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"Técnica de tinción rápida para determinar la viabilidad potencial de algunos

huevos de helmintos"

Article · January 1998

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María Neftalí Rojas-Valencia

Universidad Nacional Autónoma de México
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 Técnica de tinción rápida para determinar
la viabilidad potencial
de algunos huevos de helmintos
MA. NEFTALí ROJAS VALENCIA
Instituto de Ingeniería, UNAM, Coordinación de Ambiental

RESUMEN
Para determinar la viabilidad potencial de los huevos de helmintos, se de-
sarrolló y validó una técnica de tinción rápida, eficiente, sencilla y económica,
que se fundamenta en el uso de los colorantes biológicos azul tripán, safranina
"O" y eosina "Y", La técnica permite detectar los cambios de permeabilidad de
la cubierta externa de los huevos, misma que se ha demostrado está relacio-
nada con el desarrollo embrionario y la viabilidad, ya que los huevos no via-
bles son permeables a los colorantes, mientras que los que permanecen via-
bles, no se tiñen. Además, esta técnica ha sido ajustada a la técnica cuantita-
tiva de concentración por filtro en membrana y aplicada exitosamente en el
análisis de muestras de aguas crudas y tratadas.

PALABRAS CLAVE: tinción rápida, huevos de helminto, viabilidad.

.NTRODUCCIÓN sidera viabilidad potencial, porque el desarrollo puede verse

Los estudios epidemiológicos asociados con el uso de las interrumpido por diferentes causas y no llegar a la etapa infec-
aguas residuales en la agricultura, en algunas regiones de! ciosa (Rojas, 1998 y Rojas et al., 1998).
mundo y en particular en México, han evidenciado que existen En la práctica actual, para determinar si un huevo es verda-
riesgos de adquirir enfermedades diarreicas e infecciones in- deramente viable, es necesario obseNar su desarrollo embrio-
testinales ocasionadas por virus, bacterias, protozoarios y nario, en condiciones naturales, por medio de técnicas tradi-
helmintos. cionales de incubación que son de dos tipos:
El término «helminto» ha sido asignado a un amplio grupo
de organismos que incluye a todos los gusanos parásitos de a) incubación in vivo. que consiste en inocular animales de
humanos, animales y vegetales. Una de las formas de disemi- experimentación, como conejos, cerdos etc. con los huevos
nación de estos organismos en el medio ambiente es, en su de helmintos, esperar el tiempo requerido para el desarrollo
estadio de huevo, como se ha encontrado en grandes canti- de los embriones y después sacrificar a los animales al térmi-
dades en las aguas residuales provenientes de las excretas no del ciclo biológico del parásito para examinar los órganos
de individuos enfermos o portadores. En México, las helmin- afectados por la presencia de larvas; y
tiasismás frecuentes son las ascariasis (30%), tricuriasis (21%), b) incubación in vitro. para la cual los huevos se colocan en
enterobiasis (19%) y uncinariasis (17%). En comunidades ru- un soporte y se incuban bajo condiciones favorables para que
rales y zonas tropicales se ha encontrado más del 90% de la los embriones se desarrollen hasta la etapa infectante.
población infectada, entre enfermos y portadores; se estima
que una tercera parte de la población mundial está afectada En ambas técnicas, el tiempo de respuesta toma, como
por ascariasis producida por el nemátodoAscaris lumbricoides mínimo, 21 días (dependiendo del ciclo vital de las distintas
(Tay, 1995). La presencia de las formas infectivas (huevos) de especies de helmintos), lo que significa que no son análisis
estos organismos en el ambiente, especialmente en las aguas prácticos para la determinación del rresgo a la salud de aguas
para riego, así como en suelos y cultivos, es uno de los princi- residuales tratadas aplicadas al riego.
pales indicadores de contaminación fecal. Dado que estos métodos son complicados y toman dema-
Se reconocen principalmente dos tipos de huevos de hel- siado tiempo, se ha tratado de determinar si un huevo es po-
mintos, los infértiles o no fecundados y los fértiles o fecunda- tencialmente viable mediante el empleo de algunos procedi-
dos (Schmidty Roberts, 1984). Un huevo fértil es considerado mientos no convencionales, por ejemplo, la observación de la
también un huevo potencialmente viable, es decir, que tiene la presencia o ausencia de la corteza externa y la movilidad de
capacidad para desarrollarse hasta la etapa infecciosa. Se con- los embriones estimulados con enzimas (Lambert, 1975 y

22
 Técnica de tinción rápida para determinar la viabilidad potencial de algunos huevos de helmintos

Schmidt & Roberts, 1984); sin embargo, estos métodos no 2. Equipo de filtración para membrana de 25 mm de diáme- ca
han sido validados. Por otra parte, un procedimiento no con- tro (swinex) Millipore oequivalent~, con jeringa de plástico de u
.-
vencional que ha dado buenos resultados, es por tinción vital, 50 mi. c
desarrollado por primera vez por Zhou etaJ. (1985), yen
cual se empleó únicamente el colorante azul de metileno eosina-
borax. Con base en estos estudios, se desarrolló una técnica
el 3. Sistema de vacío para operar a un máximo de 40 cmHg.
4. Centnfuga para operar a 2,500 rpm, con rotor para tubos
de 250 y 50 mi.
--u
..G)

ca
de tinción con diferentes colorantes biológicos, la cual se de- 5. Microscopio con cámara y objetivos de 1 OX, 4OX y 100X. o
talla a continuación. 6. Membranas para filtración, Millipore o equivalentes, de 25 Z
y 47 mm de diámetro con poros de 8.0 .11m.
Fundamento 7. Tubos para centrífuga, de plástico, de fondo plano, de 250
La técnica de tinción se basa en los cambios de permeabi- y 50 mi de capacidad.
lidad de la cubierta vitelina de los huevos, provocados por la 8. Garrafones de plástico de 10 ó 5 litros de capacidad, con
modificación de las estructuras tapón de rosca, para la toma de
químicas de los componentes de muestras.
esta envoltura, una vez que se ha La técnica constituye una 9. Portaobj~tos y c~breobjet~.
perdido la viabilidad o durante la .10. Solución salina Isotónlca
eclosión, es decir, cuando la larva excelente herramIenta (NaCI al 0.85%): disolver 8.5 g de
sale del cascarón, momento en el de evaluación rápida de la NaCI en 1,000 mI de agua destila-
cual la propia larva produce una .., " da.
serie de metabolitos que cambian calidad parasltologlca de 11. Solución acuosa de sulfato de
la estructura química de la envol- las aguas residuales crudas zi.nc (ZnSO..7H2O) al 33.1% (p~):
tura de los huevos y las vuelve disolver 331 g de sulfato de zinc
susceptibles al ataque de una va- y tratadas, que se pretenden en 1,000 mi de agua destilada.
riedad de sustancias " Se ha de- U t I Ol Izar
O para "
rIego d e a , reas 12. Solución
.., de lugol: Disolver

mostrado que tales caracterlstlcas con agltaclon en 100 mi de agua

están relacionadas con la viabili- verdes como parques, destilada 1.0 g de yoduro de po-
dad (Rojas, 1998 y Rojas et al., " " tasio (KI) y 1.5 g de yodo en polvo
1998). JardInes escolares, campos (1);vaciar en un frasco de vidrio de
Este método puede acoplarse de golf y, principalmente, la color ámbar con tapón no métalico
a técnicas cuantitativas (como es" " , y dejar en reposo durante cuatro
el caso de la concentración porfil- destinada para rIego agrlcola días antes de usarla (la solución
tro en membrana y posterior lec- permanece estable durante seis
tura en membrana transparente) meses).
para evaluar, en un sólo paso, la concentración 'de huevos de 13. Solución acuosa al 0.1 % (p/v) de uno de los colorantes
helmintos así como la fracción potencialmente viable. De esta vitales: azul tripán, safranina "O" o eosina "Y".
forma, la técnica constituye una excelente herramienta de eya- 14. Glicerol.
luación rápida de la calidad parasitológica de las aguas
residuales crudas y tratadas, que se pretenden utilizar para Toma de las muestras
riego de áreas verdes como parques, jardines escolares, cam- Si el agua que se va a muestrear presenta poca turbiedad
pos de golf y, principalmente, la destinada para riego agrícola. o sólidos suspendidos, deberá tomarse una muestra de 10
La técnica de concentración por filtración fue desarrollada litros en un garrafón de plástico perfectamente limpio y enjua-
y validada para aplicarse en aguas de abastecimiento (Galván, gado con agua destilada; procurar tomar las muestras en si-
1991), pero se ha comprobado que puede aplicarse también tios donde haya mezclado, y si el agua está estancada, tomar
en aguas residuales mezcladas y efluentes tratados (Galván et además una muestra de los sedimentos.
al., 1996 Y Rojas, 1998), que contengan poca turbiedad y sóli- Si se trata de aguas residual es crudas o efluentes tratados,
dos suspendidos, además de bajas concentraciones de hue- se toman 5 litros de muestra, procurando hacerlo donde haya
vos de helmintos (de 1 a 50). mezclado; si el agua está estancada o tiene poco movimiento,
Los huevos contenidos en las muestras se recuperan por tomar también una muestra del sedimento.
flotación con solución de sulfato de zinc al 33.1 %; el recuento Es recomendable transportar los recipientes al laboratorio
se lleva a cabo por observación microscópica directa de una en refrigeración. Las muestras deberán analizarse de prefe-
membrana de ésteres de celulosa, con poros de 8.0 mm de rencia inmediatamente, de ser necesario podrían ser almace-
diámetro, teñida con lugol o con un colorante vital si se desea nadas en refrigeración durante un periodo máximo de 15 días.
determinar simultáneamente viabilidad potencial.
Método
Material, equipo y reactivos 1. Si la muestra contiene sólidos suspendidos o basura de
1. Equipo de filtración preferentemente de plástico, para mem- diversa índole, será necesario un paso de prefiltración antes
brana de 47 mm de diámetro, Millipore o equivalente. del filtrado por membrana, para lo cual se deberá homogenei-

23
 Técnica de tinción rápida para determinar la viabilidad potencial de algunos huevos de hel.rnintos

ca
.-C.)
c
--
C.)
..Q)

ca
o
z

zar la muestra perfectamente y pasarla por un tamiz de gasa. cinco minutos y desechar los sobrenadantes; repetir el proce-
Un litro del filtrado se procesará como se indica. dimientO hasta obtener un sobrenadante claro. Continuar con
2. En caso de que .la muestra no contenga sólidos, agitarla el paso 5.
vigorosamente para desprender los organismos adheridos,.a
las paredes internas del recipiente y filtrar al menos un litro, 3. Ensamblar el equipo de filtración como se indica en la figu-
aplicando vacío máximo de 40 cmHg; al término, lavar las pa- ra 1 .utilizar los fórceps para colocar en su lugar una membra-
redes del recipiente de na de 47 mm d~ diámetro y poros de 8.0 Jim.
muestreo y del embudo de 4. Colocar la membrana sobre la pared interna de un tubo de
Es recomendable filtración con solución saJi- centrífuga de 50 mi de capacidad y rasparlaperfectamente
transportar los recipientes na isotónica (NaCI al 0.85%) con una espátula; lavar la membrana y la espátula con solu-
y pasar estos lavados por ción de sulfato de zinc al 33.1 %. recibiendo todos los lavados
al laboratorio el mismo filtro. Continuar en el mismo t~bo.
en refrigeración. con el paso 3. 5. Añadir al tubo 25 mi de sulfato de zinc y homogeneizar
perfectamente (de preferencia con un vortex); añadir más
Las mul ---,
estras ClelJeran Si las muestras son de sulfato hasta completar el volumen de 50 mi; centrifugar a 2,300
.aguas crudas, contienen rpm durante tres minutos.
analizars e de preferencia cantidades apreciables de

inmedia tamente, de ser sólidos suspendidos, o si Si no se requiere fijar las preparaciones, en este paso se
., son de sedimentos, es me- pueden tomar y colocar varias alícuotas de 0.1 mi del so-
necesa rla podrlan ser jor concentrar las muestras brenadante enportaobjetos, adicionar 0.1 mi de una solución
acuosa al 0.1 % de cualquiera de los colorantes azul tripán,
almé Icenadas en por centrifugación, por lo
-, que será pecesario distri- safranina «O..o eosina "Y", montar eJcubreobjetos y observar
refrige, raclon durante buir 250 mi de muestra en la presencia de huevos teñidos y no teñidos. En caso de tomar
riada máximo cada uno de los cuatro fras- fotografías, habrá que hacerlo de inmediato ya que si se seca
unpel
cos de centrífuga, y cen- la preparación, se pierde la posibilidad de registrar la obser-
dle 15 días trifugar a 2,500 rpm duran- vación.
te cinco minutos; desechar Si se requiere fijar las muestras y cuantificar, continuar con
los sobrenadantes, resus- el paso 6.
pender los sedimentos en solución salina isotónica y agitar
vigorosamente. Pasar todos los sedimentos a tubos de centrí- 6. Vaciar el sobrenadante a una jeringa de 50 mi conectada
fuga de 50 mi de capacidad. Centrifugar a 2,500 rpm durante a un sistema de microfiltración, como se muestra en la figu-

24
 de tinci6n rápida para determinar la viabilidad potencial de algunos huevos de helmintos

microscopio usando los objetivos de 10 y ca

40 aumentos y contar los huevos teñidos y .-u
sin teñir. c

-''""..::;~
10. Etiquetar las muestras indicando
cha, colorante empleado, especies obser-
vadas, etc.
fe-
--u
'Q)
ca
o
~ -2
Si se desea conservar las preparacio-
Z
-
-
Filtro Swinex nes para tomar fotografías, determinar con

~ 2. Jeringa
precisión las especies que se observan, o
si se presenta algún cambio en los huevos
observados, se puede hacer con la adi-
ción de glicerina y el almacenamiento en
obscuridad por el tiempo que se quiera,
ya que no se altera el color ni la posición
del huevo.

a)
Expresión de resultados
Si sólo se r~quiere la cuantificación,
contar todos los huevos de helmintos que
se encuentren en la preparación y realizar
los cálculos para expresar los resultados
como número total de huevos por litro.
~ -.,,-6 Si se utilizó alguno de los colorantes
vitales aquí citados, contar el número de
huevos que no se tiñeron (huevos viables)
«~ -5 1 Base de acero inoxidable, salida Luer
y los que sí se tiñeron (huevos no viables),
2 Anillo de teflón
y expresar el resultado en términos de nú-

c~,,~
3 Soporte del filtro mero de huevos potencialmente viables por
-4
4 Filtro de membrana (25 mm cII) litro.
-3 5 Anillo de teflón
Eficiencia y confiabilidad
íC~ -2
6 Entrada Luer, de acero inoxidable
La técnica de tinción fue calibrada utili-
zando una suspensión fresca de huevos
de Mcaris suum, con resultados confiables
dentro del intervalo del 95% en un máximo
de 6 horas (Rojas, 1988 y Galván et al.,
b)
1988).

I CONCLUSIONES
Los colorantes biológicos mencionados
ra 2, equipado con un filtro de membrana de 25 mm de diá- en este trabajo, además de ser baratos y de fácil adquisición,
metro y poros de 8.0 Jim. Filtrar aplicando poca presión.7. son estables en solución acuosa por largo tiempo, lo que faci-
Si sólo se requiere identificar y/o cuantificar, hay que aña- lita que sean aplicados por laboratorios involucrados en la eva-
dir a la jeringa 10 mi de solución de lugol y filtrar. Si se desea luación de la calidad del agua para reuso.
también evaluar la viabilidad potencial, añadir en lugar dellugol, Es factible determinar la viabilidad potencial de algunos
2 mi de cualquiera de los colorantes biológicos azul tripán, huevos de helmintos como los huevos de Ascaris y Trichuris
eosina "Y" o safranina "O" (en soluciones acuosas al 0.1 %) Y presentes en aguas residuales crudas y tratadas. Sin embar-
filtrar. go, es necesario efectuar un estudio más profundo para eva-
8. Sacar la membrana y colocarla sobre un papel filtro du- luar la eficiencia de la tinción en otras especies de helmintos.
rante no más de 2 minutos, para que pierda el exceso de hu- La técnica cuantitativa de filtración en membrana combina-
medad. da con la de tinción, se puede emplear de manera confiable
9. En un portaobjetos, colocar una gota de glicerol y poner para determinar el número total de huevos de helmintos así
encima la membrana deshidratada, añadir otra gotq de glice- como la fracción que presenta viabilidad potencial en un sólo
rol, montar el cubreobjetos procurando que no queden burbu- paso.
jas de aire atrapadas; dejar reposar la membrana durante Aunque los procedimientos descritos son sencillos, es re-
media hora para que se haga transparente. Observar con el comendable que el personal que aplique estas técnicas tenga

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~-
1.
Técnica
 Técnica de tinción rápida pala determinar la viabilidad potencial de algunos huevos de helmintos

"
'O
z

conocimientos prácticos y experiencia en la identificación International Conference, 9th Health Related Water Microbiology Si m-
microscópica de las estructuras parasitarias. ya que el agua posium, Vancouver, Canadá, 1998.
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puede contener materiales que un observador inexperto con-
nual Moderno, S.A., México D.F., 1975, 45 pp.
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