure of carbon dioxide present in our tissues. The
temperature is set via a display placed on the incubator and generally ranges from 28 ° C for
insect cells and up to 37 ° C for mammalian cells. The CO2 level as a percentage set by the
incubator ranges from 5 to 10%. H2O addition to maintain the necessary humidity. Some
incubators are copper lined (antimicrobial function). The incubator is closed and has two
doors: an external one designed to maintain the temperature inside and an internal glass that
allows you to see what happens in the incubator without altering the internal conditions
(temperature and CO2 level).
- Bacterial growth incubators (Incubadoras de crecimiento bacteriano):
They do not require connection with CO2. If for growth in suspension
they require stirring of the sample ¡THEY SHOULD NEVER BE PLACED
WHERE EUKARYOTIC CELLS ARE GROWN! (No requiere conexión con
CO2. Si para el crecimiento en suspensión requiere necesidad de la
muestra ¡NUNCA DEBEN COLOCARSE DONDE SE CULTIVAN CÉLULAS
EUCARIOTAS!)
3)
It is used to observe cells that are growing in a culture dish. The normal optical microscope is
not used since there is little space between the objective and the surface. In the inverted
phase contrast optical microscope, the objective is placed below the plate while the light
source is placed above. Objectives can be of three types: 4-5x, 10x and 20x magnification. The
eyepiece, on the other hand, is always 10x. The final magnification can therefore be: 40-50x,
100x, 200x. With the 20x objective, the central portion of the cell is also better distinguished.
Finally, this microscope is called phase contrast because it helps to better distinguish cells
compared to the bright field.
Si lo usa para observar células que crecen en una placa de cultivo. No si usa el microscopio
óptico normal que tiene poco espacio entre el objetivo y la superficie. En el microscopio óptico
de contraste de fase invertida, el objetivo se coloca debajo de la placa mientras que la fuente
de luz se coloca arriba. Los objetivos pueden ser de tres tipos: 4-5x, 10x y 20x de aumento. El
ocular, a cambio, siempre es de 10x. Por lo tanto, la expansión final puede ser: 40-50x, 100x,
200x. Con el blanco 20x, también se distingue mejor la parte central de la celda. Por último,
este microscopio si contrastará la fase porque ayuda a distinguir mejor las células en
comparación con el campo claro.
4)
When working with cell cultures, 50 or 15 ml centrifuge tubes are used. They are useful when
it is necessary to change the culture medium in which the cells are resuspended since once
centrifuged the cells settle downwards. Most of the cells are centrifuged at 80-150 x g. The g
indicates the relative centrifugal force (RCF) expressed in units of gravity (rpm) because it
increases the speed with which the cells are attracted to the bottom. The so-called g-force is
not a force, but an acceleration: in this context, when we refer to "1 g" we mean an
acceleration equal to the average acceleration of gravity measured on the Earth, which is 9.8
m / s²
It should also be borne in mind that when the centrifuges are loaded they must be balanced; a
tube alone can never go into the centrifuge but it is necessary to make the so-called slingbar or
a tube filled with water because the unbalanced centrifuge is a danger for us and for the
laboratory.
Cuando se trabaja con cultivos celulares, si utiliza tubos de centrífuga de 50 o 15 ml. Solo se
necesitan cuando es necesario cambiar el medio de cultivo en el que se resuspenden las
células ya que una vez centrifugadas se depositan hacia abajo. La mayoría de las células se
centrifugan a 80-150 x g. La g indica la fuerza centrífuga relativa (RCF) expresada en unidades
de gravedad (rpm) porque aumenta la velocidad con las células que son atraídas en la parte
inferior. La llamada fuerza g no es una fuerza, hasta una aceleración: en este contexto, cuando
nos referimos a "1 g" nos referimos a una aceleración igual a la aceleración promedio de la
gravedad en la Tierra, que es de 9.8 m / s².
También hay que tener en cuenta que cuando se cargan las centrífugas se deben equilibrar; en
el centro solo puede entrar un tubo nunca hasta que sea necesario tener el honda llamada o
un tubo lleno de agua porque la centrífuga desequilibrada es un peligro para nosotros y para el
laboratorio.
5)
This is essentially a closed tank containing water at a certain temperature (generally set at 37 °
C for cell cultures). Used to warm refrigerated culture media and / or thaw reagents.
6)
Some have a glass door that allows you to see the inside but it is not essential as some land is
better not exposed to light. You can buy them from any refrigerator dealer since they do not
have particular characteristics and different from those commonly used.
The lab
Before entering the cell culture laboratory there should always be an
exchange room because everything that enters from the outside must
be cleaned and disinfected as well as the laboratory itself. Moreover,
any windows present in a cell culture laboratory should be sealed because if opened they
would disturb the air inside, even simple drafts are enough to create vortices under the hood.
 Disinfectants
Disinfectants used in the laboratory are divided into four categories (although the first two are
actually the most used):
o Alcohols: The most used is ethanol. They are diluted to 60-70%. It is also
possible to find "pink" alcohol even if it is not the best to use for surfaces (El
más utilizado es el etanol. Si se diluyen al 60-70%. También es posible
encontrar alcohol "pink" aunque no sea el mejor para usar en superficies).
o Hypochlorites: Sodium hypochlorites such as bleach and amuchin belong to
this category, they have different concentrations of hypochlorite but both are
general disinfectants, active against viruses (Los hipocloritos de sodio as la lejía
y la amoniaco pertenecen a esta categoría, tienen diferentes concentraciones
de hipoclorito pero ambos son desinfectantes generales, activos contra virus).
o Phenolics: toxic, little used (Tóxico, poco usado).
o Aldehydes (eg formaldehyde): irritants, to be used only in well-ventilated
areas (irritantes, para usar solo en áreas bien ventiladas).
 Biological risks
The most obvious biological risk that can occur in cell cultures, especially primary ones, are
pathogenic viruses for humans, components of culture media, generation and use of modified
cells and GMOs (genetically modified organisms): their generation and use must be strictly
controlled (e.g. hazards: appearance of modified or reactivated viruses, new fusion / hybrid
proteins, expression of viral or cellular oncogenes).
El riesgo biológico más evidente que puede ocurrir en los cultivos celulares, especialmente los
primarios, son los virus patógenos para humanos, componentes de medios de cultivo,
generación y uso de células modificadas y OGM (organismos genéticamente modificados): su
generación y uso debe ser estrictamente controlado (por ejemplo, peligros: aparición de virus
modificados o reactivados, nuevas proteínas de fusión / híbridos, expresión de oncogenes
virales o celulares).
 Sterile or Aseptic Techniques
To prevent accidental contamination by microbes from external sources
To prevent contamination of oneself or third parties
 Methods of Sterilization
o Plastic: γ rays. Most of the material used is in disposable plastic and already
sterilized by the company that sells it and the sterilization method generally
involves the use of gamma rays (La mayor parte del material utilizado es
 plástico descartable y esterilizado para la comercialización y el método de
esterilización generalmente involucra el uso de rayos gamma).
o Filtration with 0.22 µm filters: The land, on the other hand, is usually sold
sterile. However in case we have to add a chemical substance necessary for
our research we have to filter the soil. The soil not yet sterile is placed in the
upper part thanks to the nozzle connected to the vacuum pump system that
sucks the material. The compound then passes through the 0.22 µm filter
which eliminates bacteria but not viruses (La tierra, a cambio, suele venderse
estéril. Sin embargo, en caso de que tengamos que agregar una sustancia
química necesaria para nuestra investigación, debemos filtrar el suelo. La
tierra aún no estéril se coloca en la parte superior gracias a la boquilla
conectada al sistema de bomba de vacío que succiona el material. Luego, el
compuesto pasa por el filtro de 0.22 µm el cual elimina las bacterias pero no
los virus).
o Autoclave (moist heat) 1atm, 121 ° C for filters and saline solutions: It works
like a pressure cooker: it goes to very high temperatures and under high
pressure. It is used for filters, saline solutions and in some cases for soils
(Funciona como una olla a presión: it going to temperaturas muy altas ya
mucha presión. If utiliza para filtros, soluciones salinas y en algunos casos para
suelos).
o Dry oven 150 ° C for 3 hours for glassware
Biological contamination
 Bacteria
These are dangerous for a eukaryotic cell culture. Bacteria do not necessarily attack
cells directly, but having much lower growth requirements and being in very rich soils
they can grow rapidly inside them and take nourishment from eukaryotic cells (Estos
son peligrosos para un cultivo de células eucariotas. Las bacterias no necesariamente
atacan las células directamente, pero tienen crecimiento mucho más bajos y estar en
suelos muy ricos, pueden crecer rápidamente dentro de ellas y nutrirse de las células
eucariotas).
 Yeasts and mushrooms
These are very dangerous in spring and autumn due to the optimal climate. They are
larger and grow in groups. Yeast and fungal contamination is much more difficult to
control (Estos son muy peligrosos en primavera y otoño debido al clima óptimo. Son
más grandes y crecen en grupos. La contaminación por levaduras y hongos es mucho
más difícil de controlar).
 Micoplasma
Micoplasma is not readily visible but can still alter cell growth. This organism is actually a
bacterium that acts as a junction point between bacteria and viruses: it has its own DNA that
allows it to survive even on an external surface, but to reproduce it must partially exploit the
cell it infects. Then the microplasma enters the cell (El micoplasma no es fácilmente visible,
pero puede alterar el crecimiento celular. Este organismo es en realidad una bacteria que
actúa como punto de unión entre bacterias y virus: sostiene su propio ADN que le permite
sobrevivir incluido en una superficie externa, pero para reproducirse debe explotar
parcialmente la célula que infecta. Entonces el micoplasma entra en la célula).