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Cultivo de embriones bovinos:

Esterilización y control de calidad


y toxicidad en los laboratorios de
producción de embriones.
Parte (I)

A.T. Palasz y J. de La Fuente


Dept. de Reproducción Animal y Conservación de Recursos Zoogenéticos. INIA, Madrid
Julio de la Fuente

Introducción una solución de alcohol al 70%. En condiciones de granja


se ha de hacer un esfuerzo adicional usando papel limpio,
Aunque los procedimientos para el cultivo de em- a ser posible estéril, para las superficies de manipulación
briones han sido establecidos hace mas de 100 años (He- de los embriones. Deberá estar prohibido, fumar, comer
ape, 1891), el desarrollo de técnicas in vitro para producir o beber en todas aquellas zonas donde se manipulen los
embriones ha ido tomando relevancia durante el paso del embriones y la higiene personal (usando batas limpias, cu-
tiempo. Sin embargo la aplicación, desde un punto de bre zapatos y guantes de plástico), así como procurar una
vista comercial, de los embriones producidos por fecunda- desinfección metódica (con alcohol) antes de manipular a
ción in vitro (FIV) es aun muy limitada debido fundamen- los embriones.
Una rutina talmente a la baja eficiencia y repetibilidad de los sistemas
diaria de de cultivo in vitro. Equipamiento
limpieza y Es por tanto de gran importancia disponer de es- Solo el equipamiento estrictamente necesario; Mi-
control de la trictas medidas de control de la calidad en el laboratorio croscopio, lupa y micromanipuladores, platina calen-
asepsia en las de FIV, así como tratar de evitar la toxicidad que sobre
el semen y los embriones pueden llegar a producir los
tadora, estufa de cultivo, congelador y Biocongelador,
osmómetro y pH-metro, deben estar dentro del labo-
superficies en materiales utilizados para su manipulación. ratorio. Ha de tenerse un cuidado especial para man-
contacto con tener limpias las superficies externas de los equipos,
los envases de limpiándolas al menos semanalmente. Deben ponerse
coberturas a los microscopios y micromanipuladores,
los embriones Medidas de Control de Calidad limpiar las superficies donde se depositen las placas con
prevendrán las muestras con una solución de alcohol al 70%, con
una posible En el Laboratorio tiempo suficiente para permitir que el alcohol se eva-
pore antes de empezar a trabajar con los embriones. Ha
contaminación El laboratorio debe estar separado de los locales para de ponerse una atención especial al incubador, ya que
de los cultivos el alojamiento y la obtención de embriones y gametos de la elevada temperatura y la alta humedad ambiental
en el incubador los animales y solo deberán tener acceso a él las personas
directamente relacionadas con la manipulación in vitro de
hacen un caldo de cultivo perfecto para el crecimiento
de cualquier bacteria, hongo o virus. Una rutina diaria
los embriones. El suelo y las paredes deberán limpiarse de limpieza y control de la asepsia en las superficies
de forma rutinaria con desinfectantes, de probada acción en contacto con los envases de los embriones preven-
no toxica para los embriones, al igual que las zonas de drán una posible contaminación de los cultivos en el
trabajo como son las mesadas y en particular la mesa de incubador, el cual además ha de situarse en una zona
flujo laminar, que ha de ser limpiada frecuentemente con de tráfico ligero del personal y de mínimo movimiento
Efectos del tipo de conservante añadido al ensilado de trigo sobre la producción y composición
Cultivo de embriones bovinos: Esterilización y control de calidad y toxicidad en los laboratorios de producción de embriones
química de la leche
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Diferentes tipos de jerin-


de aire. El contenedor del agua del incubador ha de gas y filtros.
limpiarse mensualmente y rellenarse con agua destila-
da, añadiendo 10-12 gotas de solución de limpieza de
baños maría de Sigma (Sigma #S-5525) por cada 5 li-
tros. Debe instalarse un filtro de 200 nm de poro en los
tubos de entrada de gases al incubador. Mientras que
algunos técnicos piensan que se ha de limpiar men-
sualmente el incubador, otros tienen la estrategia con-
traria, esto es, la de no tocar los incubadores mientras
no exista contaminación. Diariamente debe controlarse
la temperatura, CO2 y la humedad y ajustarse si fuera
necesario.

La toxicidad potencial de los


diferentes tipos de jeringas
El numero de espermas vivos, los porcentajes de movilidad
Se conoce desde hace bastante tiempo que al- y de movilidad progresiva, fueron determinados después
gunos materiales resultan ser tóxicos para los diferentes de la colecta cada 15 minutos durante 1 hora. En el pri-
tipos celulares, en especial después de determinados mé- mer experimento, el numero de espermas vivos no se vio
todos de esterilización. Así pues, está siendo una practica afectado por el tratamiento. Sin embargo, se apreció un
habitual el testar la posible existencia de toxicidad en los descenso (P < 0.01) de la movilidad progresiva y de los
materiales que van a estar en contacto directo con los porcentajes de movilidad a los 30, 45 y 60 minutos en el
gametos y embriones. El lubricante del émbolo de ciertos Grupo B (diluyente incubado con émbolos de goma) al ser
tipos de jeringas de plástico ha sido determinante para comparado con los otros cuatro grupos, no se apreciaron
la generación de problemas tóxicos, tanto en el esperma diferencias en el semen mantenido en jeringas con émbo-
como en los embriones. los de goma o de plástico. En el segundo experimento, los
porcentajes de progresión espermática se incrementaron
Espermatozoides después de la adición de diluyente fresco.

Fueron realizados dos experimentos para de- Embriones


terminar hasta que punto podían resultar espermicidas
los émbolos de las jeringas de plástico (Broussard et al., La toxicidad potencial de diferentes jeringas produ-
1993). Los émbolos de goma o de plástico fueron culti- cidas por diferentes fabricantes fue estudiada mediante
vados por separado junto al diluyente espermático duran- el cultivo de embriones de ratón (Boone y Shapiro 1990).
te 24 horas a 40C. Después de la incubación el diluyente El medio de cultivo fue expuesto a diversos útiles de
fue conservado a -200C hasta el momento de la colecta plástico durante 16 horas y después colocado en placas
del semen. Como control se utilizó diluyente incubado a multi pocillos en las que fueron incubados embriones
40C durante 24 horas. Los tratamientos consistieron en de ratón de dos células, durante 72 horas en 5% CO2 en
lo siguiente: Grupo A; Semen equino mas diluyente con- aire y a 37ºC. Se encontraron (Tabla 1) diferencias sig-
trol, Grupo B; Semen equino mas diluyente incubado con nificativas en la frecuencia de desarrollo hasta el estadio
émbolos de goma, Grupo C; Semen equino mas diluyen- de blastocisto.

Tabla 1.
Desarrollo de embriones de dos células de ratón hasta el estadio de blastocisto después de ser expuestos a varios tipos de recipientes plásticos a temperatura
ambiente durante 1 hora (Boone y Shapiro 1990)
Tipo de recipiente plástico Nombre comercial Blastocistos n/n (%)
Placa multi pocillos Falcon 294/327 (89.9)a
Jeringas (embolo de goma) Becton Dickinson 3/88 (3.4)b
Jeringas (embolo plástico) Fortune 83/93 (89.3)a
Jeringas (embolo plástico) Monoject 52/56 (92.9)a
ab
Porcentajes con diferentes superíndices son diferentes (P< 0.05)

te incubado con émbolos de plástico, Grupo D; Semen En otro estudio, realizado con embriones de ratón
equino mas diluyente control incubado con émbolos de de dos células (Scott Fitzgerald et al., 1993; n=50) fue-
goma y Grupo E; Semen equino mas diluyente control ron cultivados en medio expuesto a émbolos de jeringa
incubado con émbolos de plástico. Cada grupo contenía negros de goma (Becton Dickinson); los embriones se
5 ml de diluyente y semen a una concentración de 1.0 x desarrollaron y realizaron 3-4 divisiones (69% embrio-
106 sperm./ml. En un segundo experimento, las incuba- nes de 8-células) pero todos los embriones termina-
ciones con semen fueron durante 45 minutos, y luego el ron haciéndose atrésicos (P<0.001 comparados con los
diluyente fue retirado y reemplazado por diluyente fresco. controles). Los efectos tóxicos de los émbolos de goma
Palasz A. T. y de La Fuente J.

y requiere de una muy larga aireación en evitación de


su toxicidad. Las radiaciones son un método muy rápi-
do, usado principalmente para esterilizar equipamientos
sensibles al calor, pero requiere unas instalaciones espe-
ciales y operadores muy cualificados. Los líquidos quí-
micos son efectivos en el tratamiento de paredes, sue-
los y muebles, pero tampoco ningún producto químico
determinado es efectivo para todo tipo de patógenos y
además los productos químicos suelen ser muy tóxicos
para los embriones.
Mórula PIV.

Todos los equipos no reutilizables pueden ser esteri-


lizados con una de las siguientes alternativas:

Calor seco

Los útiles han de ser mantenidos a 1600C durante


2 horas.

Saturación de vapor

Los útiles han de ser mantenidos a 1210C y 104 kilo-


Blastocisto PIV.
pascals de presión durante 30 min. Existen en el mercado
modelos, tipos y marcas de autoclave, que pueden realizar
esta función ajustándose a las necesidades de cada labo-
Hay numerosos ratorio.
métodos de
Vapor de oxido de Etileno (esterilización por gas)
esterilización
mediante calor, Los útiles han de ser envueltos en un material poroso
gas, radiación al oxido de etileno y después expuestos a un mínimo de
500 mg de oxido de etileno por cada 1000 cm3 durante 30
y productos minutos. Los equipos han de ser desarmados para facilitar
químicos, pero Eclosión de blastocisto PIV.
la penetración del gas. El tiempo adecuado de aireación se
la saturación sitúa por encima de los 30-40 días ya que el gas residual
puede matar a los embriones.
de vapor es el
método más de las jeringas pueden ser evitados mediante el lavado Filtración de membrana
completo y con jabón y enjuagando con agua destilada (Boone y
Shapiro 1990). Solo puede realizarse con soluciones. El medio de
efectivo cultivo ha de ser filtrado con filtros de poro de 0.22
Lavado y esterilización de los equipos µm (p.ej.: Millipore) mediante la utilización de presión
positiva.
Todo el vidrio y el resto de material reutilizable utili-
zado para la producción y manipulación de los embriones
debe ser enjuagado con agua destilada y mantenido du-
rante 24 horas en una solución al 1% de un detergente Esterilización con Gas
no toxico (p.ej., Alconox; Alconox Inc. 9E 40th St, New de Oxido de etileno
York), posteriormente lavado al menos 5 veces en agua
destilada, secado y preparado para su esterilización. La
esterilización es el proceso mediante el cual destruiremos Cuatrocientos embriones de ratón de 8 células fue-
los microorganismos (bacterias, hongos y virus) mediante ron cultivados in vitro en placas plásticas de poli-es-
calor o por reacción química. tireno y en placas de vidrio, para analizar la toxicidad
potencial de la absorción o retención del oxido de eti-
Hay numerosos métodos de esterilización mediante leno. Las placas de cultivo fueron esterizadas con gas
calor, gas, radiación y productos químicos, pero la satu- (Amprolene) y aireadas a 21ºC durante varios periodos de
ración de vapor es el método más completo y efectivo. tiempo. Los residuos de gas posteriores a la esterilización
La saturación de vapor bajo presión se utiliza para des- fueron determinados por la medida de la diferencia de
truir la vida microbiana en una gran variedad de mate- pesos, donde las placas de plástico aumentaron su peso
riales, tales como el cristal, utensilios de laboratorio y de forma exponencial. Después de una semana de airea-
medios de cultivo. El calor seco se utiliza para esterilizar ción, se retuvieron 0.625 mg de oxido de etileno por mg
materiales que son sensibles en su mezcla y no pueden de plástico de la placa de cultivo.
ser atravesados por el vapor. La esterilización con gas
de óxido de etileno es un proceso lento, utilizado para Para determinar el efecto de los residuos del gas
diversos materiales, que puede provocar daños por calor sobre el cultivo in vitro los embriones fueron colec-
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Nut rición

Estufa de calor seco.


tados de hembras de ratón (C57BL/6N) en un medio
fosfatado salino (PBS) y posteriormente mezclados al
azar en varias placas de cultivo con diferentes perio-
dos de aireación. Los embriones fueron cultivados en
medio de Whitten con 3 mg/ml de albúmina sérica
bovina (BSA), en una humedad saturada y 5% CO2 en
aire atmosférico a 37oC. El desarrollo embrionario fue
medido usando las tablas morfológicas y las medidas
de calidad sistemáticas, junto con una tinción de ace-
tato de fluoresceína. El desarrollo apareció retardado
entre las 8 a 16 células, cuando se utilizaron 12 horas
o menos de aireación de las placas de poli-estireno.
La aireación durante 24 a 36 horas resultó ofrecer un
desarrollo sub-optimo, con menos (P<0.01) blastocis-
tos y mayores grados de degeneración celular a las 48
horas de cultivo in vitro, al comparar con el control
(placas esterilizadas por el fabricante, sin gas de oxido
de etileno),y con los grupos de una semana de airea-
ción (Schiewe et al., 1985).

El efecto de introducir embriones de ratón en una


pajuela de plástico para semen esterilizadas con oxido
de etileno, fue medido al comparar su desarrollo in vi-
tro frente al desarrollo alcanzado por los embriones que
se introdujeron en pajuelas que no fueron expuestas al Autoclave.
gas. Así, se usaron un total de 920 embriones de ratón
de 8 células a mórula para los siguientes experimen-
tos. Las pajuelas fueron esterilizadas con gas de oxido
de etileno y aireadas a temperatura ambiente durante
varios periodos de tiempo por encima de las 24 hasta
las 144 horas. Los embriones fueron aspirados dentro
de las pajuelas con el medio modificado de Brinster y
mantenidos durante 2 horas, para ser luego expulsados
a una placa con el mismo medio y bajo aceite mineral.
El porcentaje de desarrollo in vitro hasta el estadio de
blastocisto después de 24 horas de cultivo fue usado
como mejor criterio para determinar el efecto produ-
cido por el gas.

El desarrollo de los embriones incluidos en las


pajuelas tratadas (esterilización con gas) fueron desde
0% (24 h de aireación) a 33% (144 h de aireación; Ta-
bla 1). Los embriones control llegaron a un desarrollo
del 50 al 95 % con un promedio del 72% de desarrollo
normal. A todos los tiempos de aireación estudiados las
diferencias en porcentajes de desarrollo normal entre
los grupos tratados y el control fueron altamente signi-
ficativas (P <0.01; Tabla 2), según se determinó por el
test de Chi-cuadrado.

Tabla 2.
Porcentajes de crecimiento normal de los embriones expuestos al contacto con Pajuelas de plástico esterilizadas con oxido de etileno
Grupo Tiempo de aireación en Horas a

24 48 72 96 120 144

Tratados (%) 0 20 19 30 32 33

(n) (44) (50) (95) (64) (82) (168)

Control (%) 90 95 65 85 50 57

(n) (25) (55) (69) (95) (43) (160)


a
entre cada tiempo de aireación las diferencias entre grupos son muy significativas (p <0.01).
Palasz A. T. y de La Fuente J.

Los resultados indican que las pajuelas de semen


esterilizadas con oxido de etileno tienen la posibilidad
de destruir a los embriones alojados en ellas. Bajo estas
condiciones experimentales, fue insuficiente un periodo
de 144 horas de aireación de las pajuelas para que no
resultaran toxicas para los embriones de ratón (Hagele et
al., 1987).

Test de toxicidad de las pajuelas


de congelación de 0.25 ml

Embriones de ratón de 8 a 16 células fueron cul-


tivados en medio de Ham´s F-10 conteniendo 5 mg/ml
BSA y posteriormente introducidos de forma aleatoria en
cuatro tipos de pajuelas de plástico de 0.25 ml (de 8 a 10
embriones por pajuela): 1) Pajuelas amarillas (no estériles),
2) Amarillas (preparadas de forma comercial y ¿estériles?),
3) Transparentes (preparadas de forma comercial y ¿esté-
riles?) y 4) Transparentes (no estériles).

Filtración de membrana.

Tabla 3.
Desarrollo de embriones de ratón de 8 a 16 células hasta el estadio de blastocisto después de su exposición a varias pajuelas de plástico de 0.25 ml a 39ºC por
24 h y posteriormente cultivados en medio Ham´s F-10 durante 24 horas mas (4 replicas)
Tipo de pajuela N Embriones desarrollados a las 24 h (%) Blastocistos
(Grupo) a las 48h (%)
Control (en gotas) 38 37/38 (97.3) 37/38 (97.3)a
Amarilla (no estéril) 41 34/41 (82.8) 31/41 (75.6)b
Amarilla (IMV*) 34 12/34 (35.3) 11/34 (32.3)c
Transparente (IMV*) 35 14/35 (40.0) 6/29 (20.7)c
Transparente (no estéril) 34 29/34 (85.3) 20/34 (58.8)b
abc
Porcentajes con diferentes superíndices son significativamente diferentes
(P< 0.05).

Las pajuelas conteniendo los embriones fueron mante- etileno antes de su venta, aunque si que estarían del orden
nidas en un incubador a 39ºC durante 24 horas y posterior- de 40 días de aireación antes de ser distribuidas.
mente trasferidos de nuevo a medio fresco de Ham´s F-10
en gotas de cultivo durante otras adicionales 24 horas. Los
resultados sugieren que las pajuelas preparadas de forma co- Referencias
mercial contienen algunos factores que actúan reduciendo el
Pajuelas preparadas para desarrollo embrionario (Tabla 3). Por esto podría ser que las Boone WR, Shapiro SS. Quality control in IVF laboratory.
vitrificación. pajuelas comerciales fueran esterilizadas con gas de oxido de Theriogenology 33:23-50, 1990.

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