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[CANCER RESEARCH 62, 518 –527, 15 de enero de 2002]
Detección de microarrays de ADNc en todo el genoma para correlacionar los perfiles de expresión génica con la
sensibilidad de 85 xenoinjertos de cáncer humano a los medicamentos contra el cáncer1
Hitoshi Zembutsu, Yasuyuki Ohnishi, Tatsuhiko Tsunoda, Yoichi Furukawa, Toyomasa Katagiri, Yoshito Ueyama,
Norikazu Tamaoki, Tatsuji Nomura, Osamu Kitahara, Rempei Yanagawa, Koichi Hirata y Yusuke Nakamura2
Laboratorio de Medicina Molecular, Centro del Genoma Humano, Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Tokio, Tokio 108-8639 [HZ, YF, TK, OK, RY, YN]; Instituto Central de
Animales Experimentales, Kanagawa 216-0001 [YO, NT, TN]; Laboratorio de Informática Médica, Centro de Investigación SNP, Riken (Instituto de Investigaciones Físicas y Químicas),
Tokio 108-8639 [TT]; Departamento de Patología, Universidad de Tokai, Facultad de Medicina, Kanagawa 259-1193 [YU]; y Primer Departamento de Cirugía, Universidad Médica de
Sapporo, Facultad de Medicina, Hokkaido 060-0061 [HZ, KH], Japón
ABSTRACTO
Uno de los problemas más críticos que deben resolverse con respecto a la quimioterapia
contra el cáncer es la necesidad de establecer un método para predecir la eficacia o la
toxicidad de los medicamentos contra el cáncer para pacientes individuales. Para identificar
los genes que podrían estar asociados con la quimiosensibilidad, utilizamos una
micromatriz de ADNc que representa 23.040 genes para analizar los perfiles de expresión en
un panel de 85 xenoinjertos de cáncer derivados de nueve órganos humanos. Los
xenoinjertos, implantados en ratones desnudos, se examinaron para determinar la
sensibilidad a nueve medicamentos contra el cáncer (5-fluorouracilo, 3 - [(4-amino-2-metil-5-
pirimidinil) metil] -1- (2- cloroetil) -1- clorhidrato de nitrosourea, adriamicina, ciclofosfamida,
cisplatino, mitomicina C, metotrexato, vincristina y vinblastina). Comparación de los
perfiles de expresión génica de los tumores con sensibilidades a cada fármaco identificado
1, 578 genes cuyos niveles de expresión se correlacionaron significativamente con la
quimiosensibilidad; 333 de esos genes mostraron una correlación significativa con dos o
más fármacos, y 32 se correlacionaron con seis o siete fármacos. Estos datos deberían
aportar información útil para identificar marcadores predictivos de sensibilidad a fármacos
que eventualmente puedan proporcionar "quimioterapia personalizada" para pacientes
individuales, así como para el desarrollo de nuevos fármacos para superar la resistencia
adquirida de las células tumorales a los agentes químicos.
INTRODUCCIÓN
La eficacia de los medicamentos contra el cáncer varía ampliamente entre
pacientes individuales. Una gran proporción de pacientes con cáncer sufren
efectos adversos de la quimioterapia mientras no muestran una respuesta efectiva
en términos de regresión tumoral. En la actualidad, no se puede predecir la
eficacia antes del tratamiento, con algunas excepciones, como el tratamiento con
tamoxifeno para pacientes con cáncer de mama con receptor de estrógeno
positivo. Numerosos investigadores han intentado establecer un método de
diagnóstico para predecir la quimiosensibilidad y se han identificado algunos
marcadores (1-4). Sin embargo, las propiedades de las células cancerosas están
determinadas por interacciones complicadas entre todos los productos génicos
expresados en las células cancerosas, y es seguro que muchas proteínas,
incluidas las enzimas involucradas en la apoptosis, la reparación del ADN y el
metabolismo y desintoxicación de fármacos, afectan las respuestas individuales.
Por eso,es decir, Para ofrecer un programa "personalizado" de quimioterapia más
eficaz y también para aliviar a los pacientes de efectos secundarios innecesarios,
se debe identificar un conjunto más grande de genes que sirvan como marcadores
predictivos precisos.
El desarrollo de la tecnología de microarrays de ADNc ha facilitado el análisis de
los perfiles de expresión de todo el genoma que pueden generar una gran
cantidad de información sobre las redes genéticas relacionadas con la respuesta a
varios fármacos y para identificar genes implicados en enfermedades patológicas.
Recibido el 23 de agosto de 2001; aceptado el 14/11/01.
Los costos de publicación de este artículo fueron sufragados en parte por el pago de cargos por página.
Por lo tanto, este artículo debe estar marcadoanuncio publicitario de conformidad con la Sección 1734 de
18 USC únicamente para indicar este hecho.
1 Apoyado en parte por la subvención 00L01402 (a YN) del Programa de Investigación para el
Futuro de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia.
2 A quién deben dirigirse las solicitudes de reimpresiones, en el Laboratorio de Medicina
Molecular, Centro del Genoma Humano, Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Tokio,
4-6-1 Shirokanedai, Minato-ku, Tokio 108-8639, Japón. Teléfono: 81-3-5449-5372; Fax:
81-3-5449-5433; Correo electrónico: yusuke@ims.u-tokyo.ac.jp.
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diciones. Por lo tanto, la micromatriz de ADNc es un método prometedor para
identificar genes asociados con la sensibilidad de los tumores a varios fármacos
contra el cáncer utilizando ARN amplificado extraído de una muestra muy pequeña
(5, 6).
Utilizando una micromatriz de ADNc que consta de 23.040 genes, obtuvimos perfiles
de expresión génica de 85 xenoinjertos de cáncer en ratones que se habían establecido a
partir de nueve órganos humanos diferentes. Aquí informamos la identificación de genes
en estos tumores que revelaron asociaciones significativas con la sensibilidad a uno o
más de los nueve medicamentos contra el cáncer examinados.
MATERIALES Y MÉTODOS
Xenoinjertos. Se trasplantaron un total de 85 xenoinjertos de cáncer humano a
BALB / c-nu / nu ratones. Los xenoinjertos se mantuvieron mediante trasplante sc
en serie de fragmentos de 2 - 2 - 2 mm en la región subaxilar derecha (Clea Japan,
Inc., Tokio, Japón) aproximadamente una vez al mes.
Medicamentos contra el cáncer. VLB,3 VCR y CPM (Shionogi & Co., Osaka,
Japón); 5FU (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO); MTX (Lederle Japan, Ltd., Tokio,
Japón); MMC y ADR (Kyowa Hakko Kogyo Co., Tokio, Japón); y Nimustine (ACNU;
Sankyo Co., Ltd., Tokio, Japón) se disolvieron en NaCl al 0,85% estéril justo antes de
su uso. Se disolvió DDP (Bristol-Myers Research Institute, Ltd., Tokio, Japón) en
NaCl al 0,85% estéril que contenía manitol al 1%. La dosis máxima tolerada para
cada uno de estos fármacos se determinó como se describió anteriormente (7).
Examen de xenoinjertos para quimiosensibilidad. Cada fármaco contra el cáncer se
administró individualmente, a la dosis máxima tolerada, a ratones desnudos que llevaban
xenoinjertos de cáncer humano. El tratamiento con un fármaco determinado comenzó cuando el
volumen del tumor alcanzó los 100-300 mm3. Los fármacos se administraron mediante inyección
intravenosa diaria durante 5 días en el caso de 5FU y MTX o como una sola administración para
todos los demás fármacos. El T / C promedio (%) de seis ratones tratados para cada fármaco con
respecto a seis controles no tratados para cada xenoinjerto se midió en cualquier día
experimental dado. La quimiosensibilidad estuvo representada por un valor de T / C (%) el día 14,
como se muestra en la Fig. 1 (8).
Extracción y purificación de ARN y preparación de sondas. Se extrajo el ARN
total de cada xenoinjerto usando reactivo TRIZOL (Life Technologies, Inc.) y se
purificó usando un kit de purificación de ARNm (Amersham Pharmacia Biotech) de
acuerdo con los protocolos del proveedor. Los ARN poli (A) de xenoinjertos y una
mezcla de ARNm combinado de cuatro tejidos humanos normales (cerebro,
pulmón, hígado y riñón) comprados en Clontech se amplificaron utilizando
Ampliscribe T7 Transcription Kits (Epicenter Technologies) y se marcaron con Cy5-
dCTP y Cy3. -dCTP respectivamente, como se describió anteriormente (9).
Microarrays de ADNc. Establecimos un sistema de microarrays de ADNc de "todo el genoma"
que contiene 23.040 ADNc seleccionados de la base de datos UniGene del Centro Nacional de
Información Biotecnológica. La fabricación de la micromatriz, la hibridación, el lavado y la
detección de intensidades de señal se describieron anteriormente (9). Para normalizar la cantidad
de ARNm entre los tumores y los controles, la proporción Cy5: Cy3 para la expresión de cada gen
se ajustó de modo que la proporción Cy5: Cy3 promediada de 52 genes domésticos fuera 1. (9).
Asignamos un valor de corte, utilizando un análisis de varianza, a cada diapositiva de microarrays.
Se excluyeron los genes cuyas intensidades de señal Cy3 o Cy5 eran inferiores a los valores de
corte.
3 Las abreviaturas utilizadas son: VLB, vinblastina; T / C (%), volumen tumoral relativo de los
ratones tratados con respecto al control; VCR, vincristina; CPM, ciclofosfamida; 5FU, 5-
fluorouracilo; MMC, mitomicina; ADR, adriamicina; MTX, metotrexato; ACNU, clorhidrato de 3- [(4-
amino-2-metil-5-pirimidinil) metil] -1- (2-cloroetil) -1-nitrosourea; DDP, cisplatino; GPX, glutatión
peroxidasa; MAP2K3, proteína quinasa quinasa 3 activada por mitógenos; MDR, resistencia a
múltiples fármacos; NSCLC, cáncer de pulmón de células no pequeñas.
 PERFILES DE EXPRESIÓN DE SENSIBILIDAD A FÁRMACOS ANTICANCER

Fig. 1. Nueve fármacos contra el cáncer y sensibilidades respectivas en cada uno de los 85 xenoinjertos, evaluados por T / C. Rojo, alta sensibilidad a la droga; verde, resistencia; gris, combinaciones que no fueron
probadas.

a partir de una investigación adicional. También excluimos los datos de genes donde la
relación señal: ruido era -3.
Análisis de clústeres de perfiles de expresión. Llevamos a cabo un análisis de
agrupamiento jerárquico para genes y muestras de tumores utilizando software
disponible en la web ("Cluster" y "TreeView") escrito por M. Eisen.4 Para obtener grupos
reproducibles, seleccionamos solo genes que pasaron un protocolo de filtro diseñado
para excluir: (a) genes en los que las intensidades de señal de Cy3 y Cy5 eran inferiores al
valor de corte; (B) genes cuyos valores se obtuvieron en -50% de las muestras analizadas;
Sensibilidad (1-T / C) de la droga. Seleccionamos genes que muestran una correlación
significativa (PAG - 0.01) y el valor absoluto de la pendiente de la recta de regresión
1.5, cuando la diferencia de los valores de T / C entre las muestras más y
menos sensibles se fijó como uno.
tabla 1 Número de genes que muestran una correlación significativa con la sensibilidad a nueve
medicamentos contra el cáncera

o (C) genes con SD en valores observados de -2. Antes de que se aplicara el algoritmo de
Todos los xenoinjertos (85) CPCNP (11) Cáncer de mama (14) Cáncer de estómago (13)
agrupamiento, la relación de fluorescencia para cada punto se transformó primero en
logaritmos y luego los datos de cada muestra se centraron para eliminar los sesgos
5FU 240 184 69 72
ACNU 290 151 78 101
experimentales. ADR 283 72 94 93
Identificación de genes asociados con fármacos contra el cáncer. Para estimar la CPM 459 168 103 92
correlación entre la razón de expresión (log2 Cy5: Cy3) y la sensibilidad a cada fármaco, DDP 217 166 76 100
MMC 321 137 199 102
calculamos un coeficiente de correlación de Pearson mediante la siguiente fórmula:r - (XI
MTX 219 92 75 171
Xsignificar) (yI ysignificar) / - XI Xsignificar)2(yI ysignificar)2,dónde XI representado Videograbadora 244 200 107 112
la relación de expresión logarítmica (log2 Cy5: Cy3) del gen x en el xenoinjerto i, mientras que yI VLB 210 201 109 60
representó la sensibilidad (1-T / C) del xenoinjerto i al fármaco y. Xsignificar representó la a Estos genes se identificaron no solo en 85 xenoinjertos, sino también en xenoinjertos de

media de la razón de expresión logarítmica del gen x, y ysignificar representó la media NSCLC, cáncer de mama y cáncer gástrico con el fin de explorar los genes relacionados con la
quimiosensibilidad dependiente de tejidos. Estos genes cumplieron los siguientes criterios:PAG -
0.01, y el valor absoluto de la pendiente de la línea de regresión fue mayor que 1.5 entre el rango
4 Dirección de Internet: http://genome-www5.stanford.edu/MicroArray/SMD/restech.html. de 100-T / C (ver “Materiales y métodos”).

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 PERFILES DE EXPRESIÓN DE SENSIBILIDAD A FÁRMACOS ANTICANCER

Fig. 2. Análisis de agrupamiento jerárquico bidimensional de perfiles de expresión entre 85 xenoinjertos. Ena, de 20,340 genes en el microarray, 961 fueron seleccionados para este análisis según
los criterios descritos en "Materiales y métodos". Rojo, genes que se sobreexpresaron en tumores en comparación con una mezcla de ARNm de órganos normales (cerebro, pulmón, hígado y riñón);
verde, disminución de la expresión; negro, expresión sin cambios; ygris, expresión nula o débil. EnB, En el eje de la muestra, los xenoinjertos de NSCLC se indican en rojo, los de cáncer de pulmón
microcítico en azul oscuro, los del páncreas en amarillo, los de colon en verde, los del cerebroglioma) en lavanda, los del neuroblastoma en rosado, los de cáncer gástrico en gris (incluyendo un
coriocarcinoma de estómago, SC16), los de mama en naranja (incluyendo dos filoides de cistosarcoma, MC3 y MC10, y un sarcoma estromal, MC6), los de ovario en púrpura, y los de coriocarcinoma en
azul claro. Los datos de MC9, un xenoinjerto de cáncer de mama que se analizó de forma independiente, se agruparon en la misma rama terminal.

Puntuación de sensibilidad a los fármacos. Utilizando los valores de la proporción de expresión
relativa de los genes asociados con los medicamentos contra el cáncer (Tabla 1), establecimos el algoritmo
para calcular la "puntuación de sensibilidad a los medicamentos". Calculamos la suma de log2 (Cy5: Cy3) de
genes multiplicado por el valor del coeficiente de correlación de Pearson para cada uno de los 85
xenoinjertos, como se describió anteriormente (10).
RESULTADOS
Análisis de conglomerados de perfiles de expresión génica de 85
xenoinjertos.Sometimos los perfiles de expresión de los 85 xenoinjertos a
un análisis de agrupamiento jerárquico para investigar similitudes entre
ellos. Se obtuvieron grupos reproducibles con 961 genes (ver "Materiales
520
y métodos ”); sus patrones de expresión en los 85 xenoinjertos se muestran en la
Fig.2a. Los perfiles de expresión del xenoinjerto MC9, analizados por duplicado de
forma independiente, se agruparon en la rama más cercana entre los xenoinjertos
en el eje de la muestra (Fig.2B). Los xenoinjertos derivados de glioblastoma,
neuroblastoma, carcinoma de pulmón de células pequeñas y coriocarcinoma se
clasificaron correctamente en ramas individuales específicas de tejido. Sin
embargo, los xenoinjertos establecidos a partir de carcinomas de mama, colon,
páncreas, estómago y ovario, así como carcinomas de pulmón de células no
pequeñas, no se agruparon en ramas únicas, lo que sugiere que esos tumores
tenían perfiles de expresión heterogéneos que reflejaban diferencias más amplias
en su naturalezas histológicas y / o biológicas.

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 PERFILES DE EXPRESIÓN DE SENSIBILIDAD A FÁRMACOS ANTICANCER

Fig. 3. Relación entre los niveles de expresión de

GPX2 y MAP2K3 y sensibilidad de los tumores a
CPM y VCR, respectivamente. Ena, niveles de
expresión de GPX2 (Iniciar sesión2 Cy5: Cy3) en los
85 xenoinjertos se trazan en el Y eje, y sus
sensibilidades a CPM (100-T / C) se trazan en el X
eje. Un coeficiente de correlación der - 0,59 indica
correlación negativa (PAG - 0,001). B, niveles de
expresión de GPX2 en los 11 xenoinjertos
derivados de NSCLC, mostrando una asociación
negativa más significativa con la sensibilidad a CPM
(r - 0,94, PAG - 0,001). C, niveles de expresión de
MAP2K3 en los 85 xenoinjertos y asociación
negativa0,29,
con PAG
sensibilidad VCR (rde
- 0,05). D,aniveles - expresión de
MAP2K3 en los 14 xenoinjertos derivados de cánceres
de mama y una asociación negativa más significativa
con la sensibilidad a la VCR (r - 0,91, PAG - 0,001).

Identificación de genes asociados con quimiosensibilidad. Para identificar genes que tienen asociaciones significativas con la eficacia de uno o onistas, no alcanzó los niveles en ratones desnudos que alcanzan en pacientes que
más de los nueve medicamentos contra el cáncer (5FU, ACNU, ADR, CPM, DDP, MMC, MTX, VCR y VLB) examinados en nuestro sistema de ratones reciben dosis clínicas, es difícil evaluar más la sensibilidad (T / C) de los tumores a
desnudos, analizamos los perfiles de expresión del genes filtrados de acuerdo con los criterios descritos en "Materiales y métodos". Se calcularon los esos dos fármacos. Por lo tanto, se seleccionaron 1228 genes seleccionados que
coeficientes de correlación de Pearson entre el nivel de expresión de cada gen filtrado y la quimiosensibilidad a cada fármaco en los 85 xenoinjertos de mostraban una posible asociación con la sensibilidad a al menos uno de los siete
cáncer. Como se muestra en la Tabla 1, cuando se analizaron 85 xenoinjertos juntos, un grupo de más de 200 genes pareció mostrar una correlación fármacos restantes para su posterior análisis. De esos 1228 genes, 333 revelaron
significativa con la sensibilidad a los nueve fármacos. Los niveles de expresión de 1578 genes se asociaron con sensibilidad a al menos uno de los una correlación significativa con dos o más fármacos, lo que sugiere que algunos
fármacos que examinamos. Cuando analizamos los datos por separado sobre la base de los órganos específicos de los que se habían originado los
mecanismos comunes pueden estar implicados en la respuesta al fármaco.
xenoinjertos, el poder estadístico para identificar asociaciones significativas fue menor porque los datos que discriminaban entre fenotipos sensibles y
Diecisiete genes parecían estar correlacionados con los siete fármacos y 15 genes
resistentes eran limitados. Sin embargo, debido a que los xenoinjertos de NSCLC, cáncer de mama y cáncer gástrico mostraron respuestas más variables
con seis (Fig. 4). Ninguno de los 333 genes que mostraron correlación entre el nivel
al panel de fármacos que los xenoinjertos derivados de otros órganos, todavía obtuvimos datos de asociación significativos para los xenoinjertos
de expresión y la respuesta a dos o más fármacos reveló resultados inversos de un
derivados de esos tres tejidos. Aunque el número de genes seleccionados fue menor, encontramos una correlación más significativa de los niveles de
fármaco a otro;es decir, si un gen mostró una correlación positiva con un fármaco,
expresión de algunos genes con la quimiosensibilidad en estos tres tejidos que la correlación obtenida por análisis utilizando los 85 xenoinjertos juntos.
también tuvo una correlación (es) positiva (s) con otros fármacos y, de manera
el poder estadístico para identificar asociaciones significativas fue menor porque los datos que discriminaban entre fenotipos sensibles y resistentes eran
similar, no se observaron excepciones en el caso de correlaciones negativas. Los
limitados. Sin embargo, debido a que los xenoinjertos de NSCLC, cáncer de mama y cáncer gástrico mostraron respuestas más variables al panel de
32 genes comúnmente asociados con la eficacia de seis o siete fármacos incluían
fármacos que los xenoinjertos derivados de otros órganos, todavía obtuvimos datos de asociación significativos para los xenoinjertos derivados de esos
ciclina B1 y benzimidazol 1.-, y otros 895 mostraron una correlación significativa
tres tejidos. Aunque el número de genes seleccionados fue menor, encontramos una correlación más significativa de los niveles de expresión de algunos
con la sensibilidad a solo uno de los siete fármacos, lo que posiblemente refleja la
genes con la quimiosensibilidad en estos tres tejidos que la correlación obtenida por análisis utilizando los 85 xenoinjertos juntos. el poder estadístico
quimiosensibilidad específica del fármaco.
para identificar asociaciones significativas fue menor porque los datos que discriminaban entre fenotipos sensibles y resistentes eran limitados. Sin

embargo, debido a que los xenoinjertos de NSCLC, cáncer de mama y cáncer gástrico mostraron respuestas más variables al panel de fármacos que los
Entre los 333 genes con respuesta a múltiples fármacos, detectamos
xenoinjertos derivados de otros órganos, todavía obtuvimos datos de asociación significativos para los xenoinjertos derivados de esos tres tejidos.
algunos cuyos niveles de expresión se correlacionaron con más importancia
Aunque el número de genes seleccionados fue menor, encontramos una correlación más significativa de los niveles de expresión de algunos genes con la
en xenoinjertos derivados de órganos específicos que en los 85 xenoinjertos
quimiosensibilidad en estos tres tejidos que la correlación obtenida por análisis utilizando los 85 xenoinjertos juntos. y el cáncer gástrico mostró
combinados. p.ej, el nivel de expresión de TNFRSF14, un miembro 14 de la
respuestas más variables al panel de fármacos que los xenoinjertos derivados de otros órganos, todavía obtuvimos datos de asociación significativos
superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral, mostró una
para los xenoinjertos derivados de esos tres tejidos. Aunque el número de genes seleccionados fue menor, encontramos una correlación más
correlación mucho más fuerte con la sensibilidad a ACNU en 11 xenoinjertos
significativa de los niveles de expresión de algunos genes con la quimiosensibilidad en estos tres tejidos que la correlación obtenida por análisis

de NSCLC (r - 0,87, PAG - 0,001) que en los 85 xenoinjertos combinados (r -

utilizando los 85 xenoinjertos juntos. y el cáncer gástrico mostró respuestas más variables al panel de fármacos que los xenoinjertos derivados de otros

0,42, PAG - 0,001; Figura 5,a y B). Además, en comparación con la correlación
0,94) fue más significativo que el de los 85 xenoinjertos
órganos, todavía obtuvimos datos de asociación significativos para los xenoinjertos derivados de esos tres tejidos. Aunque el número de genes seleccionados fue menor, encontramos una correlación más significativa de los niveles de expresión de algunos genes con la quimiosensibilidad en estos tres tejidos que la correlación obtenida por a

(r - 0,59; Fig. 3,a y B). Similar,MAP2K3 reveló un más fuerte en xenoinjertos de otros tejidos, estaba claro que el nivel de expresión de

correlación entre el nivel de expresión y la sensibilidad a VCR en los 14 TNFRSF14 casi no tiene relación con la sensibilidad a ACNU en xenoinjertos
xenoinjertos de cáncer de mama (r - 0,91, PAG - 0,001) que en todos los derivados de cánceres de mama o gástrico (Fig.5, Cy D).
xenoinjertos combinados (r - 0,29, PAG - 0,01; Fig. 3,C y D).
Por tanto, estos dos genes parecen estar estrechamente implicados en la eficacia Puntuación de sensibilidad a los fármacos. Para aplicar estos subconjuntos de genes al uso

específica de tejido de CPM o VCR, especialmente en lo que respecta a NSCLC o cánceres clínico, establecimos el algoritmo para calcular la puntuación de sensibilidad al fármaco utilizando

de mama. el valor de los niveles de expresión de los genes relacionados con la sensibilidad para cada

Identificación de genes correlacionados con dos o más fármacos contra el fármaco contra el cáncer (consulte “Materiales y métodos”). Como se muestra en la Figura 6,

cáncer. La Tabla 2 resume los datos de 20 genes que muestran los coeficientes de observamos la correlación significativa entre las puntuaciones y las sensibilidades a cada uno de

correlación de Pearson positivos o negativos más significativos para cada uno de los cinco fármacos contra el cáncer entre 85 xenoinjertos que revelaron varias respuestas a cada

los fármacos y los correspondientes PAGs calculados sobre la base de los datos del fármaco contra el cáncer, lo que indica la posibilidad de establecer un sistema de puntuación para

perfil de expresión de los 85 xenoinjertos. Debido a que las concentraciones predecir la sensibilidad a una fármaco contra el cáncer en particular que utiliza un conjunto de

plasmáticas de 5FU y MTX, que son antagonistas metabólicos genes.

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Tabla 2 Genes estrechamente relacionados con cada fármaco, identificados entre 85 xenoinjertos; los 20 genes que muestran los coeficientes de correlación de Pearson positivos o negativos más altos
están incluidosa

a r, coeficiente de correlación de Pearson; pendiente, la pendiente de la línea de regresión (consulte “Materiales y métodos”).

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Tabla 2 Continuado

DISCUSIÓN órganos. Por tanto, cierta presión selectiva puede fomentar una subpoblación de
tumores. Sin embargo, el último problema parecía tener una preocupación mínima
Para identificar marcadores moleculares que podrían predecir la quimiosensibilidad
siempre que nos centramos en los niveles de expresión de genes asociados con
de tumores individuales, analizamos los perfiles de expresión génica de 85 xenoinjertos
diferencias en la quimiosensibilidad. Con respecto al primer problema, puede ser
de cáncer humano en ratones desnudos después de tratar a cada ratón con uno de los
nueve medicamentos contra el cáncer (7, 11-13). Desventajas del enfoque de la
mejor analizar los materiales clínicos. Sin embargo, las condiciones de

quimiosensibilidad utilizando unen vivo modelo animal son: (a) el sistema interno para el metabolización o transporte de fármacos pueden diferir enormemente entre

metabolismo y / o suministro de fármacos en el ratón puede ser diferente al de los seres pacientes individuales de todos modos, debido a variaciones genéticas, edad, sexo
humanos; por lo tanto, es posible que la eficacia del fármaco en el modelo no siempre y condición física. Por tanto, aunque el metabolismo y el transporte de los
refleje correctamente lo que ocurre en el ser humano (14); y (B) debido a que los fármacos contra el cáncer no son exactamente iguales en ambas especies, en el
xenoinjertos se cultivan sc en ratones desnudos, el entorno local es diferente al de los modelo murino se puede investigar la eficacia de un fármaco a concentraciones
tejidos originales o metastásico similares en todos los ratones examinados. Además, repetido y
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Fig. 6. Se muestran puntuaciones de sensibilidad a

fármacos para xenoinjertos de cáncer humano a cada uno de
los cinco fármacos anticancerosos. Los xenoinjertos que
fueron más sensibles a cada fármaco reciben puntuaciones
más altas y los que fueron resistentes muestran
puntuaciones más bajas. Ena — e,Los coeficientes de
correlación entre las puntuaciones y las sensibilidades de 85
xenoinjertos a cada fármaco son los siguientes: CPM, 0,72 (
PAG - 8,8 - 10 15); ACNU, 0,69 (PAG - 3,0 - 10 13); ADR, 0,76 (
PAG - 8,7 - 10 17); DDP, 0,67 (PAG - 4,6 - 10 12); y VCR, 0,69 (PAG
- 8.0 - 10 13). Cada punto de la muestra de xenoinjerto indica
lo siguiente:F, glioma;
MI, cáncer de mama; Œ, coriocarcinoma; ,, cáncer de
colon;cruces cáncer gástrico; F, cáncer de pulmón; -,
neuroblastoma; -, cáncer de ovarios; y - cáncer de
páncreas.

se pueden realizar experimentos reproducibles con modelos de xenoinjerto, una
imposibilidad en casos clínicos; p.ej, podemos obtener información sobre la
eficacia de un fármaco en particular comparando los mismos tumores xenoinjertos
con o sin tratamiento farmacológico. En los casos clínicos, por otro lado, tenemos
que especular sobre la eficacia de los medicamentos contra el cáncer sobre la base
de los cambios en el tamaño del tumor, pero eso a veces es muy difícil de juzgar
porque las tasas de crecimiento de los tumores varían significativamente de un
paciente a otro. Debido a que la evidencia acumulada sugiere que las
quimiosensibilidades en los xenoinjertos tienden a concordar bien con los
resultados clínicos (7, 13), creemos que para obtener información sobre la
quimiosensibilidad frente a la expresión génica, un modelo animal tiene grandes
ventajas.
Como se muestra en la Fig. 2, los xenoinjertos derivados de NSCLC y cánceres
gástricos se distribuyeron en múltiples ramas. En cuanto a las características
clínico-patológicas, nuestros 11 xenoinjertos derivados de carcinomas de pulmón
de células no pequeñas consistieron en siete carcinomas de células grandes, dos
carcinomas de células escamosas (QG56 y Lu61) y dos adenocarcinomas papilares
(LC11 y LC17). Cuando se construyó el dendrograma en el
524
En base a la expresión génica, todos los xenoinjertos derivados de adenocarcinomas
papilares y carcinomas de células escamosas de pulmón se agruparon en la misma rama
(Fig.2B), mientras que cuatro de los siete xenoinjertos de carcinomas de pulmón de
células grandes se agruparon en la misma rama que los carcinomas de pulmón de células
no pequeñas, y los demás estaban dispersos. Asimismo, los xenoinjertos derivados de
cánceres gástricos se dividieron en seis ramas diferentes, lo que sugiere que las
características clínico-patológicas del cáncer de pulmón de células grandes y el cáncer
gástrico son relativamente heterogéneas (15, 16). El análisis de agrupaciones de muestras
de tumores sobre la base de la expresión génica podría abrir la posibilidad de un
diagnóstico detallado de cánceres individuales. Además, ahora podemos reconocer un
nuevo tipo de clasificación basada en la expresión génica mediante la exploración de una
gran cantidad de tejidos cancerosos, y los métodos actuales de terapia del cáncer podrían
mejorarse si se pudiera implementar esta nueva clasificación (17).
Aunque varios investigadores han informado sobre posibles reguladores
relacionados con la quimiosensibilidad de las células cancerosas (18), la
información disponible aún es muy limitada. El análisis de correlación de Pearson
realizado en nuestro estudio identificó cientos de genes candidatos asociados

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Fig. 4. Panel de 333 genes comúnmente correlacionados con sensibilidad o resistencia a dos o más fármacos contra el cáncer, sin incluir 5FU y MTX. Se indica el número de genes y fármacos que
comúnmente se correlacionan entre sí.Verde, una correlación positiva (sensible) entre la sensibilidad al fármaco y el nivel de expresión del gen; rojo, una correlación negativa (resistencia). La gradación
de los patrones de color correspondió al grado de coeficiente de correlación.

Fig. 5. Diferencias en la relación entre los niveles de

expresión de TNFRSF14 y sensibilidades a ACNU en
todos versus xenoinjertos específicos de tejido. Ena,en
los 85 xenoinjertos, el coeficiente de correlación entre el
nivel de expresión de TNFRSF14 y sensibilidad de las
células tumorales a ACNU (100-T / C) era débil (r - 0,42,
PAG - 0,001). EnB, en nueve xenoinjertos derivados de
NSCLC, excluyendo dos muestras cuyos valores para
este gen estaban por debajo del límite, la correlación
entre el nivel de expresión deTNFRSF14 y sensibilidad a
ACNU (100-T / C) fue fuerte (r - 0,87, PAG - 0,001). EnC y
D, en nueve xenoinjertos de cánceres de mama y 13 de
cánceres gástricos, la correlación entre el nivel de
expresión de TNFRSF14 y la sensibilidad a ACNU fue
mucho más débil que la obtenida en xenoinjertos de
NSCLC (cáncer de mama: r - 0,14, PAG
0,1; gástrico
cáncer: r - 0,15, PAG 0,1).

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ciado con sensibilidad a los fármacos contra el cáncer en 85 xenoinjertos. Algunos de los
genes enumerados en la Tabla 2 también han sido indicados por otros por sus relaciones
con la quimiosensibilidad, lo que respalda la confiabilidad de nuestro análisis.
p.ej, Otro estudio mostró que los niveles de expresión de la topoisomerasa II--,
una diana molecular de la RAM, se correlaciona positivamente con la sensibilidad a
ese fármaco (19, 20); nuestros datos también indicaron una correlación positiva (r -
0,44, PAG - 0,001) entre la expresión de la topoisomerasa II-- y sensibilidad a la
RAM entre los 85 xenoinjertos. De manera similar, se informó que la expresión
abundante de timidilato sintetasa, que inactiva 5FU a 5-fluoro-dUMP, se
correlaciona con la resistencia de las células de cáncer de colon a 5FU (21).
Nuestros propios datos revelaron consistentemente una correlación negativa (r -
0,29, PAG - 0,01) entre los niveles de expresión de timidilato sintetasa y la
sensibilidad a 5FU. Además, la aldehído deshidrogenasa 1, que está involucrada en
la resistencia de las células tumorales a CPM, se correlacionó negativamente con la
sensibilidad a CPM (r - 0,5, PAG - 0,001) de acuerdo con un informe anterior (22).
También identificamos genes que se asociaron con quimiosensibilidad en cánceres
de órganos específicos (Tabla 1). Aunque esas correlaciones no fueron
concluyentes porque el número de muestras utilizadas para cada análisis fue
pequeño, la expresión de los genes involucrados puede reflejar diferencias
relacionadas con la especificidad del tejido. Esta observación debe verificarse en
un panel más grande de xenoinjertos.
Entre los genes que muestran correlación con dos o más fármacos contra el
cáncer (Fig. 4), 32 se correlacionaron con la sensibilidad a seis o siete fármacos; Es
probable que tales asociaciones múltiples sean más significativas que las de otros
genes que mostraron correlación con uno a cinco fármacos, y estos 32 genes o sus
productos podrían ser moléculas más útiles para el diagnóstico de
quimiosensibilidad, así como buenos objetivos para el desarrollo de nuevos
fármacos. para superar la resistencia adquirida de las células tumorales a los
agentes químicos. De los 32 genes de la lista, ya se ha demostrado que algunos
están asociados con la quimiosensibilidad,p.ej,La proteína de la bóveda principal,
un regulador negativo para todos los medicamentos probados aquí excepto VLB,
es esencial para la estructura de la bóveda normal. De acuerdo con nuestros
datos, Kitazonoet al. (23) demostraron que la principal proteína de la bóveda
estaba involucrada en la resistencia a ADR, VCR, VP-16, Taxol y gramicidina D; esta
proteína parece tener un papel importante en el transporte de ADR entre el núcleo
y el citoplasma en la línea celular de carcinoma de colon humano SW-620 (23-25).
CYP3A5, un miembro de la subfamilia 3A del citocromo P450 (hemetiolato
monooxigenasas), está involucrado en una vía de transporte de electrones
dependiente de NADPH. El producto de este gen oxida una variedad de
xenobióticos y participa en su desintoxicación (26, 27); también juega algún papel
en el metabolismo de CPT-11 (28). Por lo tanto, una mayor expresión deCYP3A5
puede mejorar la desintoxicación y la inactivación de los medicamentos contra el
cáncer y conferir resistencia a los medicamentos a las células cancerosas. Con
respecto aUGT1A1, su importancia en la vía de desintoxicación de CPT-11 ya es
bien conocida (29). Aunque no tenemos datos para CPT-11, nuestros datos apoyan
un papel importante paraUGT1A1en la vía metabólica de otros fármacos contra el
cáncer. Galectina 4 (LGALS4) está involucrado en el ensamblaje de uniones
adheridas y aumenta el potencial maligno en algunos cánceres del sistema
digestivo (30, 31). Expresión deLGALS4 está más altamente regulado en focos
metastásicos que en los correspondientes tumores primarios (31), aunque su
papel en la quimiosensibilidad debe aclararse. Además, los genes que codifican
receptores de superficie celular o moléculas de adhesión celular, comoTNFRSF14,
laminina - 3, proteína de unión gap, - 1 (GJB1) y antígeno CD74 (CD74), pueden ser
buenos objetivos para el desarrollo de nuevos fármacos para superar la resistencia
a los fármacos. Se ha sugerido que las proteínas MDR están asociadas con la
resistencia a una amplia variedad de fármacos contra el cáncer (32). Nuestra
micromatriz de ADNc incluye siete genes que pertenecen al casete de unión de
ATP, subfamilia B (MDR / transportador asociado con el procesamiento de
antígenos). Entre ellos, el nivel de expresión deMDR4se correlacionó
significativamente con la sensibilidad a 5FU y VLB (PAG - 0.01), la de MDR3 se
correlacionó con la sensibilidad a 5FU
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(PAG - 0.01), y también el de MDR9 se correlacionó con la sensibilidad a MMC
(PAG - 0,05).
Nuestros experimentos seleccionaron ciclina B1 y gemación desinhibida por
benzimidazol 1 - como dos genes cuya expresión reducida probablemente induzca
quimiorresistencia en las células cancerosas. La expresión de ambos genes
depende del ciclo celular y es detectable en el G2-Fase M (33, 34). Debido a que
muchos medicamentos contra el cáncer inducen un paro en G2-M (35, 36),
sospechamos que la anulación de la detención del ciclo celular debido a la
disminución de la expresión de estos dos genes puede permitir que las células
cancerosas sobrevivan al estrés causado por los medicamentos contra el cáncer.
La lista de genes cuyo nivel de expresión mostró una relación significativa con la
sensibilidad a dos o más fármacos también incluye los de interés biológico y
médico.GPX2, que mostró asociaciones significativas con cinco fármacos en
nuestros experimentos, se ha informado que protege las células cancerosas del
clorambucilo y el melfalán (37). Los genes asociados con la reparación del ADN, el
homólogo 6 de Mut-S y el dominio RING 1 asociado a BRCA1, o los involucrados en
la regulación del ciclo celular, las ciclinas D1 y E1, también se han asociado con la
respuesta al daño del ADN o la sensibilidad a los fármacos (38, 39).
Como se muestra en la Fig. 6, establecimos el algoritmo para calcular la
puntuación de sensibilidad al fármaco utilizando el valor de los niveles de
expresión de los cientos de genes relacionados con la sensibilidad para cada
fármaco contra el cáncer (Tabla 1). Ciertamente, todavía no está claro si nuestros
datos reflejan exactamente la capacidad de respuesta clínica de los pacientes
humanos con cáncer y si todos los cientos de genes enumerados en este estudio
pueden de hecho desempeñar un papel importante en la quimiosensibilidad de las
células cancerosas. Sin embargo, los datos presentados aquí deberían
proporcionar un conjunto inicial de genes candidatos que pueden ser aplicables al
diagnóstico de quimiosensibilidad. Como siguiente paso, debemos evaluar los
materiales clínicos para determinar cuáles de los genes seleccionados son
realmente importantes y potencialmente útiles para la predicción de la
quimiosensibilidad. Usando una pequeña cantidad de material de biopsia,en vivo
modelo animal. Esto podría conducir a un tratamiento apropiado para cada caso
canceroso individual. Las investigaciones clínicas también podrían definir dianas
moleculares para superar la resistencia a los fármacos en los tumores. La
acumulación de tales datos debería conducir eventualmente a una “quimioterapia
personalizada” con medicamentos contra el cáncer más efectivos y menos dañinos
y mejoras en la efectividad terapéutica si se pueden identificar y modular los genes
asociados con la resistencia a los medicamentos.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a Hiroko Bando, Noriko Nemoto y Noriko Sudo por su ayuda en la
fabricación de la micromatriz de ADNc y los Dres. Chikashi Kihara, Jun-ichi Okutsu,
Shingo Dan, Akira Togashi, Takefumi Kikuchi y Kenji Hirotani por una discusión útil.
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Cáncer Res 2002; 62: 518-527.

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